CN106480220A - 可视化mthfr等位基因分型检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及MTHFR等位基因分型检测试剂盒，该试剂盒包括有4条引物、7条常规探针、以及2条与纳米金颗粒连接的探针；所述引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4；所述常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11，或分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11的反向互补序列；所述与纳米金颗粒连接的探针的碱基组成如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13所示，或SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13的反向互补序列所示。所述MTHFR等位基因分型检测试剂盒，可实现可视化、低成本、高灵敏的MTHFR等位基因rs1801133和rs1801131分型检测。

Description

可视化MTHFR等位基因分型检测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物技术和基因检测领域，具体是一种MTHFR等位基因(rs1801133和rs1801131)分型检测试剂盒。
背景技术
亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶，维持叶酸正常代谢。MTHFR等位基因位点rs1801133和rs1801131(c.677和c.1298位点)突变可导致其编码的叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症。对于MTHFR基因异常的人，MTHFR酶活性明显降低，造成叶酸代谢障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高，这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果。
另外，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)还参与同型半胱氨酸代谢过程，维持体内正常的同型半胱氨酸水平。研究发现，MTHFR基因c.677位点发生突变，会导致MTHFR的不稳定，致使酶活力的下降，最终致使血浆同型半胱氨酸水平的升高。同型半胱氨酸血症有引起动脉粥样硬化和血栓形成的危险，并最终可引起冠心病、脑梗死和外周血管病。中国人群中MTHFR C677T突变率高达25％，是中国H型高血压与脑卒中高发的重要遗传因素，因此，检测MTHFR基因c.677位点还具有预测携带者患高血压、脑卒中等疾病的作用。
目前市场上已有的MTHFR等位基因分型检测试剂盒基本都是基于荧光信号检测的PCR扩增技术，需要用到实时荧光PCR设备，其价格较为昂贵，不利于在设施条件差的医疗单位使用。而同时临床中，至今为止尚未有能够直接采用普通PCR循环仪器就能够实现可视化分型MTHFR等位基因的闭管方法。
发明内容
基于此，本发明的目的为提供一种对设施条件要求低、结果判读简单、成本低廉的新型MTHFR等位基因分型检测试剂盒,可实现分别针对MTHFR等位基因SNP位点位点1(rs1801133)野生型(P1)、位点1(rs1801133)突变型(P2)、位点2(rs1801131)野生型(P3)和位点2(rs1801131)突变型(P4)的分型检测。
实现上述目的的技术方案如下。
一种可视化MTHFR等位基因分型检测试剂盒，包括有4条引物，7条常规探针、以及2条与纳米金颗粒连接的探针；
所述4条引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
所述7条常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11，或所述7条常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11的反向互补序列；
所述2条与纳米金颗粒连接的探针的碱基组成如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13所示，或SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13的反向互补序列所示。
本发明利用了基于纳米金探针的可视化核酸检测技术，在将高灵敏的PCR扩增方法、高特异的酶切方法及可视化的纳米金探针检测方法相结合，用于MTHFR等位基因分型的可视化检测，实现低成本、高灵敏的MTHFR等位基因分型检测。通过检测携带者基因组DNA中的SNP位点(rs1801133和rs1801131)单核苷酸多态性位点，判定该携带者的MTHFR等位基因类型，并根据携带者的等位基因类型指导携带者服用叶酸剂量，或提醒携带者患高血压、脑卒中等疾病的风险，从而起到预警作用，提高携带者的生活质量，为临床和患者提供一种新型检测方法。
本发明具有以下有益效果:
采用本发明中的试剂盒对MTHFR等位基因SNP位点进行分型检测无需使用荧光探针，试剂存放无需避光，不必担心荧光衰减的问题，因此存放条件更加稳定。
本发明采用的纳米金探针有比较成熟的方法合成，成本低；具备高稳定性，能够耐受强热循环和强机械冲击；具备强适用性，能够与各种酶反应液共存而不影响反应的正常进行。
利用本发明中的试剂盒可实现短时间高灵敏度的闭管核酸检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染。
本发明中的试剂盒能够采用普通PCR仪完成对MTHFR等位基因位点的分型检测，且结果区分特征明显。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。
图1是本发明中引物探针设计原理。
图2是实施例2中检测反应的灵敏度。
图3是实施例3中匹配基因型检测结果。
图4是实施例4中干扰实验检测结果。
图5是实施例5中代表性样本检测结果。
具体实施方式
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1引物探针
根据MTHFR等位基因SNP位点的分别特异性设计对应的引物和探针，针对该位点分别由一对特异性的引物和探针决定其检测结果，其引物设计的位置和方法的原理如图1所示。
