CN117417986A - 一种基于5-Br-PAPS快速检测靶标核酸序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于5‑Br‑PAPS快速检测靶标核酸序列的方法，属于核酸扩增技术领域。本发明提供了一种5‑Br‑PAPS与LAMP相结合的改良LAMP技术，在LAMP反应体系中添加5‑Br‑PAPS进行等温扩增反应，可以缩短LAMP反应的检测时间，提升检测效率，从而更好地将LAMP反应应用于现场检验。利用该技术进行靶标核酸序列检测具有安全快速、低成本、简单高效、无假阳性现象等优点。
Description
技术领域
本发明涉及核酸扩增技术领域，具体涉及一种利用2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚实现快速检测靶标核酸序列的方法。
背景技术
核酸扩增技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术，目前已广泛应用于传染病检测、生物勘测、食品安全检测、临床诊断和公共卫生监测等研究领域。常用的DNA检测方法主要基于聚合酶链反应(PCR)，包括凝胶电泳PCR、实时荧光定量PCR、数字液滴PCR。然而，由于需要在两到三个不同温度之间进行不断的循环，这些PCR技术需要昂贵的设备、训练有素的人员和昂贵的试剂，并且必须在集中化的实验室中进行，从而不能在现场进行部署。因此，在不损害其敏感性的前提下开发简单的检测工具是非常重要的。
目前已经开发了许多用于核酸扩增的等温方法，如环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等，等温扩增技术全过程在同一温度下进行，使其对仪器的要求简化，反应时间大幅缩短，可通过加热模块、水浴槽等简单的，甚至是非专业的设备完成。因而，更能满足现代分子检测技术快速简便的需求，具有较大的实际应用价值。在这些方法中，基于链置换DNA聚合酶的LAMP技术已经成为用于分析核酸以及检测病原体的最普遍的方法，通过在65℃条件下反应15-60分钟，LAMP反应可以将靶标DNA扩增109-1010倍；此外，由于LAMP反应使用四个核心引物(F3、B3、FIP，BIP)去识别靶标DNA上的六个不同序列区域，从而保证了LAMP检测的特异性。
随着检验工作者的工作量和接触的信息量越来越大，如何缩短靶标DNA的检测时间一直是分子检测领域研究热点。多种方法已被用于加速LAMP反应的进程，例如使用链置换活性更强的Bst DNA聚合酶，研究表明，链侵入/启动是LAMP反应中的限速步骤；挑选具有更高扩增速率的LAMP引物组，以及在内引物和外引物之外额外设计两条环引物用于加速LAMP反应，环引物在加速起始速率方面起着重要作用。为了满足市场日益增加的对快速检测的需求，更多操作需要被用于进一步缩短LAMP反应的检测时间。
2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚(5-Br-PAPS)是一种吡啶偶氮化合物，是一种被广泛使用的分析螯合试剂。它具有两个氧化还原基团：偶氮基团和苯酚基团，可与金属离子结合形成络合物并产生肉眼可见的颜色变化，从而用于检测金属离子。迄今未见5-Br-PAPS在加速LAMP反应中作用的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单快速的核酸检测方法，满足核酸扩增领域对快速检测的需求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚在加快环介导等温扩增反应进程中的应用，所述应用包括在环介导等温扩增反应体系中添加2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚。
本发明研究发现将2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚(5-Br-PAPS)引入环介导等温扩增技术(LAMP)中，可以加速LAMP反应进程，缩短LAMP反应的检测时间，不仅简单高效，而且不影响结果判断，扩增结果无假阳性现象。
所述环介导等温扩增反应可以为但不限于常规LAMP、实时LAMP、多重检测LAMP、免疫LAMP、逆转录LAMP中任意一种。
进一步的，所述环介导等温扩增反应体系中5-Br-PAPS的浓度为8-256μM。研究表明，相较于不添加5-Br-PAPS，在LAMP体系中加入8-256μM的5-Br-PAPS，检测时间缩短。
优选的，所述环介导等温扩增反应体系中5-Br-PAPS的浓度为16-64μM。在LAMP体系中加入16-64μM的5-Br-PAPS，检测时间显著缩短。更优选的，5-Br-PAPS的浓度可以为32μM。
所述环介导等温扩增反应体系的组成可采用本领域常规试剂，包括底物dNTPs或dUTPs、引物、Bst DNA聚合酶及其缓冲液，亦可含有荧光染料、荧光探针。
进一步的，所述环介导等温扩增反应体系还包括1×LAMP缓冲液、Bst DNA聚合酶5-32U、dNTP/dUTP混合物1.0-1.4mM、外引物0.1-1.0μM、内引物0.8-3.0μM、环引物0.1-1.0μM、以及荧光染料和DNA模板。
优选的，Bst DNA聚合酶的浓度为8-16U。在一定范围内，聚合酶浓度越高，扩增效率越高。
优选的，外引物的浓度为0.1-0.4μM，内引物的浓度为1.5-2.0μM，环引物的浓度为0.3-0.6μM。
在环介导等温扩增反应体系中，反应温度以恒定温度进行，反应温度以61-69℃范围提供。优选的，反应温度为63-67℃。更优选的，反应温度为65℃。
本发明还提供了一种快速检测靶标核酸序列的方法，包括以下步骤：
