CN107881227A - 用于检测cyp2c19基因分型的lamp引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测cyp2c19基因分型的lamp引物组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组。所述LAMP引物组包括检测CYP2C19*2基因位点的第一引物组和/或检测CYP2C19*3基因位点的第二引物组，第一引物组和第二引物组均由正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP‑G、正向内引物FIP‑A和反向内引物BIP组成。本发明还涉及一种用于检测CYP2C19基因分型的LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法。所述LAMP检测试剂盒包括第一引物组和/或第二引物组。本发明提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测快速、实时监控、准确性高和成本低的优点。

Description

用于检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别的，涉及一种用于检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组、LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法，具体为检测影响临床常用药物代谢的细胞色素P450酶2C19基因的两个位点CYP2C19*2和/或CYP2C19/*3的基因型。
背景技术
CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶，在肝脏中有很多表达。CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异，使人群出现超快代谢者(UM)、快代谢者(EM)、中间代谢者(IM)和慢代谢者(PM)4种表型。其中CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)是中国人群中存在的2种导致CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。CYP2C19*2会导致转录蛋白的剪切突变失活，而CYP2C19*3能构成一个终止子，破坏转录蛋白的活性。EM个体携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型；PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。东方人群中75-85％的PM由CYP2C19*2所致，约20-25％的PM由CYP2C19*3所致。
CYP2C19参与氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等药物的代谢。氯吡格雷是一种抗血小板药物，广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症。氯吡格雷主要经CYP2C19代谢活化后发挥抗血小板效应。CYP2C19PM患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作用下降。美国FDA和美国心脏病学会建议，对于CYP2C19慢代谢基因型患者需考虑改变治疗方案。阿米替林为三环类抗抑郁药，主要用于焦虑性或激动性抑郁症的治疗。阿米替林在体内主要经CYP2C19代谢为活性代谢产物去甲替林。由于三环类抗抑郁药具有多种不良反应如抗胆碱作用、中枢神经系统不良反应和心血管不良反应，与治疗失败密切相关。调整携带CYP2C19突变等位基因患者阿米替林的起始用药剂量有助于降低初始治疗的失败率。CPIC指南建议CYP2C19EM和IM基因型患者应用常规起始剂量的阿米替林，而CYP2C19PM基因型个体阿米替林的起始剂量应降低至常规剂量的50％，并进行治疗药物监测。伏立康唑是一种广谱三唑类抗真菌药，CYP2C19是其主要代谢酶之一。CYP2C19 EM与PM个体间伏立康唑的血液浓度存在显著差异，PM个体在应用常规剂量药物时可能出现毒副反应，建议减少用药剂量；EM和IM个体可给予常规剂量。FDA批准的药物说明书中指出应用伏立康唑前需检测CYP2C19基因型，以确保用药安全。
目前，CYP2C19基因分型检测的方法主要有PCR-直接测序法和荧光PCR法，两种方法都需要昂贵的仪器设备且检测周期长、成本较高。
环式等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术的特征是针对目标DNA链上的6个区段设计4个(或6个)不同的引物，再利用链置换反应在一定温度下(60～65℃)经一个步骤即可完成反应。LAMP具有高度的特异性，且扩增效率极高，可在15～60min内实现109～1010倍的扩增。对LAMP扩增结果的检测，仅需添加染料，通过肉眼观察颜色变化来判定结果，也可以通过简易的荧光或浊度检测平台，观察有无扩增曲线来判定。由于LAMP具有等温扩增、不需要特定PCR仪器、反应时间短等优点，已广泛用于病原微生物、食品安全检测领域，但是将其用于人的基因分型检测尚少有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组、LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法，具有操作简单、检测快速、实时监控及准确性高的优点。
