CN111218529A - 用于检测新型冠状病毒的引物组合物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测新型冠状病毒的引物组合物、试剂盒和方法。所述引物组合物包括用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对，以及用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的第三引物对和第四引物对。采用该引物组合物，以待测样品的基因组DNA为模板，在例如胸腺嘧啶DNA糖基化酶、MLV反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行恒温扩增反应，并且在荧光染料的作用下对待测结果进行定量分析，能够以高特异性、高灵敏度检测新型冠状病毒。本发明由于使用了四条引物，加上对引物的碱基进行特殊修饰，并在反应中加入胸腺嘧啶DNA糖基化酶和Bst DNA聚合酶，能够在恒温的条件下实现对N基因和ORF1ab基因目标序列的指数级扩增，极大地提高了检测的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及用于检测新型冠状病毒的引物组合物，本发明还涉及使用所述引物组合物用于检测新型冠状病毒的试剂盒及方法。
背景技术
冠状病毒(Coronavirus)归类于病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Cirinaviridae)。冠状病毒的基因组为一条完整的单股正链RNA，长约30Kb，是RNA病毒中最长的RNA核酸链。由于冠状病毒基因组大而复杂，其转录过程比较复杂。各种冠状病毒的基因组有所不同，在其非编码区可分别发生不同的变异而改变调控功能。编码区可编码不同的功能蛋白，再加上RNA病毒的复制酶缺少校正功能，使得病毒在自然界动物体内复制过程中发生重组与变异的机率高，因此会出现新的或再现的冠状病毒株。新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumoia，NPC)就是一种新出现的对人致病的且传染性强的疾病。
新冠肺炎的感染者会出现发热、乏力、干咳等症状。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状。重症患者在发病一周后会出现呼吸困难或低氧血症，严重者会迅速发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。重型、危重型患者在发病过程中可为中低热，甚至无明显发热；轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。不仅如此，不论是轻型患者或者是重症患者，在感染病毒后都可以通过呼吸道飞沫和接触传播病毒，且病毒的感染者还会有1-14天的潜伏期，潜伏期内还很难确定患者真正是否感染病毒。
医疗领域中现有的用于诊断新型冠状病毒的方法包括CT影像检查、核酸扩增技术(NAATs)、胶体金法和酶联免疫法等。为了更快、更准确地对病毒感染者进行确诊，目前我国认定的检测新冠肺炎的标准为核酸检测，好的核酸检测方法能帮助医生更好、更快地对感染病毒者进行确诊。
NAATs通过针对新冠肺炎病毒基因的保守序列设计的特异性引物，检测新型冠状病毒基因，具有快速、准确、可定量检测新型冠状病毒等优势，其中TaqMan探针和基因测序等方法目前已成功地应用到新冠肺炎的诊断中，但其成本较高，操作较繁琐。环介导等温扩增技术(LAMP)、滚环扩增技术(RCA)、链置换扩增技术(SDA)等恒温扩增技术及其相关产品也应用到新冠肺炎的检测，但它们都具有一定的缺点。LAMP产物复杂，很难对产物实施进一步的与序列特征等相关的分析，导致后续应用复杂，不太容易进一步实施多重序列的同时分析。RCA依赖于环状模板，但绝大多数基因组DNA为线性分子，且合成滚环扩增锁式探针的成本高，存在信号背景问题。SDA需要经过DNA单链模板的准备、5’端3’端均含酶切位点的目的DNA片段的生成和链置换反应等多个阶段，且需要经修饰的dNTP作为底物，靶序列准备复杂。
因此，开发一种快速、特异性强、灵敏度高且成本相对更低的新型冠状病毒基因的检测方法意义重大。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供用于检测新型冠状病毒的引物及其试剂盒和方法。本发明提供的引物是通过针对新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的保守序列进行设计，从而获得的特异性引物组合物。本发明的发明人发现，采用本发明提供的引物组合物，以待测样品的基因组DNA为模板，在例如胸腺嘧啶DNA糖基化酶、MLV反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行恒温扩增反应，并且在荧光染料的作用下对待测结果进行定量分析，能够以高特异性、高灵敏度检测新型冠状病毒。与其它恒温扩增方法相比，本发明使用了四条引物，通过对引物的碱基进行特殊修饰，并在反应中加入例如胸腺嘧啶DNA糖基化酶和BstDNA聚合酶，使反应能够在恒温的条件下实现对N基因和ORF1ab基因目标序列的指数级扩增，极大的提高了基于扩增反应的检测的灵敏度和特异性。
本文所述的常规DNA碱基是指腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)，本文所述的非常规DNA碱基是指除腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之外的DNA碱基。
