CN117210540A - 基于三通核酸密码锁的基因检测方法 - Google Patents
基于三通核酸密码锁的基因检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及基于三通核酸密码锁的基因检测方法。本发明提供了检测产品，包括：表面修饰的金电极、扩增引物和三通核酸密码锁；三通核酸密码锁包括：探针1～探针3；探针1包括：a域、b域和c域；探针2包括：b1域和d域；探针3包括：c*域和d*域。本发明通过LAMP扩增产物与一种三通核酸密码锁(3W‑Codelock)去联接，将LAMP扩增产物转化为电化学信号，检测可以通过三通核酸密码锁的a域和b1域对LAMP扩增产物连接达到高度特异性识别，空白样品和其他非目标电化学检测信号接近于“0”，因此检测结果具有高信噪比，可以获得高分辨率的目标核苷酸电化学检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及基于三通核酸密码锁的基因检测方法。
背景技术
随着核酸分子领域的发展，利用核酸快速准确地诊断多种疾病已成为可能。然而，这些检测方法通常需要复杂的仪器，不利于实现便携式的疾病诊断。市面上仅有的少数便携式诊断商品对于建立和开展新的便携诊断方法是非常具有参考价值的。然而电化学检测的方法，除血糖仪以外，几乎没有。
核酸分子检测是一种用于检测和分析生物样本中的核酸分子(如DNA和RNA)的技术方法。它通过识别和量化样本中的特定核酸序列，可以确定是否存在目标分子以及其数量。核酸分子检测具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优势。它可以用于检测和鉴定病原微生物(如病毒、细菌和寄生虫)、基因突变、遗传性疾病、肿瘤标志物等。此外，核酸分子检测还可以用于环境监测，例如检测水体、土壤和空气中的微生物污染物或污染物基因。在核酸分子检测中，常用的方法包括聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、等温核酸扩增技术(如用核酸序列为基础的扩增核酸依赖性扩增检测技术(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、解链酶扩增(HAD)、滚环扩增(RCA)和环介导等温扩增技术(LAMP))等。这些方法通过利用核酸的互补配对原理、酶的催化作用，实现对目标核酸序列的选择性扩增。其中LAMP等温扩增技术因其等温扩增、快速扩增、特异性灵敏度高等特点发展迅速。该技术不需要复杂的温度循环，仅需在恒定温度下进行扩增反应。相比于PCR等温扩增技术，LAMP等温扩增技术的操作更加简单，无需高精度的温控设备。同时，LAMP等温扩增技术通过设计多个特异性引物，可以高度选择性地扩增目标序列。这种引物设计和反应机制的特点使LAMP等温扩增技术在目标序列特异性扩增方面表现出色，能够减少非特异性扩增的问题。并且，LAMP等温扩增技术的反应速度较快，通常在30分钟至1小时内完成扩增反应。这种快速的反应速度使LAMP技术在迅速的诊断和监测中具备优势，特别适用于需要快速结果的应用场景。
目前国内外LAMP等温扩增技术的检测方法主要有：纯色素检测法：LAMP反应产生大量的沉淀物或颜色变化，通过肉眼观察可以判断结果是否为阳性。这种方法简单直观，适用于一些简单的检测，但结果主观性较强，可能存在误读的风险；凝胶电泳检测法：LAMP扩增产物可以通过凝胶电泳进行分离和检测。将扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，通过可见光或荧光染料观察带型的出现，从而判断是否存在目标序列。凝胶电泳方法能够提供更加精确的结果，但需要专业的设备和操作技巧；实时荧光检测法：利用荧光染料标记的探针，通过实时监测荧光信号的增强来判断扩增过程中是否存在目标序列。实时荧光检测法具有高灵敏度、高特异性和实时性等优势，能够定量检测目标序列，并且可以实现自动化操作；试纸条检测法：将LAMP扩增产物与具有特异性抗体的纳米颗粒结合，在测试纸条上形成可视化的条带。通过肉眼观察条带的出现与否，判断是否存在目标序列。这种方法操作简单，结果可靠，并且可以快速进行初步筛查；电化学检测法：将LAMP扩增产物与电化学探针相互作用，通过测量电化学信号的变化来判断是否存在目标序列。电化学检测具有高灵敏度、快速响应和便携性等特点，适用于迅速检测目标序列。
电化学检测法主要是在LAMP反应中，引入电化学标记物，通常是标记有电化学活性基团的引物或探针。这些电化学标记物可以与LAMP扩增产物特异性结合或发生电化学反应。再通过电化学方法检测电化学标记物的电流或电位变化。常用的电化学技术包括电化学阻抗谱(EIS)、循环伏安法(CV)、方波伏安法(SWV)、安培法(Amperometry)等。这些技术可以实时监测电化学标记物的电化学活性，并根据电流或电位的变化来判断是否存在目标序列。通常，阳性样本会显示出明显的电化学信号变化，而阴性样本则不会有明显的变化。可以通过设定阈值或与对照样品进行比较来确定样品的检测结果。
