CN112126676B - 纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法及核酸检测方法 - Google Patents
纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法及核酸检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法及核酸检测方法。本发明通过获取纳米金杂交反应体系的特征吸收波长和在特定特征吸收波长下的第一区分时间或第二区分时间，后续在核酸检测时，只要反应至第一区分时间或第二区分时间即可，通过比较待测样本溶液在某一特征吸收波长下的吸收强度值与阴性吸收强度值或者比较待测样本溶液在两个特征吸收波长下的吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差，即可判断待测样本是否为阳性样本。该第一区分时间和第二区分时间都远远小于传统的杂交反应时间，因而通过本发明的方法可以有效缩短核酸检测时间，提高核酸检测的效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及基因检测技术领域，尤其是涉及一种纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法及核酸检测方法。
背景技术
自Mirkin课题组将纳米金颗粒表面修饰核酸分子并实现多种核酸和蛋白的可视化检测后，纳米金修饰探针已经被广泛应用在生物大分子的检测领域。在核酸检测中，通常是通过纳米金探针与目标核酸ssDNA(单链DNA)模板杂交，并在金属离子诱导下实现纳米金探针的聚集，若不存在目标核酸ssDNA模板，纳米金探针就会呈现分散状态。由此，在有、无目标核酸模板存在时，纳米金探针溶液在颜色上能够产生肉眼可分辨的显著性差异。此外，这种纳米金探针杂交后呈现的不同状态还可以通过紫外-可见光吸收曲线来判别。这种纳米金探针杂交后分散与聚集的状态在颜色上和紫外-可见光吸收曲线上出现的差异可以作为判断溶液中是否存在目标核酸模板的标准。通过纳米金显色的检测方式是并列于荧光检测方式的另一种便捷的核酸分子检测方式，其具有重要的作用。
目前关于常规纳米金探针热稳定性低且影响酶促反应等难题已逐步被解决，并已实现了封闭式核酸检测体系，可以稳定地检测多种核酸靶标，如专利ZL201611160054.X-可视化HLA-B*5801基因分型检测试剂盒。然而，目前基于纳米金探针的核酸检测方式其检测所需时间较长，一般需要杂交30min以上方有显著差异，这不利于对结果的快速判读，因此，需要进一步缩短其检测时间，以期能够获得更好更快的检测效果。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够有效缩短核酸检测时间的纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法及核酸检测方法。
一种纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法，包括如下步骤：
配制纳米金杂交反应体系；
在预设反应温度下记录所述纳米金杂交反应体系对不同波长光的吸收强度值，获取关于该纳米金杂交反应体系的特征吸收波长；
在预设反应温度下依次间隔第一预设时间记录所述纳米金杂交反应体系在至少一特征吸收波长下的吸收强度值随时间的变化，比较在当前特征吸收波长下的阳性吸收强度值与阴性吸收强度值，根据阳性吸收强度值与阴性吸收强度值之间的差值随时间的变化获取第一区分时间；或者，
在预设反应温度下依次间隔第二预设时间记录所述纳米金杂交反应体系在至少两个不同特征吸收波长下的吸收强度值之差随时间的变化，比较在当前两个特征吸收波长下的阳性吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差，根据阳性吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差之间的差值随时间的变化获取第二区分时间。
在其中一个实施例中，所述纳米金杂交反应体系中含有纳米金探针和纳米金杂交反应探针。
在其中一个实施例中，所述纳米金杂交反应体系中还含有PCR扩增引物和/或连接探针。
在其中一个实施例中，所述在预设反应温度下记录所述纳米金杂交反应体系对不同波长光的吸收强度值是在反应温度达到所述预设反应温度时就开始记录所述吸收强度值；和/或
所述不同波长光为全波长可见光。
在其中一个实施例中，所述在预设反应温度下依次间隔第一预设时间记录所述纳米金杂交反应体系在至少一特征吸收波长下的吸收强度值随时间的变化，是按照梯度关系设计多个所述第一预设时间分别进行实验，获取阳性吸收强度值与阴性吸收强度值之间的差值出现明显变化时的最短时间作为所述第一区分时间。
