CN112391449B

CN112391449B - 一种引物设计灵活的多功能dna恒温扩增方法及其应用

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Publication number: CN112391449B
Application number: CN202110065400.0A
Authority: CN
Inventors: 蒋健晖; 王海波; 唐丽娟; 唐昊
Original assignee: Hunan Rongjian Gene Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hunan Rongjian Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112391449A

Abstract

本发明涉及一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其应用，其采用第一和第二引物对、识别并切除双链DNA中一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶的混合物；第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增DNA的上游端或下游端互补的识别区，在非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；第二引物对中的每一条引物各自包含与第一引物对中的每一条引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；在恒定温度和两种酶的作用下，第一和第二引物对以模板进行扩增。其引物设计简单，实现DNA灵敏高效的扩增和更多功能。

Description

一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物检测领域，尤其涉及一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其在DNA检测中的应用。

背景技术

核酸体外扩增是分子生物学研究的基础，随着生物技术的发展，出现了越来越多的核酸体外扩增技术，如聚合酶链式反应、环介导的等温扩增、滚环扩增、依赖解旋酶的DNA等温扩增等。核酸体外扩增是核酸分析中的一个重要环节，是方法灵敏度、特异性等重要技术参数指标的保证。

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是根据靶基因序列设计1对特异的引物，在体外模拟DNA的天然复制的过程，其特异性依赖于针对靶序列的引物，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成，在2-3小时内即实现对靶基因几百万倍的扩增放大。该技术依赖于特殊精密的热循环设备，反应所需的时间较长，导致检测总成本高，不适用于样品的快速检测。

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）依赖于环状模板，但绝大多数基因组DNA为线性分子，且合成滚环扩增锁式探针的成本高，存在信号背景问题。依赖解旋酶的DNA等温扩增（helicase-dependent amplification，HDA）则受到DNA解旋酶的限制，主要用于扩增小片段的DNA序列。

环介导的等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种在等温条件下进行核酸扩增的技术，可以广泛应用于食品安全检测等领域。该技术灵敏度高，在等温条件下扩增15分钟至1小时即可产生10⁹～10¹⁰倍的扩增子，但若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间很容易发生非特异性结合，产生引物二聚体，从而消耗反应体系中的反应底物，降低反应效率和检测灵敏度，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。并且，现有的等温扩增方法在设计引物时完全依赖于靶标序列，因此易受到靶标序列的限制，可能存在因无法设计引物而不能扩增特定序列的问题。因此，如何优化等温扩增反应，使得其既有较高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增，同时在引物设计方面更加灵活，一直是该技术领域急需解决的技术难题。并且，目前的核酸检测方法还对实现更多的功能的检测，如产物的捕获、富集、标记、多重检测等等有更强烈的需求。一旦攻克这个难题，则可以扩大核酸分析技术在分子生物学与疾病诊断等相关领域的应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种简单、高效、特异性好、灵敏度高，且可以实现更多功能的DNA恒温扩增方法。

本文所述的常规DNA碱基是指腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C），本文所述的非常规DNA碱基是指除腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之外的DNA碱基。

本发明所述的DNA恒温扩增方法包括：

（1）制备反应混合物，其中所述反应混合物包括待扩增的DNA、第一引物对（P1和P3）、第二引物对（P2和P4）、三磷酸脱氧腺苷（dATP）、三磷酸脱氧鸟苷（dGTP）、三磷酸脱氧胞苷（dCTP）、三磷酸脱氧胸苷（dTTP）、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶；其中所述第一引物对（P1和P3）中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增的DNA的上游端或下游端互补的识别区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对（P2和P4）中的每一条引物各自包含与所述第一引物对中的每一条引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；其中所述非常规碱基的数量为2-15个；其中，所述编码区可以根据需要设计成相应的序列，所述识别区为特异性捕获区域，可识别目标序列。

（2）将步骤（1）获得的反应混合物置于恒定温度下，在识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能DNA聚合酶的作用下，第一引物对和第二引物对以待扩增的DNA为模板进行DNA扩增。

在根据本发明所述的DNA的恒温扩增方法中，所述非常规DNA碱基可以选自：5-羧基胞嘧啶（5caC）、乙烯基胞嘧啶（EthenoC）、乙烯基腺嘌呤（EthenoA）、3-甲基腺嘌呤（3-MeA）、7-甲基腺嘌呤（7-MeA）、3-甲基鸟嘌呤（3-MeG）、7-甲基鸟嘌呤（7-MeG）、N6-甲基腺嘌呤（m6A）、次黄嘌呤、脱氧次黄嘌呤、8-氧鸟嘌呤（8-oxoG），及其任意组合。

在根据本发明所述的DNA的恒温扩增方法中，所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶具有热稳定性和/或AP-裂解酶活性。具体地，所述识别并切除双链DNA中的一条DNA链内的非常规DNA碱基的酶可以选自：DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V（脱氧次黄苷3’内切核酸酶）。所述非常规碱基修饰区被所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶特异识别并切除后，可有效降低非常规碱基修饰区与待扩增的DNA的杂交稳定性。优选地，所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）、甲基嘌呤DNA糖基化酶（AAG）、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1（OGG1）、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶（Fpg），及其任意组合。

在本发明所述的DNA的恒温扩增方法中，所述具有链置换功能的DNA聚合酶具有热稳定性。所述具有链置换功能的DNA聚合酶可以选自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137 DNA聚合酶、Vent聚合酶（例如Deep Vent聚合酶、Vent（-exo）聚合酶、DeepVent（-exo）聚合酶、9°Nm聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T7 phase DNA聚合酶变种（缺少3’-5’外切酶活性）、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶，及其任意组合。