然而，所有这些反应都需要完全按照不同的LAMP扩增产物去重新设计电化学探针和电极表面修饰探针，不但价格昂贵、设计复杂，而且存在较高的设计失败的风险。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了基于三通核酸密码锁的基因检测方法。本发明通过LAMP扩增产物与一种三通核酸密码锁(3W-Codelock)去联接，将LAMP扩增产物转化为电化学信号，检测可以通过三通核酸密码锁(3W-Codelock)的a*域和b*域对LAMP扩增产物连接达到高度特异性识别，空白样品和其他非目标电化学检测信号接近于“0”，因此检测结果具有高信噪比，可以获得高分辨率的目标核苷酸电化学检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测产品，包括：表面修饰的金电极、扩增引物和三通核酸密码锁；
所述表面修饰包括：表面处理、表面修饰巯基探针和封闭巯基乙醇的步骤；
所述巯基探针包括：c域和d域；
所述三通核酸密码锁包括：探针1～探针3；
所述探针1包括：a域、b域和c域；
所述探针2包括：b1域和d域；
所述探针3包括：c*域和d*域；
所述a域和所述b域与目的基因的核苷酸序列部分互补；
所述b域与所述b1域互补；
所述c域与所述c*域互补；
所述d域与所述d*域互补；
所述c域、c*域、d域和d*域为固定域。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述目的基因包括：a*域和b2域；所述b域与所述b2域互补；所述b2域的碱基个数大于或等于b域的碱基个数；所述b域的碱基个数大于或等于b1域的碱基个数。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述探针1的b域和c域之间可以间隔3-8个单独的碱基，其碱基序列与探针1、探针2、探针3、T-Loop的核苷酸序列不互补；
所述探针2的b1域和d域之间可以间隔3-8个单独的碱基，其碱基序列与探针1、探针2、探针3、T-Loop的核苷酸序列不互补；
所述探针3的c*域和d*域可以间隔3-8个单独的碱基，其碱基序列与探针1、探针2、探针3、T-Loop的核苷酸序列不互补。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述目的基因为寡核苷酸、寡核苷酸适配子、微小RNA。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述巯基(SH)探针还包括：0～50个碱基。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述c域具有如SEQ ID NO:16所示的序列：GGTAG CTCGA ACGAT CGAGC T。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述c*域具有如SEQ ID NO:17所示的序列：AGCTCGATCGTTCGAGCTACC。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述d域具有如SEQ ID NO:18所示的序列：GTACCTGTACCCATCGT。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述d*域具有如SEQ ID NO:19所示的序列：ACGATGGGTACAGGTAC。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，金电极的表面修饰包括：表面处理、表面修饰巯基探针和封闭巯基乙醇的步骤；
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述表面处理步骤中包括：采用循环伏安法对所述金电极进行电化学清理的步骤。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述电化学清洗在10～100mMH2SO4中进行。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述电化学清洗在100mM H2SO4中进行。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述循环伏安法的扫描循环数为10～100次，电位扫描范围为-0.5至1.2V。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述循环伏安法的扫描循环数为30次，电位扫描范围为-0.5至1.2V。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，金电极表面修饰巯基探针步骤中，所述巯基探针稀释在1×TNak缓冲液中，并加入1mM TCEP，巯基探针的终浓度为0.2～2μM，所述表面修饰巯基探针的温度为4～36℃，时间为1～3h。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述巯基探针的浓度为1μM，所述表面修饰巯基探针的温度为4℃，时间为3h。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述封闭巯基乙醇包括取巯基乙醇与1×TNak缓冲液混合后，与所述表面修饰巯基探针的金电极混合的步骤。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述巯基乙醇的浓度为0.1～5mM，所述封闭的温度为4～36℃，时间为1h。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述巯基乙醇的浓度为1mM，所述封闭的温度为4℃，时间为1h。