(1)将待测核酸样本加入到含有特异性扩增靶标核酸序列的引物以及2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚的环介导等温扩增反应体系中；
(2)将反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应，然后对扩增产物进行分析。
进一步的，所述环介导等温扩增反应体系的组成包括Bst 2.0ws DNA聚合酶8U、Tris-HCl 20mM、KCl 50mM、(NH4)2SO4 10mM、MgSO4 9.0mM、0.1％ Triton@x-100、dNTP混合组分1.4mM、甜菜碱5.0M、外引物0.2μM、内引物1.6μM、环引物0.4μM、Syto-9 20μM、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚32μM。
进一步的，步骤(2)中，恒温条件为65℃。
本发明提供了一种5-Br-PAPS与LAMP相结合的改良LAMP技术，有效缩短检测时间，适用于畜牧业、农业、食品、临床诊断、科研检测的核酸扩增领域。检测对象可以是传染病基因、耐药细菌、病毒基因、致病菌基因、遗传病基因、基因表达mRNA、转基因农产品基因等靶标核酸。
进一步的，当检测目标物为沙门氏菌时，其特异性扩增靶标核酸序列的引物为：
F3：5’-GAACGTGTCGCGGAAGTC-3’；
B3：5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’；
FIP：
5’-GCGCGGCATCCGCATCAATATGCCCGGTAAACAGATGAGT-3’；
BIP：
5’-GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3’；
LF：5’-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3’；
LB：5’-GAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG-3’。
在本发明中，对所用的反应管、热块不作具体限定，需能保证完成核酸等温扩增反应即可。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明首次公开5-Br-PAPS在加速LAMP反应中的作用，将5-Br-PAPS引入LAMP中，缩短LAMP反应的检测时间，让检验人员可以更快的了解检测结果，提升检测效率，从而更好地将LAMP反应应用于现场检验。
(2)本发明提供了一种5-Br-PAPS与LAMP相结合的改良LAMP技术，利用该技术进行靶标核酸序列检测具有安全快速、低成本、简单高效、无假阳性现象等优点。
附图说明
图1为实施例1中加入不同浓度的5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测结果图，其中，标号1为体系中不加入5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测曲线，标号2为体系中加入8μM 5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测曲线，标号3为体系中加入16μM 5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测曲线，标号4为体系中加入32μM 5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测曲线，标号5为体系中加入64μM 5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测曲线，标号6为体系中加入128μM 5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测曲线，标号7-12为阴性样品检测结果。
图2为实施例1中加入不同浓度(0、8、16、32、64、128、256μM)的5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测时间对比图。
图3为实施例2中基于5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测高浓度沙门氏菌的结果图，其中，标号1为体系中加入5-Br-PAPS的荧光定量LAMP在检测高浓度沙门氏菌时的检测曲线，标号2为体系中不加入5-Br-PAPS的荧光定量LAMP在检测高浓度沙门氏菌时的检测曲线，标号3为体系中加入5-Br-PAPS的荧光定量LAMP在检测阴性样本时的检测曲线，标号4为体系中不加入5-Br-PAPS的荧光定量LAMP在阴性样本时的检测曲线。
图4为实施例3中基于5-Br-PAPS的荧光定量LAMP检测低浓度沙门氏菌的结果图，其中，标号1为体系中加入5-Br-PAPS的荧光定量LAMP在检测低浓度沙门氏菌时的检测曲线，标号2为体系中不加入5-Br-PAPS的荧光定量LAMP在检测低浓度沙门氏菌时的检测曲线，标号3为体系中加入5-Br-PAPS的荧光定量LAMP在检测阴性样本时的检测曲线，标号4为体系中不加入5-Br-PAPS的荧光定量LAMP在阴性样本时的检测曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
5-Br-PAPS，中文名2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚，CAS号：81608-06-2。
