CN101613700A - H5型或h7型禽流感病毒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供与根据H5型或H7型禽流感病毒的血凝素的碱基序列设计的任意的碱基序列特异性地杂交的寡核苷酸、使用该引物的核酸扩增方法、基于核酸扩增的检测的H5型或H7型禽流感病毒感染的的诊断方法及流感诊断用试剂盒。

Description

H5型或H7型禽流感病毒的检测方法

本发明专利申请是国际申请号为PCT/JP2005/019710，国际申请日为2005年10月26日，进入中国国家阶段的申请号为200580037605.7，名称为“H5型或H7型禽流感病毒的检测方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及H5型或H7型禽流感病毒的检测方法，更具体涉及用于检测H5型或H7型禽流感病毒的寡核苷酸引物、使用该引物的H5型或H7型禽流感病毒的检测方法、流感的诊断方法及用于诊断流感的试剂盒。

背景技术

流感是流行性的病毒性呼吸器官传染病，患病者具有从婴幼儿到老年人的广阔年龄层，常常是致命的。目前，感染禽类而形成问题的H5型禽流感病毒原来不感染人类。但是，1997年在香港发现了对人的感染，该次流行中18名患者的6名死亡。所幸之后没有再发现对人的感染，但进入2004年，在泰国和越南发现了对人的感染，在泰国有8人死亡，在越南有16人。

高致病性禽流感病毒除H5型之外，还有H7型，H7型根据其序列大致分为欧洲型和美洲型。2003年在荷兰流行时报告有1人死亡，在美国2003年至2004年也报告了H7型禽流感病毒的流行。

目前，禽流感病毒的检测使用人A型流感病毒快速诊断试剂盒。但是，所感染病毒的亚型的鉴定需要分离的病毒的抗原分析和基因检测等更加详尽的分析。

可以获得可靠的结果的采用病毒分离培养的诊断由于需要数日，因此无法进行快速的诊断。可以比病毒分离更快速地进行诊断的方法有若干种，其中的RT-PCR法被认为与其它方法相比检测灵敏度更高。但是，对于目前公开的RT-PCR法，有报道称其与病毒的感染价相比无法以高灵敏度检出病毒，即使采用RT-PCR法的检查中呈阴性，也不能排除禽流感的感染。因此，希望出现可以迅速且高灵敏度地检出H5和H7型禽流感病毒的检查法。

专利文献1：欧洲专利申请公开第1310565号说明书

专利文献2：日本专利公表2004-509648号公报

非专利文献1：Lau LT.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，vol.313，p.336-342(2004)

非专利文献2：Shang S.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，vol.302，p.377-383(2003)

非专利文献3：Collins RA.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，vol.300，p.507-515(2003)

非专利文献4：Lee MS.等，J.Virol.Methods，vol.97，p.13-22(2001)

非专利文献5：Munch M.等，Arch.Virol.，vol.146，p.87-97(2001)

发明的揭示

为了解决上述课题，本发明人认真研究后发现，制作与对H5或H7型禽流感病毒特异性的碱基序列杂交的寡聚核苷酸引物，通过LAMP(环介导恒温扩增，loop-mediated isothermal amplification)法扩增对H5或H7型禽流感病毒特异性的碱基序列，可以高灵敏度地检出H5或H7型禽流感病毒，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下的(1)～(8)。

(1)根据选自以序列编号1表示的H5型禽流感病毒的血凝素碱基序列的693位～959位的碱基序列的任意碱基序列或与其互补的碱基序列设计的寡核苷酸引物。

(2)如(1)所述的寡核苷酸引物，其中，包含选自以下的(a)～(c)的寡核苷酸：

(a)选自以序列编号2～7表示的碱基序列或与其互补的碱基序列的至少含有连续的15个碱基的寡核苷酸；

(b)可与前述(a)所述的寡核苷酸在严格条件下杂交的寡核苷酸；

(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1个～数个的碱基被置换、缺失、插入或添加的碱基序列，具有引物功能的寡核苷酸。

(3)如(1)或(2)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，从H5型禽流感病毒的血凝素的目标核酸上的3′末端侧选择记作F3c、F2c、F1c的碱基序列区域，从5′末端侧选择记作B3、B2、B1的碱基序列区域，将各自的互补碱基序列记作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c时，由选自以下的(a)～(d)的碱基序列构成：

(a)在3′末端侧具有目标核酸的F2区域，在5′末端侧具有目标核酸的F1c区域的碱基序列；

(b)具有目标核酸的F3区域的碱基序列；

(c)在3′末端侧具有目标核酸的B2区域，在5′末端侧具有目标核酸的B1c区域的碱基序列；

(d)具有目标核酸的B3区域的碱基序列。

(4)如(1)～(3)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以扩增对H5型禽流感病毒特异性的碱基序列，从5′末端到3′末端，由选自以下的(a)～(b)的碱基序列构成：

(a)5′-(与序列编号2的碱基序列互补的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(序列编号3的碱基序列)-3′；

(b)5′-(序列编号5的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(与序列编号6的碱基序列互补的碱基序列)-3′。

(5)H5型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，使用(1)～(4)所述的寡核苷酸引物，进行H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应。

(6)如(5)所述的H5型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应采用LAMP法。

(7)流感的诊断方法，其特征在于，通过使用(1)～(4)所述的寡核苷酸引物，检测H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增，诊断是否有H5型禽流感病毒的感染。

(8)试剂盒，其特征在于，包含用于诊断流感的(1)～(4)所述的寡核苷酸引物。

本发明还提供以下的(9)～(16)。

(9)根据选自以序列编号1表示的H5型禽流感病毒的血凝素碱基序列的19位～220位的碱基序列的任意碱基序列或与其互补的碱基序列设计的寡核苷酸引物。

(10)如(9)所述的寡核苷酸引物，其中，包含选自以下的(a)～(c)的寡核苷酸：

(a)选自以序列编号13～18表示的碱基序列或与其互补的碱基序列的至少含有连续的15个碱基的寡核苷酸；

(b)可与前述(a)所述的寡核苷酸在严格条件下杂交的寡核苷酸；

(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1个～数个的碱基被置换、缺失、插入或添加的碱基序列，具有引物功能的寡核苷酸。