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述探针1～所述探针3的3’端修饰反向dT；所述探针3的5’端修饰与所述电极作用产生电信号的基团。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述基团包括：亚甲基蓝和/或二茂铁。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述探针1～所述探针3的终浓度为3～12μM。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述探针1、所述探针2、所述探针3的终浓度比为6:6:5。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述探针1的终浓度为6μM，所述探针2的终浓度为6μM，所述探针3的终浓度为5μM。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述a域的碱基个数为10～20个；所述b域与所述b1域的碱基个数为20～30个；所述c域与所述c*域的碱基个数为20～30个；所述d域与所述d*域的碱基个数为15～25个。
本发明还提供了上述检测产品在基因检测中的应用。
本发明还提供了基因的检测方法，包括如下步骤：
S1：取上述检测产品中的所述扩增引物与待测样品混合，获得分子引发剂反应液；
S2：取上述检测产品中的所述的三通核酸密码锁中的所述探针1～所述探针3混合，退火后，与所述分子引发剂反应液混合，获得混合液；
S3：取所述混合液与上述检测产品中的所述表面修饰的金电极混合，加热，检测电化学信号，根据电化学检测结果，判断所述待测样品是否为目的基因。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S1中所述混合包括退火和降温的步骤；所述退火的温度为95℃，时间为1～5min；所述降温的速度为0.1～1℃/s。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S1中所述混合包括退火和降温的步骤；所述退火的温度为95℃，时间为5min；所述降温的速度为0.1℃/s。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S2中所述探针1～所述探针3的终浓度为3～12μM；所述退火的温度为95℃，时间为1～5min。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述探针1、所述探针2、所述探针3的终浓度比为6:6:5。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S2中所述探针1的终浓度为6μM，所述探针2的终浓度为6μM，所述探针3的终浓度为5μM。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S2中所述退火的温度为95℃，时间为5min。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S2中所述退火后，与所述分子引发剂反应液混合前，还包括降温的步骤，所述降温的的速度为0.1～1℃/s。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S2中所述退火后，与所述分子引发剂反应液混合前，还包括降温的步骤，所述降温的的速度为0.1℃/s。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中所述分子引发剂反应液与所述三通核酸密码锁的体积比为5:1。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S2中，与所述分子引发剂反应液混合还包括与8～16units的Bst2.0聚合酶混合的步骤。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S2中，当所述待测样品为RNA时，所述与所述分子引发剂反应液混合还包括与7.5～15units的WarmStar RT×ReverseTranscriptase混合的步骤。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S3中所述加热的温度为25～65℃，时间为0.5～2h。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S3中所述加热的温度为60℃，时间为2h。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S3中所述检测电化学信号包括：所述加热完成后检测和/或所述加热进行中检测；