一方面，本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒的引物组合物，其包括用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对，以及用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的第三引物对和第四引物对；
其中所述第一引物对由与新型冠状病毒N基因的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物组成，而且所述第一引物对中的每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分；在所述修饰部分中，与未修饰部分相邻的第1至4个常规DNA碱基中的至少一个被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物分别与第一引物对中的每一引物的修饰部分相同；
其中所述第三引物对由与新型冠状病毒ORF1ab基因的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物组成，而且所述第三引物对中的每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分；在所述修饰部分中，与未修饰部分相邻的第1至4个常规DNA碱基中的至少一个被替换成非常规DNA碱基；所述第四引物对中的每一引物分别与第三引物对中的每一引物的修饰部分相同。
根据本发明，所述非常规DNA碱基可以选自：5-羧基胞嘧啶(5caC)、乙烯基胞嘧啶(EthenoC)、乙烯基腺嘌呤(EthenoA)、3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、7-甲基腺嘌呤(7-MeA)、3-甲基鸟嘌呤(3-MeG)、7-甲基鸟嘌呤(7-MeG)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、次黄嘌呤、脱氧次黄嘌呤、8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，及其任意组合。优选地，所述非常规DNA碱基为5-羧基胞嘧啶(5caC)。
根据本发明，所述修饰部分和未修饰部分的长度分别可以为12-50个碱基，优选分别为18-40个碱基；优选地，所述非常DNA规碱基的数量为2-15个，优选为3个。
在根据本发明的引物组合物的设计中，所述新型冠状病毒N基因的保守序列如SEQID NO:25所示，所述新型冠状病毒ORF1ab基因的保守序列如SEQ ID NO:26所示；
根据本发明的具体实施方案，所述用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对选自：
SEQ ID NO：1和3表示的第一引物对，和SEQ ID NO：2和4表示的第二引物对；
SEQ ID NO：5和7表示的第一引物对，和SEQ ID NO：6和8表示的第二引物对；或
SEQ ID NO：9和11表示的第一引物对，和SEQ ID NO：10和12表示的第二引物对。
根据本发明的优选实施方案，所述用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对为：
SEQ ID NO：5和7表示的第一引物对，和SEQ ID NO：6和8表示的第二引物对。
所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab的第三引物对和第四引物对选自：
SEQ ID NO：13和15表示的第三引物对，和SEQ ID NO：14和16表示的第四引物对；
SEQ ID NO：17和19表示的第三引物对，和SEQ ID NO：18和20表示的第四引物对；或
SEQ ID NO：21和23表示的第三引物对，和SEQ ID NO：22和24表示的第四引物对。
根据本发明的优选实施方案，所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab的第三引物对和第四引物对为：
SEQ ID NO:21和23表示的第三引物对，和SEQ ID NO：22和24表示的第四引物对。
再一方面，本发明还提供了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其包括上述引物组合物、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶、识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶和具有链置换功能的DNA聚合酶。
所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶可以为DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V。优选地，所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)、甲基嘌呤DNA糖基化酶(AAG)、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1(OGG1)、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(Fpg)，及其任意组合。
所述识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶可以为AMV反转录酶和/或MLV反转录酶。