(11)如(9)或(10)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，从H5型禽流感病毒的血凝素的目标核酸上的3′末端侧选择记作F3c、F2c、F1c的碱基序列区域，从5′末端侧选择记作B3、B2、B1的碱基序列区域，将各自的互补碱基序列记作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c时，由选自以下的(a)～(d)的碱基序列构成：

(a)在3′末端侧具有目标核酸的F2区域，在5′末端侧具有目标核酸的F1c区域的碱基序列；

(b)具有目标核酸的F3区域的碱基序列；

(c)在3′末端侧具有目标核酸的B2区域，在5′末端侧具有目标核酸的B1c区域的碱基序列；

(d)具有目标核酸的B3区域的碱基序列。

(12)如(9)～(11)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以扩增对H5型禽流感病毒特异性的碱基序列，从5′末端到3′末端，由选自以下的(a)～(b)的碱基序列构成：

(a)5′-(与序列编号13的碱基序列互补的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(序列编号14的碱基序列)-3′；

(b)5′-(序列编号16的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(与序列编号17的碱基序列互补的碱基序列)-3′。

(13)H5型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，使用(9)～(12)所述的寡核苷酸引物，进行H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应。

(14)如(13)所述的H5型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应采用LAMP法。

(15)流感的诊断方法，其特征在于，通过使用(9)～(12)所述的寡核苷酸引物，检测H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增，诊断是否有H5型禽流感病毒的感染。

(16)试剂盒，其特征在于，包含用于诊断流感的(9)～(12)所述的寡核苷酸引物。

本发明还提供以下的(17)～(24)。

(17)根据选自以序列编号1表示的H5型禽流感病毒的血凝素碱基序列的114位～333位的碱基序列的任意碱基序列或与其互补的碱基序列设计的寡核苷酸引物。

(18)如(17)所述的寡核苷酸引物，其中，包含选自以下的(a)～(c)的寡核苷酸：

(a)选自以序列编号24～29表示的碱基序列或与其互补的碱基序列的至少含有连续的15个碱基的寡核苷酸；

(b)可与前述(a)所述的寡核苷酸在严格条件下杂交的寡核苷酸；

(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1个～数个的碱基被置换、缺失、插入或添加的碱基序列，具有引物功能的寡核苷酸。

(19)如(17)或(18)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，从H5型禽流感病毒的血凝素的目标核酸上的3′末端侧选择记作F3c、F2c、F1c的碱基序列区域，从5′末端侧选择记作B3、B2、B1的碱基序列区域，将各自的互补碱基序列记作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c时，由选自以下的(a)～(d)的碱基序列构成：

(a)在3′末端侧具有目标核酸的F2区域，在5′末端侧具有目标核酸的F1c区域的碱基序列；

(b)具有目标核酸的F3区域的碱基序列；

(c)在3′末端侧具有目标核酸的B2区域，在5′末端侧具有目标核酸的B1c区域的碱基序列；

(d)具有目标核酸的B3区域的碱基序列。

(20)如(17)～(19)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以扩增对H5型禽流感病毒特异性的碱基序列，从5′末端到3′末端，由选自以下的(a)～(b)的碱基序列构成：

(a)5′-(与序列编号24的碱基序列互补的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(序列编号25的碱基序列)-3′；

(b)5′-(序列编号27的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(与序列编号28的碱基序列互补的碱基序列)-3′。

(21)H5型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，使用(17)～(20)所述的寡核苷酸引物，进行H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应。

(22)如(21)所述的H5型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应采用LAMP法。

(23)流感的诊断方法，其特征在于，通过使用(17)～(20)所述的寡核苷酸引物，检测H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增，诊断是否有H5型禽流感病毒的感染。

(24)试剂盒，其特征在于，包含用于诊断流感的(17)～(20)所述的寡核苷酸引物。

本发明还提供以下的(25)～(32)。

(25)根据选自以序列编号1表示的H5型禽流感病毒的血凝素碱基序列的874位～1065位的碱基序列的任意碱基序列或与其互补的碱基序列设计的寡核苷酸引物。

(26)如(25)所述的寡核苷酸引物，其中，包含选自以下的(a)～(c)的寡核苷酸：

(a)选自以序列编号35～40表示的碱基序列或与其互补的碱基序列的至少含有连续的15个碱基的寡核苷酸；

(b)可与前述(a)所述的寡核苷酸在严格条件下杂交的寡核苷酸；

(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1个～数个的碱基被置换、缺失、插入或添加的碱基序列，具有引物功能的寡核苷酸。

(27)如(25)或(26)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，从H5型禽流感病毒的血凝素的目标核酸上的3′末端侧选择记作F3c、F2c、F1c的碱基序列区域，从5′末端侧选择记作B3、B2、B1的碱基序列区域，将各自的互补碱基序列记作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c时，由选自以下的(a)～(d)的碱基序列构成：

(a)在3′末端侧具有目标核酸的F2区域，在5′末端侧具有目标核酸的F1c区域的碱基序列；

(b)具有目标核酸的F3区域的碱基序列；

(c)在3′末端侧具有目标核酸的B2区域，在5′末端侧具有目标核酸的B1c区域的碱基序列；

(d)具有目标核酸的B3区域的碱基序列。

(28)如(25)～(27)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以扩增对H5型禽流感病毒特异性的碱基序列，从5′末端到3′末端，由选自以下的(a)～(b)的碱基序列构成：

(a)5′-(与序列编号35的碱基序列互补的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(序列编号36的碱基序列)-3′；

(b)5′-(序列编号38的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(与序列编号39的碱基序列互补的碱基序列)-3′。

(29)H5型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，使用(25)～(28)所述的寡核苷酸引物，进行H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应。

(30)如(29)所述的H5型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应采用LAMP法。

(31)流感的诊断方法，其特征在于，通过使用(25)～(28)所述的寡核苷酸引物，检测H5型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增，诊断是否有H5型禽流感病毒的感染。

