KR20120007583A

KR20120007583A - Ｃｙｐ２ｃ１９의 유전적 다형성을 이용한 보리코나졸의 효력 예측방법

Info

Publication number: KR20120007583A
Application number: KR1020100068199A
Authority: KR
Inventors: 김승희; 한순영; 정면우; 나한성; 신희정; 박현주; 강태선
Original assignee: 대한민국 (식품의약품안전청장)
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2012-01-25
Also published as: KR101190602B1

Abstract

본 발명은 시토크롬 P450 2C19(CYP2C19)를 암호화하는 유전자의 일배체형 분석방법, 분석키트 및 이를 이용한 CYP2C19 효소의 활성예측방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국인의 CYP2C19 유전자에 위치한 기존에 알려진 단일염기다형성(SNP)에 더하여 신규의 SNP를 추가 발굴하여, 특정 일배체형(Haplotype) 정보를 확보하였는 바, 이 일배체형을 분석할 수 있는 프라이머를 이용한 일배체형 분석방법, 분석키트 및 이를 이용하여 CYP2C19 효소의 활성을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 보리코나졸 대사에 관여하는 CYP2C19의 약물대사효소 활성 지표로서 일배체형을 제공할 수 있으며, 유사약물의 약동 및 약력학적 특성을 파악함으로써 CYP2C19에 의해 대사되는 의약품의 평가 및 가교시험에 대한 지표로서 활용할 수 있다.

Description

ＣＹＰ２Ｃ１９의 유전적 다형성을 이용한 보리코나졸의 효력 예측방법{METHODS FOR PREDICTING PHARMACOKINETICS OF VORICONAZOLE USING GENETIC POLYMORPHISM OF CYP2C19}

본 발명은 시토크롬 P450 2C19(CYP2C19)를 암호화하는 유전자의 일배체형 분석방법, 분석키트 및 이를 이용한 CYP2C19 효소의 활성예측방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국인의 CYP2C19 유전자에 위치한 기존에 알려진 단일염기다형성(SNP)에 더하여 신규의 SNP를 추가 발굴하여, 특정 일배체형(Haplotype) 정보를 확보하였는 바, 이 일배체형을 분석할 수 있는 프라이머를 이용한 일배체형 분석방법, 분석키트 및 이를 이용하여 CYP2C19 효소의 활성을 예측하는 방법에 관한 것이다.

인종과 민족간에 약물반응과 관련한 유전자의 변이 및 그 빈도가 다르게 나타나며, 이에 따라 인종과 민족간의 약물반응이 다르게 나타남은 잘 알려져 있는 사실이다. 따라서 외국의 데이터와는 별도로 한국인에서의 약물유전정보를 확보하고 이 유전자 타입에 따른 약물반응의 차이를 규명하는 것은 한국인에서 약물복용의 안전성과 유효성을 제고하기 위하여 매우 중요한 일이다.

시토크롬 P450(Cytochrome P450; CYP) 효소는 약물의 체내 동태에 영향을 미치는 효소로서 약물의 효능과 독성을 나타내는 데에 중요하게 작용한다. CYP는 여러 종류의 이종효소가 존재하며 약물대사에 관여하는 주 효소로는 CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 등이 있다.

CYP2C19의 기질 약물로는 항진균제(voriconazole), 항궤양제(omeprazole, lansoprazole 등), 항경련제(S-mephenytoin 등), 당뇨병치료제(tolbutamide 등) 및 진정제(diazepam 등)가 있다. 하기와 같이, 보리코나졸(voriconazole)은 항진균제로 CYP2C19에 의해 N-옥사이드 보리코나졸로 대사되고, CYP3A4에 의해 4-OH-보리코나졸로 대사된다.

항진균제인 보리코나졸의 경우 침습성 아스퍼길러스(aspergillus) 감염에 대한 치료에 사용되는데, 이는 Scedosporium apiospermum과 Fusarium 속에 의한 중증 진균감염 중 다른 치료법에 대해 내약성이 나쁘거나 불응성인 환자에 대한 치료에 사용된다. 이 약물은 CYP을 매개하여 이루어지는 12-a-스테롤 디메틸레이션을 억제함으로써 진균세포의 세포막 생성과 세포의 성장에 필수적인 에르고스테롤의 생합성 과정 중 중요한 단계의 진행을 차단하여 작용하기 때문에, 주 대사경로인 CYP2C19 효소의 활성에 많은 영향을 끼칠 것으로 생각된다.

CYP2C19 효소는 유전적인 다형성을 가지고 있어 유전자의 변이는 대상효소의 활성에 영향을 미치게 되는데, 이는 수많은 약물의 대사에서 개인간, 민족간의 약물반응 차이를 나타내게 한다. 보리코나졸의 경우, CYP2C19의 유전형에 따라 혈중농도의 차이를 보이는 데, CYP2C19의 효소 활성 감소로 인한 느린대사(PM)의 빈도는 코카시안의 경우 3% 정도이지만, 중국인의 경우 20%, 한국인의 경우 13%, 일본인의 경우 18-23%로 민족간 차이를 보인다((Roh 등, 2004; Furuta 등, 1999).

CYP2C19 유전자에 대해서는 이미 많이 알려진 바와 같이 common SNPs으로 681G>A (splicing defect, 이하 CYP2C19*2 allele) 및 636G>A (W212X, 이하 CYP2C19*3 allele)가 있다. CYP2C19*2 allele은 동양인과 서양인에서의 빈도가 유사하나, CYP2C19*3 allele은 동양인에서 주로 보고되었으며, 서양인에서는 드물게 나타난다. 상기한 유전다형성은 활성이 없는 효소 단백질을 생성하고 이는 특히 일본인에서의 PM alleles의 99% 이상을 차지하는 것으로 보고되었다. 최근에는 CYP2C19 유전자의 전사조절부위(transcriptional regulatory regions)를 분석에 포함시키는 등 보다 광범위한 연구가 진행되고 있다.

이와 같이, 인종간 유전적 다형성의 차이가 큰 CYP2C19 효소에 영향을 받는 프로브(probe) 약물로서 보리코나졸을 사용하여, 한국인에서의 약동학적 특성과 유전자변이, 특히 일배체형(Haplotype)과의 상관성 규명을 통하여 가교시험 및 수입신약의 사용시 안전성 및 유효성을 확보할 필요가 있다.

일배체형이란, 하나의 집단 내에서 발견된 여러 부위의 단일염기다형성(SNP)을 통계학적인 개연성에 근거하여 조합한 유전형으로, 개개의 단일염기다형성보다 더 정확하고 신뢰할 수 있는 기능성 유전정보를 제공한다. 이러한 일배체형의 정보는 한국인에서 다빈도로 존재하는 유전형을 대표할 수 있으며 일배체형을 구성하는 SNP간에 강한 연관관계가 존재하기 때문에 세대를 거듭해도 유전형의 변화 없이 일정하게 유지되는 장점을 지니고 있다. 일배체형을 이용한 상관성연구는 개별 SNP 정보만으로는 확인하기 어려운 결과를 SNP의 조합을 통해 분석할 수 있다. 효소의 활성정도 및 이에 따른 대사율과 상관성이 존재하는 일배체형이 규명되면 일배체형 내의 SNP 중 어떤 SNP가 효소 활성 변화의 원인이 되는 단일염기다형성(causative SNP)인지 선별할 수 있는 가능성을 제공해 줄 수 있다. 따라서, 향후 약물반응을 예측하기 위한 알고리즘 개발 및 개인맞춤약물요법을 수행하는데 있어 매우 중요한 자료로서 활용될 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 한국인의 CYP2C19 유전자의 신규의 단일염기다형성(SNP)을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 한국인의 CYP2C19 유전자의 신규의 일배체형을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 한국인의 CYP2C19 유전자의 일배체형을 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 한국인의 CYP2C19 유전자의 일배체형을 분석할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 발명에 근거하여 한국인의 CYP2C19 효소의 활성 및 이에 따른 기질의 대사율을 예측할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

(a) 게놈 DNA로부터 시토크롬 P450 2C19(CYP2C19)를 암호화하는 유전자의 프로모터, 엑손 4, 엑손 5, 인트론 5 및 인트론 7을 수득하여 이들 각각의 염기서열을 결정하는 단계;