所述具有链置换功能的DNA聚合酶可以选自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137DNA聚合酶、Vent聚合酶、9°Nm聚合酶、Klenow DNA聚合酶、缺少3’-5’外切酶活性的T7 phase DNA聚合酶变种、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶，及其任意组合；优选地，所述Vent聚合酶选自Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶或Deep Vent(-exo)聚合酶。
优选地，所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶、识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶和具有链置换功能的DNA聚合酶分别为胸腺嘧啶DNA糖基化酶、MLV反转录酶和Bst DNA聚合酶。
优选地，本发明的试剂盒还包含pH值调节剂，其使得反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间。
优选地，本发明的试剂盒还包含一种或多种选自以下的成分：Mg2+、K+、NH4 +、H+、Cl-、SO4 2-、Tris-HCl、细胞表面活性剂、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)和三磷酸脱氧胸苷(dTTP)；更优选地，所述细胞表面活性剂为TritonX-100。优选地，Mg2+的浓度为6mM-10mM；K+的浓度为4mM-8mM；NH4 +的浓度为6mM-15mM；H+的浓度为15mM-25mM；Cl-的浓度为4mM-8mM；SO4 2-的浓度为6mM-15mM；Tris-HCl的浓度为15mM-25mM；Triton X-100的浓度为0.01g/mL-0.02g/mL；三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的浓度分别为1.0mM-2.0mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40U/mL-100U/mL；所述识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶的浓度为150U/mL-200U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为300U/mL-350U/mL；第一和三引物对的浓度分别为0.2μM-1.0μM；以及第二和四引物对的浓度分别为0.2μM-1.0μM。
更优选地，在本发明的试剂盒中，Mg2+的浓度为8mM；K+的浓度为6mM；NH4 +的浓度为10mM；H+的浓度为20mM；Cl-的浓度为6mM；SO4 2-的浓度为10mM；Tris-HCl的浓度为20mM；Triton X-100的浓度为0.01g/mL；三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的浓度分别为1.4mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶，例如胸腺嘧啶DNA糖基化酶的浓度为50U/mL；所述识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶的浓度为150U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为320U/mL；第一和三引物对的浓度分别为0.2μM；以及第二和四引物对的浓度分别为0.8μM。
再一方面，本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒的方法，其包括使用上述引物组合物或试剂盒检测新型冠状病毒。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待测样品的RNA；
(2)使用上述引物组合物或试剂盒，通过恒温扩增反应扩增样品的DNA；
(3)分析扩增产物中是否存在具有保守序列的新型冠状病毒N基因和ORF1ab基因，从而确定所述待测样品中是否存在新型冠状病毒。
优选地，所述确定待测样品中是否存在新型冠状病毒为确定所述待测样品是否为新型冠状病毒或者所述待测样品是否含有新型冠状病毒。
根据本发明所述的方法，其中在步骤2)中，所述恒温扩增反应的反应条件包括：反应总体系为25μL或者30μL；反应温度为55～68℃；反应pH值7.0-9.0；扩增时间为45～90min；以及RNA模板为5μL；
根据本发明所述的方法，其中在步骤3)中，所述分析包括实时荧光分析或凝胶电泳分析。
根据本发明所述的用于检测新型冠状病毒的引物组合物及其试剂盒和方法的作用机制简述如下：
a.将恒温扩增的反应混合物置于恒定温度，例如60～65℃温度下，在识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶，例如MLV反转录酶的作用下，RNA被反转录成cDNA；
b.在具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的作用下，第一引物对中的每一引物和第二引物对中的每一引物分别以待扩增的DNA中的一条链为模板进行DNA扩增，引物延伸，形成引物延伸链，从而获得引物延伸链与模板DNA形成的双链DNA；
c.在识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶，例如胸腺嘧啶DNA糖基化酶的作用下，第一引物对和第二引物对的所述修饰部分中的非常规碱基被识别并切除，使得步骤a获得的双链DNA释放非常规DNA碱基，从而降低所述第一引物对和第二引物对的修饰部分与所述模板DNA结合的稳定性；
