CN106167829A - 可视化cyp2c19基因分型检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CYP2C19基因分型检测试剂盒，其特征在于，包括有4条引物，7条常规探针、以及2条与纳米金颗粒连接的探针；所述引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11，或分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11的反向互补序列；所述与纳米金颗粒连接的探针的碱基组成如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13所示，或SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13的反向互补序列所示。所述CYP2C19基因分型检测试剂盒，可实现可视化、低成本、高灵敏的CYP2C19基因分型检测。

Description

可视化CYP2C19基因分型检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物技术和基因检测领域，具体是一种CYP2C19基因分型检测试剂盒。
背景技术
CYP2C19基因编码的药物代谢酶是细胞色素P450同功酶的重要成员，也是参与体内药物代谢的重要酶之一。由于遗传多态性，CYP2C19基因编码的酶代谢活性在不同个体之间具有显著性差异。CYP2C19基因至少存在18种基因多态性，其中c.681G>A型和c.636G>A型是中国人群中最常见的两种等位基因型，这些突变能够引起CYP2C19基因编码的酶活性部分丧失，致使其代谢底物的能力减弱，从而引起相关药物代谢速率的个体化差异，最终导致相关药物疗效的个体化差异。临床中CYP2C19基因编码的酶活性根据其代谢药物能力强弱被分为三类：快代谢型(EM，基因型为*1/*1)、中代谢型(MM，基因型为*1/*2或*1/*3)和慢代谢型(PM，基因型为*2/*2、*3/*3或*2/*3)。对于三种不同基因型的个体，服用药物后的疗效和副作用存在明显差异，这给临床治疗造成困扰。
目前已经明确的与CYP2C19基因*2和*3两位点完全相关的药物有氯吡格雷、苯妥英、奥美拉唑和伏立康唑等。氯吡格雷(波立维)是目前世界范围内使用最广泛的噻吩吡啶类抗血小板药，用于急性冠脉综合征、冠脉支架术和冠心病的一级二级预防，可以减少心血管疾病患者心脏病发作、卒中以及死亡的风险。氯吡格雷是一种前体药物，在体外无活性，口服后必须在体内经肝脏细胞色素P450代谢为有效活性产物才能发挥其抗血小板聚集的作用。美国FDA发布警告，要求在波立维包装上附加“黑格标签”方可出售，以示提醒。由于波立维弱代谢者达不到药物应有的疗效，FDA建议药师可以通过检测CYP2C19的基因型来了解患者波立维的代谢能力，对于波立维弱代谢者可给患者选用其它抗凝血药物。丙戊酸是临床上常用的抗癫痫药之一，其血药浓度、疗效、不良反应个体差异性很大，是临床需要治疗药物监测的药物之一。苯妥英是临床上常用的抗癫痫药物，具有亲脂性，进入人体后经I相反应进行生物转化后，由肾脏和肝脏排出体外。苯妥英代谢受CYP2C9和CYP2C19基因调控。其研究结果显示CYP2C19*2和CYP2C19*3与苯妥英的代谢缺陷关系密切，是苯妥英的关键代谢酶。质子泵抑制药(PPIs)体内主要经CYP2C19代谢，其次是CYP3A4代谢。CYP2C19基因型与奥美拉唑临床疗效研究发现，奥美拉唑合用阿莫西林等抗生素治疗幽门螺旋杆菌感染性消化道溃疡患者，PM和EM杂合子愈合率明显高于EM纯合子。伏立康唑是一种广谱的三唑类抗真菌药，与目前国内市场上的抗真菌药相比，具有高效低毒的特点。伏立康唑通过细胞色素P450同工酶代谢，包括CYP2C19，CYP2C9和CYP3A4。这些酶的抑制剂或诱导剂可以分别增高或降低伏立康唑的血液浓度。伏立康唑进入人体后，EM与PM血液浓度差异显著，PM常规剂量可能出现毒副反应，此时应考虑减小剂量；EM和IM应考虑给予常规剂量，根据疗效小幅增、减剂量；给予常规剂量，若EM出现毒副反应或PM疗效不佳时，均应考虑换药。
目前市场上已有的CYP2C19基因分型检测试剂盒基本都是基于荧光信号检测的PCR扩增技术，需要用到实时荧光PCR设备或其它设备，其价格较为昂贵，不利于在设施条件差的医疗单位使用。而同时临床中，至今为止尚未有能够直接采用普通PCR循环仪器就能够实现CYP2C19基因分型检测的闭管方法。
发明内容
基于此，本发明的目的提供一种对设施条件要求低、结果判读简单、成本低廉的新型CYP2C19基因分型检测试剂盒。
本发明设计了一种新型的可视化CYP2C19基因分型检测试剂盒，该试剂盒是针对CYP2C19基因*2和*3位点实现可视化分型检测。
一种可视化CYP2C19基因分型检测试剂盒，包括有4条引物，7条常规探针、以及2条与纳米金颗粒连接的探针；
所述4条引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