本发明提供一种用于检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括检测CYP2C19*2基因位点的第一引物组和/或检测CYP2C19*3基因位点的第二引物组，其中：
所述第一引物组的各引物序列如下：
正向外引物2F3：5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAATT-3’；
反向外引物2B3：5’-CACAAAACTAGTCAATGAATCAC-3’；
正向环引物2LF：5’-ATATCACTTTCCATAAAAGCAAGG-3’；
反向环引物2LB：5’-GAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCT-3’；
正向内引物2FIP-G：
5’-TCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTCCACTATCATTGATTATTTCTTG-3’；
正向内引物2FIP-A：
5’-TCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTCCACTATCATTGATTATTTCATA-3’；
反向内引物2BIP：5’-
TGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAAAATACGCAAGCAGTCACAT-3’；
所述第二引物组的各引物序列如下：
正向外引物3F3：5’-AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3’；
反向外引物3B3：5’-AAGCCTGATCTATATTGGGATA-3’；
正向环引物3LF：5’-CCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGGT-3’；
反向环引物3LB：5’-CCATGGGGTGAATATCTGGAAAA-3’；
正向内引物3FIP-G：
5’-CTTCAGGGCTTGGTCAATATAGAATGGATTGTAAGCACCCCCTCG-3’；
正向内引物3FIP-A：
5’-CTTCAGGGCTTGGTCAATATAGAATGGATTGTAAGCACCCCCTCA-3’；
反向内引物3BIP：
5’-GAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCTGTGCATAAAATAAAGAACTTTG-3’。
本发明还提供一种用于检测CYP2C19基因分型的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括检测CYP2C19*2基因位点的第一LAMP检测液与第二LAMP检测液和/或检测CYP2C19*3基因位点的第三LAMP检测液与第二LAMP检测液，其中：
所述第一LAMP检测液包括正向外引物2F3、反向外引物2B3、正向环引物2LF、反向环引物2LB、正向内引物2FIP-G和反向内引物2BIP，各引物的序列如下：
正向外引物2F3：5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAATT-3’；
反向外引物2B3：5’-CACAAAACTAGTCAATGAATCAC-3’；
正向环引物2LF：5’-ATATCACTTTCCATAAAAGCAAGG-3’；
反向环引物2LB：5’-GAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCT-3’；
正向内引物2FIP-G：
5’-TCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTCCACTATCATTGATTATTTCTTG-3’；
反向内引物2BIP：5’-
TGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAAAATACGCAAGCAGTCACAT-3’；
所述第二LAMP检测液包括正向外引物2F3、反向外引物2B3、正向环引物2LF、反向环引物2LB、正向内引物2FIP-A和反向内引物2BIP，各引物的序列如下：
正向外引物2F3：5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAATT-3’；
反向外引物2B3：5’-CACAAAACTAGTCAATGAATCAC-3’；
正向环引物2LF：5’-ATATCACTTTCCATAAAAGCAAGG-3’；
反向环引物2LB：5’-GAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCT-3’；
正向内引物2FIP-A：
5’-TCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTCCACTATCATTGATTATTTCATA-3’；
反向内引物2BIP：5’-
TGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAAAATACGCAAGCAGTCACAT-3’；
所述第三LAMP检测液包括正向外引物3F3、反向外引物3B3、正向环引物3LF、反向环引物3LB、正向内引物3FIP-G和反向内引物3BIP，各引物的序列如下：
正向外引物3F3：5’-AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3’；
反向外引物3B3：5’-AAGCCTGATCTATATTGGGATA-3’；
正向环引物3LF：5’-CCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGGT-3’；