所述加热进行中检测包括：每4～10min采集一次电化学信号，根据峰高获得电化学检测结果。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法S3中所述检测电化学信号采用方波伏安法。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述待测样品为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含a*域和b2域。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述b域与所述b2域互补。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述b1域与所述b2域不完全相同。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述待测样品为寡核苷酸、寡核苷酸适配子、微小RNA。
本发明提供了检测产品，包括：表面修饰的金电极、扩增引物和三通核酸密码锁；
所述表面修饰包括：表面处理、表面修饰巯基探针和封闭巯基乙醇的步骤；
所述巯基探针包括：c域和d域；
所述三通核酸密码锁包括：探针1～探针3；
所述探针1包括：a域、b域和c域；
所述探针2包括：b1域和d域；
所述探针3包括：c*域和d*域；
所述a域和所述b域与目的基因的核苷酸序列部分互补；
所述b域与所述b1域互补；
所述c域与所述c*域互补；
所述d域与所述d*域互补；
所述c域、c*域、d域和d*域为固定域。
本发明的有益效果包括：
(1)、本发明通过LAMP扩增产物与一种三通核酸密码锁(3W-Codelock)去联接，将LAMP扩增产物转化为电化学信号，检测可以通过三通核酸密码锁(3W-Codelock)的a域和b1域对LAMP扩增产物连接达到高度特异性识别，空白样品和其他非目标电化学检测信号接近于“0”，因此检测结果具有高信噪比，可以获得高分辨率的目标核苷酸电化学检测；
(2)在实现目标核苷酸电化学检测的同时，只需依照不同的目标核苷酸序列改变现有三通核酸密码锁(3W-Codelock)的a*域和b1域。在实施例中，如对于SARS-CoV-2和ASFV的电化学检测来讲，只需要改变3W的a*域和b1域，可完全保留3W中的c、d、c*、d*域与电极表面修饰的P-SH探针。这样，一套性能良好的核酸分子线路可以很快的应用于新的目标核苷酸的电化学检测，大大降低了成本及重新设计序列的风险；
(3)本发明不仅大大节约了成本，而且不会产生副反应，避免了假阳性的出现，实现了对目标核苷酸的电化学检测，更精准、更有效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明提供的基于三通核酸密码锁(3W-Codelock)结构的原理图；
图2示本发明提供的基于三通核酸密码锁(3W-Codelock)的电化学检测原理图；
图3示本发明实施例1提供的基于3W终点检测TSARS-CoV-2的电化学SWV图；
图4示本发明实施例1提供的基于3W实时检测TSARS-CoV-2的电化学实时SWV检测图；
图5示本发明实施例1提供的基于3W实时检测TSARS-CoV-2的电化学实时结果图；
图6示本发明实施例2提供的基于3W实时检测TASFV的电化学实时SWV检测图；
图7示本发明实施例2提供的基于3W实时检测TASFV的电化学实时结果图；其中：峰电流值大小在0.5～3μA，不同的电极会对峰电流值有所影响，同种电极不同批次的电极也会有所影响。
具体实施方式
本发明公开了基于三通核酸密码锁的基因检测方法。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明将预检测的目的分子一个序列作为检测目标，将其划分为a*域和b2域，对应于a*域和b2域设计三通核酸密码锁(3W-Codelock)，该三通核酸密码锁(3W-Codelock)包括三段碱基序列，即：P1探针、P2探针、P3-MB探针。
所述P1探针包括a、b、c域和3’端Inverted dT，a与a*域互补，b与b2域互补，
所述P2探针包括b1、d域和3’端Inverted dT，b1与b域互补；
所述P3-MB探针包括c*、d*域、3’端Inverted dT和5’端亚甲基蓝。c*与c域互补，d*与d域。
因P1探针，P2探针，P3-MB探针有互补结构，因此形成三通核酸密码锁(3W-Codelock)分子。
检测时，三通核酸密码锁(3W-Codelock)中P1探针与a、b域与检测目标中的a*域和b2域，逐步结合，引发三通核酸分子中的三条DNA链逐渐解离，释放出带有亚甲基蓝修饰的P3-MB探针(探针3)。
P3-MB探针(探针3)与通过巯基修饰连接在电极表面的碱基序列，互补配对使亚甲基蓝端靠近电极表面，产生可以被检测到的电化学信号。
本发明提出了一种基于三通核酸密码锁(3W-Codelock)的电化学检测方法，即在待测核酸发生等温扩增反应(LAMP)的过程之中，加入三通核酸分子传导探针，通过扩增产物与传导探针中的一段核苷酸序列杂交引发三通核酸分子中的三条DNA链逐渐解离，释放出带有亚甲基蓝修饰的P3-MB探针(探针3)单链DNA，该链与修饰在电极上的巯基链互补配对使亚甲基蓝端靠近电极表面，产生可以被检测到的电化学信号。
本发明的目的是在实现等温扩增的电化学检测的同时，无需再根据不同的扩增产物设计特定的电化学探针(P3-MB探针)及电极表面修饰的巯基探针(P-SH探针)(巯基探针)，即针对不同扩增产物的检测，只需要改变3W中P1探针(探针1)的a、b域和P2探针(探针2)的b1域，无需改变3W中的其他域，并完全共享同样的P3-MB序列和P-SH序列。该方法在电化学检测核酸分子时具有普适性和可控性，检测更便捷，结果更可靠，可以实现单元分析和定量分析。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于三通核酸密码锁的分子检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)：金电极表面修饰；
