WO2017051834A1 - ウイルス、細菌および寄生虫等の病原体の型または亜型等の遺伝子型別方法 - Google Patents

ウイルス、細菌および寄生虫等の病原体の型または亜型等の遺伝子型別方法 Download PDF

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WO2017051834A1
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seq
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塚本健司
村上裕信
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学校法人麻布獣医学園
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Definitions

  • the present invention relates to a determination method for accurately classifying various genes (RNA, DNA), and more specifically, a type of a pathogen such as a DNA virus or RNA virus, a bacterium, a parasite, or the like.
  • the present invention relates to a method for designing a primer used in a gene amplification method (or nucleic acid amplification method) relating to subtype determination, the primer, a genotyping method using the primer, and a kit for the determination.
  • Influenza virus is a zoonotic pathogen that causes serious respiratory symptoms in humans, livestock and poultry.
  • Avian influenza viruses belong to type A influenza viruses, and in the natural world, wild waterfowls exist as natural hosts. Infection with avian influenza viruses is generally asymptomatic even if waterfowl is infected, but when infected with chickens, they can be highly lethal. Countermeasures are indispensable. In general, it has been thought that avian influenza viruses do not infect humans. However, in 1997, the first human infection with a highly pathogenic H5N1 avian influenza virus was reported in Hong Kong, and it was revealed that human infections were caused by a bird influenza virus at a high rate.
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • HA is a protein necessary for the virus to bind to a receptor in the cell
  • NA is an enzyme that destroys the receptor
  • a progeny virus produced in the cell destroys the receptor and is released from the cell surface. It is a protein.
  • serology is classified into 16 types (H1 to H16) of HA and 9 types (N1 to N9) of NA.
  • influenza viruses are classified into many subtypes depending on the combination of HA and NA. Among these subtypes, infection of poultry with influenza A viruses of the H5 and H7 subtypes is an international target for slaughter. Moreover, it is known that human infection with these subtypes of viruses sometimes causes high mortality, and urgent measures are required.
  • avian influenza virus subtype As soon as possible and clarify whether it is a virus to be killed or highly likely to induce high lethality in humans Is to do. If these are confirmed, it will be possible to effectively prevent the spread of infection and the birth of a new virus by quick prevention measures.
  • Patent Document 1 the most reliable method for determining the HA subtype of avian influenza virus is the real-time PCR method (Patent Document 1). This method has the advantage that a wide variety of H5 or H7 subtype viruses can be detected without omission, and is widely used as an official method in Japan and overseas.
  • the real-time PCR method involves a complicated detection process and requires a trained technician and a dedicated high-priced device, the institutions that can perform the inspection are limited. Moreover, since the real-time PCR method requires 3 hours for detection, there is a problem in rapidity. For this reason, it is pointed out that the real-time PCR method is not suitable for rapid diagnosis of many specimens, and if many samples are brought in one after another, it cannot respond individually, increasing the risk of delaying diagnosis and spreading infection. Yes. In addition, in the primer / probe primer using the current mixed base used in the real-time PCR method, there is a possibility of detection failure even now, and if the gene diversity further expands in the future, detection failure will occur. The diagnosis is likely to be difficult.
  • the LAMP method (Patent Documents 2 and 3) has an advantage that it can be used in a general laboratory because the detection process is simple, the virus can be detected quickly (1 hour), and there is no special equipment. .
  • avian influenza as well, a method for detecting a limited virus with high sensitivity and speed has been reported (Patent Document 4 and Patent Document 5), but the reliability of the method is limited to the real-time PCR method. It doesn't reach.
  • the current LAMP method can detect a part of the virus population, it cannot be widely detected, and it has been pointed out that detection failures frequently occur.
  • the present invention is a primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus such as influenza virus, a bacterium, or a parasite by a gene amplification method (or a nucleic acid amplification method such as LAMP method or PCR method) It is an object of the present invention to provide a design method, a primer set, a method for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite using the primer set, and a kit for carrying out the method.
  • the inventors have identified all the HA genes of influenza viruses belonging to the H5 subtype, H7 subtype, etc. of influenza viruses, particularly the A5 viruses that are feared to be infected by humans in addition to the damage caused by infection of poultry in recent years.
  • a method for preparing a primer for gene amplification (or nucleic acid amplification) that can detect the NA gene without omission and reliably determine the subtype of any influenza virus was examined.
  • the present inventors have focused on a specific HA subtype (for example, H5 subtype) in the HA gene and the NA gene. All the HA genes belonging to the subtype population are divided into several groups (population or population) based on the base sequence, and primers capable of detecting the H5 subtype HA gene belonging to each group, The present invention has been completed by finding a method for designing the number as small as possible.
  • the population primer (P primer) is a primer concept shown for the first time according to the present invention, and is a primer designed to divide a gene population into populations composed of closely related genes and to design each population. If P primers designed for each population are mixed and used, various genes can be detected without omission. In the examples of the present invention, in order to prove this idea, a novel P primer design method was found and the usefulness of the P primer was examined.
  • the present invention includes the following (1) to (43).
  • (A) Sense sequences or antisense sequences of the gene to be examined are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and a region where highly homologous bases accumulate is selected as a forward primer setting region Process, (B) a step of determining a consensus sequence for the forward primer setting region; (C) Comparing the consensus sequence with the bases corresponding to the base sequence of the forward primer region of each test target gene, and the base sequence of the consensus sequence in the base sequence of the forward primer setting region of the test target gene Counting the number of different bases for each gene to be tested, (D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more, (E) re-aligning the base sequences of the forward primer setting region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence for the setting region; (F) Step (c), (d) and (e) are repeated until there is no test target gene to be extracted (2) The step (a) and / or
  • Single base X and / or a mixed base composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C at 80% or more of the bases corresponding to each sequence Selecting a continuous base sequence region containing Y and having a single base X and / or mixed base Y occupying 90% or more as a forward primer setting region;
  • the subtype is an influenza A virus H7 subtype, and SEQ ID NO: 362 and SEQ ID NO: 363
  • the set of forward primers according to (1) or (2) above which is a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 364 and SEQ ID NO: 365.
  • a set of reverse primers which are oligonucleotide primers for pathogen type or subtype determination, comprising a complementary sequence to the base sequence of the forward primer described in (1) or (2) above.
  • the above subtype (4) wherein the subtype is influenza A virus H7 subtype, and is a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 368 and SEQ ID NO: 369.
  • An oligonucleotide primer for determining the pathogen type or subtype by the LAMP method wherein the following steps (a) to (g) are performed and determined in steps (c) and (f): A pair of F2 region and F1 region consensus sequences, and a FIP primer comprising a base sequence having a base sequence of the F2 region on the 3 ′ end side and a complementary sequence of the base sequence of the F1 region on the 5 ′ end side set.
  • Sense sequences or antisense sequences of the gene to be tested are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are the same.
  • Single base X and / or a mixed base composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C at 80% or more of the bases corresponding to each sequence Selecting a continuous base sequence region composed of Y as the F2 region;
  • E a test target gene having 4 or more bases counted in the step (d), and a base having a counted number of 3 different from the base of the consensus sequence is in the F1 region or the F2 region (8) the presence of 40 to 60 bases between the 5 ′ terminal base of the F1 region and the 5 ′ terminal base of the F2 region, and / or
  • the FIP primer set according to (6) or (7) above, wherein the number of bases in the F1 region and F2 region is 10 to 25 bases.
  • the subtype is influenza A virus H5 subtype, and is any one of the primer sets shown in the following (a) to (c): (6) to (8) A set of FIP primers according to any one of the above.
  • A a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20,
  • B a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119 and SEQ ID NO: 156, or
  • the subtype is influenza A virus H7 subtype, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277, and SEQ ID NO: 281
  • the subtype is influenza A virus H7 subtype, characterized in that it is a set consisting of primers of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279 and SEQ ID NO: 280
  • An oligonucleotide primer for determining the pathogen type or subtype by the LAMP method wherein the following steps (a) to (f) are performed and determined in steps (b) and (e): A set of F3 primers consisting of a consensus sequence of the F3 region.
  • a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined wherein the base sequences existing 5 ′ upstream of the F2 region described in (6) or (7) above are aligned, and each sequence corresponds.
  • step (D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more, (E) re-aligning the base sequences of the F3 region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned F3 region; (F) Step (15) in which steps (c), (d) and (e) are repeated until there is no test target gene to be extracted (15)
  • the step (a) and / or step (d) is the following step The set of F3 primers according to (14) above, which is characterized.
  • a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined wherein the base sequences existing 5 ′ upstream of the F2 region described in (6) or (7) above are aligned, and each sequence corresponds. Bases at positions corresponding to each other, a single base X in which 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are identical, and / or 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences is A, A continuous base sequence comprising a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from T, G, and C, wherein the single base X and / or the mixed base Y accounts for 90% or more Selecting the region as the F3 region; (D) a step of extracting a gene to be examined whose number of bases counted in step (c) is 3 or more (16) an oligonucleotide primer for performing pathogen type or subtype determination by the LAMP method , The base sequences present on the 5 ′ upstream side of the F2 region according to (6)
  • A a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34
  • B a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 120
  • c a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 137 to SEQ ID NO: 138 (19) wherein the subtype is influenza
  • the virus H7 subtype which is a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, and SEQ ID NO: 266, according to any one of the above (14) to (17), F3 primer set.
  • An oligonucleotide primer for determining the pathogen type or subtype by the LAMP method comprising B3 comprising a complementary sequence of the base sequence of the F3 primer according to any one of (14) to (17) above A set of primers.
  • B3 comprising a complementary sequence of the base sequence of the F3 primer according to any one of (14) to (17) above A set of primers.
  • A a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92;
  • B a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 129, or
  • c a set comprising a primer of the base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 142 (22) wherein the subtype is A
  • the set of B3 primers according to (20) above which is a type influenza virus H7 subtype and is a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 267.
  • An oligonucleotide primer for determining the pathogen type or subtype by the LAMP method wherein the following steps (a) to (f) are performed and determined in steps (b) and (e): A set of FL primers consisting of consensus sequences for the FL region.