在其中一个实施例中，所述明显变化是指开始记录后随时间推移所述差值开始小于当前特征吸收波长下的预设吸收差值，或者开始记录后随时间推移所述差值开始大于当前特征吸收波长下的预设吸收差值。
在其中一个实施例中，所述在预设反应温度下依次间隔第二预设时间记录所述纳米金杂交反应体系在至少两个不同特征吸收波长下的吸收强度值之差随时间的变化，是按照梯度关系设计多个所述第二预设时间分别进行实验，获取两个特征吸收波长的阳性吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差之间的差值出现明显变化时的最短时间作为所述第二区分时间。
在其中一个实施例中，所述明显变化是指开始记录后随时间推移所述差值开始小于预设差值，或者开始记录后随时间推移所述差值开始大于预设差值。
一种核酸检测方法，包括如下步骤：
预先按照上述任一实施例所述的纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法获取所使用的纳米金杂交反应体系的至少一特征吸收波长和第一区分时间；
在预设反应温度下间隔一个所述第一区分时间记录含有所述纳米金杂交反应体系的待测样本溶液在相应特征吸收波长下的吸收强度值，比较此刻待测样本溶液的吸收强度值与阴性吸收强度值，根据待测样本溶液的吸收强度值与阴性吸收强度值之间的差值检测待测样本是否为阳性样本；或者，
预先按照上述任一实施例所述的纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法获取所使用的纳米金杂交反应体系的至少两个特征吸收波长和第二区分时间；
在预设反应温度下间隔一个所述第二区分时间记录含有所述纳米金杂交反应体系的待测样本在两个特征吸收波长下的吸收强度值之差，比较此刻待测样本溶液的吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差，根据待测样本溶液的吸收强度之差与阴性吸收强度值之差的差值检测样本是否为阳性样本。
在其中一个实施例中，所述纳米金杂交反应体系中含有序列如SEQ ID NO.7和8所示的纳米金探针和序列如SEQ ID NO.6所示的纳米金杂交反应探针；
所述预设反应温度为55℃；
所述特征吸收波长包括448nm、512nm、563nm和610nm；
所述第一区分时间为8min，所述第二区分时间为3min。
本发明在传统的纳米金探针检测技术的基础上进行进一步深入研究，通过获取纳米金杂交反应体系的特征吸收波长和在特定特征吸收波长下的第一区分时间或第二区分时间，后续在核酸检测时，只要反应至第一区分时间或第二区分时间即可，通过比较待测样本溶液在某一特征吸收波长下的吸收强度值与阴性吸收强度值或者比较待测样本溶液在两个特征吸收波长下的吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差，即可判断待测样本是否为阳性样本。
通过前期获取相应纳米金杂交反应体系的特征波长与区分时间，后续只要使用该纳米金杂交反应体系即可反应至上述第一区分时间或第二区分时间进行检测，可理解该第一区分时间和第二区分时间都远远小于传统的杂交反应时间，因而通过本发明的方法可以有效缩短核酸检测时间，提高核酸检测的效率。
附图说明
图1是纳米金杂交反应体系的光谱特征图谱，横坐标波长(Wavelength)，纵坐标吸收强度(Intensity)；
图2是纳米金杂交反应体系的光谱特征图谱中特定特征吸收波长处吸收强度值变化趋势，横坐标波长(Wavelength)，纵坐标吸收强度(Intensity)；
图3是纳米金杂交反应体系的特征波长吸收强度值随时间变化，横坐标时间(Time)，纵坐标吸收强度(Intensity)，Positive表示阳性，Negative表示阴性；
图4是纳米金杂交反应体系的特定波长吸收强度值差值随时间变化，横坐标时间(Time)，纵坐标吸收强度(Intensity)，Positive表示阳性，Negative表示阴性；
图5是体系中含有PCR和酶切反应体系对杂交检测体系的影响考察，横坐标时间(Time)，纵坐标吸收强度(Intensity)，Positive表示阳性，Negative表示阴性；
图6是待测样本反应体系的特征吸收波长处的吸收强度值差值分析，横坐标样本(Samples)，纵坐标吸收强度(Intensity)，Gentype表示基因型。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法，其包括如下步骤：
配制纳米金杂交反应体系；