所述MTHFR等位基因分型检测试剂盒，包含4条引物、7条常规探针、2条纳米金修饰探针、反应液、酶液。
引物、探针和纳米金探针序列如引物1-引物4、探针1-探针7、纳米金探针1-纳米金探针2，或为上述序列的互补序列：
引物1：GCT GAC CTG AAG CAC TTG A；SEQ ID NO.1
引物2：GCG GAA GAA TGT GTC AGC C；SEQ ID NO.2
引物3：GGA GGA GCT GCT GAA GAT G；SEQ ID NO.3
引物4：CGG TTT GGT TCT CCC GAG A；SEQ ID NO.4
探针1：CGC GCC GAG GGC TCC CGC A；SEQ ID NO.5
探针2：CGC GCC GAG GAC TCC CGC AGA；SEQ ID NO.6
探针3：GCG TGA TGA TGA AAT CGT；SEQ ID NO.7
探针4：CGC GCC GAG GAA AGT GTC TTT GAA G；SEQ ID NO.8
探针5：CGC GCC GAG GCA AGT GTC TTT GAA GTC；SEQ ID NO.9
探针6：GAG CTG ACC AGT GAA GT；SEQ ID NO.10
探针7：GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGCGCG ATC GTG ATG AAC CAT；SEQ ID NO.11
纳米金探针1：Au-AAA AAA AAA AGT TCA TGA TCA CGA T；SEQ ID NO.12
纳米金探针2：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-Au。SEQ ID NO.13
本实施例所述的试剂盒中，所述的纳米金探针中的纳米金颗粒的平均尺寸为1nm-200nm，较佳的纳米金颗粒平均尺寸为5nm-80nm，本实施例中所用的纳米金颗粒平均尺寸为10nm-30nm。上述纳米金颗粒市面上能够购买得到的合格产品即可。
所述的分型检测试剂盒，所述酶液有两种酶混合而成，两种酶分别为扩增酶和内切酶，扩增酶可以是Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶，内切酶可以是TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN。本实施例中所用的扩增酶是Taq DNA聚合酶，内切酶所用的是AfuFEN。
所述MTHFR等位基因分型检测试剂盒对MTHFR等位基因SNP位点进行分型检测每例样本需要4管反应实现结果分型的判读，分别针对MTHFR等位基因SNP位点位点1(rs1801133)野生型(P1)、位点1(rs1801133)突变型(P2)、位点2(rs1801131)野生型(P3)和位点2(rs1801131)突变型(P4)，其步骤主要有以下三个阶段，而这三个阶段均是在同管闭管条件下完成的。第一阶段：模板扩增，通过引物对、扩增酶的参与，实现对目标模板的高灵敏扩增；第二阶段：通过探针和内切酶的参与，实现对目标模板向信号分子的高效率转化；第三阶段：通过纳米金探针实现对信号分子的高分辨识别。通过以上三个阶段的反应就可以实现在闭管条件下的高灵敏、高分辨、低成本的MTHFR等位基因SNP位点进行分型检测。
所述的分型检测试剂盒，所述的检测结果判别方式可有肉眼直接判读，反应结束后反应液红色为阳性，反应液无色为阴性。
实施例2 MTHFR等位基因SNP位点分型检测灵敏度
本实施例应用实施例1所述的所述MTHFR等位基因分型检测试剂盒，检测了不同浓度的MTHFR等位基因SNP位点分型的模板，用来验证本发明所陈述的可视化检测方法的可行性。
反应条件：
该试剂盒每样本检测由4管反应构成，分别含有针对四种基因型的引物和探针，各管反应总体积均为20μL。MTHFR等位基因SNP位点检测反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2；引物3序列：SEQ IDNO.3；引物4序列：SEQ ID NO.4)，1μM探针(探针1序列SEQ ID NO.5；探针2序列：SEQ IDNO.6；探针3序列SEQ ID NO.7；探针4序列：SEQ ID NO.8；探针5序列：SEQ ID NO.9；探针6序列：SEQ ID NO.10；探针7序列：SEQ ID NO.11)，0.1μM纳米金探针(探针1：SEQ ID NO.12；探针2：SEQ ID NO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶A，0.2mM dNTP。向该体系中分别加入105、104、103、102、10、1及0拷贝的待测核酸(模板序列P1为：5’-ATA TTT TAT TTA TAT TTATAG TTT TAA ATT ACA ACC AGA GCT TGG CAT ATT GTA TCT ATA CCT TTA TTA AAT GCTTTT AAT TTA ATA AAT TAT TGT TTT CTC TTA GAT ATG CAA TAA TTT TCC CAC TAT CATTGA TTA TTT CCC GGG AAC CCA TAA CAA ATT ACT TAA AAA CCT TGC TTT TAT GGA AAGTGA TAT TTT GGA GAA AGT AAA AGA ACA CCA AGA ATC GAT GGA CAT CAA CAA CCC TCGGGA CTT TAT TGA TTG CTT CCT GAT CAA AAT GGA-3’，SEQ ID NO.14；模板序列P2为：5’-ATA TTT TAT TTA TAT TTA TAG TTT TAA ATT ACA ACC AGA GCT TGG CAT ATT GTA TCTATA CCT TTA TTA AAT GCT TTT AAT TTA ATA AAT TAT TGT TTT CTC TTA GAT ATG CAATAA TTT TCC CAC TAT CAT TGA TTA TTT CCC AGG AAC CCA TAA CAA ATT ACT TAA AAACCT TGC TTT TAT GGA AAG TGA TAT TTT GGA GAA AGT AAA AGA ACA CCA AGA ATC GATGGA CAT CAA CAA CCC TCG GGA CTT TAT TGA TTG CTT CCT GAT CAA AAT GGA-3’，SEQ IDNO.15；模板序列P3为：5’-CAT TTA GCT TCA CCC TGT GAT CCC ACT