CN118064588A - 一种检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针及应用 - Google Patents
一种检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了公开了一种检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针及其应用；所述单链探针的序列如SEQ ID NO：1所示，且所述单链探针标记有荧光基团FAM和淬灭基团BHQ。本发明将所述单链探针联合CRISPR‑Cas12a系统应用于TdT的检测中，通过TdT触发的报告基因ssDNA的无模板延伸，使得其与crRNA结合产生长poly‑A扩增子，从而激活CRISPR/Cas12a的顺式和反式切割能力；与现有技术相比，可以最大程度地简化反应系统的组成，简化检测方法的操作步骤，同时，还能够利用CRISPR‑Cas12a系统的顺式切割和反式切割活性放大荧光信号的指数，实现TdT的超灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子检测技术领域，具体涉及一种检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针及应用。
背景技术
末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase，TdT，简称末端转移酶)是一种模板非依赖型DNA聚合酶，具有不需要模板就能催化脱氧核糖核苷酸聚合的能力。于1960年由Bollum从小牛胸腺中纯化得到，其意义在于与淋巴肿瘤的分类相关，因为它主要在胸腺T细胞和骨髓中一小部分Ig阴性细胞中表达，这种独特的表达模式表明，TdT有可能作为白血病疾病的一种有价值的生物标志物。此外，TdT还是一种具有从零开始产生基因组物质特性的DNA聚合酶，这一特性导致其广泛应用于检测各种目标分析物(包括核酸、蛋白质和金属离子)的生物传感器的开发中。鉴于TdT在病理功能和生物传感器应用中的重要性，开发确定TdT活性的有效方法非常重要。这些方法可以进一步推进对TdT潜在功能的研究和开发，并有助于生物化学和生物医学分析中生物传感器的发展。
目前，可用于TdT分析的标准方法包括凝胶电泳分析法、免疫学测定法等。凝胶电泳分析法依赖于放射性标记的核苷酸三磷酸聚合到单链DNA(ssDNA)底物的3’-OH末端，但这种分析受到诸如放射性污染和劳动密集型程序等问题的阻碍。而免疫学测定法利用酶联免疫吸附测定(ELISA)来定量TdT活性，由于该方法依赖于抗体制备的复杂过程，以及固定和分离所涉及的多个步骤，导致检测费用高、程序耗时，使得其在实际应用时具有成本高、检测时间长等缺点，不利于推广应用。进一步地，现有技术的一些研究通过对TDT进行优化来实现分析方法的改进，例如，通过利用TdT随机延长序列特异性DNA，如dGTP和dCTP混合池下的富G序列，与硫黄素T结合，并作为过氧化物酶模拟物，从而直接产生增强的TdT反应信号；或；通过使用TdT产生的序列特异性DNA作为模板来诱导进一步的等温扩增反应或作为接头与纳米材料结合，间接导致扩增的荧光或电信号。上述改进的步骤包括(1)TdT延伸以产生序列特异性DNA，(2)用于纳米材料合成的辅助探针或化学反应的设计，以及(3)序列特异性DNA与其他探针或酶的结合，或序列特异性DNA与纳米材料的结合。这些连续操作不仅需要复杂的分析工作流程和延长的周转时间，还会增加由于人为错误和交叉污染导致的分析变化和错误结果的风险。显然繁琐的步骤依旧限制了TdT分析方法的进一步推广应用。
鉴于现有方法的局限性及其不能完全满足TdT分析的要求，显然需要开发一种简单、快速和灵敏的TdT分析方法。
发明内容
有鉴于此，为解决上述问题，提供一种检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针及其应用，提供一种简单、易操作、灵敏度高的检测方法。
作为本发明的目的之一，本发明提供一种检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针，所述单链探针的序列如SEQ ID NO：1所示，且所述单链探针标记有荧光团FAM和淬灭基团BHQ。
上述的检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针可以应用在TdT的荧光检测中。
作为本发明另一个目的，还提供了一种一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法，其特征在于，包括如权利要求1所述的单链探针和含有TdT的待测样本混合后进行荧光检测。