反向环引物3LB：5’-CCATGGGGTGAATATCTGGAAAA-3’；
正向内引物3FIP-G：
5’-CTTCAGGGCTTGGTCAATATAGAATGGATTGTAAGCACCCCCTCG-3’；
反向内引物3BIP：
5’-GAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCTGTGCATAAAATAAAGAA
CTTTG-3’；
所述第四LAMP检测液包括正向外引物3F3、反向外引物3B3、正向环引物3LF、反向环引物3LB、正向内引物3FIP-A和反向内引物3BIP，各引物的序列如下：
正向外引物3F3：5’-AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3’；
反向外引物3B3：5’-AAGCCTGATCTATATTGGGATA-3’；
正向环引物3LF：5’-CCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGGT-3’；
反向环引物3LB：5’-CCATGGGGTGAATATCTGGAAAA-3’；
正向内引物3FIP-A：
5’-CTTCAGGGCTTGGTCAATATAGAATGGATTGTAAGCACCCCCTCA-3’；
反向内引物3BIP：
5’-GAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCTGTGCATAAAAT
AAAGAA CTTTG-3’。
在本发明提供的所述LAMP检测试剂盒一较佳实施例中，所述第一LAMP检测液的成份终浓度为：0.4μM正向外引物2F3、0.4μM反向外引物2B3、0.8μM正向环引物2LF、0.8μM反向环引物2LB、1.6μM正向内引物2FIP-G和1.6μM反向内引物2BIP；所述第二LAMP检测液的成份终浓度为：0.4μM正向外引物2F3、0.4μM反向外引物2B3、0.8μM正向环引物2LF、0.8μM反向环引物2LB、1.6μM正向内引物2FIP-A和1.6μM反向内引物2BIP。
在本发明提供的所述LAMP检测试剂盒一较佳实施例中，所述第一LAMP检测液和所述第二LAMP检测液均还包括4UDNA聚合酶、50000×SYBR Green I、1×Lamp Master Mix。
在本发明提供的所述LAMP检测试剂盒一较佳实施例中，所述第三LAMP检测液的成份终浓度为：0.4μM正向外引物3F3、0.4μM反向外引物3B3、0.8μM正向环引物3LF、0.8μM反向环引物3LB、1.6μM正向内引物3FIP-G和1.6μM反向内引物3BIP；所述第四LAMP检测液的成份终浓度为：0.4μM正向外引物3F3、0.4μM反向外引物3B3、0.8μM正向环引物3LF、0.8μM反向环引物3LB、1.6μM正向内引物3FIP-A和1.6μM反向内引物3BIP。
在本发明提供的所述LAMP检测试剂盒一较佳实施例中，所述第三LAMP检测液和所述第四LAMP检测液均还包括4UDNA聚合酶、50000×SYBR Green I、1×Lamp Master Mix。
本发明同时提供一种检测CYP2C19基因分型的LAMP检测方法，所述LAMP检测方法包括如下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA为模板；
步骤二：利用如上所述的LAMP检测试剂盒中的第一LAMP检测液与第二LAMP检测液和/或第三LAMP检测液与第四LAMP检测液分别对DNA模板进行LAMP扩增；
步骤三：结果判定：结合DNA模板分别与第一LAMP检测液和第二LAMP检测液的扩增反应结果来得到待检测样本CYP2C19*2基因位点的基因型，结合模板分别与第三LAMP检测液和第四LAMP检测液的扩增反应结果来得到待检测样本CYP2C19*3基因位点的基因型。
在本发明提供的检测CYP2C19基因分型的LAMP检测方法一较佳实施例中，所述步骤二中LAMP扩增条件为：62℃恒温孵育30-60min。
相较于现有技术，本发明提供的用于检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组、LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法的有益效果在于：
一、本发明以LAMP技术为基本原理，针对CYP2C19*2位点和CYP2C19*3位点基因分型分别设计了7条引物，并由检测CYP2C19*2基因位点的7条引物中的6条配制含2FIP-G引物的第一LAMP检测液和含2FIP-A引物的第二LAMP检测液，由检测CYP2C19*3基因位点的7条引物中的6条配制含3FIP-G引物的第三LAMP检测液和含3FIP-A引物的第三LAMP检测液，利用第一LAMP检测液和第二LAMP检测液同时对待检样本DNA模板进行扩增，结合两者扩增反应结果来得到待检测样本基因CYP2C19*2位点的基因型，利用第三LAMP检测液和第四LAMP检测液同时对待检样本DNA模板进行扩增，结合两者扩增反应结果来得到待检测样本基因CYP2C19*3位点的基因型，操作简便快速，反应只需一步，可在30-60min内完成。
二、与现有的CYP2C19基因分型检测的PCR-直接测序法和荧光PCR法相比，所需仪器设备简单，不需要专门的荧光PCR仪就能完成反应，间接降低检测成本，更易推广应用。
三、第一LAMP检测液、第二LAMP检测液、第三LAMP检测液和第四LAMP检测液中均包括有SYBR Green I染料，即在反应前就已加入SYBR Green I染料，无需开盖检测，有效避免了假阳性的结果。
附图说明
图1为CYP2C19*2GG型样本的LAMP检测结果图；
图2为CYP2C19*2AA型样本的LAMP检测结果图；
图3为CYP2C19*2GA型样本的LAMP检测结果图；