  • a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined wherein the base sequences existing between the F1 region and the F2 region described in (6) or (7) above are aligned, and each sequence corresponds.
  • step (D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more, (E) re-aligning the base sequences of the FL region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned FL region; (F) Step (24) in which steps (c), (d), and (e) are repeated until there is no test target gene to be extracted.
  • step (a) and / or step (d) is the following step The set of FL primers according to (23) above, which is characterized.
  • a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined wherein the base sequences existing between the F1 region and the F2 region described in (6) or (7) above are aligned, and each sequence corresponds. Bases at positions corresponding to each other, a single base X in which 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are identical, and / or 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences is A, A continuous base sequence comprising a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from T, G, and C, wherein the single base X and / or the mixed base Y accounts for 90% or more Selecting the region as the FL region; (D) a step of extracting a test target gene having 3 or more bases counted in the step (c) (25) an oligonucleotide primer for performing pathogen type or subtype determination by the LAMP method
  • the base sequence existing between the F1 region and the F2 region described in (6) or (7) above in the sense sequence or antis Base
  • a single base X in which 80% or more of the bases at corresponding positions between the sequences are the same, and / or 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are A, T, G, C A continuous base sequence region comprising a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from the above, wherein a single base X and / or mixed base Y accounts for 90% or more is defined as an F3 region -Option and were designed to cover the base sequences of the F3 region of all inspected gene, a set of FL primer consisting of a single or a plurality of mixed-base primer. (26) The FL primer set according to any one of (23) to (25) above, wherein the number of bases in the FL region is 10 to 25 bases.
  • the subtype is an influenza A virus H5 subtype and is any primer set shown in the following (a) to (c) A set of FL primers according to any one.
  • A a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45
  • B a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 121
  • SEQ ID NO: 141 a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 139 to SEQ ID NO: 141
  • a BL primer set comprising a complementary sequence of the base sequence of the FL primer according to any one of (23) to (26) above.
  • A a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 114
  • B a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 130
  • c a set comprising a primer of the base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 143 (31) wherein the subtype is A
  • the BL primer set according to (29) above which is a set of influenza virus H7 subtype and comprising a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 271 and SEQ ID NO: 272.
  • the gene origin of the pathogen in the sample A method for determining the type or subtype of a pathogen in a sample by performing a nucleic acid amplification reaction using the above nucleic acid as a template and analyzing the obtained amplified fragment.
  • the subtype is an influenza A virus H7 subtype, and the oligonucleotide primer set according to (3) and the oligonucleotide primer set according to (5) are used. 32).
  • a gene of a pathogen in a sample using the FIP primer set according to any of (6) to (10) and the BIP primer set according to any of (11) to (13) above A method of determining the type or subtype of a pathogen in a sample by performing a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method using a nucleic acid derived from the template as a template and analyzing the obtained amplified fragment.
  • the subtype is an influenza A virus H5 subtype, and the FIP primer set according to (9) and the BIP primer set according to (12) are used. 34).
  • the subtype is an influenza A virus H7 subtype, and the FIP primer set described in (10) and the BIP primer set described in (13) are used. 34).
  • the pathogen in the sample The method according to (34) above, wherein a nucleic acid amplification reaction by a LAMP method is performed using a gene-derived nucleic acid as a template, and the obtained amplified fragment is analyzed to determine the type or subtype of the pathogen in the sample.
  • the subtype is an influenza A virus H5 subtype, wherein the F3 primer set described in (18) and the B3 primer set described in (21) are further used, (35) The method described.
  • the subtype is an influenza A virus H7 subtype, wherein the F3 primer set described in (19) above and the B3 primer set described in (22) above are further used, (36) The method described. (40) The FL primer set according to any of (23) to (28) above and the BL primer set according to (29) or (31) above are further used to derive the pathogen gene in the sample.
  • the method according to (37) above wherein a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method is performed using a nucleic acid as a template, and the obtained amplified fragment is analyzed to determine the type or subtype of the pathogen in the sample.
  • the subtype is an influenza A virus H5 subtype, wherein the set of FL primers described in (27) and the set of BL primers described in (30) are further used, (38) The method described.
  • the subtype is an influenza A virus H7 subtype, and the FL primer set described in (28) above and the BL primer set described in (31) above are further used, The method according to (39).
  • the present invention makes it possible to design a set of primers for determining the type or subtype of a pathogen such as a desired virus, bacterium or parasite according to the classification criteria for each type or subtype. For example, by designing and using the primer set for each subtype of influenza virus hemagglutinin gene (HA gene) or neuraminidase gene (NA gene), a gene belonging to the subtype to be examined can be obtained. It is possible to determine quickly and easily without omission.
  • HA gene hemagglutinin gene
  • NA gene neuraminidase gene
  • a primer set according to the present invention in particular, a primer designed for the LAMP method, the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite to be tested can be quickly and easily obtained. It becomes possible to judge without omission.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for selecting a forward primer setting region (or F1, F2, F3, FL region) of the first embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a primer design process for the forward primer setting region (or F3, FL region) of the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating primer setting regions (“primer regions” in the figure) of the forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment, using the PCR method and the real-time PCR method as examples.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing a process of designing FIP primers in the FIP region (F1 region and F2 region).
  • F1c and B1c in the figure indicate the sequences (sequence regions) of the complementary strands of the sequences of F1 and B1, respectively.
  • sequence (B) is the figure (A) which showed typically the setting position of 16 PM16 primer sets for avian influenza virus H5 subtype determination, and the figure which showed the position on the gene (influenza virus V124 strain) arrangement
  • F1c and B1c in the figure indicate the sequences (sequence regions) of the complementary strands of the sequences of F1 and B1, respectively. It is the figure which showed the base appearance rate of each base in each primer setting area
  • FIG. 8 is a diagram in which the nucleotide sequences of the PCR template of 15 strains are aligned for the HA gene of the H5 subtype avian influenza virus used in this example.
  • FIG. 9 is a diagram showing primer numbers and combinations thereof used for base mismatch analysis in determination of avian influenza virus type H5.
  • FIG. 10 is a diagram showing primer numbers and base sequences used in base mismatch analysis in determination of avian influenza virus type H5.
  • Figure (A) schematically showing the setting positions of 17 PM17 primer sets for determination of avian influenza virus H7 subtype by lamp method and gene (A / duck / Tsukuba / 30/2007 (H7N7) strain as a standard) It is the figure which showed the position on the arrangement
  • the presence or absence of amplification when a synthetic gene of avian influenza virus H7 type HA is amplified by the ramp method using the PM17 primer set and the results of base mismatch analysis are shown.
  • the results of base mismatch analysis with a gene that is determined to be difficult to amplify when the avian influenza virus H7 type HA gene is amplified by the ramp method with the PM17 primer set are shown.
  • Figure (A) schematically showing the setting position of PM8 primer set for determination of avian influenza virus H7 subtype by real-time PCR method and gene (A / duck / Tsukuba / 30/2007 (H7N7) strain as a reference)
  • B shows the position on the array.
  • F1c and B1c in the figure indicate the sequences (sequence regions) of the complementary strands of the sequences of F1 and B1, respectively.
  • the result of amplifying a synthetic gene of avian influenza virus type H7 HA by real-time PCR using the H7-PM8 primer set is shown.
  • the presence or absence of amplification when a synthetic gene of avian influenza virus H7 type HA is amplified by real-time PCR using the H7-PM8 primer set and the results of base mismatch analysis are shown.
  • the result of amplifying a synthetic gene of avian influenza virus H7 type HA by real-time PCR using the H7-M3 primer set is shown.
  • A is the result using the primer (eu) for the Eurasian line
  • B is the result using the primer (am) for the North American line.
  • H7-M3 eu; Eurasian strain, am; North American strain
  • the result of the base mismatch analysis of the registered H7 subtype HA gene and each primer set is shown.
  • the number of each primer having each base mismatch number (shown in the leftmost column) was summarized.
  • the method of the present invention can be applied to genetically classified genes (for example, genes related to the pathogen type or subtype type of viruses, bacteria, parasites, etc., more specifically, the HA gene of influenza virus, NA gene etc.) can be used for each type. For example, it can be suitably carried out for HA subtype and NA subtype of influenza A virus, influenza B virus, and C virus, particularly H5 subtype and H7 subtype of influenza A virus.
  • the present invention uses a nucleic acid amplification method, for example, a nucleic acid amplification method called a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, etc., to determine the subtypes of pathogens such as viruses, bacteria, and parasites, particularly influenza viruses.
  • a nucleic acid amplification method for example, a nucleic acid amplification method called a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, etc.
  • a set of primers is provided.
  • the present invention is not limited to the LAMP method, and primers and probe primers widely used for genetic testing such as PCR method, real-time PCR method, and hybridization method (the primers disclosed in the embodiments of the present invention are also used as probe primers). Can be used for designing).
  • the primers disclosed in the embodiments of the present invention are also used as probe primers.
  • Can be used for designing when a gene is detected by the LAMP method, how many base mismatches (between the base sequence of the primer used and the base sequence of the primer binding region on the gene side to be amplified) are detected. In the case of up to (mismatch), the possibility of gene detection was examined for each primer region, and the results are shown in the examples (for details, refer to the examples).
  • the primer of the present invention is not limited to the HA and NA genes of avian influenza virus, but various genes of pathogens such as other viruses, bacteria, parasites, It can be understood that various genes such as genes belonging to the same gene family of the host can be applied when accurately typing by genetic testing such as LAMP method.
  • LAMP method 4 types of primers are designed for 6 regions of a target gene (gene to be examined) or 6 types of primers are designed for 8 regions, and a strand displacement type DNA polymerase is used. This is a method of amplifying a gene to be examined under constant temperature conditions (see Patent Document 1 and Patent Document 2).
  • the F3 region, the F2 region, and the F1 region are selected from the 5 ′ side of the sense sequence of the gene to be examined (the sense strand base sequence encoding the amino acid).