具体地，包括使用基于crRNA和CRISPR/Cas12a系统进行的等温扩增反应实现TdT的检测；所述单链探针通过触发基于CRISPR/Cas12a系统的等温扩增反应，在crRNA的作用下对所述单链探针进行靶向切割，实现荧光检测信号的放大。
作为一种优选的实施方式，所述一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法包括将单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP和Cas12a蛋白混合后进行孵育后进行荧光检测，实现末端脱氧核糖核酸转移酶的检测。
作为一种优选的实施方式，crRNA的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；利用Cas12a蛋白的辅助反式切割和顺式切割活性在crRNA的作用下对报告基因ssDNA进行靶向切割，实现检测信号的放大。
优选地，所述单链探针的浓度为2.5μM。
优选地，dATP的浓度为10mM。
优选地，TdT缓冲液为10×TdT缓冲液。
优选地，NEB缓冲液1为10×NEB缓冲液1。
优选地，所述单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白体积比为2∶2∶2∶2∶2∶2∶1。
优选地，所述孵育的条件包括37℃下孵育2h，80℃下加热10min。
进一步地，所述一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法还包括以下步骤：
将一系列不同浓度的标准TdT溶液分别与包含所述单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白和水的混合体系混合进行孵育，获得反应产物，之后对所述反应产物进行荧光强度检测，建立TdT浓度与荧光强度的标准曲线；根据所述标准曲线拟合得到线性回归方程：F520＝1.339CTdT+28.85；
将待测样本的荧光强度代入所述线性回归方程中得到末端脱氧核糖核酸转移酶的含量。
优选地，采用上述检测方法，TdT的检测限为0.01U/mL。
本发明所获得的有益技术效果：
1.通过采用本发明的技术方案，将CRISPR-Cas12a系统用于TdT检测中，通过TdT触发的报告基因ssDNA的无模板延伸，使得其与crRNA结合产生长poly-A扩增子，从而激活CRISPR/Cas12a的顺式和反式切割能力；与现有的基于CRISPR的生物传感方法相比，该方法最大程度地简化了反应系统的组成，简化检测方法的操作步骤，同时，还能够利用CRISPR-Cas12a系统的顺式切割和反式切割活性，放大荧光信号的指数，实现TdT的超灵敏检测。
2.本发明在基于CRISPR-Cas12a系统和特异性设计的crRNA的联合作用下，通过一锅法直接混合后进行孵育即可实现TdT的检测，利用Cas12a蛋白的反式切割能力进行信号报告，以及Cas蛋白的顺式切割能力在优化的crRNA的作用下对ssDNA进行靶向切割，实现检测信号的放大，对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的检测具有特异性。
3.采用本发明的技术方案，通过对温度和反应时间进行优化，能够提高检测的灵敏性，与常规的检测方法相比，灵敏度能够至少提高2个数量级。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中所记载的仅是一些优选的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的反应机理图。
图2是本发明实施例1中可行性验证的荧光性能测试示意图。
图3是本发明实施例2中反应机理的凝胶电泳条带图。
图4是本发明实施例3的线性范围及标准曲线图。
图5是本发明实施例3的温度与荧光信号强度的关系图；
图6是本发明实施例3的反应时间与荧光信号强度的关系图；
图7是本发明实施例4中特异性测试图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。
作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种用于一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针及应用。所述单链探针的序列如SEQ ID NO：1所示，且所述单链探针标记有荧光团FAM和淬灭基团BHQ。淬灭基团BHQ标记在序列中部。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的用于一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针的制备方法，其主要将报告基因ssDNA与Tris缓冲液混合即可。