图4为CYP2C19*3GG型样本的LAMP检测结果图；
图5为CYP2C19*3AA型样本的LAMP检测结果图；
图6为CYP2C19*3GA型样本的LAMP检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：LAMP检测试剂盒的制备
一、检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组的设计与合成
针对人基因组中CYP2C19*2和CYP2C19*3基因位点(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用Primer Explore 5.0软件分别设计检测CYP2C19*2(681G/A)的LAMP引物组(第一引物组)和检测CYP2C19*3(636G/A)的LAMP引物组(第二引物组)。
第一引物组和第二引物组均由正向外引物F3、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB、正向内引物FIP-G、正向内引物FIP-A和反向内引物BIP组成，具体地，第一引物组中各引物和第二引物组中各引物的序列如表一所示：
表一、第一引物组和第二引物组各引物序列
二、检测CYP2C19*2(681G/A)的第一LAMP检测液和第二LAMP检测液组成
所述第一LAMP检测液包括：0.4μM正向外引物2F3、0.4μM反向外引物2B3、0.8μM正向环引物2LF、0.8μM反向环引物2LB、1.6μM正向内引物2FIP-G、1.6μM反向内引物2BIP、4U的DNA聚合酶、50000×的SYBR Green I、1×的Lamp Master Mix和适量无核酸酶水。
所述第二LAMP检测液包括：0.4μM正向外引物2F3、0.4μM反向外引物2B3、0.8μM正向环引物2LF、0.8μM反向环引物2LB、1.6μM正向内引物2FIP-A、1.6μM反向内引物2BIP、4U的DNA聚合酶、50000×的SYBR Green I、1×的Lamp Master Mix和适量无核酸酶水。
三、检测CYP2C19*3(636G/A)的第三LAMP检测液和第四LAMP检测液组成
所述第三LAMP检测液包括0.4μM正向外引物3F3、0.4μM反向外引物3B3、0.8μM正向环引物3LF、0.8μM反向环引物3LB、1.6μM正向内引物3FIP-G、1.6μM反向内引物3BIP、4U的DNA聚合酶、50000×的SYBR Green I、1×的Lamp Master Mix和适量无核酸酶水。
所述第四LAMP检测液包括0.4μM正向外引物3F3、0.4μM反向外引物3B3、0.8μM正向环引物3LF、0.8μM反向环引物3LB、1.6μM正向内引物3FIP-A、1.6μM反向内引物3BIP、4U的DNA聚合酶、50000×的SYBR Green I、1×的Lamp Master Mix和适量无核酸酶水。
实施例2：利用上述试剂盒检测CYP2C19基因分型的LAMP检测方法
一、取待检测样本抽提的DNA作为模板；
二、利用实施例1所述的LAMP检测试剂盒对模板进行LAMP扩增；
提供所述LAMP检测试剂盒，取出第一LAMP检测液、第二LAMP检测液、第三LAMP检测液和第四LAMP检测液；
从LAMP检测试剂盒中取出所需数量LAMP检测液连管(每检测位点的LAMP检测管数＝2×样本数)；
取第一LAMP检测液、第二LAMP检测液、第三LAMP检测液、第四LAMP检测液分别与1-5μL的模板混匀配制LAMP扩增反应体系A、LAMP扩增反应体系B、LAMP扩增反应体系C和LAMP扩增反应体系D，反应体系为25μL，不足部分用灭菌纯化水补齐，具体详见表二至表五；
将配有LAMP扩增反应体系A、LAMP扩增反应体系B、LAMP扩增反应体系C和LAMP扩增反应体系D的反应管置于荧光检测仪上以62℃恒温孵育30-60min，每60s采集荧光。
表二、LAMP扩增反应体系A组成
表三、LAMP扩增反应体系B组成
原料名称 终浓度
正向外引物2F3 0.4μM
反向外引物2B3 0.4μM
正向环引物2LF 0.8μM
反向环引物2LB 0.8μM
正向内引物2FIP-A 1.6μM
反向内引物2BIP 1.6μM
DNA聚合酶 4U
SYBR Green I 50000×
Lamp Master Mix 1×
DNA模板 1-5μL
去离子水 适量
总体积 25μL
表四、LAMP扩增反应体系C组成
表五、LAMP扩增反应体系D组成
原料名称 终浓度
正向外引物3F3 0.4μM
反向外引物3B3 0.4μM
正向环引物3LF 0.8μM
反向环引物3LB 0.8μM
正向内引物3FIP-A 1.6μM
反向内引物3BIP 1.6μM
DNA聚合酶 4U
SYBR Green I 50000×
Lamp Master Mix 1×
DNA模板 1-5μL
去离子水 适量
总体积 25μL
三、结果判定：结合DNA模板分别与第一LAMP检测液和第二LAMP检测液的扩增反应结果来得到待检测样本CYP2C19*2基因位点的基因型，结合DNA模板分别与第三LAMP检测液和第四LAMP检测液的扩增反应结果来得到待检测样本CYP2C19*3基因位点的基因型。
具体地：
在配有LAMP扩增反应体系A的反应管内有扩增信号且配有LAMP扩增反应体系B的反应管内无扩增信号时，待检测样本CYP2C19*2位点为GG型；在配有LAMP扩增反应体系B的反应管内有扩增信号且配有LAMP扩增反应体系A的反应管内无扩增信号时，待检测样本CYP2C19*2位点为AA型；在配有LAMP扩增反应体系A的反应管和配有LAMP扩增反应体系B的反应管内均有扩增信号时，待检测样本CYP2C19*2位点为GA型。