(32)试剂盒，其特征在于，包含用于诊断流感的(25)～(28)所述的寡核苷酸引物。

本发明还提供以下的(33)～(40)。

(33)根据选自以序列编号48表示的H7型禽流感病毒的血凝素碱基序列的1016位～1225位的碱基序列的任意碱基序列或与其互补的碱基序列设计的寡核苷酸引物。

(34)如(33)所述的寡核苷酸引物，其中，包含选自以下的(a)～(c)的寡核苷酸：

(a)选自以序列编号49～54表示的碱基序列或与其互补的碱基序列的至少含有连续的15个碱基的寡核苷酸；

(b)可与前述(a)所述的寡核苷酸在严格条件下杂交的寡核苷酸；

(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1个～数个的碱基被置换、缺失、插入或添加的碱基序列，具有引物功能的寡核苷酸。

(35)如(33)或(34)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，从H7型禽流感病毒的血凝素的目标核酸上的3′末端侧选择记作F3c、F2c、F1c的碱基序列区域，从5′末端侧选择记作B3、B2、B1的碱基序列区域，将各自的互补碱基序列记作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c时，由选自以下的(a)～(d)的碱基序列构成：

(a)在3′末端侧具有目标核酸的F2区域，在5′末端侧具有目标核酸的F1c区域的碱基序列；

(b)具有目标核酸的F3区域的碱基序列；

(c)在3′末端侧具有目标核酸的B2区域，在5′末端侧具有目标核酸的B1c区域的碱基序列；

(d)具有目标核酸的B3区域的碱基序列。

(36)如(33)～(35)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以扩增对H7型禽流感病毒特异性的碱基序列，从5′末端到3′末端，由选自以下的(a)～(b)的碱基序列构成：

(a)5′-(与序列编号49的碱基序列互补的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(序列编号50的碱基序列)-3′；

(b)5′-(序列编号52的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(与序列编号53的碱基序列互补的碱基序列)-3′。

(37)H7型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，使用(33)～(36)所述的寡核苷酸引物，进行H7型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应。

(38)如(37)所述的H7型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，H7型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应采用LAMP法。

(39)流感的诊断方法，其特征在于，通过使用(33)～(36)所述的寡核苷酸引物，检测H7型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增，诊断是否有H7型禽流感病毒的感染。

(40)试剂盒，其特征在于，包含用于诊断流感的(33)～(36)所述的寡核苷酸引物。

若采用本发明，通过制作与对H5或H7型禽流感病毒特异性的碱基序列选择性地杂交的寡聚核苷酸引物，用LAMP法扩增对H5或H7型禽流感病毒特异性的碱基序列，可以高灵敏度且迅速地检出H5或H7型禽流感病毒。

附图的简单说明

图1为表示H5型禽流感病毒用引物组的特异性试验的结果的图，(a)、(b)、(c)和(d)分别表示使用引物组A、B、C和D时的结果，NC表示阴性对照，H1表示新喀里多尼亚亚型，H3表示巴拿马亚型，PC表示阳性对照(H5型质粒DNA)。

图2为表示H5型禽流感病毒用引物组的灵敏度试验的结果的图，(a)、(b)、(c)和(d)分别表示使用引物组A、B、C和D时的结果，10³～10⁶表示RNA提取物的稀释率。

图3为表示以H5型禽流感病毒用引物组扩增的产物的电泳结果的图，泳道1为100bp梯标记物，泳道2为LAMP产物的样本，泳道3为将LAMP产物以Dde I处理得到的样本。

图4为表示H5型禽流感病毒用引物组的交叉试验的结果的图，B-sd表示B/山东/07/97，B-sh表示B/上海/361/2002，AIV-H1等表示禽流感病毒H1等。

图5为表示H7型禽流感病毒用引物组的反应性确认试验的结果的图，250、100、50表示tRNA的添加量(拷贝/试验)，NC表示阴性对照。

图6为表示以H7型禽流感病毒用引物组扩增的产物的电泳结果的图，泳道M为100bp梯标记物，泳道1为LAMP产物的样本，泳道2为将LAMP产物以Pst I处理得到的样本。

图7为表示H7型禽流感病毒用引物组的交叉性试验的结果的图，H1和H3表示人流感病毒H1型和H3型，B-sd表示B/山东/07/97，B-sh表示B/上海/361/2002，AIV-H1等表示禽流感病毒H1等，PC表示阳性对照，NC表示阴性对照。

图8为表示H7型禽流感病毒用引物组对于各种株的反应性的结果的图，(a)表示A/荷兰/219/2003，(b)表示A/荷兰/33/2003，10⁵～10⁸表示RNA提取物的稀释率。

图9为表示H7型禽流感病毒用引物组对于各种株的反应性的结果的图，(a)表示A/野鸭/荷兰/12/00，(b)表示A/水凫/大阪/1/2001，10⁵～10⁸表示RNA提取物的稀释率。

实施发明的最佳方式

作为本发明中使用的试样，可以例举例如痰液、支气管肺泡清洗液、鼻液、鼻腔吸取液、鼻腔清洗液、鼻腔擦拭液、咽头擦拭液、漱口液、唾液、血液、血清、血浆、脑脊液、尿、粪便、组织等来自于被怀疑感染禽流感病毒的人或其它动物的活体的样本。此外，试样也可以采用分离自感染实验等中所用的细胞和其培养液或者来自于活体的标本和培养细胞等的含病毒的样本等。这些试样可以进行分离、抽提、浓缩、纯化等预处理。

这样的核酸的扩增可以通过不需要纳富等开发的PCR法中不可缺少的温度控制的新核酸扩增法——被称为LAMP法的环介导恒温扩增法(国际公开第00/28082号文本)来实现。该方法是通过使自身的3′末端退火到作为模板的核苷酸上而作为互补链合成的起点的同时，组合退火到这时形成的环上的引物，可以实现恒温下的互补链合成反应的核酸扩增法。此外，LAMP法是至少使用识别6个区域的4个引物的特异性高的核酸扩增法。