在预设反应温度下记录纳米金杂交反应体系对不同波长光的吸收强度值，获取关于该纳米金杂交反应体系的特征吸收波长；
在预设反应温度下依次间隔第一预设时间记录纳米金杂交反应体系在至少一特征吸收波长下的吸收强度值随时间的变化，比较在当前特征吸收波长下的阳性吸收强度值与阴性吸收强度值，根据阳性吸收强度值与阴性吸收强度值之间的差值随时间的变化获取第一区分时间；或者，
在预设反应温度下依次间隔第二预设时间记录纳米金杂交反应体系在至少两个不同特征吸收波长下的吸收强度值之差随时间的变化，比较在当前两个特征吸收波长下的阳性吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差，根据阳性吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差之间的差值随时间的变化获取第二区分时间。
所述阳性为纳米金保持分散状态情况下的反应体系，所述阴性为纳米金由于杂交而发生交联的反应体系。
该配制的纳米金杂交反应体系可以是不含有样本的反应体系，其中优选含有纳米金探针和纳米金杂交反应探针，如含有序列如SEQ ID NO.7和8所示的纳米金探针和序列如SEQ ID NO.6所示的纳米金杂交反应探针的Tris缓冲液等。进一步，该纳米金杂交反应体系中还可以含有PCR扩增引物和/或连接探针，如含有序列如SEQ ID NO.1和2所示的PCR扩增引物和/或序列如SEQ ID NO.3、4和5所示的连接探针。
在一个具体示例中，在预设反应温度下记录纳米金杂交反应体系对不同波长光的吸收强度值是在反应温度达到预设反应温度时就开始记录吸收强度值。本文所述的不同波长光优选为全波长可见光。
在一个具体示例中，在预设反应温度下依次间隔第一预设时间记录纳米金杂交反应体系在至少一特征吸收波长下的吸收强度值随时间的变化，是按照梯度关系设计多个第一预设时间分别进行实验，获取阳性吸收强度值与阴性吸收强度值之间的差值出现明显变化时的最短时间作为第一区分时间。例如，分别以3min、4min、5min、6min作为第一预设时间进行实验，获取阳性吸收强度值与阴性吸收强度值随时间的变化曲线，在3min时，阳性吸收强度值与阴性吸收强度值的差值无明显变化，在4min时，阳性吸收强度值与阴性吸收强度值的差值出现明显变化，在5min和6min时，阳性吸收强度值与阴性吸收强度值的差值也出现明显变化，这样就可以将4min作为最短时间，因而第一区分时间也可以确定为4min。
所述明显变化是指开始记录后随时间推移差值开始小于当前特征吸收波长下的预设吸收差值，或者开始记录后随时间推移差值开始大于当前特征吸收波长下的预设吸收差值，具体视阴性吸收强度值和阳性吸收强度值的变化趋势而定，例如随时间推移，阳性吸收强度值可以保持基本不变，阴性吸收强度值逐渐增大，这时阳性吸收强度值与阴性吸收强度值的差值随时间推移可能逐渐缩小，也可能逐渐增大，因此，根据具体的变化趋势来确定预设吸收差值即可。
在一个具体示例中，在预设反应温度下依次间隔第二预设时间记录纳米金杂交反应体系在至少两个不同特征吸收波长下的吸收强度值之差随时间的变化，是按照梯度关系设计多个第二预设时间分别进行实验，获取两个特征吸收波长的阳性吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差之间的差值出现明显变化时的最短时间作为第二区分时间。此处大致同第一区分时间的获取方法，所不同的是，根据在两个特征吸收波长下的阳性吸收强度值之差和阴性吸收强度值之差随时间变化来区分反应结果。例如获取阳性和阴性在448nm与610nm处的吸收强度值之差随时间的变化曲线，再根据阳性吸收强度之差与阴性吸收强度之差的差值来获取第二区分时间。所述明显变化是指开始记录后随时间推移差值开始小于预设差值，或者开始记录后随时间推移差值开始大于预设差值。
通过在两个特征吸收波长下的吸收强度值之差作曲线，可以进一步放大在单个特征吸收波长下的吸收强度值随时间的变化，因而往往获取的第二区分时间比第一区分时间还要短。
进一步，本发明还提供了一种核酸检测方法，其包括如下步骤：
预先按照上述纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法获取所使用的纳米金杂交反应体系的至少一特征吸收波长和第一区分时间；
在预设反应温度下间隔一个第一区分时间记录含有纳米金杂交反应体系的待测样本溶液在相应特征吸收波长下的吸收强度值，比较此刻待测样本溶液的吸收强度值与阴性吸收强度值，根据待测样本溶液的吸收强度值与阴性吸收强度值之间的差值检测待测样本是否为阳性样本；或者，
预先按照上述纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法获取所使用的纳米金杂交反应体系的至少两个特征吸收波长和第二区分时间；