在配有LAMP扩增反应体系C的反应管内有扩增信号且配有LAMP扩增反应体系D的反应管内无扩增信号时，待检测样本CYP2C19*3位点为GG型；在配有LAMP扩增反应体系D的反应管内有扩增信号且配有LAMP扩增反应体系C的反应管内无扩增信号时，待检测样本CYP2C19*3位点为AA型；在配有LAMP扩增反应体系C的反应管和配有LAMP扩增反应体系D的反应管内均有扩增信号时，待检测样本CYP2C19*3位点为GA型。
实施例3：准确性验证
提供2例CYP2C19*2GG型(样本1和样本2)、2例CYP2C19*2GA型(样本3和样本4)和2例CYP2C19*2AA型(样本5和样本6)，以及2例CYP2C19*3GG型(样本7和样本8)、2例CYP2C19*3GA型(样本9和样本10)和2例CYP2C19*3AA型(样本11和样本12)的人基因组DNA作为模板，应用实施例2提供的LAMP检测方法对已知基因型的12个样本DNA模板进行检测，检测结果详见图1至图6，其中：
图1为CYP2C19*2GG型样本的LAMP检测结果图，图1中①和②为样本1和样本2用第一LAMP检测液扩增的扩增结果，结果有明显扩增曲线；③和④为样本1和样本2用第二LAMP检测液扩增的扩增结果，结果无扩增信号；
图2为CYP2C19*2AA型样本的LAMP检测结果图，图2中①和②为样本3和样本4用第二LAMP检测液扩增的扩增结果，结果有明显扩增曲线；③和④为样本3和样本4用第一LAMP检测液扩增的扩增结果，结果无扩增信号；
图3为CYP2C19*2GA型样本的LAMP检测结果图，图3中样本5和样本6用第一LAMP检测液和用第二LAMP检测液扩增均有明显扩增曲线；
图4为CYP2C19*3GG型样本的LAMP检测结果图，图4中①和②为样本7和样本8用第三LAMP检测液扩增的扩增结果，结果有明显扩增曲线；③和④为样本7和样本8用第四LAMP检测液扩增的扩增结果，结果无扩增信号；
图5为CYP2C19*3AA型样本的LAMP检测结果图，图5中①和②为样本9和样本10用第四LAMP检测液扩增的扩增结果，结果有明显扩增曲线；③和④为样本9和样本10用第三LAMP检测液扩增的扩增结果，结果无扩增信号；
图6为CYP2C19*3GA型样本的LAMP检测结果图。样本11和样本12用第三LAMP检测液和用第四LAMP检测液扩增均有明显扩增曲线。
从图1至图6可知，扩增曲线符合判定结果。
本发明提供的用于检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组、LAMP检测试剂盒及LAMP检测方法的有益效果在于：
一、本发明以LAMP技术为基本原理，针对CYP2C19*2位点和CYP2C19*3位点基因分型分别设计了7条引物，并由检测CYP2C19*2基因位点的7条引物中的6条配制含2FIP-G引物的第一LAMP检测液和含2FIP-A引物的第二LAMP检测液，由检测CYP2C19*3基因位点的7条引物中的6条配制含3FIP-G引物的第三LAMP检测液和含3FIP-A引物的第三LAMP检测液，利用第一LAMP检测液和第二LAMP检测液同时对待检样本DNA模板进行扩增，结合两者扩增反应结果来得到待检测样本基因CYP2C19*2位点的基因型，利用第三LAMP检测液和第四LAMP检测液同时对待检样本DNA模板进行扩增，结合两者扩增反应结果来得到待检测样本基因CYP2C19*3位点的基因型，操作简便快速，反应只需一步，可在30-60min内完成。
二、与现有的CYP2C19基因分型检测的PCR-直接测序法和荧光PCR法相比，所需仪器设备简单，不需要专门的荧光PCR仪就能完成反应，间接降低检测成本，更易推广应用。
三、第一LAMP检测液、第二LAMP检测液、第三LAMP检测液和第四LAMP检测液中均包括有SYBR Green I染料，即在反应前就已加入SYBR Green I染料，无需开盖检测，有效避免了假阳性的结果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 长沙三济生物科技有限公司
<120> 用于检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组、试剂盒及方法
<130> 2017
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttttctctt agatatgcaa taatt 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacaaaacta gtcaatgaat cac 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atatcacttt ccataaaagc aagg 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtaaaa tgttaacaaa agct 24
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccatcgatt cttggtgttc tttccactat cattgattat ttcttg 46
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccatcgatt cttggtgttc tttccactat cattgattat ttcata 46
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgattgcttc ctgatcaaaa tggaaaatac gcaagcagtc acat 44