所述7条常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11，或所述7条常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11的反向互补序列；
所述2条与纳米金颗粒连接的探针的碱基组成如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13所示，或SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13的反向互补序列所示。
通过本发明优化组合设计的引物和探针，本发明所述的CYP2C19基因分型检测试剂盒对CYP2C19基因*2和*3位点检测具备高特异性，能够特异的检出目标基因型；具备灵敏性，能够稳定性的检测低拷贝目标模板。
利用本发明中的CYP2C19基因分型检测试剂盒可实现短时间、高灵敏度的闭管核酸检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染。
本发明中的CYP2C19基因分型检测试剂盒能够采用普通PCR仪完成对CYP2C19基因*2和*3位点的分型检测，且结果区分特征明显。
本发明利用了基于纳米金探针的可视化核酸检测技术，通过特异性地设计了相应的引物和探针，构建了可视化CYP2C19基因分型检测试剂盒，其可用于CYP2C19基因分型的可视化检测，实现低成本、高灵敏的CYP2C19基因分型检测。通过检测患者基因组DNA中的c.681G>A型(*1>*2)和c.636G>A型(*1>*3)两单核苷酸多态性位点，判定该患者的CYP2C19基因编码酶的药物代谢速率类型，并根据患者的代谢速率类型辅助医生正确选择药物及剂量，以达到提高药物疗效、降低毒副作用的目的，为临床提供一种新型检测方法。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。
图1是本发明中引物探针设计原理。
图2是实施例2中检测反应的灵敏度的示意图。
图3是实施例3中匹配基因型检测结果的示意图。
图4是实施例4中干扰实验检测结果的示意图。
图5是实施例5中代表性样本检测结果的示意图。
有关附图的详细说明参见如下详细描述部分的内容。
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1 引物探针
根据CYP2C19基因*2和*3位点的分别特异性设计对应的引物和探针，针对*2位点和*3位点分别由两对特异性的引物和探针决定其检测结果，其引物设计的位置和方法的原理如图1所示。
所述CYP2C19基因分型检测试剂盒，包含4条引物、7条常规探针、2条纳米金修饰探针、反应液、酶液。
引物、探针和纳米金探针序列如引物1-引物4、探针1-探针7、纳米金探针1-纳米金探针2，或为上述序列的互补序列：
引物1：CCA GAG CTT GGC ATA TTG TAT CTA TAC CTT TAT TAA ATG C；SEQ IDNO.1
引物2：CCA TCG ATT CTT GGT GTT CTT TTA CTT TCT CCA A；SEQ ID NO.2
引物3：TCT GCT CCA TTA TTT TCC AGA AAC GTT TCG A；SEQ ID NO.3
引物4：ACT GTA AGT GGT TTC TCA GGA AGC AAA AAA CT；SEQ ID NO.4
探针1：CAA GGT TTT TAA GTAATT TGT TAT GGG TTC CA；SEQ ID NO.5
探针2：CGC GCC GAG GCG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG；SEQ ID NO.6
探针3：CGC GCC GAG GTG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG；SEQ ID NO.7
探针4：AGG ATT GTA AGC ACC CCC TGT；SEQ ID NO.8
探针5：CGC GCC GAG GGA TCC AGG TAA GGC CA；SEQ ID NO.9
探针6：CGC GCC GAG GAA TCC AGG TAA GGC CA；SEQ ID NO.10
探针7：GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGCGCG ATC GTG ATG AAC CAT；SEQ ID NO.11
纳米金探针1：Au-AAA AAA AAA AGT TCA TGA TCA CGA T；SEQ ID NO.12
纳米金探针2：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-Au。SEQ ID NO.13
本实施例所述的试剂盒中，所述的纳米金探针中的纳米金颗粒的平均尺寸为1nm-200nm，较佳的纳米金颗粒平均尺寸为5nm-80nm，本实施例中所用的纳米金颗粒平均尺寸为10nm-30nm。上述纳米金颗粒市面上能够购买得到的合格产品即可。