实施例中采用的沙门氏菌基因组DNA模板是采用细菌基因组DNA提取试剂盒(购买自天根生化科技有限公司，目录号：DP302)从沙门氏菌菌液中提取，再用DEPC H2O稀释而来。
实施例中对沙门氏菌鉴定采用的引物序列：
F3：5’-GAACGTGTCGCGGAAGTC-3’；
B3：5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’；
FIP：
5’-GCGCGGCATCCGCATCAATATGCCCGGTAAACAGATGAGT-3’；
BIP：
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LF：5’-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3’；
LB：5’-GAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG-3’。
扩增的模板序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例1
本实施例利用含有荧光染料(Syto-9)和5-Br-PAPS的LAMP体系检测沙门氏菌。
探究不同终浓度(0、8、16、32、64、128、256μM)的5-Br-PAPS影响下，对LAMP反应的加速效果。
LAMP扩增体系(25μL)：Bst 2.0ws DNA聚合酶8U、Tris-HCl 20mM、KCl 50mM、(NH4)2SO4 10mM、MgSO4 9.0mM、0.1％ Triton@x-100、dNTP混合组分1.4mM、甜菜碱5.0M、外引物0.2μM、内引物1.6μM、环引物0.4μM、Syto-9 20μM、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚0、8、16、32、64、128或256μM，模板采用浓度为2×105copies/反应的沙门氏菌基因组DNA 2.5μL。
以DEPC H2O作为阴性样品替换扩增体系中的基因组DNA，其他同上。
LAMP反应程序：将LAMP扩增体系置于QuantStudio 3荧光定量PCR仪(ThermoFisher Scientific)，设定程序65℃加热60min。
通过荧光读取装置获取荧光染料(Syto9)与双链DNA结合时产生明显增强的荧光信号从而实现检测。
仪器检测结果如图1所示，根据LAMP反应荧光曲线的起峰时间，可以直观地观察到在不同终浓度(0、8、16、32、64、128μM)的5-Br-PAPS影响下，对LAMP反应的加速效果：32μM(图1中标号4)和64μM(图1中标号5)>16μM(图1中标号3)>128μM(图1中标号6)>8μM(图1中标号2)>0μM(图1中标号1)。此外，经不同浓度5-Br-PAPS加速的LAMP反应在检测阴性样本时(图1中标号7-12)在60分钟内均没有假阳性的产生，符合特异性检测的需求。
根据荧光定量LAMP反应的Ct值对比加入不同浓度(0、8、16、32、64、128、256μM)的5-Br-PAPS对LAMP反应时间的影响。如图2所示，可以明显发现在25μL LAMP体系中加入8-256μM的5-Br-PAPS都获得了比不加入5-Br-PAPS更短的检测时间。
此外，SPSS25软件(IBM Corp，Armonk，NY，USA)被用于分析数据。收集的数据采用单因素方差分析和邓肯多重极差检验进行统计分析。统计分析结果表明，使用16、32或64μM的5-Br-PAPS比使用0、8、128或256μM的5-Br-PAPS时，具有显著更低的Ct值(P<0.05)。而使用16、32或64μM的5-Br-PAPS时的Ct值之间不存在显著性差异(P＝0.383>0.05)。
因此结合图1和图2，我们将16-64μM作为了最佳的5-Br-PAPS加速LAMP反应的工作浓度，因为其具有最短的检测时间。
实施例2
本实施例利用含有荧光染料(Syto-9)和5-Br-PAPS的LAMP体系检测高浓度沙门氏菌。
LAMP扩增体系(25μL)：Bst 2.0ws DNA聚合酶8U、Tris-HCl 20mM、KCl 50mM、(NH4)2SO4 10mM、MgSO4 9.0mM、0.1％ Triton@x-100、dNTP混合组分1.4mM、甜菜碱5.0M、外引物0.2μM、内引物1.6μM、环引物0.4μM、Syto-9 20μM、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚32μM、浓度为2×106copies/反应的沙门氏菌基因组DNA 2.5μL。
将基因组DNA替换成DEPC H2O作为阴性样品。以不加5-Br-PAPS作为阴性对照。
LAMP反应程序：将LAMP扩增体系置于实时荧光定量PCR仪，设定程序65℃加热60min。
结果如图3所示，在检测高浓度的沙门氏菌时，可以明显地观察到含有5-Br-PAPS的LAMP体系(图3中标号1)比不含有5-Br-PAPS的LAMP体系(图3中标号2)拥有更短的检测时间。此外，不管是加入5-Br-PAPS的LAMP体系还是不加5-Br-PAPS的LAMP体系在检测阴性样本(图3中标号3和4)时，在60分钟内都没有观察到假阳性现象的产生。
实施例3
本实施例利用含有荧光染料(Syto-9)和5-Br-PAPS的LAMP体系检测低浓度沙门氏菌。
LAMP扩增体系(25μL)：Bst 2.0ws DNA聚合酶8U、Tris-HCl 20mM、KCl 50mM、(NH4)2SO4 10mM、MgSO4 9.0mM、0.1％ Triton@x-100、dNTP混合组分1.4mM、甜菜碱5.0M、外引物0.2μM、内引物1.6μM、环引物0.4μM、Syto-9 20μM、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚32μM、浓度为2×104copies/反应的沙门氏菌基因组DNA 2.5μL。