本发明另一个方面还提供了聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)技术的反应系统作为生物检测的工具，尤其地，本发明采用的(CRISPR)技术是由Cas12a蛋白和较短的CRISPR RNAs(crRNA)组成的CRISPR/Cas12a系统。
另一个方面，上述的CRISPR技术中，利用Cas12a蛋白的辅助反式切割和顺式切割活性作为一种生物传感器，利用Cas12a蛋白的反式切割能力进行信号报告，以及Cas蛋白的顺式切割能力在优化的crRNA的作用下对ssDNA或双链DNA(dsDNA)进行靶向切割，实现检测信号的放大。
具体原理参见图1，单一试管等温CRISPR/Cas12a扩增检测中，将各种组分混合后启动TdT的检测，混合的组分包括报告单链DNA、crRNA、Cas12a蛋白和脱氧腺苷三磷酸(dATP)池。该检测以待测目标TdT开始，将多个腺嘌呤(A)碱基快速添加到ssDNA的3～端，这个过程特异性地创建了一个长的多聚A(ply-A)链，可以沿着其长度捕获多个crRNA得到多聚A(ply-A)产物。一旦与Cas12a蛋白结合，激活的CRISPR/Cas12a单元利用其顺式切割能力将长的多聚A产物切割成较短的片段。
结合本发明具体实施例中的机理的研究结果，TdT可以在几秒钟内将核苷酸迅速添加到较短引物的3～-OH端，即使是仅有3-5个碱基的引物，而被剪切得到的较短的片段可以在后续反应中充当新的引物，启动多个次级TdT基础的无模板延伸反应，从而能够结合更多crRNA和激活CRISPR/Cas12a，从而在顺序的方式下(循环I或cycle I)将多聚A产物进行顺式切割。与此同时，CRISPR/Cas12a的逆式切割能力切割剩余的报告单链DNA成较短的片段。类似于顺式切割过程，这也促进了基于TdT的链延伸，从而进一步激活更多CRISPR/Cas12a单元来逆式切割报告基因ssDNA(循环II或cycleII)。在基于TdT的延伸和CRISPR/Cas12a的顺式和逆式切割能力的整个过程中，激活的CRISPR/Cas12a单元使得报告基因ssDNA中的荧光素(荧光基团FAM)与淬灭剂(淬灭基团BHQ)的分离，从而从FAM报告分子中恢复荧光。因此，若待测样本中的含有TdT，且即使只存在微量的TdT，单一试管等温CRISPR/Cas12a扩增也可以在多次循环步骤后产生明显增强的荧光强度，TdT的检测限可低至0.01U/mL。相反，如果样本中不含有TdT，CRISPR/Cas12a在整个过程中保持不活跃的状态，因此无法实现等温CRISPR/Cas12a扩增循环，导致报告基因SSDNA(单链探针)仅保留非常微弱的固有荧光。
基于上述分析，TdT触发的报告基因ssDNA，从而激活CRISPR-Cas12a系统，说明单一试管等温CRISPR/Cas12a扩增用于TdT检测的技术方案的设计的合理性。
进一步地，本发明实施例的另一个方面还提供了前述的一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针在TdT的荧光检测中的应用。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的一种非医学诊断目的的TdT的一锅法荧光检测方法，包括前述的用于一锅法荧光检测TdT的单链探针(报告基因ssDNA)。
具体包括：将一系列不同浓度的标准TdT溶液分别与包含所述单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白和水的混合体系混合进行孵育，获得反应产物，之后对所述反应产物进行荧光强度检测，建TdT浓度与荧光强度的标准曲线；根据标准曲线拟合线性回归方程式：F520＝1.339CTdT+28.85。
在一些优选实施方案中，上述混合体系中包括单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白和ddH2O。
进一步地，所述单链探针的浓度为2.5μM。
进一步地，dATP的浓度为10mM。
进一步地，所述NEB缓冲液1包括10×NEB缓冲液1。
进一步地，单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白体积比为2∶2∶2∶2∶2∶1。