LAMP法中所用的寡核苷酸引物为识别模板核酸的碱基序列的共6个区域的碱基序列的至少4种引物，该6个区域为自3′末端侧的记作F3c、F2c、F1c的区域和自5′末端侧的记作B3、B2、B1的区域，分别被称为内部引物F及B和外部引物F及B。此外，将F3c、F2c、F1c的互补序列分别记作F3、F2、F1，将B3、B2、B1的互补序列分别记作B3c、B2c、B1c。内部引物是指识别目标碱基序列上的“某个特定的核苷酸序列区域”，且在3′末端具有供作合成起点的碱基序列，同时在5′末端具有对于将该引物作为起点的核酸合成反应生成物的任意区域互补的碱基序列的寡核苷酸。在这里，将包含“选自F2的碱基序列”和“选自F1c的碱基序列”的引物称作内部引物F(以下略作FIP)，并将包含“选自B2的碱基序列”和“选自B1c的碱基序列”的引物称作内部引物B(以下略作BIP)。另一方面，外部引物是指识别目标碱基序列上的“存在于比内部引物识别的区域更接近3′末端侧的某个特定的核苷酸序列区域”，且具有供作合成起点的碱基序列的寡核苷酸。在这里，将包含“选自F3的碱基序列”的引物称作外部引物F(以下略作F3)，并将包含“选自B3的碱基序列”的引物称作外部引物B(以下略作B3)。在这里，各引物中的F表示与目标碱基序列的有义链互补地结合且提供合成起点的引物；另一方面，B表示与目标碱基序列的反义链互补地结合且提供合成起点的引物。在这里，用作引物的寡核苷酸的长度在10碱基以上，较好是15碱基以上，可以是化学合成或天然的寡核苷酸，各引物可以是单一的寡核苷酸，也可以是多种寡核苷酸的混合物。

LAMP法中，除内部引物和外部引物以外，还可以使用其它的引物，即环引物。环引物(Loop Primer)是指基于LAMP法的扩增生成物的同一链上产生的互补序列相互退火形成环的情况下，在其3′末端包含与该环内的序列互补的碱基序列的2种引物(构成双链的各链各1种)。若使用该引物，则核酸合成的起点增加，可以实现反应时间的缩短和检测灵敏度的上升(国际公开第02/24902号文本)。

寡核苷酸可以通过公知的方法制造，例如可以进行化学合成。或者，也可以将天然的核酸用限制性酶等剪切，改变或连结成所需碱基序列的结构。具体来说，可以使用寡核苷酸合成装置等进行合成。此外，可以使用具有1个～数个的碱基被置换、缺失、插入或添加的碱基序列的寡核苷酸的合成法等本身公知的制法。例如，可以单独或适当组合使用位点特异性突变导入法、基因同源重组法、引物伸长法或PCR法，合成所述的寡核苷酸。

作为本说明书中的“严格的杂交条件”，可以选择通常公知的条件。作为严格条件，可以例举例如以下的条件：在含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml的DNA的溶液中，在42℃杂交一晚后，在室温下于2×SSC·0.1％SDS中清洗一次，再在约65℃下用0.1×SSC·0.1％SDS中清洗两次。

流感病毒为RNA病毒。LAMP法中模板为RNA的情况下，通过在模板为DNA时的反应液中添加反转录酶，可以同样地进行核酸扩增反应(RT-LAMP法)。

本发明人对可以快速地扩增对于H5型禽流感病毒特异性的碱基序列的LAMP法的引物碱基序列及其组合认真研究后，根据H5型禽流感病毒的血凝素的碱基序列(以序列编号1表示的碱基序列)，选定了以下的A、B、C和D这4组作为引物组。另外，这些引物的序列与已报道的(例如专利文献2)的用于H5型禽流感病毒的检测的NASBA(基于核酸序列的扩增，Nucleic Acid Sequence-BasedAmplification)用引物的序列完全不同。

(引物组A)

FIP19c：5′-ACCATATTCCAACTCACTTTTCATAATTTCATTGCTCCAGAATATGC-3′(序列编号8)

BIP5：5′-CAAACTCCAATGGGGGCATGGTGAGAGGGTGTAT-3′(序列编号9)

F3m6：5′-GGAGTTCTTCTGGACAA-3′(序列编号4)

B3m：5′-GTCGCAAGGACTAATCT-3′(序列编号10)

LF24：5′-GAGTCCCCTTTCTTGACAAT-3′(序列编号11)

LB1：5′-GATAAACTCTAGTATGCCA-3′(序列编号12)

(引物组B)

FIP：5′-GGGCATGTGTAACAGTAACGTTAAACAACTCGACAGAGCA-3′(序列编号19)

BIP：5′-TGGAAAAGACACACAATGGGAACATCCAGCTACACTACAATC-3′(序列编号20)

F3：5′-CAGATTTGCATTGGTTACCA-3′(序列编号15)

B3：5′-CGTCACACATTGGGTTTC-3′(序列编号21)

LF：5′-TTCCATTATTGTGTCAACC-3′(序列编号22)

LB8：5′-CGATCTAGATGGAGTGAAGC-3′(序列编号23)

(引物组C)

FIP：5′-CACATTGGGTTTCCGAGGAGATCTAGATGGAGTGAAGCC-3′(序列编号30)

BIP：5′-TTCATCAATGTGCCGGAATGGGTTGAAATCCCCTGGGTA-3′(序列编号31)

F3：5′-GGAAAAGACACACAATGGG-3′(序列编号26)

B3：5′-GCTCAATAGGTGTTTCAGTT-3′(序列编号32)

LF6：5′-CCAGCTACACTACAATCTCT-3′(序列编号33)

LB6：5′-TCCAGCCAATGACCTCTG-3′(序列编号34)

(引物组D)

FIP：5′-TCGCAAGGACTAATCTGTTTGACATACACCCTCTCACCAT-3′(序列编号41)

BIP：5′-TACCCCTCAAAGAGAGAGAAGATCCTCCCTCTATAAAACCTG-3′(序列编号42)

F3：5′-TCTAGTATGCCATTCCACAA-3′(序列编号37)

B3：5′-ACCATCTACCATTCCCTG-3′(序列编号43)

LF8：5′-TCACATATTTGGGGCATTCC-3′(序列编号44)

LB8：5′-AGAGAGGACTATTTGGAGCT-3′(序列编号45)