(b) 상기 결정된 각 염기서열에서 하기의 단일염기다형성(SNP)의 존재여부를 검출하는 단계; 및

1. rs11568732 : 프로모터의 -889번 염기(서열번호 1의 2112번째 염기) T가 G로 변이

2. rs4986894 : 프로모터의 -98번 염기(서열번호 1의 2903번째 염기) T가 C로 변이

3. rs4986893 : 엑손 4번이 암호화하는 단백질의 636번 염기(서열번호 2의 155번째 염기) G가 A로 변이

4. rs4244285 : 엑손 5번이 암호화하는 단백질의 681번 염기(서열번호 3의 39번째 염기) G가 A로 변이

5. rs4417205 : 인트론 5번의 -51번 염기(서열번호 4의 38448번째 염기) C가 G 로 변이

6. rs4917623 : 인트론 7번의 -106번 염기(서열번호 5의 6787번째 염기) T가 C 로 변이

(c) 상기 검출된 SNP를 이용하여 하기의 H1 내지 H3에서 선택되는 일배체형을 동정하는 단계; 및

(d) 상기 동정된 일배체형을 염기쌍으로 조합하여 3종의 일배체형 조합군 EM(Extensive Metabolizer), 헤테로 EM(Hetero Extensive Metabolizer) 및 PM(Poor Metabolizer)중 어느 군에 속하는지를 결정하는 단계(이때, EM군에는 H1/H1의 일배체형쌍이 속하고, 헤테로 EM군에는 H1/H2와 H1/H3의 일배체형쌍이 속하고, PM군에는 H2/H2, H2/H3 및 H3/H3의 일배체형쌍이 속한다)를 포함하는, CYP2C19 유전자의 일배체형 분석방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)에서 염기서열을 결정하는 방법은, CYP2C19를 암호화하는 유전자의 프로모터, 엑손 4, 엑손 5, 인트론 5 및 인트론 7을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 행하는 직접 염기서열분석법(direct sequencing)인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 프로모터 -889번 염기에 대하여는 서열번호 6 및 7; 프로모터 -98번 염기에 대하여는 서열번호 8 및 9; 엑손 4번이 암호화하는 단백질의 636번 염기에 대하여는 서열번호 10 및 11; 엑손 5번이 암호화하는 단백질의 681번 염기에 대하여는 서열번호 12 및 13; 인트론 5번의 -51번 염기에 대하여는 서열번호 14 및 15; 인트론 7의 -106번 염기에 대하여는 서열번호 16 및 17의 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은, 상기의 단일염기다형성(SNP) 및 일배체형의 종류를 분석할 수 있는 프라이머를 포함하는, CYP2C19 유전자의 일배체형 분석키트를 제공한다.

또한, 본 발명은, 하기의 단계를 포함하는 CYP2C19 효소의 활성을 예측하는 방법을 제공한다.

상기 분석키트를 이용하여, 피험자의 CYP2C19 유전자가 하기의 일배체형 H1 내지 H3 중 어느 것에 해당하는지 확인하는 단계; 및

(b) 상기 확인된 일배체형을 염기쌍으로 조합하여 3종의 일배체형 조합군 EM(Extensive Metabolizer), 헤테로 EM(Hetero Extensive Metabolizer) 및 PM(Poor Metabolizer)중 어느 군에 속하는지를 결정하는 단계(이때, EM군에는 H1/H1의 일배체형쌍이 속하고, 헤테로 EM군에는 H1/H2와 H1/H3의 일배체형쌍이 속하고, PM군에는 H2/H2, H2/H3 및 H3/H3의 일배체형쌍이 속한다),

(c) 상기 확인된 일배체형 조합군의 정보를 이용하여, CYP2C19 효소의 활성을 예측하는 단계.

본 발명자는, 보리코나졸 대사에 관여하는 약물대사효소인 CYP2C19 유전자의 일배체형(haplotype)에 따른 보리코나졸의 대사특성을 통해 한국인에서 약물대사효소의 활성 지표를 발굴하고자, 한국인 성인 남녀 401명을 대상으로 동양인에서 느린대사군(poor metabolizer, PM)과 관련이 있는 CYP2C19 유전자의 SNPs를 검색하였다.

또한, 일배체형쌍(조합)인 EM(Extensive Metabolizer), 헤테로 EM(Hetero Extensive Metabolizer), PM(Poor Metabolizer)에 따라 CYP2C19의 주요 기질 약물인 보리코나졸을 경구투여한 후 보리코나졸과 대사체 N-옥사이드 보리코나졸의 혈장 농도를 HPLC-UV(PDA) 검출기를 이용하여 동시 정량하였다.

6종의 SNPs에 대한 일배체형 분석 결과, 주요 일배체형은 H1, H2 및 H3로 각각 52.74%, 25.69% 및 11.72%의 빈도로 나타났다. 또한, 대사율을 비교하였을 때, 보리코나졸의 N-옥사이드 보리코나졸로의 대사는 H1군이 H2 및 H3군에 비해 현저하게 높게 나타난 것으로 보아, EM군에서의 보리코나졸의 대사가 빠르게 나타남을 알 수 있었다.

대사율과 관련하여, 일배체형 조합에 따른 혈장 중 약물농도를 측정하여 약물속도론적 파라미터를 분석한 결과, 전체적으로는 보리코나졸의AUC_0→∞, T_1/2F은 군 간의 유의적인 차가 나타났으며, CYP2C19에 의해 형성된 대사산물(N-옥사이드 보리코나졸)은 C_max 및 T_1/2에서 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.001).

즉, 보리코나졸의 AUC_0→∞와 T_1/2 는 유전자 변이가 없는 EM군과 비교하여 PM군에서 의미있는 증가가 관찰되었고, 헤테로 EM군에서는 AUC_0→∞가 EM군에 비해 평균 2배 가량, PM군에서는 AUC_0→∞가 EM군에 비해 평균 3배 가량 증가경향을 보였으며, 유의적인 차가 나타났다(p<0.001). PM군에서 T_1/2 는 EM군에 비해 평균 2배 가량 증가경향을 보였다. N-옥사이드 보리코나졸의 경우 EM군에서 C_max 는 PM군에 비해 평균 2배 가량 증가경향을 보였으며, PM군에서 T_1/2는 평균 3배 가량 증가경향을 보였다.

본 발명에 의하면, 보리코나졸 대사에 관여하는 CYP2C19의 약물대사효소 활성 지표로서 일배체형을 제공할 수 있으며, 유사약물의 약동 및 약력학적 특성을 파악함으로써 CYP2C19에 의해 대사되는 의약품의 평가 및 가교시험에 대한 지표로서 활용할 수 있다.

도 1은 CYP2C19 유전자의 3가지 유형의 일배체형 조합군 EM(H1/H1), Hetero EM(H1/H2, H1/H3), PM(H2/H2, H2/H3, H3/H3)의 피험자에게 보리코나졸을 투여하고, 시간의 경과에 따른 보리코나졸의 혈장농도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 CYP2C19 유전자의 3가지 유형의 일배체형 조합군 EM(H1/H1), Hetero EM(H1/H2, H1/H3), PM(H2/H2, H2/H3, H3/H3)의 피험자에게 보리코나졸을 투여하고, 시간의 경과에 따른 보리코나졸의 대사산물인 N-옥시드 보리코나졸(Voriconazole N-oxide)의 혈장농도의 변화를 나타내는 그래프이다.

실시예 1: 피검자의 게놈 DNA 추출

건강한 피험자 401명을 대상으로 말초혈액을 채취하고, 추후 데이터 처리를 위하여 나이, 성별, 체중, 신장 등에 관한 정보를 제공받았다. 채취된 혈액을 2,500rpm에서 10분간 원심분리하여 연막(buffy coat)을 분리하고, DNA 정제 키트(Promega Ltd., USA)를 이용하여 연막 300㎕로부터 게놈 DNA를 추출하였다. UV 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 260nm 및 280nm에서 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 측정하였다.

실시예 2: CYP2C19 유전자 부위의 선택적 증폭 및 SNP 위치 확인

CYP2C19 유전자에 대하여 MAF가 5% 이상인 기존에 알려진 11개의 SNPs 중에서 한국인의 빈도가 높은 일배체형인 H1, H2, H3을 구분할 수 있는 6개의 SNPs를 선정하여 분석하였다(표 1).