在本发明的一些实施方案中，所述非常规碱基修饰区和识别区的长度分别为12-30个碱基。在本发明的一些实施方案中，所述非常规DNA碱基的数量为2-15个；优选地，所述非常规碱基均匀地分布在所述非常规碱基修饰区中。

在本发明的一些实施方案中，所述反应混合物进一步包含pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间。

在本发明的一些实施方案中，所述反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂。优选地，所述细胞表面活性剂为Triton X-100。

优选地，Mg²⁺的浓度为6 mM-10 mM；K⁺的浓度为4 mM-8 mM；NH₄ ⁺的浓度为6 mM-15mM；H⁺的浓度为15 mM-25 mM；Cl^-的浓度为4 mM-8 mM；SO₄ ^2-的浓度为6 mM-15 mM；Tris-HCl的浓度为15 mM-25 mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL-0.02 g/mL；三磷酸脱氧腺苷（dATP）、三磷酸脱氧鸟苷（dGTP）、三磷酸脱氧胞苷（dCTP）、三磷酸脱氧胸苷（dTTP）的浓度分别为1.0 mM-2.0 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40 U/mL-100 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为300U/mL-350 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM；第二引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM。

更优选地，Mg²⁺的浓度为8 mM；K⁺的浓度为6 mM；NH₄ ⁺的浓度为10 mM；H⁺的浓度为20mM；Cl^-的浓度为6 mM；SO₄ ^2-的浓度为10 mM；Tris-HCl的浓度为20 mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL；三磷酸脱氧腺苷（dATP）、三磷酸脱氧鸟苷（dGTP）、三磷酸脱氧胞苷（dCTP）、三磷酸脱氧胸苷（dTTP）的浓度分别为1.4 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶的浓度为50 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为320 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM；第二引物对的浓度为0.8 μM。

在本发明所述的DNA的恒温扩增方法中，所述恒定温度为25℃～95℃中的任一温度，且所述恒定温度至少满足下列情况之一：

（1）将所述反应混合物置于能够降低所述待扩增的DNA及其扩增产物的双链稳定性的温度；

（2）将所述反应混合物置于能够使所述第一引物对和第二引物对与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合的温度；

（3）将所述反应混合物置于能够使所述第一引物对和第二引物对与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合，并且在所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的作用下剪切所述非常规碱基修饰区中的非常规碱基的温度，以降低所述第一引物对和第二引物对与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合的稳定性；

（4）将所述反应混合物置于能够使与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合的第一引物对和第二引物对在所述DNA聚合酶的作用下延伸的温度，以产生扩增产物；和

（5）将所述反应混合物置于能够使与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合分子信标，以检测扩增产物。

优选地，在本发明的一些实施方案中，所述恒定温度为60℃～65℃。

本发明所述的DNA的恒温扩增方法可用于细菌、病毒或动植物细胞的DNA扩增。结合说明书附图1，根据本发明所述的DNA恒温扩增方法的反应机制简述如下：

a. 将反应混合物置于恒定温度，例如60~65℃温度下，在具有链置换功能DNA聚合酶的作用下，第一引物P1中的识别区（III）以待扩增的DNA中的一条链为模板进行引物延伸，形成引物延伸链，从而获得引物延伸链与模板DNA形成的双链DNA；紧接着，第一引物P3中的识别区（III）以第一引物P1延伸的一条DNA链为模板，进行引物延伸，形成引物延伸链，从而获得两条引物延伸链形成的双链DNA；

b. 在识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶的作用下，第一引物P1中的非常规碱基修饰区（I）中的非常规碱基被识别并切除，使得步骤a获得的双链DNA释放非常规DNA碱基，从而降低第一引物P1的非常规碱基修饰区（I）与另一引物延伸链结合的稳定性；

c. 反应混合物中的其余第一引物P1、第二引物P2分别进入释放非常规DNA碱基的位置（即第一引物P1和第二引物P2的非常规碱基修饰区），与模板DNA结合，在具有链置换功能的DNA聚合酶的作用下，第一引物P1、第二引物P2延伸，形成第一引物P1、第二引物P2的延伸链，从而获得第一引物P1、第二引物P2的延伸链与其模板DNA形成的双链DNA，同时，置换释放步骤a获得的双链DNA中的引物延伸链，形成释放的引物延伸DNA单链；

d. 循环进行上述步骤b至c，其中上一轮循环所获得的剩余的第一引物P1和第二引物P2的延伸链与模板DNA形成的双链DNA中的第一引物P1和第二引物P2的延伸链被释放，从而通过持续置换释放双链DNA中的引物延伸链而产生大量的释放的引物延伸DNA单链；

e. 在具有链置换功能DNA聚合酶的作用下，第一引物P3通过其识别区（III）以步骤d获得大量的释放的引物延伸DNA单链为模板进行引物延伸，形成引物延伸链，从而获得引物延伸链与模板DNA形成的双链DNA；

f. 在识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶的作用下，第一引物P3的非常规碱基修饰区（I）中的非常规碱基被识别并切除，使得步骤e获得的双链DNA释放非常规DNA碱基，从而降低第一引物P3的非常规碱基修饰区（I）与模板DNA结合的稳定性；

g. 反应混合物中的第一引物P3、第二引物P4分别进入释放非常规DNA碱基的位置（即第一引物P3和第二引物P4中的非常规碱基修饰区），与模板DNA结合，在具有链置换功能的DNA聚合酶的作用下，第一引物P3、第二引物P4延伸，形成第一引物P3、第二引物P4的延伸链，从而获得第一引物P3、第二引物P4的延伸链与模板DNA形成的双链DNA，同时，置换释放步骤f获得的双链DNA中的引物延伸链，形成释放的引物延伸DNA单链；

