CN105861689A

CN105861689A - 一种cyp3a5*3的检测引物组合物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN105861689A
Application number: CN201610298757.2A
Authority: CN
Inventors: 汪大为; 张井存
Original assignee: Beijing Jinqi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Jinqi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2016-05-06
Publication date: 2016-08-17

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种CYP3A5*3的检测引物组合物、试剂盒及方法，采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA—A封闭rs776746的A位点，PNA‑G封闭rs776746的G位点，PNA‑I封闭高度相似基因CYP3A4，从而使得对应的LAMP反应无法继续，以此达到CYP3A5基因分型检测的目的。该发明具有的优点在于该方法步骤简单，特异性高，鉴定简便，成本低廉。

Description

一种CYP3A5*3的检测引物组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及一种CYP3A5*3的检测引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术

细胞色素P450(cytochromeP450或CYP450)简称CYP450，主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，是人体内参与内源性物质和外源性化合物代谢过程的一组超家族酶类，尤其在药物的体内代谢过程中扮演重要角色。其中，CYP3A5参与他克莫司、咪达唑仑、氨苯砜、可的松、尼菲地平等多种药物的代谢。该基因的一个SNP，rs776746(CYP3A5*3，6986A>G)，会导致CYP3A5基因的mRNA过短地剪切，形成一个“不完整的”CYP3A5蛋白，从而导致CYP3A5酶蛋白活性的降低甚至消失。据统计，CYP3A5*3等位基因在中国人群中出现的频率约为75％，而携带突变型等位基因的患者在临床药物治疗过程中的表现与野生型携带者大相径庭。例如，在临床器官移植术后使用的主要免疫抑制剂类药物他克莫司(tacrolimus，FK506)，其代谢过程主要由CYP3A5进行调控。如果CYP3A5基因出现突变，则会导致病人体内他克莫司的血药浓度大幅度增高，并出现肾毒性、神经毒性、高血压和胃肠道紊乱等一系列药物毒副作用。因此，在临床中检测CYP3A5基因分型对于临床治疗，特别是器官移植术后病人的临床用药治疗实现个体化安全用药具有重要的指导作用。

目前，关于CYP3A5基因分型的检测多采用荧光定量PCR,基因测序以及基因芯片等技术手段。使用这些方法进行CYP3A5基因分型检测均不同程度存在购买仪器成本高，操作程序复杂，检测周期较长等问题，不利于提高检测效率并实现临床推广普及。因此，寻找一种高效且价格容易被患者接受的检测手段，对于CYP3A5基因分型检测有着重要的现实意义。环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术，其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生10⁹-10¹⁰数量级的产物。具有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。

LAMP法具有操作简单，特异性强和成本低廉的优点。目前LAMP法较多用于病原体和其他一些微生物的检测中，虽然对于使用LAMP法进行基因突变的检测也偶见报道，但这些等位基因特异性引物的LAMP法在实际的应用中很不稳定，因此在市场上还没有以LAMP法为基础的基因突变检测试剂盒出售。肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物，骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地和与之互补的DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。当PNA与靶序列完全互补时，这种复合体的稳定性要远远高于普通的DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA的双链结构。然而，当PNA与靶序列不完全配对甚至只有一个碱基错配的时候，这种PNA-DNA复合物就变得非常不稳定，很容易打开双链。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有的CYP3A5基因分型的检测存在费用高，操作程序复杂，检测周期较长等问题，不利于提高检测效率并实现临床推广普及。

为解决上述问题，本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA—A封闭rs776746的A位点，PNA-G封闭rs776746的G位点，PNA-I封闭高度相似基因CYP3A4，从而使得对应的LAMP反应无法继续，以此达到CYP3A5基因分型检测的目的，该方法既快速灵敏又成本低廉。