在一些优选实施方案中，20μL混合体系中包含有2μL的2.5μM所述单链探针、2μL的10×TdT缓冲液、2μL的10×NEBuffer 1、2μL的10mM dATP、2μL的2.5μM crRNA、1μL的1μMCas12a蛋白和0.5μL的一系列不同浓度的TdT，随后，加入dd-H20补充至20μL。
将一系列不同浓度的标准TdT溶液分别与包含单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白和水的混合体系混合并于37℃下孵育2h，之后80℃下加热10min，从而终止反应，获得反应产物；之后对所述反应产物进行荧光强度检测，建TdT浓度与荧光强度的标准曲线；根据标准曲线拟合得到线性回归方程：F520＝1.339CTdT+28.85；将待测样本的荧光强度代入线性回归方程中得到末端脱氧核糖核酸转移酶的含量；基于该检测方法，能够实现TdT的检测限为0.01U/mL。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
单链探针通过高效液相色谱(HPLC)纯化，并从Sangon生物技术有限公司(中国上海)获得。
末端脱氧核苷酸转移酶(20U/μL)、1×末端转移酶反应缓冲液(50mM乙酸钾、20mM三醋酸酯、10mM乙酸镁、pH＝7.9)、Lba Cas12a(Cpf1)、Klenow聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、1×NEBuffer 1(10mM双三丙烷-HCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、pH＝7.0)、1×NEBuffer 2(50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、pH＝7.9)、1×NEBuffer r2.1(50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/mL重组白蛋白、pH＝7.9)、1×Cutsmart(50mM乙酸钾、20mM Tris-乙酸酯、10mM乙酸镁、100μg/mLBSA、pH＝7.9)、Phi29 DNA聚合酶和10×Phi29缓冲液(500mM Tris-HCl、100mM MgCl2、100mM(NH4)2S04、40mM二硫苏糖醇)购自New EnglandBiolabs(USA)Ltd。
Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、dATP(10mM)、25-500bp DNA Maker和双蒸馏水(dd-H20)从Sangon生物技术有限公司(中国上海)获得。
仪器仪表
紫外可见UV-1900分光光度计(日本京都岛津)用于测量所有吸收光谱。TU-200块加热器(中国上海益恒)用于控制反应温度。Bio-Rad Chem Doc XRS(Bio-Rad，美国)用于进行凝胶电泳分析。
表1序列表
下面通过具体的实施例来进一步详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例提供的TdT触发一锅等温CRISPR/Cas12a扩增的可行性论证试验，具体步骤包括：
1.将2μL的10×NEB缓冲液1、2μL的10×TdT缓冲液、2μL的2.5μM crRNA(CRISPRRNA，序列如SEQ ID NO：2所示)、2μL的2.5mM dATP和1μL的1μM Cas12a蛋白混合并加入dd-H2O补充至20μL得到反应体系1，其中，NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白体积比为2∶2∶2∶2∶2∶1。
将反应体系1在37℃下孵育2h，之后80℃下加热10min，从而终止反应。
记录反应体系1的实时荧光信号响应作为对照试验。
2.将2μL的2.5μM单链探针(报告基因ssDNA，序列如SEQ ID NO：1所示))、2μL的10×NEB缓冲液1、2μL的10×TdT缓冲液、2μL的2.5μM crRNA、2μL的10mM dATP和1μL的1μMCas12a蛋白混合并加入dd-H2O补充至20μL得到反应体系2，其中，单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白体积比为2∶2∶2∶2∶2∶1；单链探针的制备方法包括将报告基因ssDNA与40×Tris缓冲液混合得到。
将反应体系2在37℃下孵育2h，之后80℃下加热10min，从而终止反应。
记录反应体系2的实时荧光信号响应。
检测结果参见图2。