  • the B3 region, the B2 region, and the B1 region are selected from a set of at least two kinds of primers having the base sequences of these regions and the 5 ′ side of the antisense sequence of the gene to be amplified, and the base sequences of these regions A target region is amplified using a pair of at least two types of primers having In some cases, a primer (FL primer) having a base sequence of a complementary strand of the base sequence existing between the F1 region and the F2 region, and a base of a complementary strand of the base sequence existing between the B1 region and the B2 region
  • the LAMP method may be performed with six types of primers obtained by further adding a primer having a sequence (BL primer) to the above four types of primers.
  • the first embodiment of the present invention uses a gene amplification test (or nucleic acid amplification test) (for example, LAMP method, PCR method, real-time PCR method, etc.) and a nucleic acid detection method (DNA chip method, DNA hybridization method, etc.).
  • a gene amplification test for example, LAMP method, PCR method, real-time PCR method, etc.
  • a nucleic acid detection method DNA chip method, DNA hybridization method, etc.
  • an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a gene (RNA or DNA) of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite in a sample, and performing the following steps (a) to (f): It is a set of forward primers comprising a consensus sequence of the forward primer setting region determined in (b) and (e).
  • A Sense sequences or antisense sequences of genes to be tested are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and a region having high homology between the genes to be tested is a forward primer setting region
  • the “sample” in the present specification refers to a living organism or excrement of an animal (human or non-human animal) that may be infected with a virus, such as an influenza virus, or a pathogen such as a bacterium or a parasite.
  • a virus such as an influenza virus, or a pathogen such as a bacterium or a parasite.
  • a blood sample, a tissue sample More specifically, sputum, nasal discharge, blood, saliva, serum, plasma, excretion (urine, stool, etc.)
  • a liquid for example, a gargle liquid, a nasal cavity washing liquid, and the like
  • a liquid for example, a gargle liquid, a nasal cavity washing liquid, and the like
  • test target gene refers to all hemagglutinin genes belonging to the H5 subtype of influenza virus when determining whether the virus in the sample belongs to, for example, the HA5 subtype of influenza virus. It is. That is, it is a gene that serves as a classification standard for a virus type or subtype to which a virus in a sample is expected to belong, and is all genes belonging to the type or subtype.
  • the “test target gene” is not particularly limited. For example, all hemagglutinin genes (HA genes) belonging to any HA subtype or NA subtype of influenza viruses of type A, type B, and type C Or a neuraminidase gene (NA gene) etc. can be illustrated.
  • the sense sequence refers to a gene sequence of a chain registered as a translation frame in a database or the like
  • the antisense sequence refers to a base sequence of a complementary strand of the sense sequence.
  • the base sequence information of the gene to be examined can be obtained from a known database or paper.
  • the virus to be tested is an influenza virus of type A, B or C
  • the base sequence information of the neuraminidase gene of all viruses belonging to the type can be obtained from a database (for example, Influenza Sequence Database (http://www.flu.lanl.gov) etc.) or a paper.
  • Step (a) of the first embodiment of the present invention is a step of performing alignment between sense sequences or antisense sequences of a gene to be examined and selecting a region where highly homologous bases are accumulated as a forward primer setting region. It is.
  • alignment aligning a plurality of base sequences
  • published alignment software for example, CLUSTAW (http://www.ddbj.nig.ac.jp/) etc.
  • commercially available software for example, Etc., etc. may be used. Note that a gap may be included when the alignment is performed.
  • the length of the sequence of the forward primer setting region may be any length that is usually provided by the primer used when amplifying a nucleic acid by the LAMP method or PCR method, and considers the GC content contained in the selected region. To decide.
  • the length of the base sequence of the forward primer setting region is not particularly limited, but may be, for example, about 10 to 25 bases, preferably about 15 to 20 bases.
  • the “region having high homology” is not particularly limited.
  • “sense sequences or antisense sequences of the gene to be examined are aligned, and bases at corresponding positions between the sequences are aligned.
  • a single base X in which 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are the same, and / or 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are A, T, G, C “A continuous base sequence region comprising a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from among the single base X and / or mixed base Y occupying 90% or more” Can do.
  • the “region having high homology” in the step (a) is, for example, aligning sense sequences or antisense sequences of the gene to be examined, comparing bases at corresponding positions between the sequences, In the single base X in which 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 98% or more of the bases at the corresponding positions are the same, and / or a single base has a low appearance rate, the top two types (In some cases, the top three types) are composed of mixed bases Y having a sum of the appearance rates of bases of 80% or higher, preferably 90% or higher, more preferably 98% or higher. This is a region where about 10 to 30 bases are 100% continuous.
  • mixed base notation is based on IUPAC notation.
  • the “region having high homology” can be selected as the forward primer setting region. Note that “regions having high homology” in the F1, F2, F3, and FL regions described later can be selected in the same manner.
  • Step (b) of the first embodiment of the present invention is a step of aligning the base sequences of the forward primer setting regions of each test target gene and determining the aligned forward primer setting region consensus sequence.
  • the consensus sequence is a sequence composed of bases having the highest appearance rate at each base position by aligning the genes to be tested constituting the population. Specifically, the consensus sequence is obtained by determining the appearance rates of four types of bases at all base positions in the aligned sequences and arranging only the bases having the highest base appearance rate in order. The appearance rate of each base constituting the consensus sequence is indicated by “number of test target genes having the same base as the base of the consensus sequence / number of all test target genes constituting the population (%)”.
  • the base appearance rate is high, it is determined that the preservability is high, and if it is low, it is determined that the preservability is low.
  • the consensus sequence is different when the test target gene constituting the population is changed, the base sequence of the primer designed based on the consensus sequence is also different.
  • the consensus sequence determined in the step (b) is compared with the bases at corresponding positions in the base sequence of the forward primer setting region of each test target gene. This is a step of counting the number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the gene forward primer setting region for each gene to be examined. This will be described with reference to FIG. 2A. For example, in the region of gene 8, since the third base from the left (from the 5 ′ side) is different from the base of the consensus sequence, the number of bases different from the base of the consensus sequence is “1”.
  • the number of bases different from the bases of the consensus sequence is “3”.
  • “the number of bases different from the bases of the consensus sequence” is described as “the number of base mismatches” (hereinafter the same).
  • Step (d) of the first embodiment of the present invention is a step of extracting a gene to be tested whose number of bases counted in step (c) is a certain number or more.
  • the “certain number” is a limit value of the number of base mismatches that is determined to be incapable of gene amplification by an oligonucleotide primer comprising a consensus sequence, and also depends on the length of the primer used and the G and C contents. It is a different numerical value and can be easily determined by a person skilled in the art through preliminary experiments or the like.
  • the limit value of base mismatch can be determined as follows, with the forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment described later as one set. First, one test target gene is selected from the test target genes. Using this as a template, a certain number of base mismatches (for example, 20) are added to the forward primer region determined in step (a) and the reverse primer region determined in step (a) of the second embodiment. Various primers are introduced in which about 0 to 3 primers are introduced per base primer. For various pairs of these primers, the possibility of gene amplification by PCR or the like is examined. This makes it possible to clarify the upper limit of the number of base mismatches that can allow gene amplification per primer or primer pair that allows amplification.
  • step (e) of the first embodiment of the present invention the base sequences in the forward primer setting region of the gene to be examined extracted in step (d) are realigned, and a new consensus sequence is added to the aligned forward primer setting region. Is a step of determining (FIG. 2B). In step (f), step (c), step (d) and step (e) are performed based on the new consensus sequence determined in step (e). These steps (c) to (e) are repeated until there are no genes to be examined.
  • FIG. 2C the gene to be examined extracted the second time is only gene 19 (therefore, the consensus sequence at this stage is the base sequence of gene 19), and there is no gene to be extracted. All sequences will be determined.
  • the sequence from the 5 ′ side to the 3 ′ side of the consensus sequence of the determined forward primer setting region is determined as the forward primer sequence.
  • the “forward primer set” may be a set of mixed base primers including a mixed base so as to cover the entire base sequence of the determined forward primer. In this case, the number of mixed bases is desirably 5 or less per 20-base primer.
  • the “set” in each embodiment refers to the consensus sequence determined first and the consensus sequence obtained in the subsequent repeating steps (for example, in the first embodiment, the steps (b) and (c) to ( It is a group of primers composed of the step (e) consensus sequence obtained by repeating e) (the same applies to other embodiments).
  • 1st Embodiment of this invention is a forward primer determined through said process.
  • the forward primer set of the present embodiment is not limited, but, for example, SEQ ID NOs: 362 to 362 that can be used to determine whether or not the virus contained in the sample to be examined is influenza A virus H7 subtype.
  • a group of primers consisting of the sequence represented by 365 can be exemplified.
  • the second embodiment of the present invention is a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence of the forward primer of the first embodiment.
  • the forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment can be used as a set for the nucleic acid amplification method.
  • the forward primer setting region selected in the first embodiment and the reverse primer setting region selected in the second embodiment have the forward primer setting region of the first embodiment on the 5 ′ side across the region to be amplified.
  • the reverse primer setting region of the second embodiment needs to be selected on the 3 ′ side.
  • the primer setting region (“primer region” in the figure) of the forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment is illustrated in FIG. thing.
  • the “forward primer setting region” described in the first embodiment is read as “reverse primer setting region”. That is, in the second embodiment of the present invention, gene amplification test (or nucleic acid amplification test) (for example, LAMP method, PCR method, real-time PCR method, etc.) and nucleic acid detection method (DNA chip method, DNA hybridization method, etc.) Is a oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a gene (RNA or DNA) of a pathogen such as a virus, bacteria, parasite, etc.
  • gene amplification test for example, LAMP method, PCR method, real-time PCR method, etc.
  • nucleic acid detection method DNA chip method, DNA hybridization method, etc.
  • a reverse primer set consisting of a sequence complementary to the consensus sequence of the reverse primer setting region determined in steps (b) and (e).
  • a reverse primer set consisting of a sequence complementary to the consensus sequence of the reverse primer setting region determined in steps (b) and (e).