在预设反应温度下间隔一个第二区分时间记录含有纳米金杂交反应体系的待测样本在两个特征吸收波长下的吸收强度值之差，比较此刻待测样本溶液的吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差，根据待测样本溶液的吸收强度之差与阴性吸收强度值之差的差值检测样本是否为阳性样本。
当待测样本的吸收强度值与阴性吸收强度值之间无差或差别很小时，或者当待测样本溶液的吸收强度之差与阴性吸收强度值之差之间无差或者差别很小时，基本可以确定样本为阴性样本，当相应的差别明显时，基本可以确定样本为阳性样本。
例如，在一个具体示例中，纳米金杂交反应体系中含有序列如SEQ ID NO.7和8所示的纳米金探针和序列如SEQ ID NO.6所示的纳米金杂交反应探针；反应体系组成可以是在10mM pH8.5的Tris缓冲液中添加所述纳米金探针和所述纳米金杂交反应探针，探针的浓度可以是但不限于是0.2～2μM。对这样的反应体系先在96℃变性30s后，以预设反应温度(例如55℃)反应。最终在可见光波长范围内，获取的特征吸收波长包括448nm、512nm、563nm和610nm；依据上述方法，可以确定第一区分时间为8min，第二区分时间为3min。
本发明在传统的纳米金探针检测技术的基础上进行进一步深入研究，通过获取纳米金杂交反应体系的特征吸收波长和在特定特征吸收波长下的第一区分时间或第二区分时间，后续在核酸检测时，只要反应至第一区分时间或第二区分时间即可，通过比较待测样本溶液在某一特征吸收波长下的吸收强度值与阴性吸收强度值或者比较待测样本溶液在两个特征吸收波长下的吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差，即可判断待测样本是否为阳性样本。
通过前期获取相应纳米金杂交反应体系的特征波长与区分时间，后续只要使用该纳米金杂交反应体系即可反应至上述第一区分时间或第二区分时间进行检测，可理解该第一区分时间和第二区分时间都远远小于传统的杂交反应时间，因而通过本发明的方法可以有效缩短核酸检测时间，提高核酸检测的效率。该核酸的检测方法可以用于非疾病诊断治疗目的的核酸检测场合，具有效率和准确性都较高的优点。
以下结合具体实施例和对比例对本发明的纳米金杂交反应体系特征波长和区分时间的获取方法以及核酸检测方法作进一步详细的说明。
实施例1特征波长和区分时间的获取
1.纳米金杂交反应体系的全波长光谱特征图谱分析
反应总体积均为20μL，反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1nM-10nM纳米金探针(探针1：GCA GTA CCA CAA GAC TTT TTT TTT T-Au，SEQ ID NO.7；探针2：Au-TTTTTT TTT TGT TCA TGA TCA CGA T，SEQ ID NO.8)。反应体系构成的反应程序为：96℃，30s；55℃，40min。
反应至55℃时，采用光谱检测装置记录开始时的光谱信号值，结果示于图1中。图1的结果显示了纳米金杂交反应体系的全波长与吸收值强度的关系，存在4个特征吸收光谱，分别为448nm、512nm、563nm和610nm。
2.纳米金杂交反应体系的光谱特征图谱中特征波长吸收值变化趋势分析
反应总体积均为20μL，反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、0.2～2μM纳米金杂交反应探针(GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTCGGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT，SEQ ID NO.6)、1nM-10nM纳米金探针(探针1：GCA GTA CCACAA GAC TTT TTT TTT T-Au，SEQ ID NO.7；探针2：Au-TTT TTT TTT TGT TCA TGA TCA CGAT，SEQ ID NO.8)。反应体系构成的反应程序为：96℃，30s；55℃，40min。
反应至55℃时，每隔8min采用光谱检测装置记录光谱信号值，结果示于图2中。图2的结果显示了纳米金杂交反应体系的特征吸收波长处的吸收值强度与时间的关系，比较后发现，由于纳米金探针和纳米金杂交反应探针杂交而发生交联，随着时间变化，光谱波长610nm附近处的吸收值逐渐增加，而光谱波长448nm和510nm附近处的吸收值逐渐降低，而563nm处的吸收值变化规模不显著。
3.纳米金杂交反应体系的特征吸收波长处吸收强度值随时间变化区分反应结果分析