所述金电极表面修饰方法，其方法包括金电极表面处理、金电极表面修饰P-SH序列和金电极表面封闭巯基己醇；
(2)：由目标核苷酸和扩增引物配制分子引发剂反应液；
(3)：将三通核酸密码锁(3W-Codelock)的各组分混合并进行退火处理；
所述三通核酸密码锁(3W-Codelock)，其组分包括P1探针、P2探针、P3-MB探针；
进一步地，所述P1探针包括a、b、c域和3’端Inverted dT，所述P2探针包括b1、d域和3’端InverteddT，所述P3-MB探针包括c*、d*域、3’端Inverted dT和5’端亚甲基蓝。
(4)：将分子引发剂反应液和三通核酸密码锁(3W-Codelock)的各组分混合加热；
(5)：检测电化学信号，获得电化学检测曲线；
进一步地，检测方法无论是终点检测还是实时检测，所述金电极表面修饰方法包括以下步骤：
(1)：金电极表面处理，首先采用循环伏安法在10～100mM H2SO4中对电极进行电化学清洗。扫描循环数为10～100次，电位扫描范围为-0.5至1.2V(相对于金参比电极)，之后用超纯水清洗，氮气吹干；
(2)：金电极表面修饰P-SH探针，是将P-SH序列和TCEP在1×TNak缓冲液中混合，混合液加入到处理过的金电极表面；
(3)：金电极表面封闭巯基己醇，是将巯基己醇用1×TNak缓冲液稀释后加入到修饰过P-SH序列的金电极表面；
所述目标核苷酸为核酸等温扩增产物中的特定线性单链或环型单链核苷酸，包含a*域和b2域；
所述三通核酸密码锁(3W-Codelock)为三通双链核酸分子，包含与目标核苷酸a*域、b2域碱基互补的可变域a域、b域和与b域碱基互补的b1域和固定域c、d、c*、d*域；
所述P-SH序列为修饰在电极表面的单链DNA，包含与三通核酸密码锁(3W-Codelock)中P3-MB探针碱基互补的c、d域；
进一步地，在核酸分子线路电化学检测中，检测流程为终点检测，所述方法包括以下步骤：
(1)金电极表面处理后用修饰0.2～2μM P-SH探针4～36℃下1～3小时，之后用0.1～5mM巯基己醇在4～36℃下封闭1小时；
(2)将目标核苷酸和扩增引物混合在1×TNak缓冲液中，在95℃下退火1～5min，0.1～1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂反应液；
(3)将三通核酸密码锁(3W-Codelock)的P1探针、P2探针、P3-MB探针混合在1×TNak缓冲液中，其中P1探针终浓度为3～12μM，P2探针终浓度为3～12μM，P3-MB探针终浓度为3～12μM，在95℃下退火1～5min，然后在0.1～1℃/s下缓慢降到室温；
(4)将分子引发剂反应液与三通核酸密码锁(3W-Codelock)按5：1体积混合，并加入Bst2.0聚合酶，混合液加入到电极表面，加热到25～65℃保持0.5～2小时；
(5)反应结束后用方波伏安法检测电化学信号，获得电化学检测结果。
进一步地，在核酸分子线路电化学检测中，检测流程为实时检测，所述方法包括以下步骤：
(1)金电极表面处理后用修饰0.2～2μM P-SH探针4～36℃下1～3小时，之后用0.1～5mM巯基己醇在4～36℃下封闭1小时；
(2)将目标核苷酸和扩增引物混合在1×TNak缓冲液中，在95℃下退火1～5min，0.1～1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂反应液；
(3)将三通核酸密码锁(3W-Codelock)的P1探针、P2探针、P3-MB探针混合在1×TNak缓冲液中，其中P1探针终浓度为3～12μM，P2探针终浓度为3～12μM，P3-MB探针终浓度为3～12μM，在95℃下退火1～5min，然后在0.1～1℃/s下缓慢降到室温；
(4)将分子引发剂反应液与三通核酸密码锁(3W-Codelock)按5：1体积混合，并加入Bst2.0聚合酶8～16units(对RNA检测还需加入7.5～15units的WarmStar RT×ReverseTranscriptase)，混合液加入到电极表面，加热到25～65℃保持2小时；
(5)方波伏安法检测电化学信号，每4～10分钟采一点，通过方波伏安图的峰高获得电化学实时检测结果。
进一步地，所述目标核苷酸为寡核苷酸、寡核苷酸适配子、微小RNA。
进一步地，所述三通核酸密码锁(3W-Codelock)的a域的碱基个数为10～20个，b域和b1域的碱基个数为20～30个，c域和c*域的碱基个数为20～30个，d域和d*域的碱基个数为15～25个。
本发明实施例1～实施例3中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1核酸分子线路法对TST终点检测方法
基于三通核酸密码锁的分子检测方法，在核酸分子线路法终点检测中，所述方法包括以下步骤：
首先进行金电极表面处理，采用循环伏安法在100mM H2SO4中对电极进行电化学清洗。扫描循环数为30次，电位扫描范围为-0.5至1.2V(相对于金参比电极)，结束后用超纯水清洗，氮气吹干。之后金电极表面修饰1μM P-SH探针，将P-SH序列(巯基探针)和TCEP(终浓度10mM)在1×TNak缓冲液中混合，混合液加入到处理过的金电极表面，保持4℃下3h。最后用1mM巯基己醇在4℃下封闭1h；