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcaatttct taacttgatg gaa 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagcctgatc tatattggga ta 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccagaaaaa aagactgtaa gtggt 25
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccatggggtg aatatctgga aaa 23
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cttcagggct tggtcaatat agaatggatt gtaagcaccc cctcg 45
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttcagggct tggtcaatat agaatggatt gtaagcaccc cctca 45
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaatactaca gtcttgccta gacagcctgt gcataaaata aagaactttg 50

Claims (8)

1.一种用于检测CYP2C19基因分型的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括检测CYP2C19*2基因位点的第一引物组和/或检测CYP2C19*3基因位点的第二引物组，其中：
所述第一引物组的各引物序列如下：
正向外引物2F3：5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAATT-3’；
反向外引物2B3：5’-CACAAAACTAGTCAATGAATCAC-3’；
正向环引物2LF：5’-ATATCACTTTCCATAAAAGCAAGG-3’；
反向环引物2LB：5’-GAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCT-3’；
正向内引物2FIP-G：
5’-TCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTCCACTATCATTGATTATTTCTTG-3’；
正向内引物2FIP-A：
5’-TCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTCCACTATCATTGATTATTTCATA-3’；
反向内引物2BIP：
5’-TGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAAAATACGCAAGCAGTCACAT-3’；
所述第二引物组的各引物序列如下：
正向外引物3F3：5’-AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3’；
反向外引物3B3：5’-AAGCCTGATCTATATTGGGATA-3’；
正向环引物3LF：5’-CCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGGT-3’；
反向环引物3LB：5’-CCATGGGGTGAATATCTGGAAAA-3’；
正向内引物3FIP-G：
5’-CTTCAGGGCTTGGTCAATATAGAATGGATTGTAAGCACCCCCTCG-3’；
正向内引物3FIP-A：
5’-CTTCAGGGCTTGGTCAATATAGAATGGATTGTAAGCACCCCCTCA-3’；
反向内引物3BIP：
5’-GAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCTGTGCATAAAATAAAGAACTTTG-3’。
2.一种用于检测CYP2C19基因分型的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括检测CYP2C19*2基因位点的第一LAMP检测液与第二LAMP检测液和/或检测CYP2C19*3基因位点的第三LAMP检测液与第四LAMP检测液，其中：
所述第一LAMP检测液包括正向外引物2F3、反向外引物2B3、正向环引物2LF、反向环引物2LB、正向内引物2FIP-G和反向内引物2BIP，各引物的序列如下：
正向外引物2F3：5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAATT-3’；
反向外引物2B3：5’-CACAAAACTAGTCAATGAATCAC-3’；
正向环引物2LF：5’-ATATCACTTTCCATAAAAGCAAGG-3’；
反向环引物2LB：5’-GAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCT-3’；
正向内引物2FIP-G：
5’-TCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTCCACTATCATTGATTATTTCTTG-3’；
反向内引物2BIP：
5’-TGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAAAATACGCAAGCAGTCACAT-3’；
所述第二LAMP检测液包括正向外引物2F3、反向外引物2B3、正向环引物2LF、反向环引物2LB、正向内引物2FIP-A和反向内引物2BIP，各引物的序列如下：
正向外引物2F3：5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAATT-3’；