d.剩余的第二引物对中的每一引物分别进入释放非常规DNA碱基的位置(即第一引物对或第二引物对的修饰部分的区域)，与模板DNA结合，在具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的作用下，剩余的第二引物延伸，形成剩余的第二引物的延伸链，从而获得剩余的第二引物的延伸链与模板DNA形成的双链DNA，同时，置换释放步骤a获得的双链DNA中的引物延伸链，形成释放的引物延伸DNA单链；
e.循环进行上述步骤b至c，其中上一轮循环所获得的剩余的第二引物的延伸链与模板DNA形成的双链DNA中的剩余的第二引物的延伸链被释放，从而通过持续置换释放双链DNA中的引物延伸链而获得大量的释放的引物延伸DNA单链；
f.剩余的第一引物对中的每一引物的未修饰部分分别与所述释放的引物延伸DNA单链结合，以所述释放的引物延伸DNA单链为模板在具有链置换功能的DNA聚合酶，例如BstDNA聚合酶的作用下继续进行DNA延伸反应，形成剩余的第一引物对中的每一引物的延伸链，同时释放的引物延伸DNA单链以第一引物对中的每一引物的修饰部分为模板进行DNA延伸反应，得到与引物的修饰部分配对的序列，形成释放的引物延伸DNA单链的延伸链，所述剩余的第一引物对中的每一引物的延伸链和所述释放的引物延伸DNA单链的延伸链形成双链DNA；
g.循环进行上述步骤a至f。
其中，经过第一次步骤a至e后，第一引物对中的每一引物和第二引物对中的每一引物分别扩增并释放的大量的引物延伸DNA单链均可以作为模板用于后续循环进行DNA扩增反应，以此类推，循环进行上述步骤a至e使得DNA扩增反应的模板数急速增加，大大提高了反应速度。本发明的引物组合物中第三引物和第四引物组成的引物对及其试剂盒和方法的作用机制亦是如此。
与现有技术相比，采用本发明的方法进行的核酸扩增为一步操作，即在恒温扩增混合液中加入待扩增模板后，立刻封闭反应管置于恒温下进行反应即可，极大地简化了扩增反应的操作过程。此外，闭管反应也避免了反复开管可能带来的样品交叉污染、造成假阳性的问题，而且恒温反应避免了如PCR技术对温度精密控制设备的依赖，降低了实验仪器成本。此外，采用本发明的方法能实现核酸的指数扩增，每一个完整的流程能得到无数个模板链，从而极大地改善了扩增效率，缩短了扩增时间。本发明的方法能检测的模板浓度低至数百aM的样本。本发明方法能够正确地检测新型冠状病毒基因的靶序列，特异性良好，提高了检测灵敏度和检测效率。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为根据本发明所述的引物组合物及其试剂盒和方法的检测原理图。
图2为采用根据本发明的三套N基因引物组合物扩增新型冠状病毒基因的实时荧光曲线。
图3为采用根据本发明的三套ORF1ab基因引物组合物扩增新型冠状病毒基因的实时荧光曲线。
图4为采用根据本发明的引物组合物扩增N基因并检测不同浓度的新型冠状病毒的实时荧光曲线。
图5为采用根据本发明的引物组合物扩增ORF1ab基因并检测不同浓度的新型冠状病毒的实时荧光曲线。
图6为采用根据本发明的N基因引物组合物扩增新型冠状病毒及其它细菌基因组DNA的实时荧光曲线。
图7为采用根据本发明的ORF1ab基因引物组合物扩增新型冠状病毒及其它细菌基因组DNA的实时荧光曲线。
具体实施方式
下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1新型冠状病毒的N基因和ORF1ab基因的扩增与检测使用含有新型冠状病毒N基因和ORF1ab基因的质粒DNA作为检测靶标，用于筛选优势引物。
其中，所述新型冠状病毒N基因保守序列如SEQ ID NO:25所示，所述新型冠状病毒ORF1ab基因保守序列如SEQ ID NO:26所示。
SEQ ID NO:25
ATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCC
SEQ ID NO:26
TGGTGCATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAA
针对上述每个基因都设计并筛选出3套引物，第1套N基因引物组合物的序列如SEQID NO:1到SEQ ID NO:4所示，第2套N基因引物组合物的序列如SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:8所示，第3套N基因引物组合物的序列如SEQ ID NO:9到SEQ ID NO:12所示；第1套ORF1ab基因引物组合物的序列如SEQ ID NO:13到SEQ ID NO:16所示，第2套ORF1ab基因引物组合物的序列如SEQ ID NO:17到SEQ ID NO:20所示，第3套ORF1ab基因引物序组合物的序列如SEQID NO:21到SEQ ID NO:24所示。
每套引物包括第一引物对(或第三引物对)P1和P3、第二引物对(第四引物对)P2和P4，其中第一引物对(或第三引物对)P1和P3分别为与待扩增的N基因(或ORF1ab基因)质粒DNA的上游端和下游端互补的一对引物，而且其中每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分，其中5’端修饰部分中的部分胞嘧啶被选择性修饰为5-羧基胞嘧啶；第二引物对P2和P4分别与所述第一引物对P1和P3中的每一引物的所述修饰部分相同，不包含未修饰部分。相应的序列及胞嘧啶修饰如表1所示。
本实施例中使用的引物根据如下原则设计：
(1)第一引物对(或第三引物对)由分别与靶基因组DNA的上游和下游互补的一对引物构成，并且分别从5’端到3’端包含具有非常规碱基的修饰部分和未修饰部分，识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶能够特异识别所述非常规碱基。
