CN106755545A - 转基因作物中pat基因的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

转基因作物中pat基因的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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李葱葱
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种转基因作物中PAT基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由6条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1~6所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×LAMP反应缓冲液、dNTPs溶液、显色剂。检测方法是利用LAMP检测引物组及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在60~65℃对样品DNA模板进行扩增，然后加入显色剂并观察反应液颜色变化，从而判断样品是否含有PAT基因成分。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强等特点，适合现场检测。

Description

转基因作物中PAT基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测转基因作物中PAT基因的引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
2014年全球转基因作物种植面积高达1.815亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性状为抗虫和抗除草剂，其中PAT基因是一种草丁膦乙酰转移酶基因，含有PAT基因的转基因作物可耐受广谱除草剂草胺膦。PAT基因已广泛应用到转基因玉米、大豆的新品种研究中，针对PAT基因开展快速精准的检测方法研究，是转基因生物安全管理相关法律法规顺利实施的技术支撑和保障。
LAMP技术是由日本学者于2000年开发出来的一种新的基因扩增技术，该技术的特点在于：①恒温扩增：在60~65℃的恒温条件即可完成扩增反应，不需要特殊仪器设备；②快速高效：在1 h内即可完成扩增及产物检测过程；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：在反应液中加入染色剂后，通过肉眼观察颜色变化即可判断样品中是否含有检测靶标。LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因作物检测领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种转基因作物中PAT基因的LAMP检测引物组。
本发明的另一个目的在于公开一种转基因作物中PAT基因的LAMP检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因作物中PAT基因的LAMP检测方法。
本发明所采用的技术方案如下：
根据PAT基因的核苷酸序列，设计PAT基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQ IDNO: 1~6；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性进行验证。
转基因作物中PAT基因的LAMP检测引物组，包括外引物PAT-F3、外引物PAT-B3、内引物PAT-FIP、内引物PAT-BIP、环引物PAT-LF和环引物PAT-LB，其核苷酸序列分别为：
外引物PAT-F3：GGCGCAAGGTTTTAAGTCTG（SEQ ID NO：1）；
外引物PAT-B3：GGTAACTGGCCTAACTGGC（SEQ ID NO：2）；
内引物PAT-FIP：TACCCCGGGCTGTGTATCCCATAGGCCTTCCAAACGATCC（SEQ ID NO：3）；
内引物PAT-BIP：ATTGCGCGCAGCTGGATACAAGGAGGAGCTGGCAACTCA（SEQ ID NO：4）；
环引物PAT-LF：GCCTCATGCAACCTAACAGAT（SEQ ID NO：5）；
环引物PAT-LB：GCATGGTGGATGGCATGAT（SEQ ID NO：6）。
转基因作物中PAT基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：
（1）检测引物溶液：由权利要求1所述的6条引物配制的检测引物溶液，PAT-F3、PAT-B3、PAT-FIP、PAT-BIP、PAT-LF和PAT-LB的浓度依次为4~6 µmol/L、4~6 µmol/L、32~48 µmol/L、32~48 µmol/L、4~6 µmol/L和4~6 µmol/L；
（2）具有链置换活性的Bst DNA聚合酶：浓度为6~10 U/μL；
（3）10×LAMP反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，40~100 mmol/L MgSO4，6~14 mol/L甜菜碱；
（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
（5）显色剂：1000×SYBR GREEN I 荧光染料。
优选的，所述的检测引物溶液中6条引物的浓度依次为5 µmol/L、5 µmol/L、40 µmol/L、40 µmol/L、5 µmol/L和5 µmol/L。
优选的，所述的Bst DNA聚合酶的浓度为8 U/μL。
优选的，所述的10×LAMP反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L和8mol/L。
利用以上所述的试剂盒检测PAT基因的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入模板DNA 2~5 μL、检测引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×LAMP反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液2~5 μL，用超纯水补齐至总体积为25 μL；
（3）在反应管盖的中央位置加1 µL的显色剂，盖到反应管上；
（4）运行LAMP扩增反应：将反应管放置在恒温水浴锅中，60~65℃孵育60 min，80℃孵育5 min终止反应；
（5）检测结果判定：上下颠倒反应管2-3次，使管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
通过实验证明，本发明提供的PAT基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强等优点。
附图说明
图1是实施例2中进行LAMP特异性检测的结果图，1~8依次为转cry1Ab和PAT基因玉米Bt11、转cry1Ab和bar基因玉米Bt176、转cspB基因玉米MON87460、转vip3Aa基因玉米MIR162、转cry1Ab水稻科丰6号、转cry3Bb基因玉米MON863、转PAT基因大豆A5547-127和非转基因玉米对照。
图2是实施例3中进行LAMP灵敏度检测的结果图，1~8依次为转基因玉米Bt11（含PAT基因）的基因组DNA拷贝数浓度分别为20000 copy/µL、2000 copy/µL、200 copy/µL、50copy/µL、20 copy/µL、10 copy/µL、5 copy/µL和1 copy/µL的测试样品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 试剂盒及其检测方法。