另外，本发明人对可以快速地扩增对于H7型禽流感病毒特异性的碱基序列的LAMP法的引物碱基序列及其组合认真研究后，根据H7型禽流感病毒的血凝素的碱基序列(以序列编号1表示的碱基序列)，选定了以下的引物组E。

(引物组E)

22FIP：5′-ACCACCCATCAATCAAACCTTCTATTTGGTGCTATAGCGG-3′(序列编号55)

22BIP：5′-TTCAGGCATCAAAATGCACAAGCCTGTTATTTGATCAATTGCTG-3′(序列编号56)

22F3m：5′-TTCCCGAAATCCCAAA-3′(序列编号51)

22B3：5′-GGTTAGTTTTTTCTATAAGCCG-3′(序列编号57)

22-9LF：5′-CCCATCCATTTTCAATGAAAC-3′(序列编号58)

22-9LB：5′-ACTGCTGCAGATTACAAAAG-3′(序列编号59)

核酸合成中使用的酶只要是具有链置换活性的模板依赖性核酸合成酶即可，没有特别限定。作为这样的酶，可以例举Bst DNA聚合酶(大片段)、Bca(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段等，较好是Bst DNA聚合酶(大片段)。

作为RT-LAMP法中使用的反转录酶，只要是具有将RNA作为模板合成cDNA的活性的酶即可，没有特别限定。作为这样的酶，可以例举AMV、克隆的AMV、MMLV的反转录酶和Superscript II、ReverTraAce、Thermoscript等，较好是AMV或克隆的AMV的反转录酶。此外，如果使用像Bca DNA聚合酶那样具有反转录酶活性和DNA聚合酶活性这两种活性的酶，则可以用1种酶进行RT-LAMP反应。

核酸合成中使用的酶和反转录酶可以从病毒或细菌等中纯化得到，也可以通过基因重组技术制成。此外，这些酶可以进行片段化或氨基酸的置换等改变。

LAMP反应后的核酸扩增产物的检测可以使用公知的技术。例如，可以使用特异性识别扩增得到的碱基序列的标记寡核苷酸或荧光性嵌入剂法(日本专利特开2001-242169号公报)进行检测，也可以将反应结束后的反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳而容易地进行检测。通过琼脂糖凝胶电泳，LAMP扩增产物被以碱基长度不同的多种条带呈梯状地检出。此外，LAMP法中，由于核酸的合成，底物被大量消耗，作为副产物的焦磷酸离子与共存的镁离子反应而生成焦磷酸镁，反应液白浊至肉眼也可确认的程度。因此，通过使用可以对反应结束后或反应中的浊度上升持续进行光学观察的测定仪器确认该白浊，例如使用常规的分光光度计确认400nm的吸光度变化，也可以检测核酸扩增反应(国际公开第01/83817号文本)。

使用本发明的引物进行核酸扩增的检测时所需的各种试剂可以事先组合而试剂盒化。具体来说，作为本发明的引物或环引物所需的各种寡核苷酸、作为核酸合成的底物的4种dNTP、进行核酸合成的DNA聚合酶、具有反转录活性的酶、提供适合于酶反应的条件的缓冲液和盐类、使酶和模板稳定化的保护剂以及根据需要采用的反应生成物的检测所需的试剂以试剂盒的形式提供。

实施例

以下，例举实施例，对本发明进行具体说明，但本发明并不受到这些实施例的任何限定。

实施例1：H5型禽流感病毒用引物组的反应性的确认

引物的反应性的确认通过以下的方法进行。用于通过LAMP法进行核酸扩增的反应溶液的组成如下。另外，引物的合成委托QIAGEN公司，使用OPC(反相柱层析)纯化得到的产品。

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

8mM MgSO₄

1.4mM dNTP

10mM(NH₄)₂SO₄

0.8M 甜菜碱(SIGMA)

0.1％ Tween20

1.6μM FIP

1.6μM BIP

0.2μM F3

0.2μM B3

0.8μM LF

0.8μM LB

AMV反转录酶2U(Finnzyme)

Bst DNA聚合酶16U(NEB)

在上述反应溶液中加入10⁴拷贝的H5质粒DNA(HK/213/03；由国立传染病研究所提供)，在62.5℃进行RT-LAMP反应60分钟。使用实时浊度测定装置LA-320C(荣研化学)，实时地对反应进行检测。其结果是，4种引物组(引物组A、B、C和D)确认扩增。

另外，对于该4组，使用提取自作为培养病毒的新喀里多尼亚亚型(H1N1)和巴拿马亚型(H3N2)的RNA作为模板进行特异性试验。图1为表示特异性试验的结果的图。如图1所示，使用各引物组的情况下，都未发现H1型和H3型的扩增。由上述结果可知，所有的引物组对于H5型的特异性都高。

接着，使用提取自作为培养病毒的越南/JP1203/04(H5N1)的RNA，进行灵敏度试验。由于提取RNA的模板量不明，因此使用以无核糖核酸酶的灭菌水稀释10³～10⁶倍的RNA作为模板样本。图2为表示灵敏度试验的结果的图。使用引物组A时，即使是稀释10⁵倍的样本也确认到扩增，灵敏度最高。

实施例2：以H5型禽流感病毒用引物组扩增得到的产物的确认

对于以引物组A扩增得到的LAMP产物，进行使用电泳和限制性酶Dde I的确认。图3为表示电泳结果的图。由图3的泳道2可明显地确认LAMP产物特有的梯形图案。此外，以Dde I处理了的样本(泳道3)确认发生消化。由以上的结果可知，目标序列被特异性地扩增。

实施例3：H5型禽流感病毒用引物组的评价(交叉性试验)

将人流感病毒的A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/巴拿马/2007/99(H3N2)、B/山东/07/97和B/上海/361/2002以及禽流感病毒H1～H15(除H5外)的总计18种作为样本。分别从培养病毒用QIAamp Viral RNA Kit(QIAGEN公司)进行RNA的抽提，将5μL抽提液用于RT-LAMP反应(使用引物组A作为引物)。

由图4(a)和(b)可知，通过RT-LAMP法所有的样本未发现扩增。因此，确认RT-LAMP法的特异性高。

实施例4：H5型禽流感病毒用引物组的评价(灵敏度试验)