  • a reverse primer set consisting of a sequence complementary to the consensus sequence of the reverse primer setting region determined in steps (b) and (e).
  • A) Sense sequences of test target genes or antisense sequences are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and regions having high homology between the test target genes are reverse primer setting regions Process to choose as, (B) a step of determining a consensus sequence for the reverse primer setting region;
  • C Comparing the consensus sequence with the bases corresponding to the base sequence of the reverse primer region of each test target gene, and among the base sequences of the reverse primer setting region of the test target gene, what is the base of the consensus sequence?
  • the “reverse primer set” may be a set of mixed base primers including a mixed base so as to cover the entire base sequence of the determined reverse primer.
  • the number of mixed bases is desirably 5 or less per 20-base primer.
  • the second embodiment of the present invention is a reverse primer determined through the above steps.
  • the set of reverse primers of the present embodiment is not limited, but, for example, SEQ ID NO: 367 can be used when determining whether the virus contained in the sample to be tested is influenza A virus H7 subtype.
  • a group of primers comprising the sequence represented by 369 can be exemplified.
  • the first embodiment of the present invention can also be used for the production of probe primers used in the real-time PCR method. That is, the “oligonucleotide primer” and the “forward primer” in the first embodiment or the “reverse primer” in the second embodiment are replaced with the “probe primer” to be used in the real-time PCR method. Probe primers can be prepared.
  • a third embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite in a sample using the LAMP method, and comprises the following (a): Steps (g) to (g) are performed, a pair of F2 region and F1 region consensus sequences determined in steps (c) and (f) is selected, and the base sequence of the F2 region is placed on the 3 ′ end side, and the F1 region It is a set of FIP primers consisting of a base sequence having a complementary sequence of the base sequence on the 5 ′ end side.
  • the third embodiment of the present invention relates to a set of FIP primers that are oligonucleotide primers for determining the type or subtype of pathogens such as viruses, bacteria, and parasites by the LAMP method.
  • the step (a) of the third embodiment is a step of aligning sense sequences or antisense sequences of the gene to be examined and selecting a region having high homology as the F2 region.
  • the length of the sequence of the F2 region The length may be any length that is usually provided by a primer used when amplifying a nucleic acid by the LAMP method, and may be determined in consideration of the GC content contained in the selected region.
  • the length of the F2 region sequence is not particularly limited, but may be, for example, about 10 to 25 bases, and preferably about 15 to 20 bases.
  • the “region having high homology” in the step (a) of the third embodiment is not particularly limited.
  • the bases at the corresponding positions are compared with each other, and a single base X in which 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are the same and / or 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences.
  • a continuous base sequence region composed of a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from A, T, G, and C ” can be exemplified.
  • FIG. 1 schematically shows a flow of selecting the “region having high homology” exemplified above as the F2 region.
  • F2 region (and F1 region (described later)) is a single base X satisfying the condition that the base appearance rate is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 98% or more at all corresponding base positions, And / or the appearance rate of a single base is low, but the sum of the appearance rates of the top two types (in some cases, the top three types) of bases is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 98% or more Is a region composed of about 10 to 30 bases.
  • the F2 region can be selected.
  • the F2 region in the step of selecting the F1 region, a region 3 ′ downstream from the 3 ′ end of the F2 region selected in the step (a), the F2 region In this step, a region that satisfies the same requirements as the region is selected as the F1 region.
  • the distance from the 3 ′ end of the F2 region to the 5 ′ end of the F1 region is not particularly limited.
  • the length of the sequence of the F1 region may be determined in consideration of the GC content contained in the selected region, as in the F2 region, and is, for example, about 10 to 25 bases, preferably about 15 to 20 bases. .
  • the F1 area needs to satisfy the requirements to be satisfied when the F2 area is selected. That is, in addition to the requirement that the F1 region is a region 3 ′ downstream from the 3 ′ end of the F2 region, “the sense sequences or the antisense sequences of the gene to be tested are aligned, and each sequence corresponds.
  • region having high homology is, for example, without limitation, “alignment between sense sequences or antisense sequences of the gene to be examined and comparison of bases at corresponding positions between the sequences.
  • a single base X in which 80% or more of bases at corresponding positions between sequences are the same, and / or 80% or more of bases at corresponding positions between sequences in A, T, G, or C.
  • a continuous base sequence region composed of a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from
  • step (c) of the third embodiment of the present invention the F1 region base sequences and the F2 region base sequences of each test target gene are aligned, and the aligned F1 region base sequence and F2 region base sequence are aligned.
  • step (b) of the first embodiment a step of determining a consensus sequence of each region (see the explanation of step (b) of the first embodiment) and selecting it as a pair.
  • “select as a pair” means that the consensus sequence of the F1 region and the consensus sequence of the F2 region determined in the step (c) are selected as one set of consensus sequences, and the F1 region and the F2 region of the one set are selected. This is because the base sequence is finally used as the base sequence of the FIP primer.
  • the F1 region consensus sequence and the F1 region base sequence of each test target gene, and the F2 region consensus sequence and the F2 region base sequence of each test target gene are compared with each other, and the number of bases different from the bases of the consensus sequence contained in the base sequences of the F1 region and F2 region is counted for each sense sequence of the gene to be examined.
  • “the number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequences of the F1 region and F2 region” means the number of bases different from the bases of the consensus sequence in the F1 region, and the bases of the consensus sequence in the F2 region. This is the total number of different bases. This will be described with reference to FIG.
  • the number of bases different from the bases of the consensus sequence is “ 3 ”, and in the F1 region, the number of bases different from the bases of the consensus sequence is“ 0 ”.
  • the number of bases different from the base of the consensus sequence is “1”, and in the F1 region, the sixth from the left, Since the 12th base is different from the base of the consensus sequence, the number of bases different from the base of the consensus sequence is “2”.
  • Step (e) of the third embodiment of the present invention is a step of extracting a gene to be examined whose number of bases counted in step (d) is a certain number or more.
  • the “certain number” is a limit value of the number of base mismatches that is determined to be incapable of gene amplification by an oligonucleotide primer comprising a consensus sequence, and also depends on the length of the primer used and the G and C contents. It is a different number.
  • the limit of the number of base mismatches that allow gene amplification can be determined by using the LAMP method to determine whether or not a single target gene can be amplified using various primer sets in combination with primers introduced with base mismatches. Can be revealed.
  • the primers used are six primers whose base sequences are completely identical to the target gene, and mutation primers designed so that a certain number of base mismatches occur with respect to the target gene.
  • the FIP primer according to the third embodiment and the BIP primer according to the fourth embodiment described later are considered to play the same role in amplification even if the positions are opposite to each other.
  • the F3 primer of the fifth embodiment described later and the B3 primer of the sixth embodiment described later, the FL primer of the seventh embodiment described later, and the BL primer of the eighth embodiment described later are also genes.
  • the role played in amplification is thought to be the same.
  • the limit of the number of base mismatches can be determined as follows. First, the F1 and F2 regions selected in the third embodiment, the B1 and B2 regions selected in the fourth embodiment, the F3 region selected in the fifth embodiment, and the sixth embodiment selected.
  • a set consisting of a primer in which a certain number of bases different from the base sequence of the gene to be examined (for example, about 0 to 3 bases per 20 bases) are introduced into the base sequence of the primer determined here is prepared. To do. At this time, based on the fact that FIP and BIP, F3 and B3, FL and BL are symmetrical, the number of base mismatches per primer region is made symmetrical so that a reproducible conclusion can be obtained. Using the combined primer set, the amplification of the gene to be examined by the LAMP method is examined.
  • the “fixed number”, that is, the limit value of the number of base mismatches per primer region is considered to be the same in any region in principle. However, since FIP and BIP are about twice as long as F3, B3, FL, and BL, the number of base mismatches per primer is doubled. , Defined as the number of base mismatches per primer region.
  • the total number of base mismatches and the base mismatches are biased to either the F1 (B1) region or the F2 (B2) region. It is also important to take care not to. Alternatively, it is difficult to amplify a gene when there is a base mismatch in each region and when there is a base mismatch in some regions. Therefore, it is necessary to estimate amplification comprehensively based on the total number of base mismatches in the eight regions.
  • the limit value of the number of base mismatches per primer region and the total number of mismatches of all the primer regions can be clarified by experiments.
  • various primer combinations can be studied based on the symmetry, and the limit value of the number of base mismatches can be clarified.
  • step (e) the test target gene whose number of bases counted in step (d) is 4 or more and the number of bases counted is 3, which is either the F1 region or the F2 region
  • the number of bases different from the consensus sequence is “2” in the F2 region and “2” in the F1 region, so that “the consensus sequence included in the base sequences of the F1 region and other F2 regions”
  • the number of bases different from the base is “4”. Therefore, the F1 region and F2 region of the gene 14 are to be extracted in the step (e).
  • the number of bases different from the consensus sequence is “3”, and the F1 region is “0”, so that it is included in the base sequences of the “F1 region and other F2 regions”.
  • the “number of bases different from the bases of the consensus sequence” is “3”.
  • the F1 region and F2 region of the gene 11 are also extracted in the step (e).
  • the number of bases different from the consensus sequence is “1”, and the F1 region is “2”, so the “F1 region and other F2 region bases”
  • the “number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the sequence” is “3”.
  • the F1 region and F2 region of the gene 12 are not subject to extraction (see FIG. 4A).
  • step (f) of the third embodiment of the present invention the F1 region base sequences of the F1 region and the F2 region base sequences of the gene to be examined extracted in step (e) are aligned again, and the aligned F1 region bases are aligned.
  • This is a step of determining a new consensus sequence of each region from the sequence and the base sequence of the F2 region and selecting them as a pair. Then, in the step (g), based on the new consensus sequence determined in the step (f), the steps (d), (e) and (f) are carried out until there is no test target gene to be extracted. Steps (d) to (f) are repeated.
  • the “FIP primer set” may be a set of mixed base primers including a mixed base so as to cover the entire base sequence of the determined FIP primer. In this case, the number of mixed bases is desirably 5 or less per 20-base primer.