TTC ATC CTG GGC TGTGCT CCC TGC AAT GTG ATC TGC TCC ATT ATT TTC CAG AAA CGT TTC GAT TAT AAA GATCAG CAA TTT CTT AAC TTG ATG GAA AAA TTG AAT GAA AAC ATC AGG ATT GTA AGC ACCCCC TGG ATC CAG GTA AGG CCA AGT TTT TTG CTT CCT GAG AAA CCA CTT ACA GTC TTTTTT TCT GGG AAA TCC AAA ATT CTA TAT TGA CCA AGC CCT GAA GTA CAT TTT TGA ATACTA CAG TCT TGC CTA GAC AGC C-3’，SEQ ID NO.16；模板序列P4为：5’-CAT TTA GCT TCACCC TGT GAT CCC ACT TTC ATC CTG GGC TGT GCT CCC TGC AAT GTG ATC TGC TCC ATTATT TTC CAG AAA CGT TTC GAT TAT AAA GAT CAG CAA TTT CTT AAC TTG ATG GAA AAATTG AAT GAA AAC ATC AGG ATT GTA AGC ACC CCC TGA ATC CAG GTA AGG CCA AGT TTTTTG CTT CCT GAG AAA CCACTT ACA GTC TTT TTT TCT GGG AAA TCC AAA ATT CTA TATTGA CCA AGC CCT GAA GTA CAT TTT TGA ATA CTA CAG TCT TGC CTA GA CAG CC-3’，SEQID NO.17)。反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果示于图2中。图2的结果显示本发明试剂盒可稳定的检测样本基因组DNA。
实施例3 MTHFR等位基因SNP位点分型检测匹配基因型样本检测
本实施例应用实施例1所述的所述MTHFR等位基因分型检测试剂盒，检测了不同分型的外周血样本基因组DNA模板，用来验证本发明所陈述的可视化检测方法检测实际样本的可行性。
反应条件：
该试剂盒每样本检测由4管反应构成，分别含有针对四种基因型的引物和探针，各管反应总体积均为20μL。MTHFR等位基因SNP位点检测反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2；引物3序列：SEQ IDNO.3；引物4序列：SEQ ID NO.4)，1μM探针(探针1序列SEQ ID NO.5；探针2序列：SEQ IDNO.6；探针3序列SEQ ID NO.7；探针4序列：SEQ ID NO.8；探针5序列：SEQ ID NO.9；探针6序列：SEQ ID NO.10；探针7序列：SEQ ID NO.11)，0.1μM纳米金探针(探针1：SEQ ID NO.12；探针2：SEQ ID NO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶A，0.2mM dNTP。向该体系中分别加入待测样本DNA。反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果参照图3(位点1为rs1801133，位点2为rs1801131；W代表野生，M代表突变)。图3的结果显示本发明试剂盒可以稳定进行样本检测。
实施例4 MTHFR等位基因SNP位点分型检测干扰实验验证
本实施例检测了加入不同干扰物质(血红蛋白、白蛋白、胆固醇、乙醇)的阳性样本，用来验证本发明所陈述的可视化检测方法检测实际样本时干扰物质对结果的影响。
反应条件：
该试剂盒每样本检测由4管反应构成，分别含有针对四种基因型的引物和探针，各管反应总体积均为20μL。MTHFR等位基因SNP位点检测反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2；引物3序列：SEQ IDNO.3；引物4序列：SEQ ID NO.4)，1μM探针(探针1序列SEQ ID NO.5；探针2序列：SEQ IDNO.6；探针3序列SEQ ID NO.7；探针4序列：SEQ ID NO.8；探针5序列：SEQ ID NO.9；探针6序列：SEQ ID NO.10；探针7序列：SEQ ID NO.11)，0.1μM纳米金探针(探针1：SEQ ID NO.12；探针2：SEQ ID NO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶A，0.2mM dNTP。向该体系中分别加入不同干扰物质(0.1mg/ml血红蛋白、0.01mmol/L白蛋白、0.2mmol/L胆固醇、0.1％乙醇)的阳性样本。反应体系构成为反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果参加图4(位点1为rs1801133，位点2为rs1801131；W代表野生，M代表突变)。图4的结果显示不同干扰物质(血红蛋白、白蛋白、胆固醇、乙醇)不会影响本发明试剂盒的检测结果。
实施例5样本检测结果
本实施例检测10例临床样本，用来评价本发明所陈述的可视化检测方法检测实际样本。
反应条件：
该试剂盒每样本检测由4管反应构成，分别含有针对四种基因型的引物和探针，各管反应总体积均为20μL。MTHFR等位基因SNP位点检测反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物(引物1序列：SEQ ID NO.1；引物2序列：SEQ ID NO.2；引物3序列：SEQ IDNO.3；引物4序列：SEQ ID NO.4)，1μM探针(探针1序列SEQ ID NO.5；探针2序列：SEQ IDNO.6；探针3序列SEQ ID NO.7；探针4序列：SEQ ID NO.8；探针5序列：SEQ ID NO.9；探针6序列：SEQ ID NO.10；探针7序列：SEQ ID NO.11)，0.1μM纳米金探针(探针1：SEQ ID NO.12；探针2：SEQ ID NO.13)，0.5U Taq DNA聚合酶和内切酶A，0.2mM dNTP。向该体系中分别加入10例临床样本DNA。反应程序为：94℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循环；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。