使用2004年在山口县确认感染的禽流感H5型株(CH/山口7/04)和2004年在越南确认感染的H5型株(VN/JP1203/04)作为模板样本。分别将从培养病毒抽提得到的RNA以无核糖核酸酶的灭菌水分步稀释(10⁴～10⁸)，RT-PCR法使用10μL稀释液，RT-LAMP法(使用引物组A作为引物)使用5μL稀释液。

RT-PCR法修改国立传染病研究所的传染病信息中心的网站上所登载的条件进行。即，使用市售的试剂盒(TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV))，在50℃进行反转录反应30分钟，在94℃处理2分钟后，重复30次94℃1分钟、45℃1分钟、72℃1分钟的循环，再于72℃进行伸长反应10分钟，在4℃进行保存。

RT-PCR法中使用的引物和反应溶液的组成如下。

引物(PCR产物的长度：708bp)

H5 515f：5′-CATACCCAACAATAAAGAGG-3′(序列编号46)

H5 1220r：5′-GTGTTCATTTTGTTAATGAT-3′(序列编号47)

反应溶液

RNA抽提液 10μL

10×One Step RNA PCR缓冲液 5μL

10mM dNTP 5μL

25mM MgCl₂ 10μL

核糖核酸酶抑制剂 1μL

AMV反转录酶 1μL

AMV-优化Taq 1μL

H5 515f(10μM)2μL

H5 1220r(10μM)2μL

无核糖核酸酶的灭菌水适当添加而将反应液调整至50μL

采用RT-PCR法和RT-LAMP法的扩增的结果汇总示于表1。表1中，RT-LAMP法的栏表示确认扩增的样本的比例。此外，RT-PCR中的扩增通过肉眼确认电泳的结果(表1中，○表示可检出扩增，×表示无法检出扩增)。

[表1]

比较RT-LAMP法和RT-PCR法时，所有的株都是RT-LAMP法高达10～100倍的灵敏度。

实施例5：H7型禽流感病毒用引物组的反应性的确认

引物组E的反应性的确认通过以下的方法进行。用于通过LAMP法进行核酸扩增的反应溶液的组成如下。另外，引物的合成委托QIAGEN公司，使用OPC(反相柱层析)纯化得到的产品。

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

8mM MgSO₄

1.4mM dNTP

10mM(NH₄)₂SO₄

0.8M 甜菜碱(SIGMA)

0.1％ Tween20

1.6μM FIP

1.6μM BIP

0.2μM F3

0.2μM B3

0.8μM LF

0.8μM LB

AMV反转录酶2U(Finnzyme)

Bst DNA聚合酶16U(NEB)

将A/荷兰/219/2003(H7N7)(在荷兰出现死亡病例时分离得到的株)的碱基序列(包含序列编号1所示的碱基序列的片段)重组到克隆载体上，通过转录反应制备tRNA。将制得的tRNA以250、100或50拷贝/试验的量加入到上述反应溶液中，在62.5℃反应35分钟，使用实时浊度测定装置LA-200(テラメツクス)，进行扩增反应和检测。

tRNA的添加量为250、100和50拷贝/试验的情况以及阴性对照的实时检测结果示于图5。由该结果可知，至50拷贝/试验也检出扩增。

实施例6：以H7型禽流感病毒用引物组扩增得到的产物的确认

对于以引物组E扩增得到的LAMP产物，进行使用电泳和限制性酶Pst I的确认。图6为表示电泳结果的图。M表示100bp的梯标记物，泳道1为未处理的LAMP产物的样本，泳道2为将LAMP产物以Pst I消化得到的样本。由图6的泳道1可明显地确认LAMP产物特有的梯形图案。此外，以Pst I处理了的样本(泳道2)确认发生消化。由以上的结果可知，目标序列被特异性地扩增。

实施例7：H7型禽流感病毒用引物组的评价(交叉性试验)

将人流感病毒的A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/巴拿马/2007/99(H3N2)、B/山东/07/97和B/上海/361/2002以及禽流感病毒H1～H15(除H7外)的总计18种作为样本，考察引物的特异性。分别从培养病毒用QIAamp Viral RNA Kit(QIAGEN公司)进行RNA的抽提，将稀释100倍的抽提RNA用于RT-LAMP反应。另外，阳性对照(PC)使用实施例5中制备的tRNA，阴性对照使用蒸馏水。

由图7可知，所有的样本都未发现扩增。因此，确认本发明的引物组的特异性高。

实施例8：H7型禽流感病毒用引物组的评价(对各种株的反应性)

将4种H7型禽流感病毒基因组用作模板样本，考察对各种病毒的灵敏度。分别将从培养病毒抽提得到的RNA以无核糖核酸酶的灭菌水分步稀释(10⁵～10⁸)，使用5μL稀释液。

将各病毒基因组作为模板样本时的实时检测的结果示于图8和9。对于A/荷兰/219/2003(H7N7)和A/荷兰/33/2003(H7N7)，可以检测至10⁷倍稀释(参照图8)，对于A/野鸭/荷兰/12/2003(H7N3)和A/水凫/大阪/1/2001(H7N7)，可以检测至10⁶倍稀释(参照图9)。由以上结果可知，本发明的引物组与上述4种株反应。

产业上利用的可能性

若采用本发明，可以高灵敏度且迅速地检出H5型或H7型禽流感病毒。

                        序列表

<110>荣研化学株式会社(EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA)

国立传染病研究所(National Institute of Infectious Diseases)