其次将目标核苷酸TST和扩增引物混合在1×TNak缓冲液中，在95℃下退火5min，0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂反应液。同时，将三通核酸密码锁(3W-Codelock)的3W-P1-ST探针(探针1)、3W-P2-ST探针(探针2)、P3-MB探针(探针3)混合在1×TNak缓冲液中，其中P1探针终浓度为6μM，P2探针终浓度为6μM，P3-MB探针终浓度为5μM，在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温。
最后将分子引发剂反应液与三通核酸密码锁(3W-Codelock)按5：1体积混合，并加入Bst2.0聚合酶16units，混合液加入到电极表面，加热到60℃保持2小时。反应结束后用方波伏安法(SWV)采集检测电化学信号。其中，
TST的序列为：AAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGA CTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTT(如SEQ ID NO:1所示)
P-SH的序列为：
GGTAGCTCGAACGATCGAGCTGTACCTGTACCCATCGTGCTCGATC GTTTTTTT-3’-SH C6(如SEQ ID NO:2所示)
3W-P1-ST的序列为：
GGTAGCTCGAACGATCGAGCTCGATCTTAGTACCATTGGTCCCAGA GACATGTATAGC-3’-Inverted dT(如SEQ ID NO:3所示)
3W-P2-ST的序列为：
TGGGACCAATGGTACTAAGATCGGTACCTGTACCCATCGT-3’-Invert ed dT(如SEQ ID NO:4所示)
P3-MB的序列为：
5’-Methylene Blue-ACGATGGGTACAGGTACAGCTCGATCGTTCGAG CTACC-3’-InverteddT(如SEQ ID NO:5所示)
扩增引物：
F3-ST-1序列
CAGGACTTGTTCTTACCTTTC(如SEQ ID NO:6所示)
B3-ST-1序列
GACTTTAATAACAACATTAGTAGCG(如SEQ ID NO:7所示)
FIP-ST-1序列
GGTAGGACAGGGTTATCAAACCTCCAATGTTACTTGGTTCCATGC(如SEQ ID NO:8所示)
BIP-ST-1序列
TGCTTCCACTGAGAAGTCTAACAGGACTGGGTCTTCGAATC(如SE Q ID NO:9所示)
LP1-ST-1序列
TAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTA(如SEQ ID NO:10所示)。
如图3所示，只有含有ST(PC)的样品才会产生MB的显著氧化峰，而纯缓冲对照(NC1)或不可放大的LAMP成分(NC2)的峰值电流几乎为“零”。说明对于有LAMP反应的体系，LAMP扩增子的环序列T-Loop与3W-P1-ST的a区域杂交，并开始进行分支迁移，解开3W-P1-ST和3W-P2-ST之间的b1-b配对。这个过程进一步破坏了3W-P1-ST和P3-MB以及3W-P2-ST和P3-MB之间的c-c*和d-d*配对，最终导致3W结构的解体。此时，P3-MB可以自由地与预先修饰在金电极表面的硫醇标记的互补序列P-SH的c域和d域杂交。因此，亚甲基蓝(MB)分子与电极表面足够接近，以实现有效的电子转移。
实施例2核酸分子线路法对TST实时电化学检测方法
基于三通核酸密码锁的分子检测方法，在核酸分子线路法对TST实时电化学检测中，所述方法包括以下步骤：
首先进行金电极表面处理，采用循环伏安法在100mM H2SO4中对电极进行电化学清洗。扫描循环数为30次，电位扫描范围为-0.5至1.2V(相对于金参比电极)，结束后用超纯水清洗，氮气吹干。之后金电极表面修饰1μM P-SH探针(SH探针)，将P-SH序列和TCEP(终浓度10mM)在1×TNak缓冲液中混合，混合液加入到处理过的金电极表面，保持4℃下3h。最后用1m M巯基己醇在4℃下封闭1h；
其次将目标核苷酸TST-R和扩增引物混合在1×TNak缓冲液中，在95℃下退火5min，0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂反应液。同时，将三通核酸密码锁(3W-Codelock)的3W-P1-ST探针、3W-P2-ST探针、P3-MB探针混合在1×TNak缓冲液中，其中P1探针终浓度为6μM，P2探针终浓度为6μM，P3-MB探针终浓度为5μM，在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温。
最后将分子引发剂反应液与三通核酸密码锁(3W-Codelock)按5：1体积混合，并加入Bst2.0聚合酶16units和逆转录酶15units(WarmStar RT×Reverse Transcriptase)，混合液加入到电极表面，加热到60℃保持2小时。方波伏安法检测电化学信号，每4分钟采一点，通过方波伏安图的峰高获得电化学实时检测结果。其中，