(2)第二引物对(或第四引物对)由分别与第一引物对的5’端修饰部分相同的一对引物构成，不包含未修饰部分。第二引物对(或第四引物对)与第一引物对(或第三引物对)的5’端修饰部分均可在靶基因组DNA的相同区间与该靶基因组DNA配对杂交。
(3)第一引物对(或第三引物对)和第二引物对(或第四引物对)中的非常规碱基相对均匀地分布在修饰部分中。
表1新型冠状病毒N基因和ORF1ab基因扩增引物序列表
注：aN为5-羧基胞嘧啶(5caC)。
制备恒温扩增反应混合物，该反应混合物含有8mM Mg2+、6mM K+、10mM NH4 +、20mM H+、6mM Cl-、10mM SO4 2-、20mM Tris-HCl、0.01g/mL Triton X-100、dNTP即dATP、dTTP、dGTP和dCTP均为1.4mM、50U/mL非常规碱基识别酶(胸腺嘧啶DNA糖基化酶，TDG)、320U/mL Bst DNA聚合酶、150U/mL MLV反转录酶、表1中P1所示的引物0.2μM、P2所示的引物0.8μM、P3所示的引物0.2μM、P4所示的引物0.8μM，以及SYBR Green I为实时荧光分析染料。
以反应温度为63℃，时间为90min为反应条件对目标序列进行扩增。
以图1为例说明本发明的反应过程，首先目标核酸在MLV反转录酶的作用下将病毒RNA被反转录成cDNA，第一引物对中的P1或第二引物对中的P2与作为模板的N基因或ORF1ab基因DNA(以下简称为“模板DNA”)的正义链互补杂交，Bst DNA聚合酶从第一引物对中的P1或第二引物对中的P2的3’端延伸引物，产生与正义链模板互补的引物延伸链，该引物延伸链与模板DNA正义链形成双链DNA；胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)特异性地识别并切除该双链DNA中的引物延伸链中的5’端修饰部分的非常规碱基5-羧基胞嘧啶，在非常规碱基切除区域处，因切除后互补碱基的缺失降低了引物延伸链在5’端修饰部分与模板DNA正义链的杂交稳定性。此时，溶液中游离的、完整的、剩余的第二引物对中的P2插入引物延伸链与模板DNA正义链的不稳定杂交区间，形成剩余的第二引物对中的P2与模板DNA正义链的稳定的双链结构，并进一步在具有链置换功能的Bst DNA聚合酶的作用下，该剩余的第二引物对中的P2发生3’端延伸反应，形成剩余的第二引物对中的P2的引物延伸链，从而获得剩余的第二引物对中的P2的引物延伸链与模板DNA正义链形成的双链DNA，同时置换释放出上一轮BstDNA聚合酶延伸反应产生的引物延伸链，获得置换释放的引物延伸DNA单链，该引物延伸DNA单链即为模板DNA反义链；而TDG特异性地识别并切除此时与模板DNA正义链形成稳定双链DNA的剩余的第二引物对中的P2的引物延伸链5’端修饰部分的非常规碱基，降低第二引物对中的P2的延伸产物链在5’端与模板DNA的杂交稳定性，从而形成“游离第二引物对中的P2插入与模板DNA杂交、Bst DNA聚合酶延伸并置换上一轮的引物延伸链、TDG特异性地识别并切除双链中第二引物对中的P2的引物延伸链5’端修饰部分的非常规碱基、第二引物对中的P2的引物延伸链在5’端与模板DNA的杂交稳定性降低”的循环，不断产生与模板DNA正义链互补的、通过引物延伸形成的反义链序列，反义链得到扩大；而第一引物对中的P3或第二引物对中的P4又以扩大的反义链序列为模板，在Bst DNA聚合酶与TDG的协同作用下，发生与上述反义链序列扩增类似的循环反应，得到扩大的正义链序列；更进一步地，该扩大得到的正义链序列可与游离的第一引物对中的P1结合，并以游离第一引物对中的P1为模板，在聚合酶的作用下，3’端被延伸并获得可与第二引物对中的P2杂交的序列区间，进入聚合酶与TDG协同作用下的第二引物对中的P2插入杂交、引物延伸、非常规碱基切除的循环扩增反应，得到扩大的反义链序列；同理，此循环产生的扩大的反义链以游离的第一引物对中的P3为模板，在聚合酶的作用下，3’端被延伸并获得可与第二引物对P4杂交的序列区间，并发生类似于第二引物对中的P2与正义链相互作用下的正义链循环扩增反应，得到扩大的正义链序列，并进入下一轮的循环反应。上述扩增反应过程中，具有较长序列的第一引物对P1和P3与具有较短序列的第二引物对P2和P4相互配合，第一引物对P1和P3作为长引物在与扩大的正义链序列和扩大的反义链序列配对后，将其作为模板进行聚合酶延伸反应，同时负责让扩大的正义链序列和扩大的反义链序列以第一引物对P1和P3为模板，使得扩大的正义链序列和扩大的反义链序列的3’端被聚合酶延伸，得到与引物的修饰部分配对的序列，即可被作为短引物对的第二引物对P2和P4结合的序列，此被延伸的扩大的正义链序列和被延伸的扩大的反义链序列进入循环，起到加快聚合酶链置换扩增反应的作用，加速链置换反应进程，产生更多的新生成的模板，一长一短两套引物相互配合，从而实现恒温下靶DNA的指数级扩增。
扩增产物的实时荧光分析
用实时荧光定量PCR仪进行检测，每间隔30s读取一次荧光值，结果记录为实时荧光曲线图，经过软件分析筛选出的3套引物再经过实验进行进一步的反应效率验证，确定效率相对最高的一套引物；再从灵敏度和特异性方面验证本发明序列扩增检测的性能。
实施例2不同引物的反应效率验证