  • the third embodiment of the present invention is a set of FIP primers determined through the above steps.
  • sequence number 1 which can be used when determining whether the virus contained in the test object sample is influenza A virus H5 subtype
  • sequence number 1 which can be used when determining whether the virus contained in the test object sample is influenza A virus H5 subtype
  • sequence number 1 which can be used when determining whether the virus contained in the test object sample is influenza A virus H5 subtype
  • sequence number 1 which can be used when determining whether the virus contained in the test object sample is influenza A virus H5 subtype
  • sequence number 1 which can be used when determining whether the virus contained in the test object sample is influenza A virus H5 subtype
  • SEQ ID NO: 20 for Eurasian strain of H5 subtype
  • SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119 and SEQ ID NO: 156 for Eurasian strain of H5 subtype and American strain
  • SEQ ID NOs: 131 to 133 for H5 subtype American strain
  • the fourth embodiment of the present invention is a BIP primer comprising a complementary sequence of the base sequence of the FIP primer of the third embodiment.
  • the FIP primer of the third embodiment and the BIP primer of the fourth embodiment can be used as a pair (that is, as a forward primer and a reverse primer) and used for nucleic acid amplification by the LAMP method.
  • the F2 region selected in the third embodiment and the B2 region selected in the fourth embodiment sandwich the region to be amplified, and the F2 region of the third embodiment is on the 3 ′ side across the region to be amplified.
  • the B2 area of the fourth embodiment needs to be set. For details, see FIG. 5 or 6A.
  • “FIP”, “F1” and “F2” described in the third embodiment are respectively It shall be read as “BIP”, “B1” and “B2”.
  • the fourth embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite in a sample using the LAMP method, Steps a) to (g) are performed, a pair of consensus sequences of the B2 region and B1 region determined in steps (c) and (f) is selected, and the base sequence of the B2 region is set to the B ′ It is a set of BIP primers comprising a complementary sequence of a base sequence having a sequence complementary to the base sequence of the region on the 5 ′ end side.
  • step (D) The consensus sequence of the B1 region and the bases at the corresponding positions in the base sequence of the B1 region of each test target gene, and the bases at the corresponding positions of the B2 region consensus sequence and the base sequence of the B2 region of each test target gene And the number of bases that are included in the base sequences of the B1 region and B2 region of each gene to be examined and that are different from the bases of the consensus sequence of each region are different from the base sequences of the consensus of each region, A process of counting for each gene to be tested, (E) extracting a test target gene whose base number counted in step (d) is a certain number or more, (F) The B1 region base sequences and the B2 region base sequences of the gene to be examined extracted in step (e) are realigned, and the aligned B1 region base sequence and B2 region base sequence are respectively Determining new consensus sequences for the region of and selecting them as a pair; (G) Step of repeating steps (d), (e), and
  • the set of BIP primers of the fourth embodiment of the present invention is not limited.
  • a population of primers consisting of sequences represented by SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 82 (for Eurasian strain of H5 subtype), SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128 and SEQ ID NO: 157 (H5 subtype Eurasian strain and A group of primers consisting of the sequences represented by SEQ ID NOs: 134 to 136 (for the American strain of H5 subtype) can be exemplified as a set of BIP primers.
  • a fifth embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacterium or parasite by the LAMP method, and comprises the following (a) to (f): It is a set of F3 primers comprising the consensus sequence of the F3 region determined in steps (b) and (e). (A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein base sequences existing 5 ′ upstream of the F2 region in the third embodiment are aligned, and bases at corresponding positions between the sequences are aligned.
  • the F3 region a region having high homology between the genes to be examined, (B) aligning the base sequences of the F3 region of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned F3 region; (C) The number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the F3 region of the test target gene by comparing the bases at the corresponding positions of the base sequence of the F3 region of each test target gene with the consensus sequence For each gene to be tested, (D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more, (E) re-aligning the base sequences of the F3 region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned F3 region; (F) A step of repeating steps (c), (d) and (e) until there is no test target gene to be extracted.
  • the length of the sequence of the F3 region may be any length that is usually provided by primers used when amplifying nucleic acids by the LAMP method or PCR method, and is determined in consideration of the GC content contained in the selected region. do it.
  • the length of the F3 region sequence is not particularly limited, but may be, for example, about 10 to 25 bases, preferably about 15 to 20 bases.
  • the F3 region is selected as a region existing on the 5 ′ side from the 5 ′ end of the F2 region in the third embodiment. For example, about 0 to 60 bases, preferably about 5 to 40 bases, more preferably about 10 to 25 bases are present between the 5 ′ terminal base of the F2 region and the 3 ′ terminal base of the F3 region. Good.
  • Step (a) of the fifth embodiment of the present invention is a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, and aligns base sequences existing 5 ′ upstream of the F2 region in the third embodiment. Then, the bases at corresponding positions between the sequences are compared, and a region having high homology between the genes to be examined is selected as the F3 region.
  • the “region having high homology” is not particularly limited. For example, “a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, which is upstream of the F2 region in the third embodiment”.
  • FIG. 1 schematically shows a method of selecting the “region having high homology” exemplified above as the F3 region. For a detailed explanation, see the explanation part of the step (a) of the first embodiment.
  • step (b) of the fifth embodiment of the present invention the F3 regions are aligned with each other, and a consensus sequence is obtained from the aligned F3 regions (see the explanation of the step (b) of the first embodiment). It is a step of determining.
  • step (c) of the fifth embodiment of the present invention the bases in the F3 region of the test target gene are compared by comparing the consensus sequence of the F3 region with the bases at the corresponding positions in the base sequence of the F3 region of each test target gene. In this step, the number of bases different from the bases of the consensus sequence is counted for each gene to be examined. For the “number of bases different from the consensus sequence”, refer to the explanation of step (c) in the first embodiment.
  • Step (d) of the fifth embodiment of the present invention is a step of extracting a test target gene whose number of bases counted in step (c) is a certain number or more.
  • the “certain number” is a limit value of the number of base mismatches that is determined to be incapable of gene amplification by an oligonucleotide primer comprising a consensus sequence, and also depends on the length of the primer used and the G and C contents. It is a different numerical value and can be easily determined by a person skilled in the art through preliminary experiments or the like.
  • the limit value of the base mismatch is a pair of the FIP primer of the third embodiment and the BIP primer of the fourth embodiment, a pair of the F3 primer of the fifth embodiment and the B3 primer of the sixth embodiment described later, and necessary.
  • a pair of a FL primer according to the seventh embodiment described later and a BL primer according to the eighth embodiment described later can be obtained as one set as follows. First, the F1 and F2 regions selected in the third embodiment, the B1 and B2 regions selected in the fourth embodiment, the F3 region selected in the fifth embodiment, and the sixth embodiment selected. Primer sequences that bind to the B3 region, the FL region selected in the seventh embodiment, and the BL region selected in the eighth embodiment are determined.
  • a primer pair in which a fixed number of mutations (for example, about 0 to 5 or 0 to 3 mutations per 20 bases) are introduced into the base sequence of the primer determined here that is, a pair of FIP primer and BIP primer) , F3 primer and B3 primer pair, FL primer and BL primer pair), each designed in pairs, from FIP primer and BIP primer pair, F3 primer and B3 primer pair, FL primer and BL primer pair
  • FIP primer and BIP primer F3 primer and B3 primer pair
  • FL primer and BL primer pair FL primer and BL primer pair
  • the number of mutations contained in each region of the primer set that could be amplified and the number of mutations contained in each region of the primer set that could not be amplified were examined. Based on the number of base mismatches, such as whether gene amplification occurs, how many base mismatches are in total for each primer region, and whether there are primer regions that are susceptible to base mismatches. A limit value can be determined. Examples of the present specification, “(I) Determination method of avian influenza virus H5 subtype”, “7. Effect of base mismatch on gene amplification” in materials and experimental methods , “8. Base mismatch analysis”, and See also “5. Effect of base mismatch on gene amplification” and “6.
  • the “certain number”, that is, the limit of base mismatch varies depending on the gene to be examined.
  • the gene to be examined is an HA gene belonging to any HA5 subtype of avian influenza virus, for example, 1 to 5 , Preferably an integer of 2 to 4, more preferably 3.
  • the extracted genes are the gene 11, the gene 19, and the gene 20 (FIG. 2B).
  • the base sequences of the F3 region of the gene to be examined extracted in the step (d) are aligned again, and a new consensus sequence of the aligned F3 region is determined.
  • FIG. 2B the steps (c), (d) and (e) are performed, and until there is no test target gene to be extracted, Repeat steps (c) to (e).
  • the gene to be examined extracted the second time is only gene 19 (therefore, the consensus sequence at this stage is the base sequence of the F3 region of gene 19), and there is no gene to be extracted. All consensus sequences will be determined.
  • the sequence from the 5 ′ side to the 3 ′ side of the determined consensus sequence of the F3 region is determined as the sequence of the F3 primer.
  • the F3 primer according to the fifth embodiment of the present invention does not perform the steps (b) to (e) or the steps (b) to (e) for the F3 region determined by the step (a).
  • the mixed base primer containing the mixed base so as to cover the base sequence of the F3 region of the sense sequence of all the test target genes (including the base sequence of the F3 region of the sense sequence of all the test target genes) It is good also as F3 primer.
  • the number of mixed bases is desirably 5 or less per 20 base primer.
  • F3 primer of the 5th Embodiment of this invention
  • it uses when determining whether the virus contained in the sample to be examined is influenza A virus type H5
  • a group of primers consisting of the sequences represented by SEQ ID NOs: 137 and 138 for H5 subtype American strains
  • the sixth embodiment of the present invention is a B3 primer comprising a sequence complementary to the base sequence of the F3 primer of the fifth embodiment.
  • the F3 primer of the fifth embodiment and the B3 primer of the sixth embodiment can be used as a pair (that is, as a forward primer and a reverse primer) and used for nucleic acid amplification by the LAMP method.