如图2所示，步骤1的整个反应过程中，反应体系1为未添加TdT的阴性样品，荧光信号没有表现出信号反应(参见图2中的曲线b)，其实时荧光曲线几乎完全与报告基因ssDNA的固有荧光信号重叠(参见图2中的曲线a)；该结果说明：采用一锅等温CRISPR/Cas12a扩增由于CRISPR/Cas12a的失活而有效地抑制了背景信号。
进一步地，参见图2中的曲线c，为添加有TdT的反应体系2，而在加入TdT的实时荧光响应曲线中，由于TdT与报告基因ssDNA的反应，生物传感系统表现出荧光信号的快速增加，与步骤1的对照试验相比，在仅仅10分钟内，含有TdT的阳性样品也产生了可检测的信号。
显然，上述结果表明步骤2的反应体系2由于TdT触发报告基因ssDNA的无模板延伸，使得其与crRNA结合的长poly-A扩增子的产生，从而激活CRISPR/Cas12a的顺式和反式切割能力，实现等温CRISPR/Cas12a扩增。
通过反应体系1和反应体系2的荧光信号曲线的结果差异证明了本发明采用的用于TdT分析的一锅等温CRISPR/Cas12a扩增的可行性。
实施例2
本实施例提供了TdT触发一锅等温CRISPR/Cas12a扩增的反应机理的验证试验，具体步骤包括：
通过使用12％native-PAGE电泳来表征单链探针和TdT之间的相互作用，以及在dATP池下单链探针和CRISPR/Cas12a之间的相互作用。
首先通过将10μL寡核苷酸溶液(不同组分)，2μL的上样缓冲液(6×DNA loadingbuffer)和1μL的4S Red Plus核酸染色(100×)混合制备样品，然后添加到天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％native-PAGE)的电泳泳道中。DNA分析在1×TBE缓冲液中以80V的恒定电位进行90分钟。
表征结果如图3所示，通过在泳道中添加不同的样品显示电泳分析的结果。
参阅图3，在泳道a中，条带对应于小尺寸的报告基因ssDNA(ReporterssDNA)，用TdT处理后，如泳道b所示，条带向装载槽迁移，表明报告基因ssDNA被TdT延长。泳道c显示了crRNA的条带，由于报告基因ssDNA的poly-A和crRNA的poly-U之间的杂交，该条带在泳道d遇到拉长的报告基因ssDNA时完全消失。因此，带被阻挡在凹槽中，表现出更亮的条带。然而，当将Cas12a蛋白添加到泳道d的样品中时，如泳道e中清楚显示出现了多个分散的条带，显然，这种现象产生的原因在于CRISPR/Cas12a的顺式和反式切割效应导致报告ssDNA和poly-A链发生不同程度的切割。
通过上述电泳分析可知，在整个电泳通道中观察到的变化与预期一致，并进一步证实了反应机制。
实施例3
本实施例提供了TdT触发一锅等温CRISPR/Cas12a扩增的灵敏度测定
首先配置范围为0.01U/mL至100U/mL的不同浓度的TdT以触发扩增，浓度分别为0.01，0.1，1，5，10，20，40，50，60，80，100U/mL添加比例如实施例1所示，TdT的添加体积为2μL。
建立TdT浓度与荧光强度的线性范围为0.01U/mL至100U/mL和标准曲线，标准曲线参见图4，线性回归方程为F520＝1.339CTdT+28.85。
未添加TdT的样品用作对照组。
在如图4所示中，整个反应系统的荧光信号响应随着TdT浓度的增加而逐渐增加。当TdT浓度达到50U/mL时，荧光信号达到最大值，进一步增加TdT浓度不会产生额外的荧光强度增益。这表明当TdT浓度达到50U/mL时，所有的报告基因ssDNAs都被切割以获得最大的荧光响应。520nm处的峰值荧光强度与范围为0.001U/mL至0.1U/mL的TdT浓度对数值之间的良好线性关系。该方法的灵敏度至少提高了2个数量级。可见，通过增加报告基因ssDNA的浓度可以进一步提高灵敏度。
进一步地，通过对整个反应系统的反应时间进行了进一步分析，通过添加TdT浓度为50U/mL，并分别设定系统的反应温度分别为16℃、25℃、37℃、43℃和55℃。
温度对反应的影响结果参阅图5，在未添加TdT的荧光，响应几乎无变化，而在添加TdT后，信号明显增强，TdT触发一锅等温CRISPR/Cas12a扩增的孵育温度为25～43℃，而当反应温度为37℃时，荧光响应达最大值。
最后对反应时间进行进一步分析。参阅图6，延长反应时间能够明显地提高灵敏度，当反应至120min达到最佳，继续延长反应时间，荧光响应增强不明显。
实施例4
本实施例提供了TdT触发一锅等温CRISPR/Cas12a扩增的特异性测定，具体步骤包括：
选择Klenow聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶作为干扰酶来进行本发明提出的生物传感器的特异性分析。