按下列配方制备PAT基因的LAMP检测试剂盒，每个试剂盒的规格为100次反应：
（1）检测引物溶液：合成外引物PAT-F3、外引物PAT-B3、内引物PAT-FIP、内引物PAT-BIP、环引物PAT-LF和环引物PAT-LB，将引物干粉用超纯水分别配成浓度为100 μmol/L的母液，然后分别取5 μL PAT-F3、5 μL PAT-B3、40 μL PAT-FIP、40 μL PAT-BIP、5 μL PAT-LF和5 μL PAT-LB，放入一个新的1.5 mL离心管中，充分混匀，配成100 μL的PAT基因的LAMP检测引物溶液，其中引物序列分别为：
外引物PAT-F3：GGCGCAAGGTTTTAAGTCTG（SEQ ID NO：1）；
外引物PAT-B3：GGTAACTGGCCTAACTGGC（SEQ ID NO：2）；
内引物PAT-FIP：TACCCCGGGCTGTGTATCCCATAGGCCTTCCAAACGATCC（SEQ ID NO：3）；
内引物PAT-BIP：ATTGCGCGCAGCTGGATACAAGGAGGAGCTGGCAACTCA（SEQ ID NO：4）；
环引物PAT-LF：GCCTCATGCAACCTAACAGAT（SEQ ID NO：5）；
环引物PAT-LB：GCATGGTGGATGGCATGAT（SEQ ID NO：6）；
（2）Bst DNA聚合酶：浓度为8 U/μL，分装100 μL放入一个新的1.5 mL离心管中；
（3）10×LAMP反应缓冲液：包含200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl，100mmol/L (NH4)2SO4，80 mmol/L MgSO4和8 mol/L甜菜碱，分装250 μL放入一个新的1.5 mL离心管中；
（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成，分装500 μL放入一个新的1.5 mL离心管中；
（5）显色剂：1000×SYBR GREEN I 荧光染料，分装200 μL放入一个新的棕色1.5 mL离心管中。
用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：
（1）提取待测样品的基因组DNA：采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA，稀释至25 ng/μL；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：采用25 μL的反应体系，在200 μL 反应管内依次加入超纯水15.5 μL、模板DNA 2 μL、检测引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液3 μL；
（3）在反应管盖的中央位置加1 µL的显色剂，盖到反应管上；
（4）运行LAMP扩增反应：将反应管放置在恒温水浴锅中，63℃孵育60min，80℃孵育5min终止反应；
（5）检测结果判定：上下颠倒反应管2-3次，使管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
实施例2 试剂盒及检测方法的特异性实验。
按实施例1所述的试剂盒制备方法准备试剂盒，并对其检测方法进行特异性测试：
（1）提取转cry1Ab和PAT基因玉米Bt11、转cry1Ab和bar基因玉米Bt176、转cspB基因玉米MON87460、转vip3Aa基因玉米MIR162、转cry1Ab水稻科丰6号、转cry3Bb基因玉米MON863、转PAT基因大豆A5547-127和非转基因玉米等8种试验材料的基因组DNA，用ND1000核酸微量测定仪测定DNA浓度，用超纯水稀释至20 ng/μL；
（2）在200 μL的八联管中，按照实施例1所述的步骤，在每个管中依次加入超纯水15.5μL、检测引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液3 μL，然后在1-8号管中分别加入2 μL的Bt11、Bt176、MON87460、MIR162、科丰6号、MON863、A5547-127和非转基因玉米样品的DNA对照；
（3）在八联管盖的每个管盖上加1 µL的显色剂，盖到八联管上；
（4）运行LAMP扩增反应：将八联管放置在恒温水浴锅中，63℃孵育60 min，80℃孵育5min终止反应；
（5）检测结果判定：上下颠倒反应管2-3次，使管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
本实施例中，仅在含有PAT基因的转基因玉米Bt11和转基因大豆A5547-127样品管中显现绿色，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对PAT基因具有很好的特异性。
实施例3 试剂盒及检测方法的灵敏度实验。
对实施例1所述的试剂盒及其检测方法的灵敏度进行实验，测试样品由转基因玉米Bt11（含PAT基因）的基因组DNA以灭菌去离子水梯度稀释而成，测试样品中Bt11玉米基因组DNA的拷贝数浓度分别为20000 copy/µL、2000 copy/µL、200 copy/µL、50 copy/µL、20copy/µL、10 copy/µL、5 copy/µL和1 copy/µL，每个反应体系中加入2 µL作为模板DNA。
本实施例中，20000 copy/µL、2000 copy/µL、200 copy/µL、50 copy/µL、20 copy/µL、10 copy/µL、5 copy/µL的测试样品反应管中均呈现绿色，表明本发明所述试剂盒及其检测方法的检测极限可达10个拷贝。
应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 吉林省农业科学院
<120> 转基因作物中PAT基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
<130>
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT基因的LAMP检测外引物PAT-F3
<400> 1
ggcgcaaggt tttaagtctg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT基因的LAMP检测外引物PAT-B3
<400> 2
ggtaactggc ctaactggc 19
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT基因的LAMP检测内引物PAT-FIP
<400> 3
taccccgggc tgtgtatccc ataggccttc caaacgatcc 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT基因的LAMP检测内引物PAT-BIP
<400> 4
attgcgcgca gctggataca aggaggagct ggcaactca 39
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT基因的LAMP检测环引物PAT-LF
<400> 5
gcctcatgca acctaacaga t 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT基因的LAMP检测环引物PAT-LB
<400> 6
gcatggtgga tggcatgat 19