制备恒温扩增反应混合物，该反应混合物含有Mg2+的浓度为8mM；K+的浓度为6mM；NH4 +的浓度为10mM；H+的浓度为20mM；Cl-的浓度为6mM；SO4 2-的浓度为10mM；Tris-HCl的浓度为20mM；Triton X-100的浓度为0.01g/mL；dNTP浓度为1.4mM；胸腺嘧啶DNA糖基化酶的浓度为50U/mL；Bst DNA聚合酶的浓度为320U/mL；MLV反转录酶的浓度为150U/mL；表1中P1所示的引物0.2μM、P2所示的引物0.8μM、P3所示的引物0.2μM、P4所示的引物0.8μM，以及SYBRGreen I为实时荧光分析染料。使用经设计、筛选以及比对后得出的3套引物，使用浓度为10fM的N基因和ORF1ab基因质粒DNA作为检测靶标，以RNase-free water作为阴性对照，以反应温度为63℃，时间为90min为反应条件进行核酸扩增反应，用实时荧光定量PCR仪进行检测，每间隔30s读取一次荧光值，结果记录为实时荧光曲线图，具体结果即实时荧光曲线图请参见附图2和3。实时荧光曲线图显示：对于N基因质粒DNA，反应效率最高的为第2套引物，在10min的时候出峰，表明第2套引物为优选引物；对于ORF1ab基因质粒DNA，反应效率最高的为第3套引物，在9min的时候出峰，表明第3套引物为优选引物。
实施例3反应灵敏度验证
如实施例2所述制备扩增检测混合物，其中采用第2套N基因引物，在63℃、90min条件下进行扩增和实时荧光检测不同浓度的N基因质粒DNA的实时荧光曲线，各浓度依次是10pM、1pM、100fM、10fM、1fM、100aM、0aM。用实时荧光定量PCR仪进行检测，每间隔30s读取一次荧光值，具体结果实时荧光曲线图请参见附图4。实时荧光曲线图显示：本实施例中N基因质粒DNA可被检测到的浓度可低至10aM，表明本发明的检测方法具有高灵敏度和极低的检测下限。
如实施例2所述制备扩增检测混合物，其中采用第3套ORF1ab基因引物，在63℃、90min条件下进行扩增和实时荧光检测不同浓度的ORF1ab基因质粒DNA的实时荧光曲线，各浓度依次是10pM、1pM、100fM、10fM、1fM、100aM、0aM。用实时荧光定量PCR仪进行检测，每间隔30s读取一次荧光值，具体结果实时荧光曲线图请参见附图5。实时荧光曲线图显示：本实施例中ORF1ab基因质粒DNA可被检测到的浓度可低至10aM，表明本发明的检测方法具有高灵敏度和极低的检测下限。
实施例4反应特异性验证
分别以副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特菌、表皮葡萄球菌、阴沟肠杆菌、耐甲氧西林葡萄球菌、沙门氏菌基因组DNA为模板(湖南省疾病预防控制中心)，以RNase-free water为阴性对照，以具有N基因的新冠肺炎假病毒(来自厦门致善生物科技股份有限公司)为阳性对照，并使用如实施例2所述制备的扩增检测混合液(第2套N基因引物)在63℃、90min条件下进行扩增和实时荧光检测，所得的实时荧光曲线请参见附图6。实时荧光曲线显示：只有阳性对照曲线呈标准S型，其他基因组DNA模板均未起峰，表明只有阳性对照发生了扩增反应，检测到新型冠状病毒中的N基因，其余均未检测到新型冠状病毒的N基因。说明本发明的新型冠状病毒N基因的检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到新型冠状病毒的N基因。
分别以副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特菌、表皮葡萄球菌、阴沟肠杆菌、耐甲氧西林葡萄球菌、沙门氏菌基因组DNA为模板(湖南省疾病预防控制中心)，以RNase-free water为阴性对照，以具有ORF1ab基因的新冠肺炎假病毒(来自厦门致善生物科技股份有限公司)为阳性对照，并使用如实施例2所述制备的扩增检测混合液(第3套ORF1ab基因引物)在63℃、90min条件下进行扩增和实时荧光检测，所得的实时荧光曲线请参见附图7。实时荧光曲线显示：只有阳性对照曲线呈标准S型，其他基因组DNA模板均未起峰，表明只有阳性对照发生了扩增反应，检测到新型冠状病毒中的ORF1ab基因，其余均未检测到新型冠状病毒的ORF1ab基因。说明本发明的新型冠状病毒ORF1ab基因的检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到新型冠状病毒的ORF1ab基因。
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南融健基因生物科技有限公司
<120> 用于检测新型冠状病毒的引物组合物、试剂盒和方法
<130> DIC20110026
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
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taca 64
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agttgtgatn aactccgnga acccatgntt cagtcagctg atgcacaatc gtttttaaac 60
g 61
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atnattgtag atgtnaaaag cnctgtatac gacatcagta ctagtgcctg tgccg 55
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gnatgggttc gnggagttga tcanaactac agccataacc tttccacata ccgcaga 57
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gnatgggttc gnggagttga tcanaac 27
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<213> Coronavirus
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ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc 120