h. 循环进行上述步骤f至g，其中上一轮循环所获得的剩余的第一引物P3和第二引物P4的延伸链与模板DNA形成的双链DNA中的第一引物P3和第二引物P4的延伸链被释放，从而通过持续置换释放双链DNA中的引物延伸链而产生大量的释放的引物延伸DNA单链；

i. 在具有链置换功能DNA聚合酶的作用下，第一引物P1通过其识别区（III）以步骤h获得大量的释放的引物延伸DNA单链为模板进行引物延伸，形成引物延伸链，从而获得引物延伸链与模板DNA形成的双链DNA，即回到步骤a；

j. 循环进行上述步骤a至i。

其中，经过第一次步骤a至i后，第一引物对（P1和P3）中的每一引物和第二引物对（P2和P4）中的每一引物分别扩增并释放的大量引物延伸DNA单链均可以作为模板用于后续循环进行DNA扩增反应，以此类推，循环进行上述步骤a至i使得DNA扩增反应的模板数急速增加，大大提高了反应速度。

本发明还提供了一种用于DNA恒温扩增的试剂盒，其包括：第一引物对、第二引物对、三磷酸脱氧腺苷（dATP）、三磷酸脱氧鸟苷（dGTP）、三磷酸脱氧胞苷（dCTP）、三磷酸脱氧胸苷（dTTP）、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶；其中所述第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增的DNA的上游端或下游端互补的识别区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物各自包含与所述与第一引物对中的每一引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；其中所述非常规碱基的数量为2-15个。

优选地，所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基酶选自DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V；优选地，所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）、甲基嘌呤DNA糖基化酶（AAG）、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1（OGG1）、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶（Fpg），及其任意组合。

优选地，所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137 DNA聚合酶、Vent聚合酶（例如Deep Vent聚合酶、Vent（-exo）聚合酶、Deep Vent（-exo）聚合酶）、9°Nm聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T7 phase DNA聚合酶变种（缺少3’-5’外切酶活性）、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶，及其任意组合。

优选地，所述试剂盒进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂。优选地，所述细胞表面活性剂为Triton X-100。

另一方面，本发明还提供了一种DNA检测方法，其包括使用上述的DNA恒温扩增方法或用于DNA恒温扩增的试剂盒扩增DNA。优选地，其中所述反应混合物还包含一种或多种分子信标，并且所述分子信标的环区序列与第一引物对中的一条引物的编码区的序列相同，并且在5’和3’端分别携带荧光基团和猝灭基团。由于所述分子信标的环区序列与第一引物对的一条引物编码区的序列相同，因此可与反应扩增产物序列互补，可用于特异性捕获反应扩增产物，分子信标的茎区序列互补，使得在分子信标的5’和3’端分别标记的荧光基团和猝灭基团靠近而淬灭荧光，而在特异性捕获到反应扩增的产物时，荧光基团和猝灭基团分开，荧光恢复。

相应地，本发明还提供了一种用于DNA检测的试剂盒，其包括：第一引物对、第二引物对、任选的分子信标、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶；其中所述第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增的DNA的上游端或下游端互补的识别区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物各自包含与所述第一引物对中的每一引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；其中所述非常规碱基的数量为2-15个。

优选地，所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基酶选自DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V；优选地，所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶、甲基嘌呤DNA糖基化酶、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，及其任意组合。

优选地，所述试剂盒进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂；优选地，所述细胞表面活性剂为Triton X-100。

优选地，Mg²⁺的浓度为6 mM-10 mM；K⁺的浓度为4 mM-8 mM；NH₄ ⁺的浓度为6 mM-15mM；H⁺的浓度为15 mM-25 mM；Cl^-的浓度为4 mM-8 mM；SO₄ ^2-的浓度为6 mM-15 mM；Tris-HCl的浓度为15 mM-25 mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL-0.02 g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.0 mM-2.0 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40 U/mL-100 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为300 U/mL-350 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM；第二引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM；分子信标的浓度为1.0 μM-2.0 μM。

更优选地，Mg²⁺的浓度为8 mM；K⁺的浓度为6 mM；NH₄ ⁺的浓度为10 mM；H⁺的浓度为20mM；Cl^-的浓度为6 mM；SO₄ ^2-的浓度为10 mM；Tris-HCl的浓度为20 mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.4 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶的浓度为50 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为320 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM；第二引物对的浓度为0.8 μM；分子信标的浓度为2.0 μM。采用本发明的方法进行DNA扩增为一步操作，即在恒温扩增混合液中加入待扩增模板后，立刻封闭反应管置于恒温下进行反应即可，极大地简化了扩增反应的操作过程。此外，闭管反应也避免了反复开管可能带来的样品交叉污染、造成假阳性的问题，而恒温反应则避免了如PCR技术对温度精密控制设备的依赖，降低了实验仪器成本。并且，从扩增产物角度来说，LAMP的产物杂乱，各种分子量的核酸链都会存在，而本发明方法的扩增产物分子量会很单一，在电泳上分析时，不会出现类似LAMP产物那样杂乱的条带。从这方面来说，因产物的单一且忠实于原模板，从而使得本发明方法的优势在于扩增产物更容易被进一步实施测序等分析工作。

另外，本发明采用特殊的引物设计，引物在模板上仅覆盖两个不同的区域，极大地降低了LAMP中引物需要覆盖模板上六至八个不同区域的要求，因而不会出现LAMP中因无法获得合适的引物对，从而导致无法实施LAMP扩增的情况。引物探针设计时，仅需要在靶标的上下游引物各选取一个区间作为引物对靶标的特异识别捕获，因而对靶标的序列要求降低，更便于设计，尤其是对较短的靶标区间设计更有利（便利程度接近或等同于PCR）；非常规碱基修饰区独立于靶标序列设计，不受限于靶标序列，因此可使用通用设计，从而灵活性更好，设计更便利；在引物的非常规碱基修饰区和识别区间可灵活插入编码区，便于实现更多功能，例如产物的捕获、富集、标记、多重检测等等；这对于产物的多重实时分析与后续的进一步实验等均非常有利，可极大降低实验成本、简化后续实验操作，同时在同时检测性能上提升。在扩增过程中，产生的是大量的单链扩增产物（类似于SDA与PCR的产物），因此亦可用特异性探针用于产物的检测。