우선, CYP2C19 유전자의 프로모터, 엑손 4, 엑손 5, 인트론 5 및 인트론 7 부위를 증폭하기 위해, 실시예 1에서 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하고, SNP 유전형 분석키트(SNaPshot^TM Assay Kit; TaqMan^TM Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems, Inc., USA)에 포함된 각 부위에 특이적인 프라이머(서열번호 6 내지 17)를 사용하여 PCR을 수행(95℃: 30초, 60℃:1분, 72℃: 1분, 35cycle)한 후, CYP2C19 유전자의 상기 각 부위를 각각 증폭시켰다. 상기 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

상기 증폭된 각 유전자 단편을 주형으로 하고, 상기 SNP 유전형 분석키트에 포함된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음(95℃: 10분, 95℃: 15초, 60℃: 1분, 45cycle), 자동 염기서열 분석기(7900HT Fast Real Time PCR System, Applied Biosystems, USA)에 적용하여, 각각의 염기서열을 분석하였다.

분석된 각각의 염기서열을 염기서열 분석용 컴퓨터 프로그램(Polyphred, University of Washington, USA)에 적용하여, 각 유전자 단편의 염기에 단일염기다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)이 존재하는지의 여부를 확인하였다. 그 결과 하기 표 1과 같이 CYP2C19 경우 6종의 SNP가 존재함을 확인하였다.

[표 1]

상기 표 1에서, rs.No는 NCBI dbSNP에 공식적으로 등록되어 등록번호를 부여 받은 SNP의 번호를 나타내고; 위치는 SNP가 존재하는 유전자의 영역을 나타내며; MAF(minor allele frequency)는 두개의 대립유전자 중 변이형이 나타나는 빈도수를 나타낸다.

실시예 3: 연관분석 및 일배체형의 결정

상기 실시예 2에서 확인된 CYP2C19 유전자의 각 SNP 상호간의 연관불균형(linkage disequilibirum, LD) 정도를 분석하고자, 컴퓨터 분석 프로그램인 Phase 2.0(GNU General Public, USA)을 이용하여, 상기 SNP 데이터에 의한 연관불균형 계수(linkage disequilibrium coefficient, LD coefficient)를 산출하고, 이를 이용하여 SNP 상호간의 연관불균형(linkage disequilibirum, LD) 정도를 분석하여 연관군을 결정하였으며, 상기 연관군에 내에 존재하는 각 SNP를 분석하여 9개의 일배체형을 결정하였다(표 2).

[표 2] CYP2C19 유전자의 일배체형

상기 표 2에서,

-889T/G는 프로모터의 -889번 염기(서열번호 1의 2112번째 염기) T가 G로 변이됨을 나타내고,

-98T/C는 프로모터의 -98번 염기(서열번호 1의 2903번째 염기) T가 C로 변이됨을 나타내고,

636G/A는 엑손 4가 암호화하는 단백질의 636번 염기(서열번호 2의 155번째 염기) G가 A로 변이됨을 나타내고, 이는 또한 W212X로 표시될 수 있는 데 엑손 4가 암호화하는 단백질의 212번 아미노산인 트립토판을 암호화하는 코돈이 정지코돈으로 변이됨을 나타내며,

681G/A는 엑손 5가 암호화하는 단백질의 681번 염기(서열번호 3의 39번째 염기) G가 A로 변이됨을 나타내고, 이는 또한 P227P로 표시될 수 있는 데 엑손 5가 암호화하는 단백질의 227번 아미노산인 프롤린을 암호화하는 코돈의 염기 G가 A로 변이됨을 나타내며,

IVS5-51C/G는 인트론 5의 -51번 염기(서열번호 4의 38448번째 염기) C가 G로 변이됨을 나타내고,

IVS7-106T/C는 인트론 7의 -106번 염기(서열번호 5의 6787번째 염기) T가 C로 변이됨을 나타낸다.

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 일배체형 중에서 H1, H2 및 H3의 총 빈도는 약 90.1%를 나타내고, 그 중에서도 H1이 가장 높은 빈도를 나타내었으므로, SNP가 존재하는 유전자 중에서 이들 3종류의 일배체형이 염기쌍으로 조합된 유전자의 빈도를 측정하였다(표 3). 하기 표 3에서 확인할 수 있듯이, H1을 포함하는 조합의 염기쌍의 빈도가 가장 높은 수준(68.6%)을 나타내었다.

[표 3] CYP2C19 유전자의 일배체형 조합의 빈도

이에 따라, 3가지 유형의 일배체형 조합군으로서 각각 다음과 같이 분류하였다.

EM(Extensive Metabolizer): H1/H1,

Hetero EM(Hetero Extensive Metabolizer): H1/H2, H1/H3,

PM(Poor Metabolizer): H2/H2, H2/H3, H3/H3

실시예 4: 인체내 보리코나졸 대사실험(CYP2C19 효소활성 실험)

1) 혈장의 수득

상기 실시예 3의 표 3에서 결정된 CYP2C19 유전자의 일배체형 조합군 EM(H1/H1), Hetero EM(H1/H2, H1/H3), PM(H2/H2, H2/H3, H3/H3)를 갖는 피험자에게 보리코나졸 400mg(Vfend®, Pfizer)을 1회 경구투약하였으며, 투약 직전, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 25, 33, 36 및 48시간 간격으로 총 15시점 채혈하고, 원심분리하여 각각의 혈장을 수득하였다.

2) 혈장 중 보리코나졸 농도의 분석

보리코나졸 및 N-옥시드 보리코나졸을 메탄올에 용해시켜 각각 1,000㎍/mL의 용액을 수득하고, 상기 각 용액을 보리코나졸이 투여되지 않은 정상인으로부터 수득한 혈장으로 희석하여, 최종 보리코나졸 및 N-옥시드 보리코나졸의 농도가 50, 100, 200, 500, 1000, 4000 및 10000ng/mL가 되도록 각각의 검량선용 표준혈장액을 제조하였다.

상기 수득한 각 표준혈장액 200μL에 내부표준액(케토코나졸 20000ng/mL) 50μL를 넣고 10초간 혼합하고, 1.5mL의 추출액(헥산:메틸렌클로라이드 = 70:30, v/v)을 가하여 10초간 다시 혼합한 다음, 60분간 흔들어 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층(유기용매층)을 수득하고, 40℃에서 증발건조시킨 다음, 분석 이동상(염화칼륨인산염(pH 6.0, 0.04M) : 아세토니트릴 : 3차 증류수 = 45:52.5:2.5, v/v) 200μL에 용해시키고, 0.45μm의 기공을 갖는 필터로 여과한 후, 20μL를 HPLC(Nanospace SI-2, Shiseido, JAPAN)에 적용하였다. 이때, 사용한 분석 칼럼으로는 SP Column C18 MG II (250×1.5mm, 5㎛)을 사용하였으며, 분석 온도는 40℃였다. 또한, 분석 이동상의 유속은 0.2mL/min, 모든 검체는 UV 260nm에서 검출하고, 이로부터 얻은 내부표준물질의 피크면적에 대한 보리코나졸 및 N-옥시드 보리코나졸의 피크 면적비를 갖고 표준 검량선을 작성하였다.

한편, 상기 실시예 4에서 수득한 각 혈장 200μL를 이용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 각 혈장에 포함된 보리코나졸 및 N-옥시드 보리코나졸의 UV 260nm에서 검출값을 수득하였으며, 이를 상기 작성한 표준 검량선에 대입하여, 각 혈장에 포함된 보리코나졸 및 N-옥시드 보리코나졸의 농도를 산출하였다(도 1 내지 도 2).

도 1은 CYP2C19 유전자의 3가지 유형의 일배체형 조합군 EM(H1/H1), Hetero EM(H1/H2, H1/H3), PM(H2/H2, H2/H3, H3/H3)의 피험자에게 보리코나졸을 투여하고, 시간의 경과에 따른 보리코나졸의 혈장농도의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 2는 상기 3가지 유형의 일배체형 조합군의 피험자에게 보리코나졸을 투여하고, 시간의 경과에 따른 보리코나졸의 대사산물인 N-옥시드 보리코나졸의 혈장농도의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 1 내지 2에서 알 수 있듯이, 보리코나졸의 N-옥시드 보리코나졸로의 대사는 EM군(H1/H1)이 Hetero EM군(H1/H2, H1/H3) 및 PM군(H2/H2, H2/H3, H3/H3)에 비해 현저하게 높게 나타났으며, 각각 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다(P<0.0001).