反应结束后拍照，结果参见图5(位点1为rs1801133，位点2为rs1801131；W代表野生，M代表突变)。图5的结果显示本发明试剂盒能够正常的反应临床样本的结果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
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cctttattaa atgcttttaa tttaataaat tattgttttc tcttagatat gcaataattt 120
tcccactatc attgattatt tcccgggaac ccataacaaa ttacttaaaa accttgcttt 180
tatggaaagt gatattttgg agaaagtaaa agaacaccaa gaatcgatgg acatcaacaa 240
ccctcgggac tttattgatt gcttcctgat caaaatgga 279
<210> 15
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atattttatt tatatttata gttttaaatt acaaccagag cttggcatat tgtatctata 60
cctttattaa atgcttttaa tttaataaat tattgttttc tcttagatat gcaataattt 120
tcccactatc attgattatt tcccaggaac ccataacaaa ttacttaaaa accttgcttt 180
tatggaaagt gatattttgg agaaagtaaa agaacaccaa gaatcgatgg acatcaacaa 240
ccctcgggac tttattgatt gcttcctgat caaaatgga 279
<210> 16
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
catttagctt caccctgtga tcccactttc atcctgggct gtgctccctg caatgtgatc 60
tgctccatta ttttccagaa acgtttcgat tataaagatc agcaatttct taacttgatg 120
gaaaaattga atgaaaacat caggattgta agcaccccct ggatccaggt aaggccaagt 180
tttttgcttc ctgagaaacc acttacagtc tttttttctg ggaaatccaa aattctatat 240
tgaccaagcc ctgaagtaca tttttgaata ctacagtctt gcctagacag cc 292
<210> 17
<211> 292
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
catttagctt caccctgtga tcccactttc atcctgggct gtgctccctg caatgtgatc 60
tgctccatta ttttccagaa acgtttcgat tataaagatc agcaatttct taacttgatg 120
gaaaaattga atgaaaacat caggattgta agcaccccct gaatccaggt aaggccaagt 180
tttttgcttc ctgagaaacc acttacagtc tttttttctg ggaaatccaa aattctatat 240
tgaccaagcc ctgaagtaca tttttgaata ctacagtctt gcctagacag cc 292

Claims (7)

1.一种MTHFR等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，包括有4条引物，7条常规探针、以及2条与纳米金颗粒连接的探针；
所述4条引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
所述7条常规探针分别为SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11，或所述7条常规探针分别为SEQID NO.5至SEQ ID NO.11的反向互补序列；
所述2条与纳米金颗粒连接的探针的碱基组成如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13所示，或SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13的反向互补序列所示。
2.根据权利要求1所述的MTHFR等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述纳米金颗粒的平均尺寸为1nm-200nm。
3.根据权利要求2所述的MTHFR等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述纳米金颗粒的平均尺寸为5nm-80nm。
4.根据权利要求3所述的MTHFR等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述纳米金颗粒的平均尺寸为10nm-30nm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的MTHFR等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，还包括有扩增酶，所述扩增酶选自Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶中的一种。
6.根据权利要求5所述的MTHFR等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，还包括有内切酶，所述内切酶选自TaqPol、TthPol、TaqExo、AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN或MthFEN中的一种。
7.根据权利要求6所述的MTHFR等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述扩增酶为Taq DNA聚合酶，所述内切酶为AfuFEN。
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