操作步骤包括，将上述的干扰酶替代实施例1中的TdT，并与实施例1进行比较。
结果如图7所示，上述的干扰酶的荧光强度几乎可以忽略不计，而只有在存在TdT时，反应系统才会产生强荧光信号的释放。结果表明：上述的包括Klenow聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶在内的干扰酶作为非靶向核酸酶，无法诱导无模板链延伸。
而TdT本身具有独特的无模板聚合特性，当前的反应系统确保了极高的特异性。
基于上述实施例分析得知，本发明采用的TdT触发一锅等温CRISPR/Cas12a扩增的反应系统，将CRISPR-Cas12a系统用于TdT检测中，利用TdT的非依赖模板的特性，并结合Cas12a蛋白的辅助反式切割和顺式切割活性，利用Cas12a蛋白的反式切割能力进行信号报告，以及Cas蛋白的顺式切割能力在优化的crRNA的序列指导下对ssDNA或双链DNA(dsDNA)进行靶向切割，从而实现信号的放大。
以上仅为本发明的优选实施例，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针，其特征在于，所述单链探针的序列如SEQ ID NO：1所示，且所述单链探针标记有荧光基团FAM和淬灭基团BHQ。
2.如权利要求1所述的检测末端脱氧核糖核酸转移酶的单链探针在TdT的荧光检测中的应用。
3.一种一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法，其特征在于，包括如权利要求1所述的单链探针和含有TdT的待测样本混合后进行荧光检测。
4.根据权利要求3所述的一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法，其特征在于，包括使用基于crRNA和CRISPR/Cas12a系统进行的等温扩增反应实现TdT的检测；
所述单链探针通过触发基于CRISPR/Cas12a系统的等温扩增反应，在crRNA的作用下对所述单链探针进行靶向切割，实现荧光检测信号的放大。
5.根据权利要求3所述的一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法，其特征在于，包括将单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP和Cas12a蛋白混合后进行孵育后进行荧光检测，实现末端脱氧核糖核酸转移酶的检测。
6.根据权利要求5所述的一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法，其特征在于，crRNA的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
利用Cas12a蛋白的辅助反式切割和顺式切割活性在crRNA的作用下对ssDNA进行靶向切割，实现检测信号的放大。
7.根据权利要求5所述的一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法，其特征在于，所述单链探针的浓度为2.5μM；
dATP的浓度为10mM；
TdT缓冲液为10×TdT缓冲液；
NEB缓冲液1为10×NEB缓冲液1。
8.根据权利要求7所述的一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法，其特征在于，所述单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白体积比为2∶2∶2∶2∶2∶2∶1。
9.根据权利要求4所述的一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法，其特征在于，所述孵育的条件包括37℃下孵育2h，80℃下加热10min。
10.根据权利要求3-9任一项所述的一锅法检测末端脱氧核糖核酸转移酶的方法，其特征在于，所述方法还包括：
将一系列不同浓度的标准TdT溶液分别与包含所述单链探针、NEB缓冲液1、TdT缓冲液、crRNA、dATP、Cas12a蛋白和水的混合体系混合进行孵育，获得反应产物；之后对所述反应产物进行荧光强度检测，建立TdT浓度与荧光强度的标准曲线；
根据所述标准曲线拟合得到线性回归方程：F520＝1.339CTdT+28.85；
将待测样本的荧光强度代入所述线性回归方程中得到末端脱氧核糖核酸转移酶的含量；
TdT的检测限为0.01U/mL。
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