3) 보리코나졸의 약물속도론적 분석

정상인 39명을 대상으로 시험하여 얻은 혈장 중 보리코나졸 및 N-옥시드 보리코나졸의 최고 혈중농도(C_max), 최고 혈중농도 도달시간(T_max), 혈중 약물농도 곡선 하 면적(AUC_0→∞) 및 생체내 반감기(T_1/2) 등을 통계분석용 컴퓨터 프로그램(WinNonlin v.5.2, Washington Univ., USA; BE-Calc v.2007)을 이용하여 산출하였다(표 4 내지 5).

[표 4] 보리코나졸의 각 일배체형 조합군에 따른 약물속도론적 분석결과

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 보리코나졸의 AUC_0→∞는 Hetero EM군이 EM군보다 평균 약 2배 가량 높게 나타났고, PM군이 EM군과 Hetero EM군에 비해 유의하게 증가하였다. C_max와 t_max는 EM군, Hetero EM군, PM군에서 각각 유의한 차이가 없었고, t_1/2는 EM군에 비해 PM군에서 평균 약 2배 가량 유의하게 증가하였다.

[표 5] N-옥시드 보리코나졸의 각 일배체형 조합군에 따른 약물속도론적 분석결과

상기 표 5에 나타난 바와 같이, N-옥시드 보리코나졸의 AUC_0→∞와 t_max는 EM군, Hetero EM군, PM군에서 각각 유의한 차이가 없었고, C_max는 Hetero EM군이 EM군보다 다소 낮게 나타났고, PM군이 EM군, Hetero EM군에 비해 유의하게 감소하였다. 또한, t_1/2는 EM군에 비해 Hetero EM군에서 다소 높게 나타났으며, PM군에서는 EM군보다 평균 약 3배 증가하였으며, EM군과 Hetero EM군에서 보다 각각 유의하게 증가하였다

상기 표 4 내지 5의 결과로부터, CYP2C19 일배체형의 조합군별 혈장 중 약물농도를 측정하여 약물속도론적 파라미터를 분석하여 비교한 결과, 전체적으로는 보리코나졸의 AUC_0→∞, T_1/2는 군 간의 유의적인 차가 나타났으며, CYP2C19에 의해 형성된 대사산물(N-옥시드 보리코나졸)은 C_max 및 T_1/2에서 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.05).

실시예 5: CYP2C19 유전자의 일배체형 분석키트 제작

실시예 4의 결과로부터, 보리코나졸을 대사하는 효소인 CYP2C19를 암호화하는 유전자에 존재하는 연관된 SNP를 포함하는 일배체형을 각 그룹으로 분류할 경우, 분류된 그룹별로 보리코나졸의 대사정도, 즉 CYP2C19의 효소활성 정도가 각각 상이하게 나타남을 확인할 수 있었다.

이에, 일배체형에 따른 CYP2C19 단백질의 효소활성을 예측하고자, 피험자에서 CYP2C19 유전자에 존재하는 SNP 및 일배체형을 분석할 수 있는 키트를 제작하였다. 이를 위해, 하기의 SNP 및 일배체형을 검출하기 위하여 프로모터, 엑손 4, 엑손 5, 인트론 5 및 인트론 7을 각각 PCR 증폭한 후 염기서열을 결정하기 위한 프라이머로서 서열번호 6 내지 17의 프라이머를 각각 합성하여, 이를 키트에 포함시켰다.