Claims (4)

1.一套转基因作物中PAT基因的LAMP检测引物组，其特征在于，所述引物包括外引物PAT-F3、外引物PAT-B3、内引物PAT-FIP、内引物PAT-BIP、环引物PAT-LF和环引物PAT-LB，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物PAT-F3：GGCGCAAGGTTTTAAGTCTG（SEQ ID NO：1）；
外引物PAT-B3：GGTAACTGGCCTAACTGGC（SEQ ID NO：2）；
内引物PAT-FIP：TACCCCGGGCTGTGTATCCCATAGGCCTTCCAAACGATCC（SEQ ID NO：3）；
内引物PAT-BIP：ATTGCGCGCAGCTGGATACAAGGAGGAGCTGGCAACTCA（SEQ ID NO：4）；
环引物PAT-LF：GCCTCATGCAACCTAACAGAT（SEQ ID NO：5）；
环引物PAT-LB：GCATGGTGGATGGCATGAT（SEQ ID NO：6）。
2.一种检测转基因作物中PAT基因的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
（1）检测引物溶液：由权利要求1所述的6条引物配制的检测引物溶液，PAT-F3、PAT-B3、PAT-FIP、PAT-BIP、PAT-LF和PAT-LB的浓度依次为4~6 µmol/L、4~6 µmol/L、32~48 µmol/L、32~48 µmol/L、4~6 µmol/L和4~6 µmol/L；
（2）具有链置换活性的Bst DNA聚合酶：浓度为6~10 U/μL；
（3）10×LAMP反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，40~100 mmol/L MgSO4，6~14 mol/L甜菜碱；
（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
（5）显色剂：1000×SYBR GREEN I 荧光染料。
3.根据权利要求2所述的PAT基因检测试剂盒，其特征在于，所述的检测引物溶液中6条引物的浓度依次为5 µmol/L、5 µmol/L、40 µmol/L、40 µmol/L、5 µmol/L和5 µmol/L；所述的Bst DNA聚合酶的浓度为8 U/μL；所述的10×LAMP反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L、8 mol/L。
4.一种利用权利要求3所述试剂盒检测PAT基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL 反应管内加入模板DNA 2~5 μL、检测引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×LAMP反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液2~5 μL，用超纯水补齐至总体积为25 μL；
（3）在反应管盖的中央位置加1 µL的显色剂，盖到反应管上；
（4）运行LAMP扩增反应：将反应管放置在恒温水浴锅中，60~65℃孵育60 min，80℃孵育5 min终止反应；
（5）检测结果判定：上下颠倒反应管2-3次，使管盖上的显色剂与反应溶液充分混合，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
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