<120>H5型或H7型禽流感病毒的检测方法

<130>FP05-0385-00

<160>59

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1674

<212>DNA

<213>禽流感病毒

<400>1

agtcttgtta aaagtgatca gatttgcatt ggttaccatg caaacaactc gacagagcag    60

gttgacacaa taatggaaaa gaacgttact gttacacatg cccaagacat attggaaaag    120

acacacaatg ggaagctctg cgatctagat ggagtgaagc ctctaatttt gagagattgt    180

agtgtagctg gatggctcct cggaaaccca atgtgtgacg aattcatcaa tgtgccggaa    240

tggtcttaca tagtggagaa ggccagtcca gccaatgacc tctgttaccc aggggatttc    300

aacgactatg aagaactgaa acacctattg agcagaataa accattttga gaaaattcag    360

atcatcccca aaagttcttg gtccaatcat gaagcctcat caggggtgag ctcagcatgt    420

ccatatcttg ggaagtcctc ctttttcaga aatgtggtat ggcttatcaa aaagaacagt    480

acatacccaa caataaagag gagctataat aataccaacc aagaagatct tttggtactg    540

tgggggattc accatcctaa tgatgcggca gagcagacaa agctctatca aaacccaacc    600

acctatattt ccgttggaac atcaacacta aaccagagat tggtaccaaa aatagctact    660

agatccaaag taaacgggca aagtggaaga atggagttct tctggacaat tttaaagccg    720

aatgatgcta tcaatttcga gagtaatgga aatttcattg ctccagaata tgcatacaaa    780

attgtcaaga aaggggactc agcaattatg aaaagtgaat tggaatatgg taactgcaac    840

accaagtgtc aaactccaat gggggcgata aactctagta tgccattcca caacatacac    900

cctctcacca tcggggaatg ccccaaatat gtgaaatcaa acagattagt ccttgcgact    960

ggactcagaa atacccctca aagagagaga agaagaaaaa agagaggact atttggagct    1020

atagcaggtt ttatagaggg aggatggcag ggaatggtag atggttggta tgggtaccac    1080

catagcaatg agcaggggag tggatacgct gcagacaaag aatccactca aaaggcaata    1140

gatggagtta ccaataaggt caactcgatc attgacaaaa tgaacactca gtttgaggcc    1200

gttggaaggg aatttaataa cttagaaagg agaatagaaa atttaaacaa gaagatggaa    1260

gacggattcc tagatgtctg gacttataat gctgaacttc tggttctcat ggaaaatgag    1320

agaactctag actttcacga ctcaaatgtc aagaaccttt acgacaaggt ccgactacag    1380

cttagggata atgcaaagga gctgggtaac ggctgtttcg agttctatca caaatgtgat    1440

aatgaatgta tggaaagtgt aaaaaacgga acgtatgact acccgcagta ttcagaagaa    1500

gcaagactaa acagagagga aataagtgga gtaaaattgg aatcaatggg aacttaccaa    1560

atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt tccctagcac tggcaatcat ggtagctggt    1620

ctatctttat ggatgtgctc caatggatcg ttacaatgca gaatttgcat ttaa          1674

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

aattatgaaa agtgagttgg aatatggt                                       28

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

tcattgctcc agaatatgc                                                 19

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

ggagttcttc tggacaa                                                   17

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

caaactccaa tgggggc                                                   17

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

atacaccctc tcaccat                                                   17

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>7

agattagtcc ttgcgac                                                   17

<210>8

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>8

accatattcc aactcacttt tcataatttc attgctccag aatatgc                  47

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>9

caaactccaa tgggggcatg gtgagagggt gtat                                34

<210>10

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>10

gtcgcaagga ctaatct                                                   17

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>11

gagtcccctt tcttgacaat                                                20

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>12

gataaactct agtatgcca                                                 19

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>13

aacgttactg ttacacatgc cc                                             22

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>14

aaacaactcg acagagca                                                  18

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>15

cagatttgca ttggttacca                                                20

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>16

tggaaaagac acacaatggg aa                                             22

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>17

gattgtagtg tagctggatg                                                20

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>18

gaaacccaat gtgtgacg                                                  18

<210>19

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>19

gggcatgtgt aacagtaacg ttaaacaact cgacagagca                          40

<210>20

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>20

tggaaaagac acacaatggg aacatccagc tacactacaa tc                       42

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>21

cgtcacacat tgggtttc                                                  18

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>22

ttccattatt gtgtcaacc                                                 19

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>23

cgatctagat ggagtgaagc                                                20

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>24

ctcctcggaa acccaatgtg                                                20

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

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<223>引物

<400>25

atctagatgg agtgaagcc                                                 19

<210>26

<211>19

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<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>26

ggaaaagaca cacaatggg                                                 19

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<211>21

<212>DNA

<213>人工的

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<223>引物

<400>27

ttcatcaatg tgccggaatg g                                              21

<210>28

<211>18

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tacccagggg atttcaac                                                  18

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aactgaaaca cctattgagc                                                20

<210>30

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

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cacattgggt ttccgaggag atctagatgg agtgaagcc                           39

<210>31

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

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ttcatcaatg tgccggaatg ggttgaaatc ccctgggta                           39

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<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>32

gctcaatagg tgtttcagtt                                                20

<210>33

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ccagctacac tacaatctct                                                20

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tccagccaat gacctctg                                                  18

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<220>

<223>引物

<400>35

tcaaacagat tagtccttgc ga                                             22

<210>36

<211>18

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<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>36

catacaccct ctcaccat                                                  18

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>37

tctagtatgc cattccacaa                                                20

<210>38

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>38

tacccctcaa agagagagaa ga                                             22

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>39

caggttttat agagggagga                                                20

<210>40

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>40

cagggaatgg tagatggt                                                  18

<210>41

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>41

tcgcaaggac taatctgttt gacatacacc ctctcaccat                          40

<210>42

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>42

tacccctcaa agagagagaa gatcctccct ctataaaacc tg                       42

<210>43

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>43

accatctacc attccctg                                                  18

<210>44

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>44

tcacatattt ggggcattcc                                                20

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>45

agagaggact atttggagct                                                20

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>RT-PCR引物(H5 515f)

<400>46

catacccaac aataaagagg                                                20

<210>47

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>RT-PCR引物(H5 1220r)