<110> Korea Food and Drug Administration <120> METHODS FOR PREDICTING PHARMACOKINETICS OF VORICONAZOLE USING GENETIC POLYMORPHISM OF CYP2C19 <130> KR10P0547 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3000 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(3000) <223> promoter of CYP2C19 gene <400> 1 caatagataa atgaatagac aacatggtaa acctatacaa tgaatgttat ttagtgttaa 60 aagaaatgaa ctatcaagcc atgaaaagac atggagaaat tttatacata ttagtaagtt 120 aaatcttaaa aggctacata ctgtatgatt ccaaacatat gacattctgg aaaaggcaaa 180 actatgccaa cactgcaaag attatttgtt gctagggctc gtgaggaaga gagggtgaac 240 aggtagagca cagagggttt taagggcagt aaagctattt tatatgatac tacaatggtg 300 gatacatgtc attatgcatt agtcaaatcc catagaatgt acaacacaaa gaatgaaccc 360 cacagaaact atgagctttg gttgttgatg tgtcaatgtt ggttcattga ttgtaaccta 420 tgagagttct tgattgtgag aggctgtgtg tgggtgcagg gaaagaggca tgtggtaatt 480 atatactttc cactttccac ttagtgttgc tggaaacccc aaactgctgt taagaaatac 540 atttttctaa agcctacttt aacccaccat tctagtcaag ctgaggtttg tattacccag 600 tgactgtgga gggcttaatg ttgatactcc cctgatcact tggactgaga tgtgaattct 660 atgagacggg atgtgatatg tcactgaact gggagttgaa aaactgtgat tctaagtctt 720 atactgaggc attgtgatac tttgtctcac tgagtcaaca attgctcatt taaaaaaaaa 780 atcaattcct gtttagaata gttgatctca gagatccctt ttgtcttcaa attatctata 840 attctttcat agtataaact gaaagatcta gggaggagcc tcaacttagc agaagagagg 900 aggagcagaa ctggaacacc tagctctcaa ggaatgaaat gattattcta aagagagcaa 960 ccaagcttat cttacccaaa ctaaggtagt atatttctgt tagagtttaa agttacgtga 1020 gtcagggacc aagttattgc ttttctttgc cctgtataaa gggttctcca aggccttgga 1080 ctcacccaag tactaaaggt tataaaacca aactcttctg acccccaatc tagtcaactt 1140 gggctgtaat tattaatgaa attaatattt attttgaaaa tcatttacta gactgaatca 1200 cgaaatactg aaccattgta cacaatcagt aaatatctgt ggactcaatt gaactgaatg 1260 ttttgcttga aatgaaacct tcaagatgca gggcttatga attctagtct cagctctagc 1320 accagcagac accatgttct tggctacagt actgaatctt caaggctcag cctcctcatt 1380 cctgagatgg gtcaatttta ttgtaagcaa aggcaattga gagattccaa agggatatga 1440 ggtgtgagaa ttctctctaa atggggttag aatccctgtt aaaaatgacc agtgaaacat 1500 tgtgcaattg tgtcttaaca taacttactt tttcttaata agagaactgg aaataacctc 1560 attaggaaat ttagaacaaa tacgatgata tctttaaaga aaatggcttt gtgtaagtat 1620 tgtcgttagt gatctagtaa tgtgtatctt tctggttgta tttagacctt caactcaaat 1680 gtcagctccc gttaaggtct atacattgtg gtggttttgt gctgtgggtc catttagtga 1740 tttccctacc tcccatcctc tattagattc acaactgttg ttctgcccat aatttcctat 1800 gcttgctttg cattgttaca tttttttttg aaaatcagaa agcaaaatca atataaagca 1860 gccatgtctg gaggagacca ggaggtcaag aagccttagt ttctcaagcc cttagcacca 1920 aattctctga gatcagctct tccttcagtt acactgagca tttcccctct gcagtgatgg 1980 agaagggaga actcttattt tttctcatga gcatctctgg ggctgttttc cttagataaa 2040 taagtggttc tatttaatgt gaagcctgtt ttatgaacag gatgaatgtg gtatatattc 2100 agaataacta atgtttggaa gttgttttgt tttgctaaaa caaagtttta gcaaacgatt 2160 ttttttttca aatttgtgtc ttctgttctc aaagcatctc tgatgtaaga gataatgcgc 2220 cacgatgggc atcagaagac ctcagctcaa atcccagttc tgccagctat gagctgtgtg 2280 gcaccaacag gtgtcctgtt ctcccagggt ctcccttttc ccatttgaaa tataaaaaat 2340 aacaattcct gccttcacgt gtttttttag ggggttaaat ggtaaaggtg tttatatctg 2400 ctaaggtaat ttacttgata tatgtttggt tattgaagat atatgagtta tgttagctat 2460 ttcatgttta ggctgctgta tttttagtag gctatattaa atagaggatt tcattataaa 2520 ggacaaagtc tcctaatctt cgatatagga ttgacatact ttttaaatat acaaggcata 2580 gaatatggcc atttccgtta aatcataaat tcccaactgg ttattaatct aagaattcag 2640 aattttaagt aattgttttt gcatcagatt gtttacttca gtgctctcaa ttatgacggt 2700 gcattggaac cacttgggtt aacatttttt tgtttttatt accaatacct aggcttcaac 2760 ctagtacaat gaaaccagaa tgtacagagt gggcactggg acgaaggaga acaagaccaa 2820 aggacatttt atttttatct ctatcagtgg gtcaaagtcc tttcagaagg agcatatagt 2880 gggcctaggt gattggccac tttatccatc aaagaggcac acacacttaa ttagcatgga 2940 gtgttataaa aagcttggag tgcaagctca cggttgtctt aacaagagga gaaggcttca 3000 3000 <210> 2 <211> 161 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (1)..(161) <223> exon4 of CYP2C19 gene <400> 2 cttcaccctg tgatcccact ttcatcctgg gctgtgctcc ctgcaatgtg atctgctcca 60 ttattttcca gaaacgtttc gattataaag atcagcaatt tcttaacttg atggaaaaat 120 tgaatgaaaa catcaggatt gtaagcaccc cctggatcca g 161 <210> 3 <211> 177 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (1)..(177) <223> exon5 of CYP2C19 gene <400> 3 atatgcaata attttcccac tatcattgat tatttcccgg gaacccataa caaattactt 60 aaaaaccttg cttttatgga aagtgatatt ttggagaaag taaaagaaca ccaagaatcg 120 atggacatca acaaccctcg ggactttatt gattgcttcc tgatcaaaat ggagaag 177 <210> 4 <211> 38498 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(38498) <223> intron 5 of CYP2C19 gene <400> 4 gtaaaatgtt aacaaaagct tagttatgtg actgcttgcg tatttgtgat tcattgacta 60 gttttgtgtt tactacggat gtttaacagg tcaaggagta atgcttgaga agcatattta 120 agtttttatt gtatgcatga atatccagta agcatcatag aaaatgtaaa attaaattgt 180 taaataatta gaatacatag aagaaattgt ttagataaat ataatctatc tgaacaataa 240 ggatgtcagg ataggaaaag ctctgttctg cagcttccag tgagatcagc acaggaggaa 300 cttaaattta aaagaaaata aaaaacatct ccatcaaaaa gtgagtgaag gatatgaaca 360 gacacttttc aaaagaagtc attggagaaa tgcaaataaa aacaacaatg agataccatc 420 tcatgccagt tagaatggcg atcattaaaa agtcaggata taacagatgc tgaagaggat 480 gtggaaaaat agaaatgttt ttactctgtt tgtgggagcg taaattagtt caatcattgt 540 ggaaggcagt gtggcaattc ctcaaggatc tagaactaga aataccattt gacccagcaa 600 tccaattact ggatatatat ccaaaggatt ataaattatt ctattataaa gacacatgta 660 cacatttgtt tattgtgcca ctattcacaa tagccaagac ttggaatcaa cccaaatgta 720 catcaatgac agactggatt aagaaaatgt ggcacatata caccataaaa tactatggag 780 gcataaaaaa gatgaattca tgtcctctgc agggacatag atgaagctgg aagcccccac 840 tctcagtaaa ctaacacagg aacagaaaac caaacaccgt atgttctcac tcataagtgg 900 cagttgaaca atgagaacac atagacacag gatgaggaac atcacacact ggggcctgtc 960 aaggggtgga gggcttgggg agggataaca ttaagagaaa tacctaatgt agatgacaag 1020 ttcataggtg caggagacca ccatggcacg tgtgtaccta tttaacaatc ctgcacgttc 1080 tgcacatgta tcccagaact taaagtataa taataataac aataacaaaa atctacccaa 1140 ggggaaacaa aatgcaggtt ttaggtgaaa tggaagcaat tatgaacaag ttagaaaata 1200 taaaatatta tgtcatagga tgaaaatggg catcattatt gcacacagtt tattggagaa 1260 tgggaaagaa tggtttaacc taggtgggtt tcctgcattc ctgcagattg aaataggcct 1320 taaaatattt gcagtgagag tcagaagagg ggtttcagat gggttggaat gctttacatg 1380 gaggtgtaga ggtgtgtgat ggaaaagagt aggtggatgg aagagggaag gcttcattga 1440 gtgtaaacta aaatgatttg tacagataag aattggaatt tggtatctat cagataccgt 1500 gtaaacatca cctcttttgt cattgcacca tttttgaaga ggctattttt tcctcctatt 1560 gaattgtctt gacaaccttg tcaaaaccca attgactata aatgtgtgaa gggttttttt 1620 tggggggctc tcaattctac tccattgatc tatgtgtctg tcctaatgcc tatagtacac 1680 catcttgaag tcttaattac tgtacctttg tattaatatc aacttattaa atcaaggagt 1740 gtgagtcttt tgttgttctt tttcaatact gttttcacta ttctgggtcc cttgaatctt 1800 catatgaaat ttaggatcaa cttgtcaatt tcttcaaagg agccaatggg aattttgaca 1860 ggattgcatt aaatctgtag aacagggagt tatgccattt taaaaattga agtaaaattc 1920 acacaacata caattaacca gtttaaagca tacacctaag tggtatttaa tgtattcaca 1980 atgttgtgca accatcagct ttctctggtt tcaaaatgtt tttatcacgc cacaaaaacg 2040 tattatattc gctaaataat cactccattc ccccactcca tcatgtaata acctctaatc 2100 ttttttctgt ctctatgggt ttgcgtgtta tggatatata aagaattcat agcatatgca 2160 accttttatt tctgggtcct tacacttaca atgttttgga ggctcatcta agttgtagca 2220 tatatctgta cttcattctt tttgtggata aagtatattt tattttctat gcacatttat 2280 cacaaattgt tattcatctg tttgtggaca tttgcattgt ttccaacttt tggctcttat 2340 agataatctt tctttaacca tttgtgtatg tttctttatg ggcatgtttt catcattctt 2400 gggtgtattc tcaggagttg atttgctggg tcaaatggta attttatgtt tatcttcttg 2460 tataagagcc aaatttttct acagtgaatg tggcatttta tattccttcc agcaatgtag 2520 aaggatttct gtttctccac atagttgcta atacttgtaa ttttctgtgt ttattaaagc 2580 cctcctagtg aatgtaaagt ggtatctcat tatttattta tttatttatt tattttgaga 2640 cagagtctca ctctgttgcc taggctcgag tgcagtagca