相对于发明人的在先专利ZL201911065571.2，本发明的最大不同在于引物设计构思上的进步。在先专利的引物设计完全依赖于靶标序列，因此易受到靶标序列的限制，可能存在因无法设计引物而不能扩增特定序列的问题。另外，在先专利的引物无法引入编码区，因此就无法实现扩增产物的捕获、富集、标记、多重检测等，或者需要额外的实验步骤进一步实现相应功能，例如通过多管并行反应实现多重检测。而本发明仅识别区依照靶标序列设计，体现了引物设计上的灵活性，有利于引物设计的成功。另外，本发明也可根据需要自由引入编码区，便于实现更多功能，例如产物的捕获、富集、标记、多重检测等等，这对于产物的多重实时分析与后续的进一步实验等均非常有利，可以极大地降低实验成本、简化后续实验操作，同时在检测性能上得到提升。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的DNA扩增方法的基本原理图。

图2为采用本发明的方法对碳青霉烯耐药基因KPC特征序列进行扩增的实时荧光曲线，其中基于双链嵌入染料进行实时荧光监测。

图3A为采用本发明的方法对不同浓度下的碳青霉烯耐药基因KPC特征序列扩增的实时荧光曲线，其中基于双链嵌入染料进行实时荧光监测。

图3B为采用本发明的方法对不同浓度下的碳青霉烯耐药基因KPC特征序列扩增的工作曲线，其中基于双链嵌入染料进行实时荧光监测。

图4为根据本发明的多重DNA扩增及检测方法的基本原理图。

图5为采用本发明的方法基于分子信标实现的碳青霉烯耐药基因KPC（曲线a）与NDM（曲线b）的同时多重扩增与荧光检测曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括的定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

实施例1：基于双链嵌入染料的实时荧光监测可行性验证实验（检测碳青霉烯耐药基因KPC）

碳青霉烯类抗生素作为广谱的抗生素，是重症感染或其他抗菌药物治疗疗效不佳时首选药物，有时甚至成为唯一可用的有效药物。对重症患者进行碳青霉烯酶耐药性和感染检测，可以快速判断病患感染及耐药类型。

以碳青霉烯耐药KPC基因序列作为扩增靶标设计引物组序列，并借助实时荧光分析读取扩增产物的量，以验证本发明的方法恒温扩增基因组的扩增效率和灵敏度。

依据碳青霉烯耐药KPC基因设计检测引物，包括第一引物对P1和P3、第二引物对P2和P4，其中所述第一引物对（P1和P3）序列由三部分组成，I区域为非常规碱基修饰区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区（II区域）相邻的位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基，即5’端修饰部分中的部分胞嘧啶被选择性修饰为5-羧基胞嘧啶；II区域为编码区，根据需要设计其相应的序列；III区域为特异性识别区域，用于识别和捕获目标序列，其分别与待扩增的KPC基因质粒DNA的上游端和下游端互补；其中所述第二引物对（P2和P4）中的引物序列与第一引物对中的I区域相同。

本实施例中使用的引物根据如下原则设计：

（1）第一引物对（P1和P3）序列由三部分组成，I区域为非常规碱基修饰区，其中至少与编码区相邻的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基，即5’端修饰部分中的部分胞嘧啶被选择性修饰为5-羧基胞嘧啶，识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶能够特异识别非常规碱基；II区域为编码区，根据需要设计其相应的序列；III区域为特异性识别区域，识别并捕获目标序列，分别与待扩增的KPC基因质粒DNA的上游端和下游端互补。

（2）第二引物对（P2和P4）中的引物序列与第一引物对中每一引物的I区域相同。第二引物对和第一引物对中的引物的5’端修饰部分均可在靶基因组DNA的相同区间与该靶基因组DNA互补配对杂交。

（3）第一引物对和第二引物对中的非常规碱基相对均匀地分布在修饰部分中。

KPC基因质粒序列（SEQ ID NO: 1）：

AGGCATGACGGTGGCGGAGCTGTCCGCGGCCGCCGTGCAATACAGTGATAACGCCGCCGCCAATTTGTTGCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCGGCGATACCACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAGGCGATGCGCGCGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGGGCTCTGCACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGACCGGCAACCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCGGAACCTGCGGAGTGTATGGCACGGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCAC

表1 碳青霉烯耐药KPC基因扩增引物序列表

注：^aN为5-羧基胞嘧啶（5caC）。单下划线标记序列为引物I区；双下划线标记序列为引物II区；虚线标记序列为引物III区。

制备恒温扩增反应混合物，其中该反应混合物含有8mM Mg²⁺、6 mM K⁺、10 mM NH₄ ⁺、20 mM H⁺、6 mM Cl^-、10 mM SO₄ ^2-、20 mM Tris-HCl、0.01 g/mL Triton X-100、dNTP即dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为1.4 mM、50 U/mL非常规碱基的识别酶（胸腺嘧啶DNA糖基化酶，TDG）、320 U/mL Bst DNA聚合酶、表1中SEQ ID NO: 2所示的引物0.2 μM、SEQ ID NO: 3所示的引物0.8 μM、SEQ ID NO: 4所示的引物0.2 μM、SEQ ID NO: 5所示的引物0.8 μM，以及SYBRGreen I为实时荧光分析染料。