将基因组DNA替换成DEPC H2O作为阴性样品。以不加5-Br-PAPS作为阴性对照。
LAMP反应程序：将LAMP扩增体系置于实时荧光定量PCR仪，设定程序65℃加热60min。
结果如图4所示，在检测低浓度的沙门氏菌时，可以观察到含有5-Br-PAPS的LAMP体系(图4中标号1)比不含有5-Br-PAPS的LAMP体系(图4中标号2)拥有更短的检测时间。此外，不管是加入5-Br-PAPS的LAMP体系还是不加5-Br-PAPS的LAMP体系在检测阴性样本(图4中标号3和4)时，在60分钟内都没有观察到假阳性现象的产生。
结合实施例2和实施例3，可以得出结论：适宜浓度的5-Br-PAPS对低浓度和高浓度靶标的LAMP检测都具有加速作用，且对低浓度靶标的LAMP加速作用更明显。
上文中所描述的实施例为本发明的部分实施例，而非全部，不应理解为对本发明的限制。比如上述实施例以使用荧光染料(Syto-9)的实时LAMP为例来阐述其机制和技术特点，这是基于考虑使用荧光染料的实时LAMP不仅操作简便、价格低廉、灵敏，而且能够精确直观的看到反应过程。采用使用荧光染料的实时LAMP作为实施例并不代表本发明仅限于使用荧光染料的实时LAMP，本发明可应用于各种LAMP技术。
本发明是经过反复的研究和实验，通过对5-Br-PAPS的加速扩增作用的深入理解，开发出的一种新型的LAMP工作体系。对于基于此开发体系所开展的研究或者实施例都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚在加快环介导等温扩增反应进程中的应用，其特征在于，在环介导等温扩增反应体系中添加2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述环介导等温扩增反应体系中2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚的浓度为8-256μM。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述环介导等温扩增反应体系中2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚的浓度为16-64μM。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述环介导等温扩增反应体系还包括1×LAMP缓冲液、Bst DNA聚合酶5-32U、dNTP/dUTP混合物1.0-1.4mM、外引物0.1-1.0μM、内引物0.8-3.0μM、环引物0.1-1.0μM、以及荧光染料和DNA模板。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述环介导等温扩增反应体系中，Bst DNA聚合酶的浓度为8-16U，外引物的浓度为0.1-0.4μM，内引物的浓度为1.5-2.0μM，环引物的浓度为0.3-0.6μM。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的温度为61-69℃。
7.一种快速检测靶标核酸序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测核酸样本加入到含有特异性扩增靶标核酸序列的引物以及2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚的环介导等温扩增反应体系中；
(2)将反应体系置于恒温条件下进行等温扩增反应，然后对扩增产物进行分析。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应体系的组成包括Bst 2.0ws DNA聚合酶8U、Tris-HCl 20mM、KCl 50mM、(NH4)2SO4 10mM、MgSO4 9.0mM、0.1％Triton@x-100、dNTP混合组分1.4mM、甜菜碱5.0M、外引物0.2μM、内引物1.6μM、环引物0.4μM、Syto-9 20μM、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚32μM。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，恒温条件为65℃。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当检测目标物为沙门氏菌时，其特异性扩增靶标核酸序列的引物为：
F3：5’-GAACGTGTCGCGGAAGTC-3’；
B3：5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’；
FIP：
5’-GCGCGGCATCCGCATCAATATGCCCGGTAAACAGATGAGT-3’；
BIP：
5’-GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3’；
LF：5’-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3’；
LB：5’-GAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG-3’。
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