CN105861690A - 一种cyp2c19*2和cyp2c19*3多态性检测的引物组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

一种cyp2c19*2和cyp2c19*3多态性检测的引物组合物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的引物组合物、试剂盒及方法，采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA‑2G封闭CYP2C19*2位点处的G等位基因，PNA‑2A封闭CYP2C19*2位点处的A等位基因，PNA‑3G封闭CYP2C19*3位点处的G等位基因，PNA‑3A封闭CYP2C19*3位点处的A等位基因，从而使得相应的LAMP反应无法继续，以此达到检测CYP2C19基因型的目的。该发明具有的优点在于该方法步骤简单，特异性高，鉴定简便，成本低廉，利于临床检验大范围普及。

Description

一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的引物组合物、试剂 盒及方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的引物组合物、试剂盒及方法。
背景技术
在人体中，CYP2C19参与氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等药物的代谢。氯吡格雷是一种抗血小板药物，广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症。心脏支架手术后的患者需长期服用氯吡格雷以防止支架内再梗。氯吡格雷主要经CYP2C19代谢活化后发挥抗血小板效应。CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，UM)、快代谢者(extensive metabolizer，EM)、中间代谢者(intermediatemetabolizer，IM)和慢代谢者(poor metabolizer，PM)4种表型。CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。EM个体只携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型；PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。CYP2C19PM患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作用下降。美国FDA和美国心脏病学会建议，对于CYP2C19慢代谢基因型患者需考虑改变治疗方案。阿米替林为三环类抗抑郁药，主要用于焦虑性或激动性抑郁症的治疗。阿米替林在体内主要经CYP2C19代谢为活性代谢产物去甲替林。CYP2C19活性的高低可通过影响血液中阿米替林与去甲替林的浓度比，影响阿米替林的疗效和不良反应的产生。伏立康唑是一种广谱三唑类抗真菌药，CYP2C19是其主要代谢酶之一。CYP2C19EM与PM个体间伏立康唑的血液浓度存在显著差异，PM个体在应用常规剂量药物时可能出现毒副反应，建议减少用药剂量；EM和IM个体可给予常规剂量。在常规剂量治疗时，若EM个体出现毒副反应或PM疗效不佳，均应考虑更换药物。FDA批准的药物说明书中指出应用伏立康唑前需检测CYP2C19基因型，以确保用药安全。由上述可见，CYP2C19的活性在在临床指导用药上具有非常广泛的作用，因此，CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测也是非常重要。目前用于检测这两种亚型的方法主要是直接测序法、Taqman荧光PCR法以及芯片法等等，这些方法均在不同方面展现出了自己的优势，但是也都普遍存在检测仪器及配套试剂耗材购买成本高昂，检测周期长、操作繁琐且假阳性率时有出现的问题。因此，发明并构建一套价格低廉，使用操作简便且利于临床检验大范围普及的商品化试剂盒就显得十分重要。
日本科学家于2000年提出一种恒温扩增法-----环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，该技术的主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)的催化下于65℃左右进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可获得109-1010数量级的特异产物。具有操作简单，特异性强和成本低廉的优点。目前LAMP法较多用于病原体和其他一些微生物的检测中，虽然对于使用LAMP法进行基因突变的检测也偶见报道，但这些等位基因特异性引物的LAMP法在实际的应用中很不稳定，因此在市场上还没有以LAMP法为基础的基因突变检测试剂盒出售。肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物，骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。当PNA与靶序列完全互补时，这种复合体的稳定性要远远高于普通的DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA的双链结构。然而，当PNA与靶序列不完全配对甚至只有一个碱基错配的时候，这种PNA-DNA复合物就变得非常不稳定，很容易打开双链。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有CYP2C19*2和CYP2C19*3的检测存在费用高，检测周期较长、操作繁琐且假阳性率时有出现等问题。