TST-R的序列为SARS-CoV-2假病毒提取的RNA，序列为：GTTCTTGTT AACAACTAAACGAACAATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTT ATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAA(如SEQ ID NO:11所示)
P-SH的序列为：
GGTAGCTCGAACGATCGAGCTGTACCTGTACCCATCGTGCTCGATC GTTTTTTT-3’-SH C6(如SEQ ID NO:2所示)
3W-P1-ST的序列为：
GGTAGCTCGAACGATCGAGCTCGATCTTAGTACCATTGGTCCCAGA GACATGTATAGC-3’-Inverted dT(如SEQ ID NO:12所示)
3W-P2-ST的序列为：
TGGGACCAATGGTACTAAGATCGGTACCTGTACCCATCGT-3’-Invert ed dT(如SEQ ID NO:4所示)
P3-MB的序列为：
5’-Methylene Blue-ACGATGGGTACAGGTACAGCTCGATCGTTCGAG CTACC-3’-InverteddT(如SEQ ID NO:5所示)
扩增引物：
F3-ST-1序列
CAGGACTTGTTCTTACCTTTC(如SEQ ID NO:6所示)
B3-ST-1序列
GACTTTAATAACAACATTAGTAGCG(如SEQ ID NO:7所示)
FIP-ST-1序列
GGTAGGACAGGGTTATCAAACCTCCAATGTTACTTGGTTCCATGC(如SEQ ID NO:8所示)
BIP-ST-1序列
TGCTTCCACTGAGAAGTCTAACAGGACTGGGTCTTCGAATC(如SE Q ID NO:9所示)
LP1-ST-1序列
TAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTA(如SEQ ID NO:10所示)
如图4所示，不同拷贝数的RNA通过逆转录酶进行LAMP扩增，产生的环序列T-Loop与3W-P1-ST的a区域杂交，并开始进行分支迁移，解开3W-P1-ST和3W-P2-ST之间的b1-b配对，最终导致3W结构的解体。不同拷贝数的RNA在扩增时间上有所不同，以致P3-MB与预先修饰在金电极表面的硫醇标记的互补序列P-SH的杂交时间会产生不同。方波伏安法(SWV)实时检测的电化学曲线通过计算峰电流转化为图5。
表1本发明实施例2提供的基于3W实时检测TSARS-CoV-2的电化学实时峰电流值
/>
实施例3核酸分子线路法对TASFV实时电化学检测方法
基于三通核酸密码锁的分子检测方法，在核酸分子线路法对TASFV实时电化学检测中，所述方法包括以下步骤：
首先进行金电极表面处理，采用循环伏安法在100mM H2SO4中对电极进行电化学清洗。扫描循环数为30次，电位扫描范围为-0.5至1.2V(相对于金参比电极)，结束后用超纯水清洗，氮气吹干。之后金电极表面修饰1μM P-SH探针(SH探针)，将P-SH序列和TCEP(终浓度10mM)在1×TNak缓冲液中混合，混合液加入到处理过的金电极表面，保持4℃下3h。最后用1m M巯基己醇在4℃下封闭1h；
其次将目标核苷酸TASFV和扩增引物混合在1×TNak缓冲液中，在95℃下退火5min，0.1℃/s下缓慢降到室温，形成分子引发剂反应液。同时，将三通核酸密码锁(3W-Codelock)的3W-P1-ASFV探针(探针1)、3W-P2-ASFV探针(探针2)、P3-MB探针(探针3)混合在1×TNak缓冲液中，其中P1探针终浓度为6μM，P2探针终浓度为6μM，P3-MB探针终浓度为5μM，在95℃下退火5min，然后在0.1℃/s下缓慢降到室温。
最后将分子引发剂反应液与三通核酸密码锁(3W-Codelock)按5：1体积混合，并加入Bst2.0聚合酶和WarmStar RT×Reverse Transcriptase，混合液加入到电极表面，加热到60℃保持2h。方波伏安法检测电化学信号，每4分钟采一点，通过方波伏安图的峰高获得电化学实时检测结果。其中，
TASFV的序列为：ATGGATTCTGAATTTTTTCAACCGGTTTATCCGCGG CATTATGGTGAGTGTTTGTCACCAGTCACTACACCAAGCTTCTTCTCCACACATATGTATACTATTCTCATTGCTATCGTGGTCTTAGTCATCATTATCATCGTTCTAATCTATCTATTCTCTTCAAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTGAGGAGGAAGATATACAGTTTATAAATCCTTATCAAGATCAGCAGTGGGTAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCAGCTGGAGCGACTACAGCAAGTGTAGGCAAGCCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTTACGGACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCGGCGGCCGCACCTGCGGCCGCGAGTGCTCCTGCTCATCCGGCTGAGCCTTACACGACAGTCACTACTCAGAACACTGCTTCACAAACAATGTCGGCTATTGAAAATTTACGACAAAGAAAC ACCTATACGCATAAAGACCTAGAAAACTCCTTGTAA(如SEQ ID NO:13所示)