反应总体积均为20μL，反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、0.2～2μM纳米金杂交反应探针(GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGAGTC CTCGGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT，SEQ ID NO.6)、1nM-10nM纳米金探针(探针1：GCA GTA CCACAA GAC TTT TTT TTT T-Au，SEQ ID NO.7；探针2：Au-TTT TTT TTT TGT TCA TGA TCA CGAT，SEQ ID NO.8)。反应体系构成的反应程序为：96℃，30s；55℃，40min。
反应至55℃时，每隔8min采用光谱检测装置记录光谱信号值，平行完成3次检测实验，结果示于图3中。图3的结果显示了纳米金杂交反应体系在相应波长处(阳性为纳米金保持分散状态情况下的反应体系，阴性为纳米金由于杂交而发生交联的反应体系)，不同时间的阳性吸收强度值基本维持稳定，而阴性吸收强度值则存在一定规律的变化。如图3的610nm波长处的检测结果，以单波长吸收强度值随时间变化趋势来看，最快需要8min能判读检测结果，相比目前的可视化检测方法需要30min时间判读，其检测时间缩短了接近4倍。同时注意到448nm或510nm波长与610nm波长处的吸收值变化趋势与时间呈现负相关，这可能成为进一步缩短检测时间的新方式。
4.纳米金杂交反应体系的特征吸收波长处吸收强度值差值随时间变化区分反应结果分析
反应总体积均为20μL，反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、0.2～2μM纳米金杂交反应探针(GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTCGGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT，SEQ ID NO.6)、1nM-10nM纳米金探针(探针1：GCA GTA CCACAA GAC TTT TTT TTT T-Au，SEQ ID NO.7；探针2：Au-TTT TTT TTT TGT TCA TGA TCA CGAT，SEQ ID NO.8)。反应体系构成的反应程序为：96℃，30s；55℃，40min。
反应至55℃时，每隔1min采用光谱检测装置记录光谱信号值，平行完成3次检测实验，取448nm或510nm波长与610nm波长处的吸收值做差值计算，并与反应时间作图，其结果示于图4中。图4的结果显示了纳米金杂交反应体系相应波长处，不同时间的阳性吸收强度值差值基本维持稳定，而阴性吸收强度值差值则随反应时间变化其区分更加显著，且阳性和阴性结果区分的时间可以进一步缩短至3-4min，相比目前的可视化检测方法需要30min时间判读，其判读时间缩短了近10倍，显示该波长吸收值差值法较单波长吸收值的判读方式更具先进性。
5.体系中含有PCR和酶切反应体系对杂交检测体系的影响考察
反应总体积均为20μL，反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、0.2-2μM PCR扩增引物(引物1序列：5’-GGA CCC CAG CTC CTT AAC A-3’，SEQ ID NO.1；引物2序列：5’-CCA TGT GGC AAA GTC GG-3’，SEQ ID NO.2)、1μM连接探针(连接探针1序列：CTC CGA GGAAAC TCT，SEQ ID NO.3；连接探针2序列：CGC GCC GAG GGT CCC CCC C，SEQ ID NO.4；连接探针3序列：CGC GCC GAG GAT CCC CCC C，SEQ ID NO.5)，0.2～2μM纳米金杂交反应探针(GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTGATG AAC CAT，SEQ ID NO.6)、1nM-10nM纳米金探针(探针1：GCA GTA CCA CAA GAC TTT TTTTTT T-Au，SEQ ID NO.7；探针2：Au-TTT TTT TTT TGT TCA TGA TCA CGA T，SEQ ID NO.8)、1U Taq DNA聚合酶、2U内切酶、0.2-1mM dNTP。与不含有PCR和酶切组分的简单体系进行比较，反应体系构成的反应程序为：96℃，30s；55℃，40min。