  • the F3 region selected in the fifth embodiment and the B3 region selected in the sixth embodiment have the F3 region of the fifth embodiment on the 3 ′ side on the 5 ′ side across the region to be amplified.
  • the B3 area of the sixth embodiment needs to be set. For details, see FIG. 5 or 6A.
  • the sixth embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of pathogens such as viruses, bacteria, and parasites by the LAMP method, and includes the following (a) to (f) ) And a B3 primer set consisting of a complementary sequence of the consensus sequence of the B3 region determined in steps (b) and (e).
  • (A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein base sequences existing on the 5 ′ upstream side of the B2 region in the fourth embodiment are aligned, and bases at corresponding positions between the sequences are aligned.
  • the step (d) of the fifth embodiment See the explanation.
  • the B3 primer may be a mixed base primer containing a mixed base, similarly to the F3 primer.
  • the number of mixed bases is desirably 5 or less per 20-base primer.
  • B3 primer of the 6th Embodiment of this invention it is determined whether the influenza virus contained in the sample to be examined is HA5 subtype of influenza A virus.
  • SEQ ID NO: 129 for Eurasian strains of H5 subtype and American strains
  • a group of primers composed of sequences and a group of primers composed of sequences represented by SEQ ID NO: 142 (for American strain of H5 subtype) can be exemplified as a set of B3 primers.
  • a seventh embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacterium or parasite by the LAMP method, and comprises the following (a) to (f) This is a set of FL primers comprising the consensus sequence of the FL region determined in steps (b) and (e).
  • a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined wherein the base sequences existing between the F1 region and the F2 region in the third embodiment are aligned, and the bases at corresponding positions between the sequences And selecting a region having high homology between the genes to be examined as an FL region, (B) aligning the base sequences of the FL region of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned FL region; (C) The number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the FL region of the test target gene by comparing the bases at the corresponding positions of the base sequence of the FL region of each test target gene with the consensus sequence For each gene to be tested, (D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more, (E) re-aligning the base sequences of the FL region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned FL region; (F) A step of
  • the sequence length of the FL region may be any length that is usually provided by primers used when amplifying nucleic acids by the LAMP method or PCR method, and is determined in consideration of the GC content contained in the selected region. do it.
  • the length of the F3 region sequence is not particularly limited, but may be, for example, about 10 to 25 bases, preferably about 15 to 20 bases.
  • the FL region is selected between the F1 region and the F2 region.
  • the distance between the FL region and the F1 region or F2 region is not particularly limited.
  • Step (a) of the seventh embodiment of the present invention is a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, and aligns base sequences present between the F1 region and the F2 region in the third embodiment. Then, the bases at corresponding positions between the sequences are compared, and a region having high homology between the genes to be examined is selected as the F3 region.
  • the “region having high homology” is not particularly limited.
  • a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined which is between the F1 region and the F2 region in the third embodiment.
  • FIG. 1 schematically shows a method of selecting the “region having high homology” exemplified above as the FL region. For a detailed explanation, see the explanation part of the step (a) of the first embodiment.
  • the FL regions are aligned with each other, and a consensus sequence is obtained from each aligned FL region (see the explanation of the step (b) of the first embodiment). It is a step of determining.
  • the consensus sequence of the FL region is compared with the bases at the corresponding positions in the base sequence of the FL region of each test target gene, and the base of the FL region of the test target gene is compared.
  • the number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the sequence is counted for each gene to be examined. For the “number of bases different from the consensus sequence”, refer to the explanation of step (c) in the first embodiment.
  • Step (d) of the seventh embodiment of the present invention is a step of extracting a gene to be tested whose number of bases counted in step (c) is a certain number or more.
  • the “certain number” is a limit value of the number of base mismatches that is determined to be incapable of gene amplification by an oligonucleotide primer comprising a consensus sequence, and also depends on the length of the primer used and the G and C contents. It is a different numerical value and can be easily determined by a person skilled in the art through preliminary experiments or the like.
  • the limit value of the base mismatch is the pair of the FIP primer of the third embodiment and the BIP primer of the fourth embodiment, the pair of the F3 primer of the fifth embodiment and the B3 primer of the sixth embodiment, the seventh A pair of the FL primer of the embodiment and the BL primer of the eighth embodiment to be described later can be obtained as follows, taking one set. First, the F1 and F2 regions selected in the third embodiment, the B1 and B2 regions selected in the fourth embodiment, the F3 region selected in the fifth embodiment, and the sixth embodiment selected. Primer sequences that bind to the B3 region, the FL region selected in the seventh embodiment, and the BL region selected in the eighth embodiment are determined.
  • a primer pair in which a fixed number of mutations (for example, about 0 to 5 or 0 to 3 mutations per 20 bases) are introduced into the base sequence of the primer determined here that is, a pair of FIP primer and BIP primer) , F3 primer and B3 primer pair, FL primer and BL primer pair), each designed in pairs, from FIP primer and BIP primer pair, F3 primer and B3 primer pair, FL primer and BL primer pair
  • FIP primer and BIP primer F3 primer and B3 primer pair
  • FL primer and BL primer pair FL primer and BL primer pair
  • the number of mutations contained in each region of the primer set that could be amplified and the number of mutations contained in each region of the primer set that could not be amplified were examined. Based on the number of base mismatches, such as whether gene amplification occurs, how many base mismatches are in total for each primer region, and whether there are primer regions that are susceptible to base mismatches. A limit value can be determined. Examples of the present specification, “(I) Determination method of avian influenza virus H5 subtype”, “7. Effect of base mismatch on gene amplification” in materials and experimental methods , “8. Base mismatch analysis”, and See also “5. Effect of base mismatch on gene amplification” and “6.
  • the “certain number”, that is, the limit of base mismatch varies depending on the gene to be examined.
  • the gene to be examined is an HA gene belonging to any HA5 subtype of avian influenza virus, for example, 1 to 5 , Preferably an integer of 2 to 4, more preferably 3.
  • the extracted genes are the gene 11, the gene 19, and the gene 20 (FIG. 2B).
  • step (e) of the seventh embodiment of the present invention the base sequences of the FL regions of the gene to be examined extracted in step (d) are aligned again, and a new consensus sequence of the aligned FL region is determined. (FIG. 2B). Then, in the step (f), based on the new consensus sequence determined in the step (e), the steps (c), (d) and (e) are performed, and until there is no test target gene to be extracted, Repeat steps (c) to (e).
  • the gene to be examined extracted the second time is only gene 19 (therefore, the consensus sequence at this stage is the base sequence of the F3 region of gene 19), and there is no gene to be extracted. All consensus sequences will be determined. The sequence from the 5 ′ side to the 3 ′ side of the consensus sequence of the determined FL region is determined as the sequence of the FL primer.
  • the FL primer according to the seventh embodiment of the present invention does not perform the steps (b) to (e) or the steps (b) to (e) for the FL region determined in the step (a).
  • the number of mixed bases is desirably 5 or less per 20 base primer.
  • the FL primer set according to the seventh embodiment of the present invention is not limited, but, for example, it is determined whether or not the virus contained in the sample to be examined is HA5 subtype of influenza A virus.
  • SEQ ID NO: 121 for integration of Eurasian strains of H5 subtype and American strains
  • a group of primers consisting of the sequences represented by SEQ ID NOs: 139 to 141 for H5 subtype American strains
  • the eighth embodiment of the present invention is a BL primer comprising a sequence complementary to the base sequence of the FL primer of the seventh embodiment.
  • the addition of the FL primer of the seventh embodiment and the BL primer of the eighth embodiment is effective for shortening the nucleic acid detection time by the LAMP method.
  • the FL region selected in the seventh embodiment and the BL region selected in the eighth embodiment have the FL region of the seventh embodiment on the 5 ′ side and the third region on the 3 ′ side across the region to be amplified.
  • the BL area of the eighth embodiment needs to be set. For details, see FIG. 5 or 6A.
  • “F1”, “F2” and “FL” described in the seventh embodiment are It shall be read as “B1”, “B2” and “BL”.
  • the eighth embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacterium, parasite or the like by the LAMP method, and comprises the following (a) to (f) ) And a BL primer set consisting of a sequence complementary to the consensus sequence of the BL region determined in steps (b) and (e).
  • a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined wherein the base sequences existing between the B1 region and the B2 region in the fourth embodiment are aligned, and bases at corresponding positions between the sequences And selecting a region having high homology between each test target gene as a BL region, (B) aligning the base sequences of the BL regions of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned BL regions; (C) The number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the BL region of the test target gene by comparing the bases at the corresponding positions of the base sequence of the BL region of each test target gene with the consensus sequence For each gene to be tested, (D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more, (E) re-aligning the base sequences of the BL region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned BL region;
  • the BL primer set according to the eighth embodiment of the present invention is not limited.
  • a group of primers consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 143 can be exemplified as a set of BL primers.
  • the primers of the first to eighth embodiments of the present invention may be synthesized by a method known in the art as an oligonucleotide synthesis method (eg, phosphodiester method) using an automatic DNA synthesizer or the like. Alternatively, it may be synthesized by entrusting to an organization that performs commissioned synthesis.
  • the ninth embodiment of the present invention is a pair of at least the forward primer set of the first embodiment of the present invention and the reverse primer set of the second embodiment, or the set of the FIP primer of the third embodiment.
  • a pair of BIP primer sets of the fourth embodiment a nucleic acid amplification reaction is performed using a nucleic acid derived from a gene of a pathogen such as a virus, bacteria, parasite, etc. in a sample as a template, and the obtained amplified fragment is It is a method of analyzing and determining the type or subtype of a pathogen in a sample.
  • the set of the forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment includes a conventional PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, an RT-real-time PCR, and a TMA (Transcription Mediated Amplification) method.
  • the FIP primer set of the third embodiment and the BIP primer set of the fourth embodiment may be used for the entire nucleic acid amplification method, but are particularly preferably used for the nucleic acid amplification method by the LAMP method. be able to.