向待扩增的碳青霉烯耐药KPC基因的双链DNA提供恒温扩增混合液，获得反应混合物。此扩增反应为一步操作，即在恒温扩增混合液中加入待扩增模板后，立刻封闭反应管，并将所述反应混合物置于63℃进行DNA扩增反应，等温反应50 min，反应pH值为8.0。

以图1为例，说明为本发明的反应过程。在该反应过程中，第一引物P1中的III区域与作为模板的KPC基因DNA的正义链互补杂交，形成引物延伸链，从而获得引物延伸链与模板DNA形成的双链DNA；紧接着，第一引物P3中的III区域以第一引物P1延伸的一条DNA链为模板，进行引物延伸，形成引物延伸链，从而获得引物延伸链与其模板DNA形成的双链DNA。

胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）特异性地识别并切除该双链DNA中的引物延伸链中的5’端修饰部分的非常规碱基5-羧基胞嘧啶，在非常规碱基切除区域处，因切除后互补碱基的缺失降低了引物延伸链在5’端修饰部分与其模板DNA正义链的杂交稳定性。此时，溶液中游离的、完整的、剩余的第二引物P2插入引物延伸链与其模板DNA正义链的不稳定杂交区间，形成剩余的第二引物P2与所述模板DNA正义链的稳定的双链结构，并进一步在具有链置换功能的Bst DNA聚合酶的作用下，该剩余的第二引物P2发生3’端延伸反应，形成剩余的第二引物P2的引物延伸链，从而获得第二引物P2的引物延伸链与该模板DNA正义链形成的双链DNA，同时置换释放出上一轮Bst DNA聚合酶延伸反应产生的引物延伸链，获得置换释放的引物延伸DNA单链，该引物延伸DNA单链即为模板DNA反义链；而此时TDG特异性地识别并切除与模板DNA正义链形成稳定双链DNA的剩余的第二引物对中P2引物延伸链5’端修饰部分的非常规碱基，降低第二引物对中P2引物延伸产物链在5’端与其模板DNA的杂交稳定性，从而形成“游离第二引物对中P1引物插入与模板DNA杂交、游离第二引物对中P2引物插入与模板DNA杂交、Bst DNA聚合酶延伸并置换上一轮的引物延伸链、TDG特异性地识别并切除双链中第二引物对中P2引物的引物延伸链5’端修饰部分的非常规碱基、第二引物对中的P2引物的引物延伸链在5’端与模板DNA的杂交稳定性降低”的循环，不断产生与模板DNA正义链互补的、通过引物延伸形成的反义链序列，反义链得到扩大（溶液中游离的、完整的、剩余的第一引物P1也可参与这样的过程，但由于P2引物的浓度远大于P1引物，所以主要是P2引物参与此过程）；而第一引物对中的P3和第二引物对中的P4又以扩增的反义链序列为模板，在Bst DNA聚合酶与TDG的协同作用下，发生与上述正义链序列扩增类似的循环反应，得到扩增的正义链序列；更进一步地，该扩增得到的正义链序列可与游离的第一引物对中的P1引物结合，在聚合酶的作用下，3’端被延伸并获得可与第二引物对中的P2引物杂交的序列区间，进入聚合酶与TDG协同作用下的第二引物对中的P2引物插入杂交、引物延伸、非常规碱基切除的循环扩增反应，得到扩增的反义链序列（P1引物也参与这样的过程，但因为P2引物的浓度远大于P1引物，所以主要是P2引物参与此过程）；同理，此循环产生的扩大的反义链与游离的第一引物对中的P3引物结合，在聚合酶的作用下，3’端被延伸并获得可与第二引物对中的P4杂交的序列区间，并发生类似于第二引物对中的P2与正义链相互作用下的正义链循环扩增反应，得到扩大的正义链序列，并进入下一轮的循环反应。

上述扩增反应过程中，具有较长序列的第一引物对P1和P3与具有较短序列的第二引物对P2和P4相互配合，第一引物对P1和P3作为长引物在与扩增的正义链序列和扩增的反义链序列配对后，由其进行聚合酶延伸反应，同时让扩增的正义链序列和扩增的反义链序列作为第一引物对P1和P3的模板，使得扩增的正义链序列和扩增的反义链序列的3’端被聚合酶延伸，得到与引物的修饰部分配对的序列，即可被作为短引物对的第二引物对P2和P4结合的序列，此被延伸的扩增的正义链序列和被延伸的扩增的反义链序列进入循环，起到加快聚合酶链置换扩增反应的作用，加速链置换反应进程，产生更多的新生成的模板，一长一短两套引物相互配合，从而实现恒温下靶DNA的指数级扩增。

本实施例采用实时荧光光谱仪进行检测，实时监测荧光选择SYBR通道，对应染料SYBR Green I选择激发波长497 nm和发射波长520 nm，每间隔30s读取一次荧光值，具体结果实时荧光曲线图请参见图2。实时荧光曲线图显示：对于碳青霉烯耐药KPC基因，随着扩增时间的推移，在10 min左右体系荧光逐渐增强，反应20 min时，荧光达到最大值，表明本发明的方法对碳青霉烯耐药KPC基因的快速响应。同时，对于空白体系（c）和加入碳青霉烯耐药NDM基因质粒的对照体系（b），反应进行50 min的过程中，体系荧光均无显著变化，表明本发明对碳青霉烯耐药KPC基因的特异响应。

实施例2：基于双链嵌入染料实时荧光定量分析碳青霉烯耐药基因KPC

如实施例1制备恒温扩增反应混合物，反应温度为63℃，反应pH值为8.0。向待扩增的不同浓度的碳青霉烯耐药KPC基因的双链DNA提供恒温扩增混合液，获得反应混合物。此扩增反应为一步操作，即在恒温扩增混合液中加入待扩增模板后，立刻封闭反应管，并将所述反应混合物置于63℃进行DNA扩增反应，等温反应50 min。