为解决上述问题，本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA-2G封闭CYP2C19*2位点处的G等位基因，PNA-2A封闭CYP2C19*2位点处的A等位基因，PNA-3G封闭CYP2C19*3位点处的G等位基因，PNA-3A封闭CYP2C19*3位点处的A等位基因，从而使得相应的LAMP反应无法继续，以此达到检测CYP2C19基因型的目的。该方法既快速灵敏又成本低廉，利于临床检验大范围普及。
本发明的第一个目的在于提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的引物组合物，包括如下八条引物和四条肽核酸序列：
5’-AGTTTTAAATTACAACCAGAGCT-3’(SEQ ID No.1，以下简称F3)；
5’-TGATGTCCATCGATTCTTGG-3’(SEQ ID No.2，以下简称B3)；
5’-GGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGC-3’(SEQ ID No.3，以下简称FIP)；
5’-GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACT-3’(SEQ IDNo.4，以下简称BIP)；
5’-AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3’(SEQ ID No.5，以下简称F3′)；
5’-ATGGCTGTCTAGGCAAGA-3’(SEQ ID No.6，以下简称B3′)；
5’-GAAGCAAAAAACTTGGCCTTACCTATTGAATGAAAACATCAGGATTG-3’(SEQ ID No.7，以下简称FIP′)；
5’-ACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGGTAGTATTCAAAAATGTACTTCAGG-3’(SEQ ID No.8，以下简称BIP′)；以及
用于封闭CYP2C19*2位点处G等位基因的肽核酸序列：
5’-CATTGATTATTTCCCG-3’(SEQ ID No.9，以下简称PNA-2G)；
用于封闭CYP2C19*2位点处A等位基因的肽核酸序列：
5’-CAGGAACCCATAACA-3’(SEQ ID No.10，以下简称PNA-2A)；
用于封闭CYP2C19*3位点处G等位基因的肽核酸序列：
5’-TAAGCACCCCCTGGAT-3’(SEQ ID No.11，以下简称PNA-3G)；
用于封闭CYP2C19*3位点处A等位基因的肽核酸序列：
5’-TAAGCACCCCCTGAAT-3’(SEQ ID No.12，以下简称PNA-3A)；
其中，F3、B3、FIP和BIP为检测CYP2C19*2的引物，F3′、B3′、FIP′和BIP′为检测CYP2C19*3的引物。
本发明的第二个目的在于提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，所述检测的试剂盒包括上述的引物和肽核酸序列。
进一步地，所述检测的试剂盒中还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
进一步地，所述检测的试剂盒分为检测CYP2C19*2位点处G等位基因的反应体系2G，检测CYP2C19*2位点处A等位基因的反应体系2A，检测CYP2C19*3位点处G等位基因的反应体系3G，检测CYP2C19*3位点处A等位基因的反应体系3A：
反应体系2G中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-2G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水；
反应体系2A中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-2A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水；
反应体系3G中包括F3′、B3′、FIP′、BIP′、PNA-3G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水；
反应体系3A中包括F3′、B3′、FIP′、BIP′、PNA-3A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
进一步地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中还包括用于显示体系颜色的指示剂。
优选地，所述指示剂为羟基萘酚蓝。
优选地，所述指示剂在反应体系2G、2A、3G和3A中的浓度相同，羟基萘酚蓝的浓度为120μM。
进一步地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中还包括添加剂，所述添加剂在四个反应体系中的浓度一致。
优选地，所述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为0.8M。
优选地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中缓冲液的浓度相同，均包括：Tris-HCl20mM，KCl 50mM，(NH4)2SO4 10mM，MgSO4 4mM，Tween-20 0.1％(体积分数)。