  • the F3 primer set of the fifth embodiment of the present invention and the B3 primer set of the sixth embodiment of the present invention, and / or the The LAMP method may be performed using the set of FL primers of the seventh embodiment and the set of BL primers of the eighth embodiment of the present invention.
  • the number of base mismatches of all primers per gene contained in each type or subtype It is desirable that the sum of (minimum value) is 7 or less.
  • Pair of forward primer set of the first embodiment and reverse primer set of the second embodiment in the case of real-time PCR method, three types of primer sets including probe primers
  • a forward primer and a reverse primer in the case of the real-time PCR method, three types of primer sets including a probe primer
  • a region including a gene region sandwiched between the FIP primer and the BIP primer is amplified (see, for example, FIGS. 3, 5 and 6A).
  • the F2 region and the B2 region so that the region sandwiched between the forward primer and the reverse primer, or the FIP primer and the BIP primer is a distance that can be amplified by the nucleic acid synthase.
  • the distance between the FIP primer and the BIP primer is not particularly limited, but is, for example, about 50 bases to 300 bases, and preferably about 100 bases to 200 bases.
  • any one of the primer sets of the first to eighth embodiments of the present invention is used, and the nucleic acid amplification method is performed using a primer other than the primer according to the present invention as the other primer in the pair. Needless to say, even when any one of the primers of the first to eighth embodiments of the present invention is used, the present invention is also carried out.
  • a primer set for carrying out the real-time PCR method
  • the base sequences of the primers contained in are shown in Table 11 (see Examples).
  • a primer set (FIP, F3, FL, BIP, B3) for performing the LAMP method
  • the base sequences of the primers included in the set consisting of BL primer and BL primer are exemplified by SEQ ID NOs.
  • Primer set ("Version 1" for Eurasian strains of H5 subtype) FIP primer set; SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20 F3 primer set; SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34 FL primer set; SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45 BIP primer set; SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 82 B3 primer set; SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92 BL primer set; SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 114 (2) Primer set 2 ("PM16 primer set" for H5 subtype Eurasian strain) FIP primer set; SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119 F3 primer set; SEQ ID NO: 120 Set of FL primers; SEQ ID NO: 121 BIP primer set; SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128 B3 primer set; SEQ ID NO: 129 BL primer set; SEQ ID NO: 130 (3) Primer set 3 (for H5 subtype American strains
  • the base sequence of the primer included in the primer set (set consisting of FIP, F3, FL, BIP, B3 and BL primers) for carrying out the LAMP method is These are exemplified by SEQ ID NOs.
  • a set of FIP primers SEQ ID NO: 273 (primer name; P2472), SEQ ID NO: 274 (P2473), SEQ ID NO: 275 (P2474), SEQ ID NO: 276 (P2475), SEQ ID NO: 277 (P2476), and SEQ ID NO: 281 (P2573)
  • a set of F3 primers SEQ ID NO: 264 (P2456), SEQ ID NO: 265 (P2469) and SEQ ID NO: 266 (P2470) FL primer set; SEQ ID NO: 268 (P2459), SEQ ID NO: 269 (P2460) and SEQ ID NO: 270 (P2461)
  • a set of BIP primers SEQ ID NO: 278 (P2477), SEQ ID NO: 279 (P2478) and SEQ ID NO: 280 (P2479) Set of B3 primers; Sequence number 267 (P2458) A set of BL primers; SEQ ID NO: 271 (P2461)
  • viral gene extraction or cDNA preparation can be performed according to conventional methods.
  • the virus to be judged is an influenza virus
  • the influenza virus is an RNA virus
  • RNA from the influenza virus gene is extracted from the sample
  • cDNA is synthesized by reverse transcription
  • the synthesized cDNA is used as a template.
  • the LAMP method may be performed. Or you may add a reverse transcriptase in the reaction liquid which performs the nucleic acid amplification reaction of LAMP method, and may perform a nucleic acid amplification reaction.
  • the DNA polymerase used for performing nucleic acid amplification by the LAMP method is not particularly limited as long as it is a chain-type-dependent nucleic acid synthase having strand displacement activity. Examples of such enzymes include Bst DNA polymerase, Bct (exo-) DNA polymerase, Csa DNA polymerase, and the like.
  • the reverse transcriptase used in the present embodiment is not limited as long as it is an enzyme having an activity of synthesizing cDNA using RNA as a template, but for example, for example, M- Examples include retrovirus-derived reverse transcriptase such as MVL (Moloney Murine Leukemia Virus) and AMV (Avian Myeloblastosis Virus), and reverse transcriptase derived from the thermophilic eubacteria Thermus thermophilus HB8.
  • MVL Moloney Murine Leukemia Virus
  • AMV Allevian Myeloblastosis Virus
  • Detection of the amplification product by the LAMP method can be performed by a known method. For example, when the amount of magnesium pyrophosphate generated in the course of the amplification reaction increases, the reaction solution becomes cloudy, so the presence of the amplification product can be confirmed visually. In addition, when calcein is added to the reaction solution, calcein that has been quenched by binding to manganese ions before the reaction is depleted by pyrophosphoric acid ions generated during the amplification reaction. The presence of the amplification product can be confirmed. Alternatively, when amplification products are separated by agarose electrophoresis, a plurality of bands on the ladder are generated. Therefore, the presence of the amplification products may be confirmed by detecting these bands.
  • the tenth embodiment of the present invention determines the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacterium, parasite or the like, comprising at least one set of the primer sets of the first to eighth embodiments of the present invention. It is a kit to do.
  • the kit according to the embodiment of the present invention includes a reagent for extracting RNA, a nucleic acid amplification method (PCR method, RT-PCR method, real-time PCR method, RT-real-time PCR method, TMA method, NASBA method, LAMP).
  • PCR method RT-PCR method
  • real-time PCR method real-time PCR method
  • RT-real-time PCR method TMA method
  • NASBA method NASBA method
  • LAMP nucleic acid amplification method
  • instructions for use may be included.
  • each primer (FIP, BIP, F3, B3, FL and BL) on the HA gene was set in the vicinity of the HA cleavage site (FIGS. 4A and 5A).
  • all of the three types of primer sets (S primer set, M primer set, and P primer set) described later were set in the same region so that the effectiveness could be correctly compared.
  • Primer design 2-1 Primer specific to the virus strain gene (S primer)
  • S primer is designed to target the HA gene (accession number; BAJ23243) of A / duck / Tsukuba / 9/2005 (H5N2) (abbreviated as V124 strain) and is currently in common use. This is used as an example of a primer for the LAMP method.
  • M primer Primer containing mixed base
  • the M primer is an essential primer for widely detecting various HA genes using PCR (Tsukamoto et al., J Clin Microbiol 48: 4275-4278, 2010.). Therefore, in this example, the usefulness of the M primer for the broad detection of the HA gene by the LAMP method was examined.
  • primers were designed using mixed bases.
  • the number of mixed bases per primer was set to 5 or less, but when there were still base positions with low base coverage, 6 or more mixed bases could be used.
  • the P primer is a primer developed by the present inventors for the first time in order to widely detect various HA genes by the LAMP method.
  • the set of P primers is a set of primers in which primers are designed and collected for each group of HA genes having similar base sequences in the primer region.
  • gene amplification was possible with the P primer when there were no more than 2 base mismatches between the base sequence of the P primer and the base sequence on the gene side.
  • genes with 3 or more base mismatches require 60 minutes or more for amplification with the P primer, or may not be amplified, and stable gene detection is difficult.
  • the P primer in each primer region, is designed so that the number of base mismatches is 2 or less, and for 3 or more genes, these consensuses are applied so as to cover as many genes constituting the gene population as possible.
  • a new P primer consisting of a sequence was designed.
  • a new new P primer was designed.
  • a set of P primers was designed so that the number of base mismatches was 2 or less for all 2211 genes. The method for designing the P primer is described in detail below.
  • Primer region setting In many reports, “Primer Explorer”, a primer design software dedicated to the LAMP method, published on the web by Eiken Chemical Co., Ltd., is used to design primer sets. Yes.
  • the primer region designed by Primer Explorer is often set to a region with low conservation, resulting in a primer with a narrow spectrum. The gene cannot be detected widely.
  • the primer region must have a high base coverage and a region in which about 20 well-preserved bases are continuous. Specifically, the base appearance rate of the primer region is 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 98% or more), or the appearance rate of a single base is less than 80%. In addition, a region where about 20 consecutive mixed bases with a sum of the appearance rates of the top two types of bases having a high base appearance rate of 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 98% or more) is a primer region. As a candidate. For these candidate regions, primers were designed that completely matched the base sequence with the artificial H5-HA gene (H5 subtype HA gene) of the virus strain V124.
  • H5-HA gene H5 subtype HA gene
  • This primer set was named S primer set in the meaning of a strain-specific primer set for a certain strain. Since the S primer set is equivalent to the commonly used avian influenza virus primer, it was used as an example of the current ramp method primer in this study.
  • Consensus sequence design Using the aligned primer database, the appearance rate of A, G, T, and C is determined for each base position, and only the bases that show the highest base appearance rate are arranged in order to form a consensus sequence. .
  • a consensus sequence comprising the F2 region and the F1 region as a set was constructed for a population consisting of 2211 strain H5-HA genes (see FIG. 4).
  • (Vii) FIP primer design In each set of the obtained consensus sequences, a fused FIP primer in which the consensus sequence of the complementary strand of the F1 region is at the 5 end and the consensus sequence of the F2 region is at the 3 end is designed (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20). This designs a set of P primers for the FIP region.
  • the length of the FIP primer region is preferably about 20 bases for both the F2 region and the F1 region, but may be shorter if the gene can be amplified.
  • the number of FIP primers designed at first was 20, but when the F2 region was shortened from 20 bases to 16 bases and the F1 region was shortened from 20 bases to 14 bases, Short FIP primers were used.
  • the number could be reduced to a total of 5 (SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119).
  • This set is a mixture of eight types of primer molecules. However, in this technical field, if they are synthesized including a mixed base, they are handled as five primers.