所述的分型检测试剂盒，所述酶液有两种酶混合而成，两种酶分别为扩增酶和内切酶，扩增酶可以是Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶，内切酶可以是TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN。本实施例中所用的扩增酶是Taq DNA聚合酶，内切酶所用的是AfuFEN。
所述CYP2C19基因分型检测试剂盒对CYP2C19基因*2和*3位点进行分型检测每例样本需要4管反应实现结果分型的判读，分别针对CYP2C19基因*2位点野生型(P1)、突变型(P2)和*3位点野生型(P3)、突变型(P4)，其步骤主要有以下三个阶段，而这三个阶段均是在同管闭管条件下完成的。第一阶段：模板扩增，通过引物对、扩增酶的参与，实现对目标模板的高灵敏扩增；第二阶段：通过探针和内切酶的参与，实现对目标模板向信号分子的高效率转化；第三阶段：通过纳米金探针实现对信号分子的高分辨识别。通过以上三个阶段的反应就可以实现在闭管条件下的高灵敏、高分辨、低成本的CYP2C19基因*2和*3位点进行分型检测。
所述的分型检测试剂盒，所述的检测结果判别方式可有肉眼直接判读，反应结束后反应液红色为阳性，反应液紫色或无色为阴性。
实施例2 CYP2C19基因*2和*3位点分型检测灵敏度
本实施例应用实施例1所述的所述CYP2C19基因分型检测试剂盒，检测了不同浓度的CYP2C19基因*2和*3位点分型的模板，用来验证本发明所陈述的可视化检测方法的可行性。
反应条件：
该试剂盒每样本检测由4管反应构成，分别含有针对四种基因型的引物和探针，各管反应总体积均为20μL。CYP2C19基因*2和*3位点检测反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：5’-CCA GAG CTT GGC ATA TTG TAT CTA TAC CTT TAT TAAATG C-3’，SEQ ID NO.1；引物2序列：5’-CCA TCG ATT CTT GGT GTT CTT TTA CTT TCTCCAA-3’，SEQ ID NO.2；引物3序列：5’-TCT GCT CCA TTA TTT TCC AGA AAC GTT TCGA-3’，SEQ ID NO.3；引物4序列：5’-C ACT GTA AGT GGT TTC TCA GGA AGC AAA AAA CT-3’，SEQID NO.4)，1μM探针(探针1序列：CAA GGT TTT TAA GTA ATT TGT TAT GGG TTC CA，SEQ IDNO.5；探针2序列：CGC GCC GAG GCG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG，SEQ ID NO.6；探针3序列：CGC GCC GAG GTG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG，SEQ ID NO.7；探针4序列：AGG ATTGTA AGC ACC CCC TGT，SEQ ID NO.8；探针5序列：CGC GCC GAG GGA TCC AGG TAA GGC CA，SEQ ID NO.9；探针6序列：CGC GCC GAG GAA TCC AGG TAA GGC CA，SEQ ID NO.10)，1μM探针7(GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATCGTG ATG AAC CAT，SEQ ID NO.11)加入纳米金探针(探针1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAAAAA A-Au，SEQ ID NO.12；探针2：Au-AAA AAA AAA AGT TCA TGA TCA CGA T，SEQ IDNO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶，2UAfuFEN酶，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入105、104、103、102、10、1及0拷贝的待测核酸(模板序列P1为：5’-ATA TTT TAT TTA TAT TTA TAG TTT TAAATT ACA ACC AGA GCT TGG CAT ATT GTA TCT ATA CCT TTA TTA AAT GCT TTT AAT TTAATA AAT TAT TGT TTT CTC TTA GAT ATG CAA TAA TTT TCC CAC TAT CAT TGA TTA TTTCCC GGG AAC CCA TAA CAA ATT ACT TAA AAA CCT TGC TTT TAT GGA AAG TGA TAT TTTGGA GAA AGT AAA AGA ACA CCA AGA ATC GAT GGA CAT CAA CAA CCC TCG GGA CTT TATTGA TTG CTT CCT GAT CAA AAT GGA-3’，SEQ ID