本发明的第一个目的在于提供一种CYP3A5*3的检测引物组合物，包括：

正向外侧引物F3：

5’-TACCACCCAGCTTAACGA-3’(SEQ ID No.1)；

反向外侧引物B3：

5’-CCATACCCCTAGTTGTACG-3’(SEQ ID No.2)；

正向内侧引物FIP：

5’-TCCAAACAGGGAAGAGATATTGAAAATGCTCTACTGTCATTTCTAACC-3’(SEQ ID No.3)；

反向内侧引物BIP：

5’-GCTCCTGTGTGAGACTCTTGCACACACAGCAACCTTAGG-3’(SEQ ID No.4)；以及

用于封闭rs776746A位点的肽核酸序列PNA-A：

5’-CAATATCTCTTCCCTGT-3’(SEQ ID No.5)；

用于封闭rs776746G位点的肽核酸序列PNA-G：

5’-AGTATCTCTTCCCTGTT-3’(SEQ ID No.6)；

用于封闭CYP3A4的肽核酸序列PNA-I：

5’-TTGTTTGGCCCACATTA-3’(SEQ ID No.7)。

本发明的第二个目的在于提供一种CYP3A5*3的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括上述的引物和肽核酸序列。

进一步地，所述检测试剂盒中还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。

进一步地，所述检测试剂盒分为两个反应体系，分别记为反应体系A和反应体系G：

反应体系A中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-A、PNA-I、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水；反应体系G中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-G、PNA-I、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。

进一步地，所述两个反应体系中还包括用于显示体系颜色的指示剂。

优选地，所述指示剂为羟基萘酚蓝。

优选地，所述指示剂在反应体系A和反应体系G中的浓度相同，羟基萘酚蓝的浓度为120μM。

进一步地，所述两个反应体系中还包括添加剂，所述添加剂在两反应体系中的浓度一致。

优选地，所述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为0.8M。

优选地，所述两个反应体系中缓冲液的浓度相同，其包括：Tris-HCl 20mM，KCl50mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，MgSO₄ 4mM，Tween-20 0.1％(体积分数)。

优选地，所述两个反应体系中：F3的浓度相同，均为0.4μM；B3的浓度相同，均为0.4μM；FIP的浓度相同，均为1.6μM；BIP的浓度相同，均为1.6μM，PNA-I的浓度相同，均为0.4μM；反应体系A中的PNA-A的浓度和反应体系G中PNA-G的浓度相同，均为0.4μM。

优选地，两个反应体系中dNTP的浓度相同，均为1.4mM；两个反应体系中Bst聚合酶的浓度相同，均为8U。

本发明的第三个目的在于提供一种CYP3A5*3的检测方法，其使用上述的检测试剂盒，包括如下步骤：

(1)取新鲜血液，以EDTA抗凝管保存；

(2)将上述新鲜血液与超纯水混匀，在95℃下加热15min以裂解血液中的白细胞使其释放出DNA；

(3)将上述处理后的血水混合物在12000g下离心1min，取上清液作为待检测的模板，同时以超纯水代替模板做阴性对照；

(4)采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体系A和反应体系G中，于60℃下反应，然后升温至80℃保持20min进行酶灭活处理，之后自然降温，观察体系颜色变化即可。

进一步地，所述反应时间为60～80min。

在本发明的两个反应体系中，当反应体系中存在指示剂时，选用羟基萘酚蓝作为指示剂时，反应前体系中的镁离子与dNTP螯合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，镁离子与副产物焦磷酸形成沉淀，溶液pH发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色。因此，观察反应体系颜色的变化就可以直接判定是否发生扩增反应。

本发明具有的优点和积极效果是：

本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA将相应的等位基因“封闭”，从而使得LAMP反应无法继续；而当检测样本中存在另外一个或者几个等位基因时，PNA由于不能有效对其进行“封闭”，使得LAMP反应得以顺利进行，以此达到CYP3A5基因分型检测的目的。

与现有技术相比，PNA clamp LAMP法具有如下有益效果：

(1)步骤简单：LAMP法本身对模板的要求并不严格，因此可以直接以血液样本经过简单处理后直接扩增，无需提取DNA，而且只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变温过程；