本实施例用实时荧光光谱仪进行检测，实时监测荧光选择SYBR通道，对应染料SYBR Green I选择激发波长497 nm和发射波长520 nm，每间隔30 s读取一次荧光值，结果记录为实时荧光曲线图，从扩增效率方面验证本发明恒温扩增目标DNA的性能。

实验结果见图3A所示的实时荧光曲线图，其对应于不同浓度的碳青霉烯耐药KPC基因质粒（浓度分别为100 fM、10 fM、1 fM、100 aM和0 M）。除空白样本0 M外，测得的实时荧光曲线的POI（point of inflection）值随着靶标浓度的升高而降低，表明本发明的方法对靶基因的高灵敏度动态响应，并均在50 min内完成扩增反应，达到平衡，表明了本发明的方法在恒温下极高的扩增效率和灵敏度。

将实验中各实时荧光曲线的POI值对碳青霉烯耐药KPC的质粒浓度对数作图，得到本实施例的定量工作曲线，如图3B所示。定量工作曲线显示：当靶标碳青霉烯耐药KPC浓度在100 aM-100 fM之间时，POI值与标靶浓度线性相关，表明本发明方法可用于靶标碳青霉烯耐药KPC的定量分析。

实施例3：基于分子信标的碳青霉烯耐药基因KPC与NDM的同时检测

针对本发明的设计原理，反应中的第一引物P1设计由三部分组成，I区域为非常规碱基修饰区，其中在所述修饰部分中至少与未修饰部分相邻的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基，即5’端修饰部分中的部分胞嘧啶被选择性修饰为5-羧基胞嘧啶；II区域为编码区，根据需要设计相应的序列；III区域为特异性捕获区域，识别目标序列，分别与待扩增的KPC基因质粒DNA的上游端和下游端互补。由于II区域为编码区，可以设计不同的分子信标，捕获反应扩增的产物，达到同时检测多种目标的目的。其中所述分子信标的环区序列与第一引物对的II区域相同，与反应扩增产物序列互补，用于特异性捕获反应扩增的产物，分子信标的茎区序列互补，并在5’和3’端分别标记荧光基团和猝灭基团，每种分子信标标记一种荧光基团，则可以达到同时检测几种目标基因的效果。

NDM基因质粒序列（SEQ ID NO: 6）：

CTGGCAGCACACTTCCTATCTCGACATGCCGGGTTTCGGGGCAGTCGCTTCCAACGGTTTGATCGTCAGGGATGGCGGCCGCGTGCTGGTGGTCGATACCGCCTGGACCGATGACCAGACCGCCCAGATCCTCAACTGGATCAAGCAGGAGATCAACCTGCCGGTCGCGCTGGCGGTGGTGACTCACGCGCATCAGGACAAGATGGGCGGTATGGACGCGCTGCATGCGGCGGGGATTGCGACTTATGCCAATGCGTTGTCGAACCAGCTTGCCCCGCAAGAGGGGATGGTTGCGGCGCAACACAGCCTGACTTTCGCCGCCAATGGCTGGGTCGAACCAGCAACCGCGCCCAACTTTGGCCCGCTCAAGGTATTTTACCCCGGCCCCGGCCACACCAGTGACAATATCACCGTTGGGATCGACGGCACCGACATCGCTTTTGGTGGCTGCCTGATCAAGGACAGCAAGGCCAAGTCGCTCGGCA

表2 碳青霉烯耐药基因NDM扩增引物序列表

注：^a N为5-羧基胞嘧啶（5caC）。单下划线标记序列为引物I区；双下划线标记序列为引物II区；虚线标记序列为引物III区。

制备恒温扩增反应混合物，其中该反应混合物含有8 mM Mg²⁺、6mM K⁺、10 mM NH₄ ⁺、20 mM H⁺、6 mM Cl^-、10 mM SO₄ ^2-、20 mM Tris-HCl、0.01 g/mL Triton X-100、dNTP即dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为1.4 mM、50 U/mL非常规碱基的识别酶（胸腺嘧啶DNA糖基化酶，TDG）、320 U/mL Bst DNA聚合酶、表1与表2中SEQ ID NO: 2、NO: 4、NO: 7与NO: 9所示的引物分别为0.2μM、SEQ ID NO: 3、NO: 5、NO: 8与NO: 10所示的引物分别为0.8μM，以及表3中SEQID NO: 11与NO: 12所示的分子信标分别为1.0μM。

表3 用于碳青霉烯耐药基因KPC与NDM扩增的分子信标的序列表

反应温度为63℃，反应pH值为8.0。向待扩增的碳青霉烯耐药KPC和NDM基因双链DNA提供恒温扩增混合液，获得反应混合物。此扩增反应为一步操作，即在恒温扩增混合液中加入待扩增模板后，立刻封闭反应管，并将所述反应混合物置于63℃进行DNA扩增反应，等温反应30 min。

以图4为例，说明本发明进行的多重DNA扩增反应及荧光检测的实施过程。在该反应扩增过程中，产生了大量的单链扩增产物（类似于SDA与PCR的产物），因此可设计特异性分子信标探针用于产物的检测。