NO.14；模板序列P2为：5’-ATA TTT TATTTA TAT TTA TAG TTT TAA ATT ACA ACC AGA GCT TGG CAT ATT GTA TCT ATA CCT TTATTA AAT GCT TTT AAT TTA ATA AAT TAT TGT TTT CTC TTA GAT ATG CAA TAA TTT TCCCAC TAT CAT TGA TTA TTT CCC AGG AAC CCA TAA CAA ATT ACT TAA AAA CCT TGC TTTTAT GGA AAG TGA TAT TTT GGA GAA AGT AAA AGA ACA CCA AGA ATC GAT GGA CAT CAACAA CCC TCG GGA CTT TAT TGA TTG CTT CCT GAT CAA AAT GGA-3’，SEQ ID NO.15；模板序列P3为：5’-CAT TTA GCT TCA CCC TGT GAT CCC ACT TTC ATC CTG GGC TGT GCT CCCTGC AAT GTG ATC TGC TCC ATT ATT TTC CAG AAA CGT TTC GAT TAT AAA GAT CAG CAATTT CTT AAC TTG ATG GAA AAA TTG AAT GAA AAC ATC AGG ATT GTA AGC ACC CCC TGGATC CAG GTA AGG CCA AGT TTT TTG CTT CCT GAG AAA CCA CTT ACA GTC TTT TTT TCTGGG AAA TCC AAA ATT CTA TAT TGA CCA AGC CCT GAA GTA CAT TTT TGA ATA CTA CAGTCT TGC CTA GAC AGC C-3’，SEQ ID NO.16；模板序列P4为：5’-CAT TTA GCT TCA CCC TGTGAT CCC ACT TTC ATC CTG GGC TGT GCT CCC TGC AAT GTG ATC TGC TCC ATT ATT TTCCAG AAA CGT TTC GAT TAT AAA GAT CAG CAA TTT CTT AAC TTG ATG GAA AAA TTG AATGAA AAC ATC AGG ATT GTA AGC ACC CCC TGA ATC CAG GTA AGG CCA AGT TTT TTG CTTCCT GAG AAA CCA CTT ACA GTC TTT TTT TCT GGG AAA TCC AAA ATT CTA TAT TGA CCAAGC CCT GAA GTA CAT TTT TGA ATA CTA CAG TCT TGC CTA GA CAG CC-3’，SEQ IDNO.17)。反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果示于图2中。图2的结果显示该方法能够稳定检测100拷贝的核酸分子(相当于0.3ng的人基因组DNA)，说明本发明试剂盒完全可检测实际基因组DNA样本。
实施例3 CYP2C19基因*2和*3位点分型检测匹配基因型样本检测
本实施例应用实施例1所述的所述CYP2C19基因分型检测试剂盒，检测了不同分型的外周血样本基因组DNA模板，又分有3例样本，分型结果分别为：*1*1、*1*1、*1*2，用来验证本发明所陈述的可视化检测方法检测实际样本的可行性。
反应条件：
该试剂盒每样本检测由4管反应构成，分别含有针对四种基因型的引物和探针，各管反应总体积均为20μL。CYP2C19基因*2和*3位点检测反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：5’-CCAGAG CTT GGC ATA TTG TAT CTA TAC CTT TAT TAAATG C-3’，SEQ ID NO.1；引物2序列：5’-CCA TCG ATT CTT GGT GTT CTT TTA CTT TCT CCAA-3’，SEQ ID NO.2；引物3序列：5’-TCT GCT CCA TTA TTT TCC AGA AAC GTT TCG A-3’，SEQ ID NO.3；引物4序列：5’-C ACT GTA AGT GGT TTC TCA GGA AGC AAA AAA CT-3’，SEQID NO.4)，1μM探针(探针1序列：CAA GGT TTT TAA GTA ATT TGT TAT GGG TTC CA，SEQ IDNO.5；探针2序列：CGC GCC GAG GCG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG，SEQ ID NO.6；探针3序列：CGC GCC GAG GTG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG，SEQ ID NO.7；探针4序列：AGG ATTGTA AGC ACC CCC TGT，SEQ ID NO.8；探针5序列：CGC GCC GAG GGA TCC