反应至55℃时，每隔1min采用光谱检测装置记录光谱信号值，平行完成3次检测实验，取448nm或510nm波长与610nm波长处的吸收值做差值计算，并与反应时间作图，其结果示于图5中。图5中A与B为简单体系检测结果，C与D为完整体系检测结果，根据结果，A与C结果基本一致，而B与D结果基本一致，这显示完整体系中的一些组分未对检测结果有可见的影响，阳性和阴性结果区分的时间等特征基本和未加入PCR和酶切组分的简单体系一致，这说明PCR和酶切等组分不会影响到纳米金杂交体系的光谱强度变化。
实施例2采用纳米金杂交反应体系的两个特定波长吸收强度值差值判读实际样本检测结果
反应总体积均为20μL，反应体系组成为：10mM Tris缓冲液(pH 8.5)、0.2-2μM PCR扩增引物(引物1序列：5’-GGA CCC CAG CTC CTT AAC A-3’，SEQ ID NO.1；引物2序列：5’-CCA TGT GGC AAA GTC GG-3’，SEQ ID NO.2)、1μM连接探针(连接探针1序列：CTC CGA GGAAAC TCT，SEQ ID NO.3；连接探针2序列：CGC GCC GAG GGT CCC CCC C，SEQ ID NO.4；连接探针3序列：CGC GCC GAG GAT CCC CCC C，SEQ ID NO.5)，0.2～2μM纳米金杂交反应探针(GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTGATG AAC CAT，SEQ ID NO.6)、1nM-10nM纳米金探针(探针1：GCA GTA CCA CAA GAC TTT TTTTTT T-Au，SEQ ID NO.7；探针2：Au-TTT TTT TTT TGT TCA TGA TCA CGA T，SEQ ID NO.8)、1U Taq DNA聚合酶、2U内切酶、0.2-1mM dNTP。
向该体系中分别加入5例待检测实际血液样本提取的基因组DNA，用以分型HLA-B*5801等位基因位点。反应程序为：96℃，30s；96℃，2s，70℃，15s，30循环；96℃，2s，63℃，10min；55℃，4min。反应至55℃时，采用光谱检测装置记录开始时和第4分钟时的光谱信号值，取448nm或510nm波长与610nm波长处的吸收值做差值，并根据结果判断样本的基因分型。
样本检测结果示于图6中。图6的结果显示了5例样本的纳米金杂交体系相应波长吸收强度值差值，根据结果，可以判断样本S1至S5的HLA-B*5801等位基因位点分别为GG、AA、GA、GG和GG，该结果和样本测序结果一致，这显示该方法可以完成样本的检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市宝创生物技术有限公司
<120> 纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法及核酸检测方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaccccagc tccttaaca 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccatgtggca aagtcgg 17
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctccgaggaa actct 15
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcgccgagg gtccccccc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcgccgagg atccccccc 19
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcttgtggt actgcactcg tctcggtttt ccgagacgag tcctcggcgc gatcgtgatg 60
aaccat 66
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcagtaccac aagacttttt ttttt 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttttttttt gttcatgatc acgat 25
Claims (7)
1.一种纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制纳米金杂交反应体系，包括阳性反应体系和阴性反应体系，所述阳性反应体系中纳米金保持分散状态，所述阴性反应体系中纳米金由于杂交而发生交联；
在预设反应温度下记录所述纳米金杂交反应体系对不同波长光的吸收强度值，获取关于该纳米金杂交反应体系的特征吸收波长；