对于碳青霉烯耐药基因KPC与NDM，分别设计分子信标MB1与MB2，在5’标记TAMRA/Cy5荧光基团，3’标记BHQ2猝灭基团，分子信标自身的茎区序列互补，两个分子信标的环区序列分别与靶标第一引物对的II区域相同，与反应扩增产物序列互补。在没有靶分子及其扩增产物的时候，分子信标的荧光和淬灭基团靠得很近，发生荧光能量共振转移，荧光被淬灭。随着反应慢慢进行，产生了大量的与目标DNA序列互补的单链扩增产物，分子信标分别MB1与MB2与其单链扩增产物结合，分子信标的空间构型发生改变，5’标记荧光基团远离3’标记猝灭基团，荧光恢复，TAMRA/Cy5荧光信号增强。

用荧光光谱仪进行反应终点荧光检测，激发波长为560 nm/640 nm，记录560 nm-750 nm波长范围内的荧光发射强度，结果记录为荧光曲线图，验证本发明同时恒温扩增多靶标DNA及检测的性能。如图5所示，实验结果表明KPC和NDM基因均在30 min内给出了不同的荧光曲线，表明本发明方法恒温扩增可以借助第一引物对的II区域作为编码，结合分子信标等方法同时检测碳青霉烯耐药KPC和NDM基因，说明了本发明方法的灵活性及用于高通量检测的潜力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖南融健基因生物科技有限公司

<120> 一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其应用

<130> DIC20110022

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 414

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aggcatgacg gtggcggagc tgtccgcggc cgccgtgcaa tacagtgata acgccgccgc 60

caatttgttg ctgaaggagt tgggcggccc ggccgggctg acggccttca tgcgctctat 120

cggcgatacc acgttccgtc tggaccgctg ggagctggag ctgaactccg ccatcccagg 180

cgatgcgcgc gatacctcat cgccgcgcgc cgtgacggaa agcttacaaa aactgacact 240

gggctctgca ctggctgcgc cgcagcggca gcagtttgtt gattggctaa agggaaacac 300

gaccggcaac caccgcatcc gcgcggcggt gccggcagac tgggcagtcg gagacaaaac 360

cggaacctgc ggagtgtatg gcacggcaaa tgactatgcc gtcgtctggc ccac 414

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<400> 2

ctagaancgg tngacgcaat naacgattcc agtatttccc gaagactccg ccatcccagg 60

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<400> 3

ctagaancgg tngacgcaat n 21

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<400> 4

atcttntggn aaaataaaac cngggagcgt cgtgtaaaga aagagttccg actgcccagt 60

ctg 63

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<400> 5

atcttntggn aaaataaaac cn 22

<210> 6

<211> 485

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ctggcagcac acttcctatc tcgacatgcc gggtttcggg gcagtcgctt ccaacggttt 60

gatcgtcagg gatggcggcc gcgtgctggt ggtcgatacc gcctggaccg atgaccagac 120

cgcccagatc ctcaactgga tcaagcagga gatcaacctg ccggtcgcgc tggcggtggt 180

gactcacgcg catcaggaca agatgggcgg tatggacgcg ctgcatgcgg cggggattgc 240

gacttatgcc aatgcgttgt cgaaccagct tgccccgcaa gaggggatgg ttgcggcgca 300

acacagcctg actttcgccg ccaatggctg ggtcgaacca gcaaccgcgc ccaactttgg 360

cccgctcaag gtattttacc ccggccccgg ccacaccagt gacaatatca ccgttgggat 420

cgacggcacc gacatcgctt ttggtggctg cctgatcaag gacagcaagg ccaagtcgct 480

cggca 485

<210> 7

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<400> 7

acgaagnaag ngtttaactn atcggttctc aggttgcaag gtttttgatc gtcagggatg 60

gc 62

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<400> 8

acgaagnaag ngtttaactn 20

<210> 9

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<400> 9

aacnaaggga cagngcatca ngggcggagg aaggtccgaa ctgctggttc gacaacgcat 60

tg 62

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n为5-羧基胞嘧啶（5caC）

<400> 10

aacnaaggga cagngcatca n 21

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> g被TAMRA荧光基团修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (44)..(44)

<223> c被BHQ2猝灭基团修饰

<400> 11

gaagtaatcg gggagcgtcg tgtaaagaaa gagtcgatta cttc 44

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> g被Cy5荧光基团修饰

<220>

<221> modified_base

<222> (41)..(41)

<223> c被BHQ2猝灭基团修饰

<400> 12

gaagtaatcg gggcggagga aggtccgaac tcgattactt c 41

Claims

1.一种DNA恒温扩增方法，所述方法包括：

（1）制备反应混合物，其中所述反应混合物包含待扩增的DNA、第一引物对、第二引物对、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶；其中所述第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增的DNA的上游端或下游端互补的识别区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一条引物各自包含与所述第一引物对中的每一条引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；其中所述非常规碱基的数量为2-15个；

2.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述非常规DNA碱基选自：5-羧基胞嘧啶、乙烯基胞嘧啶、乙烯基腺嘌呤、3-甲基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、3-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤、脱氧次黄嘌呤、8-氧鸟嘌呤，及其任意组合。

3.根据权利要求1或2所述的DNA恒温扩增方法，其中所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基酶选自DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V。

4.根据权利要求3所述的DNA恒温扩增方法，其中所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶、甲基嘌呤DNA糖基化酶、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，及其任意组合。

5.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137 DNA聚合酶、Vent聚合酶、9°Nm聚合酶、Klenow DNA聚合酶、缺少3’-5’外切酶活性的T7 phase DNA聚合酶变种、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaqDNA聚合酶，及其任意组合。

6.根据权利要求5所述的DNA恒温扩增方法，其中所述Vent聚合酶是Deep Vent聚合酶、Vent（-exo）聚合酶或Deep Vent（-exo）聚合酶。

7.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述非常规碱基修饰区和识别区的长度分别为12-30个碱基。

8.根据权利要求7所述的DNA恒温扩增方法，其中所述非常规碱基均匀地分布在所述非常规碱基修饰区中。

9.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述反应混合物进一步包含pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间。