AGG TAA GGC CA，SEQ ID NO.9；探针6序列：CGC GCC GAG GAA TCC AGG TAA GGC CA，SEQ ID NO.10)，1μM探针7(GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATCGTG ATG AAC CAT，SEQ ID NO.11)加入纳米金探针(探针1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAAAAA A-Au，SEQ ID NO.12；探针2：Au-AAA AAA AAA AGT TCA TGA TCA CGA T，SEQ IDNO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶，2U AfuFEN酶，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入四种待测基因组样本DNA。反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果参照图3。图3的结果显示3例样本的检测结果分别为*1*1、*1*1、*1*2，检测结果与临床分型结果一致，说明本发明试剂盒可以准确进行样本检测。图3和图4中的2和3代表了CYP2C19基因的*2和*3突变位点，M与W代表突变类型。
实施例4 CYP2C19基因*2和*3位点分型检测干扰实验验证
本实施例检测了加入不同干扰物质(氯吡格雷、华法林、甘油三酯、乙醇)的阳性质控品样本，用来验证本发明所陈述的可视化检测方法检测实际样本时干扰物质对结果的影响。
反应条件：
该试剂盒每样本检测由4管反应构成，分别含有针对四种基因型的引物和探针，各管反应总体积均为20μL。CYP2C19基因*2和*3位点检测反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：5’-CCA GAG CTT GGC ATA TTG TAT CTA TAC CTT TAT TAAATG C-3’，SEQ ID NO.1；引物2序列：5’-CCA TCG ATT CTT GGT GTT CTT TTA CTT TCTCCAA-3’，SEQ ID NO.2；引物3序列：5’-TCT GCT CCA TTA TTT TCC AGA AAC GTT TCG A-3’，SEQ ID NO.3；引物4序列：5’-C ACT GTA AGT GGT TTC TCA GGA AGC AAA AAA CT-3’，SEQ ID NO.4)，1μM探针(探针1序列：CAA GGT TTT TAA GTA ATT TGT TAT GGG TTC CA，SEQID NO.5；探针2序列：CGC GCC GAG GCG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG，SEQ ID NO.6；探针3序列：CGC GCC GAG GTG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG，SEQ ID NO.7；探针4序列：AGGATT GTA AGC ACC CCC TGT，SEQ ID NO.8；探针5序列：CGC GCC GAG GGA TCC AGG TAA GGCCA，SEQ ID NO.9；探针6序列：CGC GCC GAG GAA TCC AGG TAA GGC CA，SEQ ID NO.10)，1μM探针7(GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATCGTG ATG AAC CAT，SEQ ID NO.11)加入纳米金探针(探针1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAAAAA A-Au，SEQ ID NO.12；探针2：Au-AAA AAA AAA AGT TCA TGA TCA CGA T，SEQ IDNO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶，2UAfuFEN酶，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入不同干扰物质(氯吡格雷、华法林、甘油三酯、乙醇)的阳性质控品样本(包含P1、P2、P3、P4四种对应分型的质粒模板)。反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果参加图4。图4的结果显示不同干扰物质(氯吡格雷、华法林、甘油三酯、乙醇)不会影响本发明试剂盒的检测结果。
实施例5 样本检测结果
本实施例检测15例临床样本，用来评价本发明所陈述的可视化检测方法检测实际样本。
反应条件：