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attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt 240
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agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag acgtggtcca gaacaaaccc 350
<210> 26
<211> 350
<212> DNA
<213> Coronavirus
<400> 26
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gtatacaggg cttttgacat ctacaatgat aaagtagctg gttttgctaa 350
Claims (10)
1.一种用于检测新型冠状病毒的引物组合物，其包括用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对，以及用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的第三引物对和第四引物对；
其中所述第一引物对由与新型冠状病毒N基因的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物组成，而且所述第一引物对中的每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分；在所述修饰部分中，与未修饰部分相邻的第1至4个常规DNA碱基中的至少一个被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物分别与第一引物对中的每一引物的修饰部分相同；
其中所述第三引物对由与新型冠状病毒ORF1ab基因的保守序列的上游端和下游端互补的一对引物组成，而且所述第三引物对中的每一引物从5’端到3’端依次包含修饰部分和未修饰部分；在所述修饰部分中，与未修饰部分相邻的第1至4个常规DNA碱基中的至少一个被替换成非常规DNA碱基；所述第四引物对中的每一引物分别与第三引物对中的每一引物的修饰部分相同。
2.权利要求1所述的引物组合物，其中所述非常规DNA碱基选自：5-羧基胞嘧啶(5caC)、乙烯基胞嘧啶(EthenoC)、乙烯基腺嘌呤(EthenoA)、3-甲基腺嘌呤(3-MeA)、7-甲基腺嘌呤(7-MeA)、3-甲基鸟嘌呤(3-MeG)、7-甲基鸟嘌呤(7-MeG)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)、次黄嘌呤、脱氧次黄嘌呤、8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，及其任意组合；优选地，所述非常规DNA碱基为5-羧基胞嘧啶(5caC)。
3.权利要求1或2所述的引物组合物，其中所述修饰部分和未修饰部分的长度分别为12-50个碱基，优选分别为18-40个碱基；优选地，所述非常规DNA碱基的数量为2-15个，优选为3个。
4.权利要求1至3中任一项所述的引物组合物，其中所述用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对选自：
SEQ ID NO：1和3表示的第一引物对，和SEQ ID NO：2和4表示的第二引物对；
SEQ ID NO：5和7表示的第一引物对，和SEQ ID NO：6和8表示的第二引物对；或
SEQ ID NO：9和11表示的第一引物对，和SEQ ID NO：10和12表示的第二引物对；
优选地，所述用于检测新型冠状病毒N基因的第一引物对和第二引物对为：
SEQ ID NO：5和7表示的第一引物对，和SEQ ID NO：6和8表示的第二引物对；
所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab的第三引物对和第四引物对选自：
SEQ ID NO：13和15表示的第三引物对，和SEQ ID NO：14和16表示的第四引物对；
SEQ ID NO：17和19表示的第三引物对，和SEQ ID NO：18和20表示的第四引物对；或
SEQ ID NO：21和23表示的第三引物对，和SEQ ID NO：22和24表示的第四引物对；
优选地，所述用于检测新型冠状病毒ORF1ab的第三引物对和第四引物对为：
SEQ ID NO:21和23表示的第三引物对，和SEQ ID NO：22和24表示的第四引物对。
5.一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其包括权利要求1至4中任一项所述的引物组合物、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶、识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶和具有链置换功能的DNA聚合酶。
6.权利要求5所述的试剂盒，其中所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶为DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V；优选地，所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)、甲基嘌呤DNA糖基化酶(AAG)、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1(OGG1)、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(Fpg)，及其任意组合；