10.根据权利要求9所述的DNA恒温扩增方法，其中所述反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂。

11.根据权利要求10所述的DNA恒温扩增方法，其中所述细胞表面活性剂为Triton X-100。

12.根据权利要求10所述的DNA恒温扩增方法，其中Mg²⁺的浓度为6 mM-10 mM；K⁺的浓度为4 mM-8 mM；NH₄ ⁺的浓度为6 mM-15 mM；H⁺的浓度为15 mM-25 mM；Cl^-的浓度为4 mM-8 mM；SO₄ ^2-的浓度为6 mM-15 mM；Tris-HCl的浓度为15 mM-25 mM；Triton X-100的浓度为0.01g/mL-0.02 g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.0 mM-2.0 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40 U/mL-100 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶的浓度为300 U/mL-350 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM；第二引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM。

13.根据权利要求12所述的DNA恒温扩增方法，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。

14.根据权利要求12所述的DNA恒温扩增方法，其中Mg²⁺的浓度为8 mM；K⁺的浓度为6mM；NH₄ ⁺的浓度为10 mM；H⁺的浓度为20 mM；Cl^-的浓度为6 mM；SO₄ ^2-的浓度为10 mM；Tris-HCl的浓度为20 mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.4 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶的浓度为50 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶的浓度为320U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM；第二引物对的浓度为0.8 μM。

15.根据权利要求14所述的DNA恒温扩增方法，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。

16.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述恒定温度为60℃～65℃中的任一温度，且所述恒定温度至少满足下列情况之一：

17.一种用于DNA恒温扩增的试剂盒，其包括：第一引物对、第二引物对、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶；其中所述第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增的DNA的上游端或下游端互补的识别区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物各自包含与所述第一引物对中的每一引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；其中所述非常规碱基的数量为2-15个。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基酶选自DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶、甲基嘌呤DNA糖基化酶、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，及其任意组合。

20.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137 DNA聚合酶、Vent聚合酶、9°Nm聚合酶、KlenowDNA聚合酶、缺少3’-5’外切酶活性的T7 phase DNA聚合酶变种、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶，及其任意组合。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述Vent聚合酶是Deep Vent聚合酶、Vent（-exo）聚合酶或Deep Vent（-exo）聚合酶。

22.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述细胞表面活性剂为Triton X-100。

24.根据权利要求22所述的试剂盒，其中Mg²⁺的浓度为6 mM-10 mM；K⁺的浓度为4 mM-8mM；NH₄ ⁺的浓度为6 mM-15 mM；H⁺的浓度为15 mM-25 mM；Cl^-的浓度为4 mM-8 mM；SO₄ ^2-的浓度为6 mM-15 mM；Tris-HCl的浓度为15 mM-25 mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL-0.02g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.0 mM-2.0 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40U/mL-100 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶的浓度为300 U/mL-350 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM；第二引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。

26.根据权利要求24所述的试剂盒，其中Mg²⁺的浓度为8 mM；K⁺的浓度为6 mM；NH₄ ⁺的浓度为10 mM；H⁺的浓度为20 mM；Cl^-的浓度为6 mM；SO₄ ^2-的浓度为10 mM；Tris-HCl的浓度为20mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.4 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶的浓度为50 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶的浓度为320 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM；第二引物对的浓度为0.8 μM。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。

28.一种DNA检测方法，其包括使用根据权利要求1至16中任一项所述的DNA恒温扩增方法或根据权利要求17至27中任一项所述的用于DNA恒温扩增的试剂盒扩增DNA。

29.根据权利要求28所述的DNA检测方法，其中所述反应混合物还包含一种或多种分子信标，并且所述分子信标的环区序列与第一引物对中的一条引物的编码区的序列相同，并且在5’和3’端分别携带荧光基团和猝灭基团。

30.一种用于DNA检测的试剂盒，其包括：第一引物对、第二引物对、任选的分子信标、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶；其中所述第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增的DNA的上游端或下游端互补的识别区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物各自包含与所述第一引物对中的每一引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；其中所述非常规碱基的数量为2-15个。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基酶选自DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V。

32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶、甲基嘌呤DNA糖基化酶、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，及其任意组合。

33.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137 DNA聚合酶、Vent聚合酶、9°Nm聚合酶、KlenowDNA聚合酶、缺少3’-5’外切酶活性的T7 phase DNA聚合酶变种、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶，及其任意组合。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述Vent聚合酶是Deep Vent聚合酶、Vent（-exo）聚合酶或Deep Vent（-exo）聚合酶。

35.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄ ⁺、H⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂。

36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述细胞表面活性剂为Triton X-100。

37.根据权利要求35所述的试剂盒，其中Mg²⁺的浓度为6 mM-10 mM；K⁺的浓度为4 mM-8mM；NH₄ ⁺的浓度为6 mM-15 mM；H⁺的浓度为15 mM-25 mM；Cl^-的浓度为4 mM-8 mM；SO₄ ^2-的浓度为6 mM-15 mM；Tris-HCl的浓度为15 mM-25 mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL-0.02g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.0 mM-2.0 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40U/mL-100 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶的浓度为300 U/mL-350 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM；第二引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM；分子信标的浓度为1.0 μM-2.0 μM。

38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。

39.根据权利要求37所述的试剂盒，其中Mg²⁺的浓度为8 mM；K⁺的浓度为6 mM；NH₄ ⁺的浓度为10 mM；H⁺的浓度为20 mM；Cl^-的浓度为6 mM；SO₄ ^2-的浓度为10 mM；Tris-HCl的浓度为20mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.4 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶的浓度为50 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶的浓度为320 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM；第二引物对的浓度为0.8 μM；分子信标的浓度为2.0 μM。

40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。