反向外引物2B3：5’-CACAAAACTAGTCAATGAATCAC-3’；
正向环引物2LF：5’-ATATCACTTTCCATAAAAGCAAGG-3’；
反向环引物2LB：5’-GAAGGTAAAATGTTAACAAAAGCT-3’；
正向内引物2FIP-A：
5’-TCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTCCACTATCATTGATTATTTCATA-3’；
反向内引物2BIP：
5’-TGATTGCTTCCTGATCAAAATGGAAAATACGCAAGCAGTCACAT-3’；
所述第三LAMP检测液包括正向外引物3F3、反向外引物3B3、正向环引物3LF、反向环引物3LB、正向内引物3FIP-G和反向内引物3BIP，各引物的序列如下：
正向外引物3F3：5’-AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3’；
反向外引物3B3：5’-AAGCCTGATCTATATTGGGATA-3’；
正向环引物3LF：5’-CCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGGT-3’；
反向环引物3LB：5’-CCATGGGGTGAATATCTGGAAAA-3’；
正向内引物3FIP-G：
5’-CTTCAGGGCTTGGTCAATATAGAATGGATTGTAAGCACCCCCTCG-3’；
反向内引物3BIP：
5’-GAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCTGTGCATAAAATAAAGAACTTTG-3’；
所述第四LAMP检测液包括正向外引物3F3、反向外引物3B3、正向环引物3LF、反向环引物3LB、正向内引物3FIP-A和反向内引物3BIP，各引物的序列如下：
正向外引物3F3：5’-AGCAATTTCTTAACTTGATGGAA-3’；
反向外引物3B3：5’-AAGCCTGATCTATATTGGGATA-3’；
正向环引物3LF：5’-CCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGGT-3’；
反向环引物3LB：5’-CCATGGGGTGAATATCTGGAAAA-3’；
正向内引物3FIP-A：
5’-CTTCAGGGCTTGGTCAATATAGAATGGATTGTAAGCACCCCCTCA-3’；
反向内引物3BIP：
5’-GAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGCCTGTGCATAAAATAAAGAACTTTG-3’。
3.根据权利要求2所述的用于检测CYP2C19基因分型的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述第一LAMP检测液的成份终浓度为：0.4μM正向外引物2F3、0.4μM反向外引物2B3、0.8μM正向环引物2LF、0.8μM反向环引物2LB、1.6μM正向内引物2FIP-G和1.6μM反向内引物2BIP；所述第二LAMP检测液的成份终浓度为：0.4μM正向外引物2F3、0.4μM反向外引物2B3、0.8μM正向环引物2LF、0.8μM反向环引物2LB、1.6μM正向内引物2FIP-A和1.6μM反向内引物2BIP。
4.根据权利要求3所述的用于检测CYP2C19基因分型的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述第一LAMP检测液和所述第二LAMP检测液均还包括4UDNA聚合酶、50000×SYBR Green I和1×Lamp Master Mix。
5.根据权利要求2所述的用于检测CYP2C19基因分型的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述第三LAMP检测液的成份终浓度为：0.4μM正向外引物3F3、0.4μM反向外引物3B3、0.8μM正向环引物3LF、0.8μM反向环引物3LB、1.6μM正向内引物3FIP-G和1.6μM反向内引物3BIP；所述第四LAMP检测液的成份终浓度为：0.4μM正向外引物3F3、0.4μM反向外引物3B3、0.8μM正向环引物3LF、0.8μM反向环引物3LB、1.6μM正向内引物3FIP-A和1.6μM反向内引物3BIP。
6.根据权利要求5所述的用于检测CYP2C19基因分型的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述第三LAMP检测液和所述第四LAMP检测液均还包括4UDNA聚合酶、50000×SYBR GreenI、1×Lamp Master Mix。
7.一种检测CYP2C19基因分型的LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：取待检测样本抽提的DNA为模板；
步骤二：利用如权利要求4和/或权利要求6所述的LAMP检测试剂盒中的LAMP检测液分别对DNA模板进行LAMP扩增；
步骤三：结果判定：结合DNA模板分别与第一LAMP检测液和第二LAMP检测液的扩增反应结果来得到待检测样本CYP2C19*2基因位点的基因型，结合模板分别与第三LAMP检测液和第四LAMP检测液的扩增反应结果来得到待检测样本CYP2C19*3基因位点的基因型。
8.根据权利要求7所述的一种检测CYP2C19基因分型的LAMP检测方法，其特征在于，所述步骤二中LAMP扩增条件为：62℃恒温孵育30-60min。
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