tgatctcatt caagcaattc 2700 tcctgcccca gccttcagag tagctgggat tacaggaatg tgccaccata cctgactaat 2760 ttttatattt ttggtagaga tagggtttca ccatgttggc caggctggtc tcgaactctt 2820 gacctcaggt gatctgccca ccttggcatc cctaagtgct gggattacag gtgtgagcca 2880 ccatgcccag ctctcattgt ggttttaact tgtatttaat gaccagtgat tttgaacttc 2940 ttttaatata ctgttaccca tttgtatatc ttctttggag aaatgttatt caagtccatt 3000 tcctatttaa attaagttgc ctttattttt ctttttaagc tattagaatt gtttatgttt 3060 tcaaaacatt aaactcttac atatacataa tatgaaaata tttcctccca ttctgttggt 3120 tgtcatttca cattcctaat tatatttttg atgcacaaag tttaattttg atgaagtttg 3180 gtttatctat tttttctttt gctcctctgg tatcaaattt atgaacctat tgccaaatat 3240 gaagtcatga agatttaccc ctacatttta ttctaagagt tttatagttt tagcccttat 3300 atttaagttt ttccgtccat ttttcagtta tatttttcat ttggagtgag gtagggtagg 3360 tcccagctac attcttttgt attttgtcat ccaattgact catcaccatt tgttgaagag 3420 attctttcct cggactgaat ggtctaggca cccttgatga aagtaaattg gccacagatg 3480 tttaggttta tttcttgatt tcagttttat tccattggtc ttgatgtcta tctttatgct 3540 agtaccacac ttttgattat tatactttgt agtaagtttt gaagtcagaa actgagaact 3600 cactgataca gaaattaaga agaaattact taggcagaga gtaagcattt gggaattctc 3660 agtaaggttt ttctttttaa tgaaaagcaa ccctaaatca 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ctgttttaaa 34500 ttctcttttg tttaacagtc tttgtactac ttatttattt ttttaatttt tacaaaaaca 34560 taaggaaaat gtagtctctt tctttttttt tttattatac tttaagtttt agggtacatg 34620 tgcacattgt gcaggttagt tacatatgta tacatgtgcc atcctggtgc gctgcaccca 34680 ctaactcgtc atctagcctt aggtatatct cccaatgcta tccctccccc ctccccccac 34740 cccacatcag tccccagagt gtggtattcc ccttcatgtg tccatgtgat ctcattgttc 34800 aattcccacc tatgagtgag aatatacggt gtttggtttt ttgttcttgt gatagtttac 34860 tgagaatgat gatttccaat ttcatccatg tccctacaaa ggatatgaac tcatcatttt 34920 ttatggctgc atagtattcc atggtgtata tgtgccacat tttcttaatc cagtctatca 34980 ttgttggaca tttgggttgg ttccaagtct ttgctattgt gaataatgcc gcaataaaca 35040 tacgtgtgca tgtgtcttta tagcagcatg atttatagtc ctttgggtat atacccagta 35100 atgggatggc tgggtcaaat ggtatttcta attctagatc cctgaggaat cgccacactg 35160 acttccacaa tggttgaact agtttacagt cccaccaaca gtgtaaaagt gttcccattt 35220 ctccacatcc tctccagcac ctgttgtttc ctgacttttt aatgattgcc attctaactg 35280 gtgtgagatg atatctcatt gtggttttga tttgtatttc tctgatggcc agtgatgatg 35340 agcatttttt catgtgtttt ttggctgcat aaatgtcttc ttttgagaag tgtctgttca 35400 tgtcctttgc ccactttttg atggggttgt ttgttttttt cttgtaaatt tgtttgagtt 35460 cattgtagat tctggatatt agccctttgt cagatgagta ggttgcgaaa attttctccc 35520 atgttgtagg ttgcctgttc actctgatgg tagtttcttt tgctgtgcag aagctcttta 35580 gtttaattag atcccatttg tcaattttgt cttttgttgc cattgctttt ggtgttttgg 35640 acatgaagtt cttgcccatg cctatgtcct gaatggtaat gcctaggttt tcttctaggg 35700 tttttatggt tttaggtcta acgtttaaat ctttggccgg gtgcggtggc tcacacctgt 35760 aatcccggca ctttgggagg ccgaggcggg cggatcacga ggtcaggaga tcgagaccat 35820 cctggctaaa acggtgaaac cccgtctcta ctaaaaatac aaaaaattag ccgggcgtag 35880 tggcgggcac ctgtagtccc agctacttgg gaggctgagg caggagaatg gcgtgaaccc 35940 gggaggcgga gcttgcagtg agccgagatc ccgccactgc actccagcct gggcgacaga 36000 gtgagactcc atctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaat ctttaatcca tcttgaattg 36060 atttttgtat aaggtgtaag gaagggatcc agtttcagct ttctacatat ggctagccag 36120 ttttcccagc accatttatt aaatagggaa tcctttcccc attgcttgtt tttctcaggt 36180 ttgtcaaaga tcagatagtt gtaggtatgc ggcgttattt ctgagggctc tgttctgttc 36240 cattgatcta tatctctgtt ttggtaccag taccatgctg ttttggttac tgtagccttg 36300 tagtatagtt tgaagtcagg tagtgtgatg cctccagctt tgttcttttg gcttaggatt 36360 gacttgatga tgcgggctct tttttggttc catatgaact ttaaagtagt tttctccaat 36420 tctgtgaaga aagtcattgg tagcttgatg gagatggcat tgaatctgta aattaccttg 36480 ggcagtatgg ccattttcac aatattgatt cttcctaccc atgagcatgg aatgttcttc 36540 catttgtttg tatcctcttt tatttccttg agcagtggtt tgtagttctc cttgaagagg 36600 tccttcacat cccttgtaag ttggattcct aggtatttta ttctctttga agcaattgtg 36660 aatgggagtt cactcatgat tcggctctct gtttgtctgt tgttggtgta taagaatgct 36720 tgtgattttt gtacattgat tttgtatcct gagactttgc tgaagttgct tatcagctta 36780 aggagatttt gggctgagac gatggggttt tctagataaa caatcatgtc gtctgcaaac 36840 agggacaatt tgacttcctc ttttcctaat tgaatcccct ttatttcctt ctcctgcctg 36900 attgccctgg ccagaacttc caaatcaaca gaatatacat ttttttcagc accacaccac 36960 acctattcca aaattgacca catagttgga agtaaagctc tcctcagcaa atgtaaaaga 37020 acagaaatta taacaaacta tctctcagac cacagtgcaa tcaaactaga actcaggatt 37080 aagaatctca ctcaaaactg ctcaactaca tggaaactga acaacctgct cctgaatgac 37140 tactgggtat ataacgaaat gaaggcagaa ataaagatgt tctttgaaac caacgagaac 37200 aaagacacaa cataccagaa tctctgggac gcattcaaag cagtgtgtag agggaaattt 37260 atagcactaa atgcccacaa gagaaagcag gaaagatcca aaattgacac cctaacatca 37320 caattaaaag aactagaaaa gcaagagcaa acacattcaa aagctagcag aaggcaagaa 37380 ataactaaaa tcagagcaga actgaaggaa atagagacac aaaaaaccct tcaaaaaatc 37440 aatgaatcca ggagctggtt ttttgaaagg atcaacaaaa ttgatagacc actagcaaga 37500 ctaataaaga aaaaaagaga gaagaatcaa atagacacaa taaaaaatga taaaggggat 37560 atcaccactg atcccacaga aatacaaact accatcagag aatactacaa acacctctac 37620 acaaataaac tagaaaatct agaagaaatg gatacattcc tcgacacata cactctccca 37680 agactaaacc aggaagaagt tgaatctctg aatagaccaa taacaggagc tgaaattgtg 37740 gcaataatca atagtttacc aaccaaaaag agtccgggac cagatggatt cacagccgaa 37800 ttctaccaga ggtacaagga ggaactggta ccattccttc tgaaactatt ccaatcaata 37860 gaaaaagagg gaatcctccc taactcattt tatgaggcca gcatcattct gataccaaag 37920 ccgggcagag acacaaccaa aaaagagaat tttagaccaa tatccttgat gaacattcat 37980 gcaaaaatcc tcaataaaat actggcaaac cgaatccagc agcacatcaa aaagcttatc 38040 caccatgatc aagtgggctt catccctggg atgcaaggct ggttcaatat atgcaaatca 38100 ataaatgtaa tccagcatat aaacagagcc aaagacaaaa accacatcat tatctcaata 38160 gatgcagaaa aagcccttga caaaattcaa caacccttca tgctaaaaac tctcaataaa 38220 ttaggtattg atgggatgta tttcaaaata ataagagcta tctatgacaa acccacagcc 38280 aatatcatac tgaatgggca aaaactggaa gcattccctt tgaaaactgg cacaagacag 38340 ggatgccctc tctcaccgct cctattcaat atttttttct agtactatac tttacagttt 38400 ctatgttggt aagtatacaa tgtgagtaat tttgaattta ctgtcatcaa atatgctgtt 38460 aaataatttg tcagataatt gcatcaaatc attcctag 38498 <210> 5 <211> 6892 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> intron <222> (1)..(6892) <223> intron 7 of CYP2C19 gene <400> 5 gtaagtttgt ttctcctaca ctgcaactcc atgttctttt attcctcaaa ttcacagtat 60 gattcttacc ctctaccatc actgggtgag agaagtgcat tactcctatg tatggcagtt 120 taattggact ttctgttgat tccagtttgg gactataaag atttgtaaca ggtcttagtg 180 tctcacagtg tgtgtttttc agatttattc tttcttcaag attgttctgg ctactcttaa 240 gtggttatat ttccagacaa attttgaagg tgttaatttt tcaatttccc aaaacattgg 300 gctagaattt ctgtcagggt gacattaaat ttataggtca gtttggaaag aactgacatc 360 ttgacacctt gagtctttct gtttgtgaat ataattatgc ttccaattta tttgcacttt 420 ctttattttc ccaggaatgt tgtgattttg ttgtcatggc ttgcaagtct ttggtttttc 480 ctagataatt aatatttttg ttgttgttat aaacttacaa aatgcctttt gatttctttg 540 tacttggtat gttgaaacat aattagtttt tatcattctg atgaccttaa tctatcaact 600 ttgctaaatt tactaatcac tattcataat ttatctctag attcattgga atttctgtga 660 acagtacact gtatctgtgt taatattgtt ttatttctta ctttccaatt cttgtgggct 720 taatttctct ttattgcatt cattattgca ttggctagaa tttctaggag agtgttgaat 780 agaattgctg atagtgggca tccttgtttc tcatttctaa tctgcaggaa gcagtggaag 840 ttttacattt caatattgaa aatgatgcta gaagtagatt ttggtagaaa ttctttatca 900 gattagggaa gtttgccctc acatatatat agaaataaat ataaatagaa ataagtatgc 960 acatagagat gaatttatat tcttcatatt gtttagggct tctgtgttta cattcacaag 1020 gatttagttt gtaattttct ttctcagaat tttcaagatt tttgatatca agattaggcc 1080 agccttataa aactaagtga gaaatgtttc ctaatgtgag tctgttttta ctgcctcccc 1140 gtctccactt ttcttcttgt gatcacttag ttgtatcttt gaaatgccta ataacttttg 1200 gttaaatacc agatgttatg tgtaagaaag tgcagaattt cagaggatgt ttatattctt 1260 caaagaaaga ttcattcctc tcccatcggc