P-SH的序列为：GGTAGCTCGAACGATCGAGCTGTACCTGTACCCAT CGTGCTCGATCGTTTTTTT-3’-SH C6(如SEQ ID NO:2所示)
3W-P1-ASFV的序列为：GGTAGCTCGAACGATCGAGCTCGAGTAACTGGGTTGTCCGTAACTGGTTTGTTTGTTGC-3’-Inverted dT(如SEQ ID NO:14所示)
3W-P2-ASFV的序列为：GTTACGGACAACCCAGTTACTCGGTACCTG TACCCATCGT-3’-Inverted dT(如SEQ ID NO:15所示)
P3-MB的序列为：5’-Methylene Blue-ACGATGGGTACAGGTACAGCTCGATCGTTCGAGCTACC-3’-Inverted dT(如SEQ ID NO:5所示)
扩增引物：
F3-ASFV序列
GCAGTGGGTAGAAGTCACTC(如SEQ ID NO:20所示)
B3-ASFV序列
AGTGACTGTCGTGTAAGGCT(如SEQ ID NO:21所示)
FIP-ASFV序列
TCTGTTTGTTGCCGGTCTGCCCCTCTAAACCAGCTGGAGC(如SEQ ID NO:22所示)
BIP-ASFV序列
AGACTAGTCATGGCAACTGGCGCGGATGAGCAGGAGCACT(如SE Q ID NO:23所示)
LF-ASFV序列
GGCTTGCCTACACTTGCTG(如SEQ ID NO:24所示)
如图6所示，不同拷贝数的TASFV进行LAMP扩增，产生的环序列T-Loop与3W-P1-ASFV的a区域杂交，并开始进行分支迁移，解开3W-P1-ASFV和3W-P2-ASFV之间的b1-b配对，最终导致3W结构的解体。不同拷贝数的TASFV在扩增时间上有所不同，以致P3-MB与预先修饰在金电极表面的硫醇标记的互补序列P-SH的杂交时间会产生不同。方波伏安法(SWV)实时检测的电化学曲线通过计算峰电流转化为图7。
表2本发明实施例3提供的基于3W实时检测TASFV的电化学实时峰电流值
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.检测产品，其特征在于，包括：表面修饰的金电极、扩增引物和三通核酸密码锁；
所述表面修饰包括：表面处理、表面修饰巯基探针和封闭巯基乙醇的步骤；
所述巯基探针包括：c域和d域；
所述三通核酸密码锁包括：探针1～探针3；
所述探针1包括：a域、b域和c域；
所述探针2包括：b1域和d域；
所述探针3包括：c*域和d*域；
所述a域和所述b域与目的基因的核苷酸序列部分互补；
所述b域与所述b1域互补；
所述c域与所述c*域互补；
所述d域与所述d*域互补；
所述c域、c*域、d域和d*域为固定域。
2.如权利要求1所述的检测产品，其特征在于，所述探针1～所述探针3的终浓度为3～12μM。
3.如权利要求1或2所述的检测产品，其特征在于，所述a域的碱基个数为10～20个；所述b域与所述b1域的碱基个数为20～30个；所述c域与所述c*域的碱基个数为20～30个；所述d域与所述d*域的碱基个数为15～25个。
4.如权利要求1至3任一项所述的检测产品，其特征在于，所述目的基因包括：a*域和b2域；所述b域与所述b2域互补；所述b2域的碱基个数大于或等于b域的碱基个数；所述b域的碱基个数大于或等于b1域的碱基个数。
5.如权利要求1至4任一项所述的检测产品在基因检测中的应用。
6.基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取如权利要求1至4任一项所述检测产品中的所述扩增引物与待测样品混合，获得分子引发剂反应液；
S2：取如权利要求1至4任一项所述检测产品中的所述的三通核酸密码锁中的所述探针1～所述探针3混合，退火后，与所述分子引发剂反应液混合，获得混合液；
S3：取所述混合液与如权利要求1至4任一项所述检测产品中的所述表面修饰的金电极混合，加热，检测电化学信号，根据电化学检测结果，判断所述待测样品是否为目的基因。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，S1中所述混合包括退火和降温的步骤；所述退火的温度为95℃，时间为1～5min；所述降温的速度为0.1～1℃/s。
8.如权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，S2中所述探针1～所述探针3的终浓度为3～12μM；所述退火的温度为95℃，时间为1～5min。
9.如权利要求6至8任一项所述的检测方法，其特征在于，S3中所述加热的温度为25～65℃，时间为0.5～2h。
10.如权利要求6至9任一项所述的检测方法，其特征在于，S3中所述检测电化学信号包括：所述加热完成后检测和/或所述加热进行中检测；
所述加热进行中检测包括：每4～10min采集一次电化学信号，根据峰高获得电化学检测结果。
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