优选地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中F3、B3、F3′和B3′的浓度相同，均为0.4μM；FIP、BIP、FIP′和BIP′的浓度相同，均为1.6μM，所述反应体系2G、2A、3G和3A中相应肽核酸序列的浓度相同，均为0.4μM。
优选地，所述反应体系2G、2A、3G和3A中dNTP的浓度相同，均为1.4mM；所述反应体系2G、2A、3G和3A中Bst聚合酶的浓度相同，均为8U。
本发明的第三个目的在于提供一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的方法，其使用上述检测的试剂盒，包括如下步骤：
(1)抽取静脉血，以EDTA抗凝管保存；
(2)用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为检测的模板，以超纯水代替模板做阴性对照；
(3)采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体系2G、2A、3G和3A中，于60℃下反应，然后升温至80℃保持20min进行酶灭活处理，之后自然降温，观察体系颜色变化。
进一步地，所述反应时间为60～80min。
在本发明的四个反应体系中，当反应体系中存在指示剂时，选用羟基萘酚蓝作为指示剂时，反应前体系中的镁离子与dNTP螯合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，镁离子与副产物焦磷酸形成沉淀，溶液pH发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色。因此，观察反应体系颜色的变化就可以直接判定是否发生扩增反应。
本发明具有的优点和积极效果是：
本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA将相应的等位基因“封闭”，从而使得LAMP反应无法继续；而当检测样本中存在另外一个或者几个等位基因时，PNA由于不能有效对其进行“封闭”，使得LAMP反应得以顺利进行，以此达到检测CYP2C19基因型的目的。
与现有技术相比，PNA Clamp LAMP法具有如下有益效果：
(1)步骤简单：LAMP法本身对模板的要求并不严格，反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变温过程；
(2)高特异性：扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；
(3)扩增反应快速、高效：整个扩增2h内即可完成，且产率高；
(4)鉴定简便：反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制；
(5)成本低廉：整个检测反应仅需要水浴锅就可开展，无需任何其他检测设备。
附图说明
图1-图4分别是检测样本M1-M4用PCR测序分型得到的测序图谱；
图5-图8分别是检测样本M6-M9用PCR测序分型得到的测序图谱。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的引物组合物，包括如下八条引物和四条肽核酸序列：
5’-AGTTTTAAATTACAACCAGAGCT-3’(SEQ ID No.1，以下简称F3)；
5’-TGATGTCCATCGATTCTTGG-3’(SEQ ID No.2，以下简称B3)；
5’-GGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGC-3’(SEQ ID No.3，以下简称FIP)；
5’-GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACT-3’(SEQ IDNo.4，以下简称BIP)；
5’-AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3’(SEQ ID No.5，以下简称F3′)；
5’-ATGGCTGTCTAGGCAAGA-3’(SEQ ID No.6，以下简称B3′)；
5’-GAAGCAAAAAACTTGGCCTTACCTATTGAATGAAAACATCAGGATTG-3’(SEQ ID No.7，以下简称FIP′)；
5’-ACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGGTAGTATTCAAAAATGTACTTCAGG-3’(SEQ ID No.8，以下简称BIP′)；以及
用于封闭CYP2C19*2位点处G等位基因的肽核酸序列：
5’-CATTGATTATTTCCCG-3’(SEQ ID No.9，以下简称PNA-2G)；
用于封闭CYP2C19*2位点处A等位基因的肽核酸序列：
5’-CAGGAACCCATAACA-3’(SEQ ID No.10，以下简称PNA-2A)；
用于封闭CYP2C19*3位点处G等位基因的肽核酸序列：
5’-TAAGCACCCCCTGGAT-3’(SEQ ID No.11，以下简称PNA-3G)；
用于封闭CYP2C19*3位点处A等位基因的肽核酸序列：
5’-TAAGCACCCCCTGAAT-3’(SEQ ID No.12，以下简称PNA-3A)；
其中，F3、B3、FIP和BIP为检测CYP2C19*2的引物，F3′、B3′、FIP′和BIP′为检测CYP2C19*3的引物。
一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，所述检测的试剂盒包括上述的引物和肽核酸序列，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、羟基萘酚蓝和甜菜碱。