所述识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶为AMV反转录酶和/或MLV反转录酶；
所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage3137 DNA聚合酶、Vent聚合酶、9°Nm聚合酶、Klenow DNA聚合酶、缺少3’-5’外切酶活性的T7phase DNA聚合酶变种、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaqDNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶，及其任意组合；优选地，所述Vent聚合酶选自Deep Vent聚合酶、Vent(-exo)聚合酶或Deep Vent(-exo)聚合酶；
优选地，所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶、识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶和具有链置换功能的DNA聚合酶分别为胸腺嘧啶DNA糖基化酶、MLV反转录酶和Bst DNA聚合酶。
7.权利要求5或6所述的试剂盒，其还包含pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间；
优选地，所述试剂盒还包含一种或多种选自以下的成分：Mg2+、K+、NH4 +、H+、Cl-、SO4 2-、Tris-HCl、细胞表面活性剂、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)和三磷酸脱氧胸苷(dTTP)；更优选地，所述细胞表面活性剂为Triton X-100；
优选地，Mg2+的浓度为6mM-10mM；K+的浓度为4mM-8mM；NH4 +的浓度为6mM-15mM；H+的浓度为15mM-25mM；Cl-的浓度为4mM-8mM；SO4 2-的浓度为6mM-15mM；Tris-HCl的浓度为15mM-25mM；Triton X-100的浓度为0.01g/mL-0.02g/mL；三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的浓度分别为1.0mM-2.0mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40U/mL-100U/mL；所述识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶的浓度为150U/mL-200U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为300U/mL-350U/mL；第一和三引物对的浓度分别为0.2μM-1.0μM；以及第二和四引物对的浓度分别为0.2μM-1.0μM。
8.权利要求5至7中任一项所述的试剂盒，其中Mg2+的浓度为8mM；K+的浓度为6mM；NH4 +的浓度为10mM；H+的浓度为20mM；Cl-的浓度为6mM；SO4 2-的浓度为10mM；Tris-HCl的浓度为20mM；Triton X-100的浓度为0.01g/mL；三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的浓度分别为1.4mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶，例如胸腺嘧啶DNA糖基化酶的浓度为50U/mL；所述识别RNA并对其进行反转录合成cDNA的逆转录酶的浓度为150U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为320U/mL；第一和三引物对的浓度分别为0.2μM；以及第二和四引物对的浓度分别为0.8μM。
9.一种用于检测新型冠状病毒的方法，其包括使用权利要求1至4中任一项所述的引物组合物或权利要求5至8中任一项所述的试剂盒检测新型冠状病毒；
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待测样品的RNA；
(2)使用权利要求1至4中任一项所述的引物组合物或权利要求5至8中任一项所述的试剂盒，通过恒温扩增反应扩增样品的DNA；
(3)分析扩增产物中是否存在具有保守序列的新型冠状病毒N基因和ORF1ab基因，从而确定所述待测样品中是否存在新型冠状病毒；
优选地，所述确定待测样品中是否存在新型冠状病毒为确定所述待测样品是否为新型冠状病毒或者所述待测样品是否含有新型冠状病毒。
10.权利要求9所述的方法，其中在步骤2)中，所述恒温扩增反应的反应条件包括：反应总体系为25μL或者30μL；反应温度为55～68℃；反应pH值7.0-9.0；扩增时间为45～90min；以及RNA模板为2μL；
优选地，在步骤3)中，所述分析为实时荧光分析或凝胶电泳分析。
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| CN114410836B (zh) * | 2021-12-17 | 2024-03-01 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种集样本处理、核酸提取及多重恒温扩增一体化的检测人细小病毒b19的试剂盒和方法 |
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