<400>47

gtgttcattt tgttaatgat                                                20

<210>48

<211>1737

<212>DNA

<213>禽流感病毒

<400>48

agcaaaagca ggggatacaa aatgaacact caaatcctgg tattcgctct ggtggcgagc    60

attccgacaa atgcagacaa gatctgcctt gggcatcatg ccgtgtcaaa cgggactaaa    120

gtaaacacat taactgagag aggagtggaa gtcgttaatg caactgaaac ggtggaacga    180

acaaacgttc ccaggatctg ctcaaaaggg aaaaggacag ttgacctcgg tcaatgtgga    240

cttctgggaa caatcactgg gccaccccaa tgtgaccaat tcctagaatt ttcggccgac    300

ttaattattg agaggcgaga aggaagtgat gtctgttatc ctgggaaatt cgtgaatgaa    360

gaagctctga ggcaaattct cagagagtca ggcggaattg acaaggagac aatgggattc    420

acctacagcg gaataagaac taatggaaca accagtgcat gtaggagatc aggatcttca    480

ttctatgcag agatgaaatg gctcctgtca aacacagaca atgctgcttt cccgcaaatg    540

actaagtcat acaagaacac aaggaaagac ccagctctga taatatgggg gatccaccat    600

tccggatcaa ctacagaaca gaccaagcta tatgggagtg gaaacaaact gataacagtt    660

gggagttcta attaccaaca gtcctttgta ccgagtccag gagcgagacc acaagtgaat    720

ggccaatctg gaagaattga ctttcattgg ctgatactaa accctaatga cacggtcact    780

ttcagtttca atggggcctt catagctcca gaccgtgcaa gctttctgag agggaagtcc    840

atgggaattc agagtgaagt acaggttgat gccaattgtg aaggagattg ctatcatagt    900

ggagggacaa taataagtaa tttgcccttt cagaacataa atagcagggc agtaggaaaa    960

tgtccgagat atgttaagca agagagtctg ctgttggcaa caggaatgaa gaatgttccc    1020

gaaatcccaa agaggaggag gagaggccta tttggtgcta tagcgggttt cattgaaaat    1080

ggatgggaag gtttgattga tgggtggtat ggcttcaggc atcaaaatgc acaaggggag    1140

ggaactgctg cagattacaa aagcacccaa tcagcaattg atcaaataac agggaaatta    1200

aatcggctta tagaaaaaac taaccaacag tttgagttaa tagacaacga attcactgag    1260

gttgaaaggc aaattggcaa tgtgataaac tggaccagag attccatgac agaagtgtgg    1320

tcctataacg ctgaactctt agtagcaatg gagaatcagc acacaattga tctggccgac    1380

tcagaaatga acaaactgta cgaacgagtg aagagacaac tgagagagaa tgccgaagaa    1440

gatggcactg gttgcttcga aatatttcac aagtgtgatg acgactgcat ggccagtatt    1500

agaaacaaca cctatgatca cagcaagtac agggaagaag caatacaaaa tagaatacag    1560

attgacccag tcaaactaag cagcggctac aaagatgtga tactttggtt tagcttcggg    1620

gcatcatgtt tcatacttct ggccattgca atgggccttg tcttcatatg tgtgaagaat    1680

ggaaacatgc ggtgcactat ttgtatataa gtttggaaaa acacccttgt ttctact       1737

<210>49

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>49

aaggtttgat tgatgggtgg t                                              21

<210>50

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>50

ctatttggtg ctatagcgg                                                 19

<210>51

<211>16

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>51

ttcccgaaat cccaaa                                                    16

<210>52

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>52

ttcaggcatc aaaatgcaca ag                                             22

<210>53

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>53

cagcaattga tcaaataaca gg                                             22

<210>54

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>54

cggcttatag aaaaaactaa cc                                             22

<210>55

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>55

accacccatc aatcaaacct tctatttggt gctatagcgg                          40

<210>56

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物[

<400>56

ttcaggcatc aaaatgcaca agcctgttat ttgatcaatt gctg                     44

<210>57

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>57

ggttagtttt ttctataagc cg                                             22

<210>58

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>58

cccatccatt ttcaatgaaa c                                              21

<210>59

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>59

actgctgcag attacaaaag                                                20

Claims (8)

1.寡核苷酸引物，其特征在于，根据选自以序列编号48表示的H7型禽流感病毒的血凝素碱基序列的1016位～1225位的碱基序列的任意碱基序列或与其互补的碱基序列设计。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸引物，其特征在于，包含选自以下的(a)～(c)的寡核苷酸：

(a)选自以序列编号49～54表示的碱基序列或与其互补的碱基序列的至少含有连续的15个碱基的寡核苷酸；

(b)可与前述(a)所述的寡核苷酸在严格条件下杂交的寡核苷酸；

(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中1个～数个的碱基被置换、缺失、插入或添加的碱基序列，具有引物功能的寡核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸引物，其特征在于，从H7型禽流感病毒的血凝素的目标核酸上的3′末端侧选择记作F3c、F2c、F1c的碱基序列区域，从5′末端侧选择记作B3、B2、B1的碱基序列区域，将各自的互补碱基序列记作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c时，由选自以下的(a)～(d)的碱基序列构成：

(a)在3′末端侧具有目标核酸的F2区域，在5′末端侧具有目标核酸的F1c区域的碱基序列；

(b)具有目标核酸的F3区域的碱基序列；

(c)在3′末端侧具有目标核酸的B2区域，在5′末端侧具有目标核酸的B1c区域的碱基序列；

(d)具有目标核酸的B3区域的碱基序列。

4.如权利要求1～3中任一项所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以扩增对H7型禽流感病毒特异性的碱基序列，从5′末端到3′末端，由选自以下的(a)～(b)的碱基序列构成：

(a)5′-(与序列编号49的碱基序列互补的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(序列编号50的碱基序列)-3′；

(b)5′-(序列编号52的碱基序列)-(碱基数0～50的任意的碱基序列)-(与序列编号53的碱基序列互补的碱基序列)-3′。

5.H7型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，使用权利要求1～4中任一项所述的寡核苷酸引物，进行H7型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应。

6.如权利要求5所述的H7型禽流感病毒的检测方法，其特征在于，H7型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增反应采用LAMP法。

7.流感的诊断方法，其特征在于，通过使用权利要求1～4中任一项所述的寡核苷酸引物，检测H7型禽流感病毒的目标核酸区域的扩增，诊断是否有H7型禽流感病毒的感染。

8.试剂盒，其特征在于，包含用于诊断流感的权利要求1～4中任一项所述的寡核苷酸引物。

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