所述检测的试剂盒分为检测CYP2C19*2位点处G等位基因的反应体系2G，检测CYP2C19*2位点处A等位基因的反应体系2A，检测CYP2C19*3位点处G等位基因的反应体系3G和检测CYP2C19*3位点处A等位基因的反应体系3A。反应体系2G中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-2G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、羟基萘酚蓝和甜菜碱；反应体系2A中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-2A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、羟基萘酚蓝和甜菜碱；反应体系3G中包括F3′、B3′、FIP′、BIP′、PNA-3G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、羟基萘酚蓝和甜菜碱；反应体系3A中包括F3′、B3′、FIP′、BIP′、PNA-3A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、羟基萘酚蓝和甜菜碱。
四个反应体系中各组分的浓度可按正常LAMP反应的浓度设置，作为一种实施方案，四个反应体系中：F3、B3、F3′和B3′的浓度相同，均为0.4μM；FIP、BIP、FIP′和BIP′的浓度相同，均为1.6μM，相应肽核酸序列的浓度相同，均为0.4μM；dNTP的浓度相同，均为1.4mM；Bst聚合酶的浓度相同，均为8U；缓冲液的浓度相同，均包括：Tris-HCl20mM，KCl 50mM，(NH4)2SO4 10mM，MgSO4 4mM，Tween-20 0.1％(体积分数)；羟基萘酚蓝的浓度相同，均为120μM；甜菜碱的浓度相同，均为0.8M。
一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的方法，其使用上述检测的试剂盒，包括如下步骤：抽取静脉血，以EDTA抗凝管保存；用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为检测的模板，以超纯水代替模板做阴性对照；采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体系2G、2A、3G和3A中，于60℃下反应，然后升温至80℃保持20min进行酶灭活处理，之后自然降温，观察体系颜色变化。优选地，所述反应时间为60～80min。
具体实施时，抽取8个人1ml静脉血以EDTA抗凝管保存，分为两组，一组用于检测CYP2C19*2，记为M1，M2，M3和M4，另有一以超纯水代替模板的阴性对照，记为M5；另一组用于检测CYP2C19*3，记为M6，M7，M8和M9，另有一以超纯水代替模板的阴性对照，记为M10。每管取200ul血液，用全式金或者其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组DNA作为检测的模板。对模板Mn(n为组别编号，n为1-10)进行LAMP反应，将模板M1-M5分别加入到反应体系2G和2A中，将模板M6-M10分别加入到反应体系3G和3A中，各反应体系于60℃下反应60min，然后升温至80℃保持20min进行酶灭活处理，之后自然降温，观察体系颜色变化。
利用检测试剂盒对模板Mn进行检测，作为一种实施方式，检测试剂盒的四个反应体系各为25μL，其内的组分和含量如下表1-表4所示：
表1反应体系2G的组分和含量
表2反应体系2A的组分和含量
表3反应体系3G的组分和含量
表4反应体系3A的组分和含量
反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别反应体系的颜色及基因型判断如下表5-6所示：
表5 CYP2C19*2各组别反应体系的颜色及基因型判断
表6 CYP2C19*3各组别反应体系的颜色及基因型判断
为进一步验证反应的准确性，将上述8个实验组别的模板M1-M4、M6-M9分别用PCR测序法进行分型，得到的测序图谱参见图1-图8。
对比基因测序图谱和本发明提供的检测的试剂盒的检测结果可知，二者的检测吻合率100％，验证了本发明的结果精确。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (14)

1.一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的引物组合物，其特征在于：包括如下八条引物和四条肽核酸序列：
5’-AGTTTTAAATTACAACCAGAGCT-3’(SEQ ID No.1，以下简称F3)；
5’-TGATGTCCATCGATTCTTGG-3’(SEQ ID No.2，以下简称B3)；
5’-GGAAAATTATTGCATATCTAAGAGAAAACAATAATTTATGCATATTGTATCTATACCTTTATTAAATGC-3’(SEQ ID No.3，以下简称FIP)；
5’-GGAACCCATAACAAATTACTTAAAAACCTTTCTTTTACTTTCTCCAAAATATCACT-3’(SEQ IDNo.4，以下简称BIP)；
5’-AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3’(SEQ ID No.5，以下简称F3′)；
5’-ATGGCTGTCTAGGCAAGA-3’(SEQ ID No.6，以下简称B3′)；
5’-GAAGCAAAAAACTTGGCCTTACCTATTGAATGAAAACATCAGGATTG-3’(SEQ ID No.7，以下简称FIP′)；