agtcataatg acataacaca tgttgtcatg 1320 attcagaatt gtacataatg tgaacccagt cgaaaattga ctgtcagtgt tagcttagct 1380 ctctgaggtt ctcctacctc tggaatcttg agaccaattt ttgtcttggc agctttacaa 1440 ttgccttcta tcacatggtt tctgtattca tccagacact ctagttgcca tctcaaacct 1500 gctcttttcc aatttaaacc aagacatatt attagtaaaa ttaaaaataa tataacctaa 1560 agttatattt tcaaggggaa aaatcaatga gattggtaag gttgaaatta ctaatgtcac 1620 tttttgaaga agacagaatt gttaatttac caagagatta tggggcttac cctgaggtca 1680 ctgatttagt acaagagtta agacttcaat gcactctgtt ttcacaaaca caggagataa 1740 ccaggagaag gctttcgctt ctcaaaatta gggtctgagg gtaatagtaa tgaaacttat 1800 ttcttctcct ataactaatt aatgagaaat atactgaaga atcaggatga gtcgccagtc 1860 tcccaatcca ctgcatcagc tttggtgacc tgttgaaggg gaatgctgca tctgatgagc 1920 ttcttcattc acccacctgc agggcagctc atgctatgcc tggtgtcttt tgagccctga 1980 gaacccagag cgcaaggaaa tcacccactg aatcccttct tcatggaaca gcctatagaa 2040 aagtgcagca ctgcgtggcc aattctaccc tctttacaaa tcaggcaaat gtgttcttct 2100 gctacaggct ggatccactt atctaggtgg agataatagt ctgagagagg agttggcaaa 2160 ctgttcctgt aatgggccag atagtaaata ttttagactt tttaggccat gatgtttctg 2220 ttgcaatcct tgacatctgc tattgtagca tgaaagcagt catagacaat gtacaaatga 2280 atatcttcca atttttatag aaacaaatgt aaatttccca taaatttttg tttcaaaaat 2340 attatttatt tgcatttgtt caatgtaaat acttttagct cacatactat acaaaaacag 2400 gtggcaggat ggacttgtgc agagagtatt gtttattgat gcccaatata agactttcct 2460 gtccagtaga attttctgca aagatgctcg attgatttgt gtcctattta aagaatattt 2520 gtcagcacaa gattccaaag actgagtttt aactttccca taattttttt gttttagctc 2580 ttatatttac atcaatgaca tgtttcaaat taatttttat ttgtagtatg gagtaataat 2640 ggtcgtgctt caatgtctat aaatttctat ttattcaagt aacatttgtt gaaataaatc 2700 tgctttggta tcttaaaaac attttaatat agtacttatt tataaatatt caagggaata 2760 ttttttaaaa caaaattgta gactatttat atgaaaactt agtgggtaga atttttcatc 2820 acctttgtat tataaaattt ttaagaataa ataacattac acacatatat ctatatgtac 2880 atatggcagt gtgtatatat atctactttg atatctgtct atccatctat ctagacctca 2940 atactgcagt atatgtagcc caataacaat ggttttctcc tatataataa taatagcatt 3000 catagtatgg agttattgat acaataatat tatttactgt acagcttata tttaaaattt 3060 cccaattctt aaggaacatt ttaattactt ttttctttca attcactctc cagtcaagaa 3120 acaggcacat aattcgggta tgttgtcatt tttatctcct gtaatcaaga acagttcatt 3180 tcctctgttt cctttcagta tgttgatctc tgtgaagagt tgaggccttt agtcatttaa 3240 attttcttcg ggcttgtttt gtataattgt tttctagata ttatattcca gttatgactt 3300 tggcaagaaa actacatagt actttgacta ttccactgaa tcacagtggt gaggcagagg 3360 cacataatgt tacatatgct attactggtt atgctaagat cctgacctaa taagttggaa 3420 tctgccagat ctctccattg aaggagttct gcttttatgt gtaaatgatg aaaatctatg 3480 gcatgacact ttaagacaga acaccctgtt tccaaagtca cacatccaat agttttatct 3540 ttcattgatg atccttgcct ggcctgatga tcttgacctg aatggttaca aaagatgatt 3600 tttttctaat ttcattattc cttctgtatt ttttaaacta ttagaatcta tttatttatt 3660 tatttatttt attattttta tactttaagt tttagggtac atgtgcacaa tgtgcaggtt 3720 agttacatat gtatacatgt gccatgctgg tgtgctgcac ccattaactc gtcatttagc 3780 attaggtata tctcctaatg ctatctttct gtatttttaa gctatgatta atctgtaatg 3840 aatatctctc ccgtatcttt aaatgataac aaacaaacta catggcaatg acaaacattc 3900 aatagtttta tacttgtgac tatacttgtt accattctag aagacgtcgt ttgaagctca 3960 atcatatgtt tattcacaaa tgccctgtga atagacactc tggccatttc ccatgtcaac 4020 agagacttca actttatttt atttatttat ttatttattt ttattattat actgtaagtt 4080 ttagggtaca tgtgcacaac gtgcaggtta gttacaaatg tatacatgtg ccatgtcggt 4140 gtgctgcacc cattaacttg tcatttagca ttaggtatat ctcctaatgc taaccctcct 4200 ccctccctcc accccaaaac agtccctggt gtgtgatgtt ccccttcctg tgtccatgtg 4260 ttctcattgt tcaattccca cctatgagtg agaatatgcg gtgtttggtt ttttgtcctt 4320 gtgatagttt gctgagaatg atggtttcca gcttcatcca tgtccctaca aaggacatga 4380 actcatcatt ttttatggct gtgtagtatt ccatggtgta tatgtgccat attttcttaa 4440 tccagtctat cattgttgga tatttgggtt gattccaagt cgttgctatt gtgagtagtg 4500 ctgcaataaa tatacgtgtg catgtgtctt tatagtagca tgatttataa tcctttgggt 4560 atatacccag taatgggatg gctgggtcaa gcggtatttc tagttctaga cccctgagga 4620 atcaccacac tgacttccac aatggttgaa ctagtttaca gtcccaccaa cagtgtaaaa 4680 ctgttcctat ttctccacat cctctcctgc acctgttgtt tcctgacttt ttaatgatcg 4740 ccattctaac tggtgtgaga tggtatctca ttgtggttgt gatttgcatt tttgtgatgg 4800 ccagtgatga tgagcatttt ttcaagtgct tttggctgca taaatgtctt cttttcagaa 4860 gtgtctgttc atatccttca cccacttttt gatgcggttg tttgtttttt tcttgtaaat 4920 ttgttggagt tcattgtaga ttctggatat tagcccttcg tcagatgagt agattgcaaa 4980 aattttctcc cattctgtag gttgcctatt cactctgatg gtggtttctt ttgctgtgca 5040 gaagctcttt agttttatta gatcccattt gtcaattttg gcttttgttg ccattgcttt 5100 tggtgtttta gacatgaagt ccttgcccat gcctatgtcc tgagtggtat tgcctaggtt 5160 ttcttctagg atttttatgg ttttaggtct aacatttaag tctttgatcc atcttgaatt 5220 aatttttgta taaggtgtaa agaagggatc cagtttcaga tttctacata cggctagtca 5280 gttttcccag caccatttat taaataggga atcctttccc catttcttgt ttttgtcaag 5340 tttgtcaaag atcagatcat tgtagatgtg tggtattatt tctgttggct ctgttctgtt 5400 ccattggtct acatctctgt tttggtacca gtaccatgct gttttggtta ctgtagcctt 5460 gtagtatagt ttgaagtcag gtagtgtgat gcctccagct ttgttctttt ggcttaggat 5520 tgacttggca atgcaggctc ttttttggtt ccatatgaac tttaaagtag tttttccaat 5580 tctgtgaaga aagtcattgg tagcttgatg gggatggcat tgaatctata aattaccttg 5640 ggcagtatgg ccattttcac aatattgatt cttcctacct atgagcatgg aatgttcttc 5700 catttgtttg tatcctcttt tatttcattg agcagtggtt tgtagttctc cttaaagaga 5760 tccttcacgt cccttgtaag ttggattcct aggtatttta ttctctttga agcaattgtg 5820 aatggaagtt cactcatgat ttggctctct gtttgtctgt tattggtgta taagaatgct 5880 tgtgattttt gtccattgat tttgtatcct gagactttgc tgaagttgtt tatcagctta 5940 aggagatttt gggctgagac gatggggttg tctagatgta caatcatgtc atctgcaaac 6000 agggacaatt agacttcatc ttttcctaat tgaatgccct ttattccctt ctcctgcctg 6060 atagccctgt ccagaacttc caacactatg ttgaatagga gtggtgagag agaacatccc 6120 tgtcttgtgc ctttaagtca tagtctacac ataagatttg tgaaaactga agtgatgaaa 6180 tagagcagca ggagtggaca ggcactaaag cccaagcttg atgaaaagga cagattcaga 6240 aggttgcacc caagtacgca agtactcagt acttcaaatg tggttgtggg cattttattt 6300 atttatttat ttattttttt catcagcaga ttttattaag aagaagaaac aggaaattca 6360 aaagcaagtt cattttaaat tagctggtca gaagagtaca aagagaaaaa aaaagaaaag 6420 aatcaagaaa tcctatagga ctttgggatt ttttttaaat tttattatca ttatacttta 6480 agttttaggg tacatgtgca caatgtgcag gtttgttaca tatgtataca tgtgccatat 6540 tggtgtgctg cacccattaa ctcatcattt agcattaggt atatctccta atgctatccc 6600 tcccccctcc ccccacccca caacagtccc cgaagtgtga tgttcccctt cctgtgtcca 6660 tgtgttctca ttgttcaatt cctgattgtg ggcattttag caagattatt gtcactggcc 6720 ttaagctcat gcctcttatt acttcgtcta tctgtctgga aatggtactg ctcttctttg 6780 gaatggtgtt tcatcatctg tacatcaaaa gatttaactg catgattacc actgtttctt 6840 aaaccttcgt gacttcttta cagctcagtt cacctatgtc tcttgtttct ag 6892 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tctttctggt tgtatttaga cctt 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctttgagaac agaagacaca aat 23 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggtgcattgg aaccact 17 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tactttacaa tgatctcttg taacatt 27 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 caggaaacag ctatgaccag caggtataag tctaggaaa 39 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tgtaaaacga cggccagtgc attactcctt gacctg 36 <210> 12 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 caggaaacag ctatgaccgg aattcatagg taagatatta cttaaa 46 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tgtaaaacga cggccagtaa gcctgatcta tattgggat 39 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caggaaacag ctatgaccaa ttttgaattt actgtcat 38 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgtaaaacga cggccagtgg ctgggattac aatcat 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 caggaaacag ctatgaccat tgtgggcatt ttagca 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tgtaaaacga cggccagtta tcaccagcgg agaaaa 36