(2)高特异性：典型的LAMP反应需要四条引物，它们共六个不同的模板结合区域，远远高于普通PCR的两条引物，因此LAMP扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；

(3)扩增反应快速、高效：整个扩增过程不超过1.5h，且产率高；

(4)鉴定简便：反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制；

(5)成本低廉：整个检测反应仅需要水浴锅就可开展，无需任何其他检测设备。

附图说明

图1-图5分别是检测样本M1-M5用PCR测序分型得到的测序图谱。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

一种CYP3A5*3的检测引物组合物，包括：

正向外侧引物F3：

5’-TACCACCCAGCTTAACGA-3’(SEQ ID No.1)；

反向外侧引物B3：

5’-CCATACCCCTAGTTGTACG-3’(SEQ ID No.2)；

正向内侧引物FIP：

5’-TCCAAACAGGGAAGAGATATTGAAAATGCTCTACTGTCATTTCTAACC-3’(SEQ ID No.3)；

反向内侧引物BIP：

5’-GCTCCTGTGTGAGACTCTTGCACACACAGCAACCTTAGG-3’(SEQ ID No.4)；以及

用于封闭rs776746A位点的肽核酸序列PNA-A：

5’-CAATATCTCTTCCCTGT-3’(SEQ ID No.5)；

用于封闭rs776746G位点的肽核酸序列PNA-G：

5’-AGTATCTCTTCCCTGTT-3’(SEQ ID No.6)；

用于封闭CYP3A4的肽核酸序列PNA-I：

5’-TTGTTTGGCCCACATTA-3’(SEQ ID No.7)。

一种CYP3A5*3的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括上述的引物和肽核酸序列，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、羟基萘酚蓝和甜菜碱。

所述检测试剂盒分为两个反应体系，分别为检测rs776746A位点的反应体系A和检测rs776746G位点的反应体系G。反应体系A中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-A、PNA-I、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、羟基萘酚蓝和甜菜碱；反应体系G中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-G、PNA-I、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、羟基萘酚蓝和甜菜碱。

两反应体系中各组分的浓度可按正常LAMP反应的浓度设置，作为一种实施方案，两个反应体系中：F3的浓度相同，均为0.4μM；B3的浓度相同，均为0.4μM；FIP的浓度相同，均为1.6μM；BIP的浓度相同，均为1.6μM，PNA-I的浓度相同，均为0.4μM；反应体系A中的PNA-A的浓度和反应体系G中PNA-G的浓度相同，均为0.4μM；dNTP的浓度相同，均为1.4mM；Bst聚合酶的浓度相同，均为8U；缓冲液的浓度相同，均包括：Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，(NH₄)₂SO₄10mM，MgSO₄ 4mM，Tween-20 0.1％(体积分数)；羟基萘酚蓝的浓度相同，均为120μM；甜菜碱的浓度相同，均为0.8M。

一种CYP3A5*3的检测方法，使用上述的检测试剂盒，具体为：取新鲜血液，以EDTA抗凝管保存；将上述新鲜血液与超纯水混匀，在95℃下加热15min以裂解血液中的白细胞使其释放出DNA；将上述处理后的血水混合物在12000g下离心1min，取上清液作为检测的模板，同时以超纯水代替模板做阴性对照；采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体系A和反应体系G中，于60℃下反应，然后升温至80℃保持20min进行酶灭活处理，之后自然降温，观察体系的颜色变化。作为优选，所述反应时间为60～80min。

具体实施时，取5人新鲜血液，以EDTA抗凝管保存，标记为M1、M2，以此类推至M5，另有一以超纯水代替模板的阴性对照，记为M6。取出5μL新鲜血液与45μL的超纯水混匀，在95℃下加热15min以裂解血液中的白细胞使其释放出DNA；立即将上述处理后的血水混合物在12000g下离心1min，取上清液做待检测的模板；对模板Mn(n为组别编号，n为1-6)进行LAMP反应，将模板Mn分别加入到反应体系A和反应体系G中，各反应体系于60℃下反应60min，然后升温至80℃保持20min进行酶灭活处理，之后自然降温，观察体系颜色变化。