5’-ACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGGTAGTATTCAAAAATGTACTTCAGG-3’(SEQ ID No.8，以下简称BIP′)；以及
用于封闭CYP2C19*2位点处G等位基因的肽核酸序列：
5’-CATTGATTATTTCCCG-3’(SEQ ID No.9，以下简称PNA-2G)；
用于封闭CYP2C19*2位点处A等位基因的肽核酸序列：
5’-CAGGAACCCATAACA-3’(SEQ ID No.10，以下简称PNA-2A)；
用于封闭CYP2C19*3位点处G等位基因的肽核酸序列：
5’-TAAGCACCCCCTGGAT-3’(SEQ ID No.11，以下简称PNA-3G)；
用于封闭CYP2C19*3位点处A等位基因的肽核酸序列：
5’-TAAGCACCCCCTGAAT-3’(SEQ ID No.12，以下简称PNA-3A)；
其中，F3、B3、FIP和BIP为检测CYP2C19*2的引物，F3′、B3′、FIP′和BIP′为检测CYP2C19*3的引物。
2.一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物和肽核酸序列。
3.根据权利要求2所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
4.根据权利要求3所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述检测的试剂盒分为检测CYP2C19*2位点处G等位基因的反应体系2G，检测CYP2C19*2位点处A等位基因的反应体系2A，检测CYP2C19*3位点处G等位基因的反应体系3G，检测CYP2C19*3位点处A等位基因的反应体系3A：
反应体系2G中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-2G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水；
反应体系2A中包括F3、B3、FIP、BIP、PNA-2A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水；
反应体系3G中包括F3′、B3′、FIP′、BIP′、PNA-3G、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水；
反应体系3A中包括F3′、B3′、FIP′、BIP′、PNA-3A、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。
5.根据权利要求4所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述反应体系2G、2A、3G和3A中还包括用于显示体系颜色的指示剂。
6.根据权利要求5所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述指示剂为羟基萘酚蓝。
7.根据权利要求6所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述指示剂在反应体系2G、2A、3G和3A中的浓度相同，羟基萘酚蓝的浓度为120μM。
8.根据权利要求4所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述反应体系2G、2A、3G和3A中还包括添加剂，所述添加剂在四个反应体系中的浓度一致。
9.根据权利要求8所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为0.8M。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述反应体系2G、2A、3G和3A中缓冲液的浓度相同，均包括：Tris-HCl 20mM，KCl50mM，(NH4)2SO4 10mM，MgSO4 4mM，Tween-20 0.1％(体积分数)。
11.根据权利要求4-9中任一项所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述反应体系2G、2A、3G和3A中F3、B3、F3′和B3′的浓度相同，均为0.4μM；FIP、BIP、FIP′和BIP′的浓度相同，均为1.6μM；所述反应体系2G、2A、3G和3A中相应肽核酸序列的浓度相同，均为0.4μM。
12.根据权利要求4-9中任一项所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述反应体系2G、2A、3G和3A中dNTP的浓度相同，均为1.4mM；所述反应体系2G、2A、3G和3A中Bst聚合酶的浓度相同，均为8U。
13.一种CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的方法，使用权利要求3-12任一所述的检测的试剂盒，其特征在于：包括如下步骤：
(1)抽取静脉血，以EDTA抗凝管保存；
(2)用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为检测的模板，同时以超纯水代替模板做阴性对照；
(3)采用PNA Clamp LAMP技术，进行LAMP反应，将模板和超纯水分别加入到反应体系2G、2A、3G和3A中，于60℃下反应，然后升温至80℃保持20min进行酶灭活处理，之后自然降温，观察体系颜色变化。
14.根据权利要求13所述的CYP2C19*2和CYP2C19*3多态性检测的方法，其特征在于：所述反应时间为60～80min。
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