在预设反应温度下依次间隔第二预设时间记录所述纳米金杂交反应体系在至少两个不同特征吸收波长下的吸收强度值之差随时间的变化，比较在当前两个特征吸收波长下的阳性吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差，根据阳性吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差之间的差值随时间的变化获取第二区分时间，在所选择的至少两个不同特征吸收波长中有两个不同波长满足：所述纳米金杂交反应体系对该两个不同波长的光的吸收强度随时间的变化趋势相反；
所述在预设反应温度下依次间隔第二预设时间记录所述纳米金杂交反应体系在至少两个不同特征吸收波长下的吸收强度值之差随时间的变化，是按照梯度关系设计多个所述第二预设时间分别进行实验，获取两个特征吸收波长的阳性吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差之间的差值出现明显变化时的最短时间作为所述第二区分时间；
所述明显变化是指开始记录后随时间推移所述差值开始小于预设差值，或者开始记录后随时间推移所述差值开始大于预设差值。
2.如权利要求1所述的纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法，其特征在于，所述纳米金杂交反应体系中含有纳米金探针和纳米金杂交反应探针。
3.如权利要求2所述的纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法，其特征在于，所述纳米金杂交反应体系中还含有PCR扩增引物和/或连接探针。
4.如权利要求1~3中任一项所述的纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法，其特征在于，所述在预设反应温度下记录所述纳米金杂交反应体系对不同波长光的吸收强度值是在反应温度达到所述预设反应温度时就开始记录所述吸收强度值。
5.如权利要求1~3中任一项所述的纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法，其特征在于，所述不同波长光为全波长可见光。
6.一种非疾病诊断和治疗目的的核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
预先按照如权利要求1~5中任一项所述的纳米金杂交反应体系特征波长与区分时间的获取方法获取所使用的纳米金杂交反应体系的至少两个特征吸收波长和第二区分时间；
在预设反应温度下间隔一个所述第二区分时间记录含有所述纳米金杂交反应体系的待测样本在两个特征吸收波长下的吸收强度值之差，比较此刻待测样本溶液的吸收强度值之差与阴性吸收强度值之差，根据待测样本溶液的吸收强度之差与阴性吸收强度值之差的差值检测样本是否为阳性样本。
7.如权利要求6所述的非疾病诊断和治疗目的的核酸检测方法，其特征在于，所述纳米金杂交反应体系中含有序列如SEQ ID NO.7和8所示的纳米金探针和序列如SEQ ID NO.6所示的纳米金杂交反应探针；
所述预设反应温度为55℃；
所述特征吸收波长包括448nm、512nm和610nm；
所述第二区分时间为3min。
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| CN101344481A (zh) * | 2008-08-18 | 2009-01-14 | 厦门大学 | 一种用纳米金检测dna突变的方法 |
| CN106480220A (zh) * | 2016-12-15 | 2017-03-08 | 广州市宝创生物技术有限公司 | 可视化mthfr等位基因分型检测试剂盒 |
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- 2019-06-25 CN CN201910553115.6A patent/CN112126676B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Robert Elghanian等.Selective Colorimetric Detection of Polynucleotides Based on the Distance-Dependent Optical Properties of Gold Nanoparticles.《Science》.2017,第277卷(第22期), * |
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