Claims

하기의 단계를 포함하는, CYP2C19 유전자의 일배체형 분석방법:
(a) 게놈 DNA로부터 시토크롬 P450 2C19(CYP2C19)를 암호화하는 유전자의 프로모터, 엑손 4, 엑손 5, 인트론 5 및 인트론 7을 수득하여 이들 각각의 염기서열을 결정하는 단계;
(b) 상기 결정된 각 염기서열에서 하기의 단일염기다형성(SNP)의 존재여부를 검출하는 단계; 및
1. rs11568732 : 프로모터의 -889번 염기(서열번호 1의 2112번째 염기) T가 G로 변이
2. rs4986894 : 프로모터의 -98번 염기(서열번호 1의 2903번째 염기) T가 C로 변이
3. rs4986893 : 엑손 4번이 암호화하는 단백질의 636번 염기(서열번호 2의 155번째 염기) G가 A로 변이
4. rs4244285 : 엑손 5번이 암호화하는 단백질의 681번 염기(서열번호 3의 39번째 염기) G가 A로 변이
5. rs4417205 : 인트론 5번의 -51번 염기(서열번호 4의 38448번째 염기) C가 G 로 변이
6. rs4917623 : 인트론 7번의 -106번 염기(서열번호 5의 6787번째 염기) T가 C 로 변이
(c) 상기 검출된 SNP를 이용하여 하기의 H1 내지 H3에서 선택되는 일배체형을 동정하는 단계; 및

(d) 상기 동정된 일배체형을 염기쌍으로 조합하여 3종의 일배체형 조합군 EM(Extensive Metabolizer), 헤테로 EM(Hetero Extensive Metabolizer) 및 PM(Poor Metabolizer)중 어느 군에 속하는지를 결정하는 단계(이때, EM군에는 H1/H1의 일배체형쌍이 속하고, 헤테로 EM군에는 H1/H2와 H1/H3의 일배체형쌍이 속하고, PM군에는 H2/H2, H2/H3 및 H3/H3의 일배체형쌍이 속한다).
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 염기서열을 결정하는 방법은, CYP2C19를 암호화하는 유전자의 프로모터, 엑손 4, 엑손 5, 인트론 5 및 인트론 7을 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 행하는 직접 염기서열분석법(direct sequencing)인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 2 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 6 내지 17 중에서 선택되는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1 항의 단일염기다형성(SNP) 및 일배체형의 종류를 분석할 수 있는 프라이머를 포함하는, CYP2C19 유전자의 일배체형 분석키트.
제 4 항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 6 내지 17의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 분석키트.
하기 단계를 포함하는, CYP2C19 단백질의 활성을 예측하는 방법:
(a) 제 4 항 또는 제 5 항의 분석키트를 이용하여, 피험자의 CYP2C19 유전자가 하기의 일배체형 H1 내지 H3 중 어느 것에 해당하는지 확인하는 단계; 및

(b) 상기 확인된 일배체형을 염기쌍으로 조합하여 3종의 일배체형 조합군 EM(Extensive Metabolizer), 헤테로 EM(Hetero Extensive Metabolizer) 및 PM(Poor Metabolizer)중 어느 군에 속하는지를 결정하는 단계(이때, EM군에는 H1/H1의 일배체형쌍이 속하고, 헤테로 EM군에는 H1/H2와 H1/H3의 일배체형쌍이 속하고, PM군에는 H2/H2, H2/H3 및 H3/H3의 일배체형쌍이 속한다),
(c) 상기 확인된 일배체형 조합군의 정보를 이용하여, CYP2C19 효소의 활성을 예측하는 단계.