利用检测试剂盒对模板Mn进行检测，作为一种实施方式，检测试剂盒的两个反应体系各为25μL，其内的组分和含量如下表1和表2所示：

表1反应体系A的组分和含量

表2反应体系G的组分和含量

反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别反应体系的颜色及基因型判断如下表3所示：

表3各组别反应体系的颜色及基因型判断

为进一步验证反应的准确性，将上述5个实验组别的模板M1-M5分别用PCR测序法进行分型，得到的测序图谱参见图1-图5。

对比基因测序图谱和本发明提供的检测试剂盒的检测结果可知，二者的检测吻合率100％，验证了本发明的结果精确。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims

1.一种CYP3A5*3的检测引物组合物，包括：

正向外侧引物F3：

5’-TACCACCCAGCTTAACGA-3’(SEQ ID No.1)；

反向外侧引物B3：

5’-CCATACCCCTAGTTGTACG-3’(SEQ ID No.2)；

正向内侧引物FIP：

5’-TCCAAACAGGGAAGAGATATTGAAAATGCTCTACTGTCATTTCTAACC-3’(SEQ ID No.3)；

反向内侧引物BIP：

5’-GCTCCTGTGTGAGACTCTTGCACACACAGCAACCTTAGG-3’(SEQ ID No.4)；以及

用于封闭rs776746A位点的肽核酸序列PNA-A：

5’-CAATATCTCTTCCCTGT-3’(SEQ ID No.5)；

用于封闭rs776746G位点的肽核酸序列PNA-G：

5’-AGTATCTCTTCCCTGTT-3’(SEQ ID No.6)；

用于封闭CYP3A4的肽核酸序列PNA-I：

5’-TTGTTTGGCCCACATTA-3’(SEQ ID No.7)。

2.一种CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物和肽核酸序列。

3.根据权利要求2所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。

4.根据权利要求3所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒分为两个反应体系，分别记为反应体系A和反应体系G：

反应体系A中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-A、PNA-I、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水；

反应体系G中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-G、PNA-I、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。

5.根据权利要求4所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：所述两个反应体系中还包括用于显示体系颜色的指示剂。

6.根据权利要求5所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：所述指示剂为羟基萘酚蓝。

7.根据权利要求6所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：所述指示剂在反应体系A和反应体系G中的浓度相同，羟基萘酚蓝的浓度为120μM。

8.根据权利要求4所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：所述两个反应体系中还包括添加剂，所述添加剂在两反应体系中的浓度一致。

9.根据权利要求8所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：所述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为0.8M。

10.根据权利要求4-9中任一项所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：所述两个反应体系中缓冲液的浓度相同，其包括：Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，MgSO₄4mM，Tween-20 0.1％(体积分数)。

11.根据权利要求4-9中任一项所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：所述两个反应体系中：F3的浓度相同，均为0.4μM；B3的浓度相同，均为0.4μM；FIP的浓度相同，均为1.6μM；BIP的浓度相同，均为1.6μM，PNA-I的浓度相同，均为0.4μM；反应体系A中的PNA-A的浓度和反应体系G中PNA-G的浓度相同，均为0.4μM。

12.根据权利要求4-9中任一项所述的CYP3A5*3的检测试剂盒，其特征在于：两个反应体系中dNTP的浓度相同，均为1.4mM；两个反应体系中Bst聚合酶的浓度相同，均为8U。

13.一种CYP3A5*3的检测方法，使用权利要求3-12任一所述的检测试剂盒，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取新鲜血液，以EDTA抗凝管保存；

(2)将上述新鲜血液与超纯水混匀，加热使其释放出DNA；

(3)将上述处理后的血水混合物在离心取上清液作为待检测的模板，同时以超纯水代替模板做阴性对照；

14.根据权利要求13所述的CYP3A5*3的检测方法，其特征在于：所述反应时间为60～80min。