该试剂盒每样本检测由4管反应构成，分别含有针对四种基因型的引物和探针，各管反应总体积均为20μL。CYP2C19基因*2和*3位点检测反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：5’-CCA GAG CTT GGC ATA TTG TAT CTA TAC CTT TAT TAAATG C-3’，SEQ ID NO.1；引物2序列：5’-CCA TCG ATT CTT GGT GTT CTT TTA CTT TCT CCAA-3’，SEQ ID NO.2；引物3序列：5’-TCT GCT CCA TTA TTT TCC AGA AAC GTT TCG A-3’，SEQ ID NO.3；引物4序列：5’-C ACT GTA AGT GGT TTC TCA GGA AGC AAA AAA CT-3’，SEQID NO.4)，1μM探针(探针1序列：CAA GGT TTT TAA GTA ATT TGT TAT GGG TTC CA，SEQ IDNO.5；探针2序列：CGC GCC GAG GCG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG，SEQ ID NO.6；探针3序列：CGC GCC GAG GTG GGA AAT AAT CAA TGA TAG TG，SEQ ID NO.7；探针4序列：AGG ATTGTA AGC ACC CCC TGT，SEQ ID NO.8；探针5序列：CGC GCC GAG GGA TCC AGG TAA GGC CA，SEQ ID NO.9；探针6序列：CGC GCC GAG GAA TCC AGG TAA GGC CA，SEQ ID NO.10)，1μM探针7(GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATCGTG ATG AAC CAT，SEQ ID NO.11)加入纳米金探针(探针1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAAAAA A-Au，SEQ ID NO.12；探针2：Au-AAA AAA AAA AGT TCA TGA TCA CGA T，SEQ IDNO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶，2UAfuFEN酶，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入15例外周血提取的基因组DNA样本。反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果参见图5。图5的结果显示检测的临床样本分型完全与临床分型检测结果一致，这说明本发明试剂盒能够正常的反应临床样本的结果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种CYP2C19基因分型检测试剂盒，其特征在于，包括有4条引物，7条常规探针、以及2条与纳米金颗粒连接的探针；
所述4条引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
所述7条常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11，或所述7条常规探针分别为SEQID NO.5至SEQ ID NO.11的反向互补序列；
所述2条与纳米金颗粒连接的探针的碱基组成如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13所示，或SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13的反向互补序列所示。
2.根据权利要求1所述的CYP2C19基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述纳米金颗粒的平均尺寸为1nm-200nm。
3.根据权利要求2所述的CYP2C19基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述纳米金颗粒的平均尺寸为5nm-80nm。
4.根据权利要求3所述的CYP2C19基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述纳米金颗粒的平均尺寸为10nm-30nm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的CYP2C19基因分型检测试剂盒，其特征在于，还包括有扩增酶和内切酶，所述扩增酶选自th DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、VentDNA聚合酶中的一种；所述内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN中的一种。
6.根据权利要求5所述的CYP2C19基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述扩增酶为TaqDNA聚合酶，所述内切酶为AfuFEN。
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