  • the F2 region of the Long FIP primer has base numbers 950 to 969
  • the F1 (F1c) region has base numbers 998 to 1017 (FIG. 5)
  • Short FIP The F2 region of the primer has base numbers 954 to 969
  • the F1 (F1c) region has base numbers 1004 to 1017 (FIG. 6).
  • BIP primer design The BIP primer is composed of a B2 region and a B1 region, and is a primer in which the sequence of the complementary strand of the B1 region is fused at the 5 ′ end and the B2 region is fused at the 3 end.
  • the design method of the BIP primer is the same as the design of the FIP primer.
  • a BIP primer is designed for each gene population whose primer region has a similar base sequence. Specifically, a P primer set for the BIP region was designed through steps (i) to (vii).
  • the length of the BIP primer region is preferably about 20 bases for both the B1 region and the B2 region, but may be shorter if the gene can be amplified.
  • the number of initially designed BIP primers was 37 (SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 82), but the B1 region was shortened from 17 bases to 11/12 bases, and the B2 region was shortened from 19 bases to 17 bases.
  • the number of BIP primers could be reduced to a total of 7 (SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128).
  • This set is a mixture of 10 types of primer molecules.
  • it is synthesized including a mixed base, it will be treated as 7 primers, so it is described as 7 in this specification.
  • the position of the BIP primer is based on the V124 strain, the B2 region of the Long BIP primer is at base numbers 1071 to 1089, the B1 (B1c) region is at base numbers 1024 to 1040 (FIG. 5), and the B2 region of the Short FIP primer was base numbers 1073 to 1089, and the B1 (B1c) region was base numbers 1022 to 1033 (FIG. 6).
  • (Ix) F3 primer design The F3 region was excised from a primer-specific database constructed using the 2211 strain H5-HA gene. Next, the consensus sequence of the F3 region (see FIG. 7) was compared with the base sequence of the F3 region of each HA gene, and the number of mismatched bases (base mismatch number) was counted. The HA gene having a base mismatch of 3 or more in the F3 region was determined to be difficult to amplify with primers designed based on the consensus sequence, and these were extracted to organize a new population. A new consensus sequence was designed for a new population, and the number of base mismatches per HA gene was counted by comparing the new consensus sequence with the sequence of each HA gene belonging to the new population.
  • An HA gene having a base mismatch number of 3 or more was determined to be difficult to amplify with a primer designed based on a novel consensus sequence, and the next population was organized by extracting these difficult amplification genes. By repeating this process until there are no more difficult-to-amplify genes, a set of P primers with a base mismatch number of 2 or less is designed for each of the H5-HA genes of the 2211 strain for the F3 region.
  • the length of the F3 primer is preferably about 20 bases, but may be shorter if the gene can be amplified.
  • the number of P primers in the F3 region was 14 (SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34).
  • the position of the F3 primer was set to base numbers 917 to 936 for the V124 strain (FIGS. 5 and 6).
  • region was not a P primer, it was also possible to use a mixed base primer (sequence number 120).
  • (X) FL primer design The FL region was cut out from the primer-dedicated database, and a set of P primers for the FL region was designed according to step (ix) based on this information.
  • the length of the FL primer is preferably about 20 bases, but may be shorter if the gene can be amplified.
  • the number of P primers in the FL region was 11 (SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45).
  • the position of the FL primer was set to base numbers 974 to 993 for the V124 strain (FIGS. 5 and 6).
  • the FL region can be a mixed base primer (SEQ ID NO: 121) even if it is not a P primer.
  • (Xi) B3 primer design The B3 region was cut out from the primer-dedicated database, and based on this information, a P primer set for the B3 region was designed according to step (ix).
  • the length of the B3 primer is preferably about 20 bases, but may be shorter if the gene can be amplified.
  • the number of P primers in the B3 region was 10 (SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92).
  • the position of the B3 primer was set to base numbers 1092 to 1110 for the V124 strain (FIGS. 5 and 6). Note that a mixed base primer can be used for the B3 region, not a P primer (SEQ ID NO: 129).
  • (Xii) BL primer design A BL region was cut out from the primer-dedicated database, and based on this information, a P primer set for the BL region was designed according to step (ix).
  • the length of the BL primer is preferably about 20 bases, but may be shorter if the gene can be amplified.
  • the number of P primers in the BL region was 22 (SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 114).
  • the position of the BL primer was set to base numbers 1049 to 1068 or base numbers 1052 to 1071 (in the case of mixed base primers) for the V124 strain (FIGS. 5 and 6).
  • a mixed base primer can be used (sequence number 130).
  • the 70 base long oligonucleotide pair is designed so that 20 bases overlap with both terminal portions of adjacent oligonucleotides.
  • first PCR in each tube containing Ex Taq (Takara, Shiga, Japan), two sets of primers 1 (plus strand) and 2 (minus strand) and primers 3 (plus strand) and 4 (minus strand) In combination, 15 cycles of PCR reaction were performed to amplify 120-base DNA each.
  • the synthetic DNA was diluted 100-fold, and 30 cycles of PCR reaction were performed using two primers (primer 1 (plus strand) and 5 (minus strand)) at both ends.
  • the DNA was designated as PCR template DNA.
  • Virus cDNA temperate Avian influenza virus (H1-H4 subtype, H6 subtype, H8-H12 subtype), chicken infectious bronchitis virus (IBV) and Newcastle disease virus (NDV)
  • the viral genomic RNA was purified from the allantoic fluid of infected embryonated eggs using the Viral RNA Purification Kit (Qiagen).
  • viral cDNA was synthesized from viral genomic RNA using SuperScript III reverse transcriptase (Takara, Shiga, Japan) (Tsukamoto et al., J Clin Microbiol 48: 4275-4278, 2010.).
  • SuperScript III reverse transcriptase Takara, Shiga, Japan
  • LAMP method PCR template DNA (1,000-fold dilution) 1 ⁇ L, 80 pmol FIP primer and BIP primer solution 0.5 ⁇ L each, 40 pmol FL primer and BL primer solutions 0.5 ⁇ L each, 5 pmol F3 primer and B3 primer 0.5 ⁇ L of each solution, 5.0 ⁇ L of (x2) enzyme reaction solution, 0.5 ⁇ L of Bst DNA polymerase (New England BioLabs, Tokyo), 0.5 ⁇ L of fluorescence detection reagent (Eiken Chemical, Tokyo, Japan) Using the reaction solution of the LAMP method, the reaction was carried out in a system with a total volume of 10 ⁇ L.
  • the composition of the enzyme reaction solution was 20 mmol / L Tris-HCl (pH 8.8), 10 mmol / L KCl, 10 mmol / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X-100, 8 mmol / L MgSO 4 , 0.8 mmol / L betaine (Sigma, USA) and 1.4 mmol / L dNTPs (Promega, USA).
  • the reaction solution containing temperate was reacted at 60 ° C. for 60 minutes, and then the reaction was stopped by treatment at 95 ° C. for 2 minutes.
  • the reaction tube was irradiated with UV, and the presence or absence of gene amplification was determined from the presence or absence of green fluorescence. When green light was emitted, it was determined that the H5 subtype HA gene was positive.
  • reaction specificity of LAMP method for detecting avian influenza virus of H5 subtype was performed using 12 types of HA subtype avian influenza viruses and 2 types of chicken viruses other than avian influenza viruses. It was.
  • As a template used for the examination of reaction specificity for the H5 and H7 subtypes of avian influenza virus, the artificially synthesized PCR template was diluted 1,000 times with a 70-base primer. Using. For other HA subtypes (H1, H2, H3, H4, H6, H8, H9, H10, H11 and H12 subtypes) avian influenza viruses, NDV (B1 strain) and IBV (H120 strain) A 10-fold dilution of was used to examine reaction specificity.
  • the amplification reaction of the LAMP method was determined by ultraviolet irradiation after stopping the reaction after 60 minutes of incubation at 60 ° C., as in 5 above, but in order to more strictly confirm the presence or absence of nonspecific reaction, amplification was performed. The reaction time was extended to 120 minutes.
  • H5 subtype PCR temperate of (A / duck / Tsukuba / 9 /2005 (H5N2) strain derived) (270 bases in length, 10 9 copies / [mu] L) (above) the 10-fold serial
  • a diluted solution of PCR template was prepared by diluting and preparing the number of molecules of template in the range of 10 6 copies / ⁇ L to 1 copy / ⁇ L. Using these dilutions, the detection limit of the H5 subtype LAMP method was examined.
  • the amplification conditions of the LAMP method were the same as those in 5 above, but the amplification time was 120 minutes.
  • Base mismatch analysis 8-1 Method for calculating the number of base mismatches
  • P primers FIP; SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119, BIP; SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128) are used in the FIP primer and BIP primer regions, and the other four primer regions Base mismatch analysis was performed using M primers (FL; SEQ ID NO: 121, BL; SEQ ID NO: 130, F3; SEQ ID NO: 120, B3; SEQ ID NO: 129) for (F3, B3, FL, BL).
  • FL SEQ ID NO: 121, BL
  • the base sequences of the FIP primers F1 and F2 are extracted and linked on Excel to construct a database as an integrated gene.
  • the number of base mismatches between a certain FIP primer and the HA gene is determined for all the HA genes.
  • the number of base mismatches of all HA genes is calculated for each primer. A specific example will be described.
  • the number of base mismatches of a certain HA gene is expressed in the order of (F1, F2, F1 + F2) for each of five FIP-P primers, the first (0, 1, 1), second ( 1, 2, 3) (0, 0, 0), 4 (2, 1, 3), 5 (2, 3, 5).
  • the third primer (0, 0, 0) that minimizes the number of base mismatches is related to gene amplification. Therefore, the number of base mismatches of this HA gene for this FIP-P primer set is (0 , 0, 0).
  • the number of base mismatches was determined for each of the seven P primers for each of the B1, B2, and B1 + B2 regions for all HA genes in accordance with the FIP-P primer method. .
  • the minimum number of base mismatches was calculated for all HA genes as the number of base mismatches of the HA gene.
  • the primer regions of F3, B3, FL, and BL are all M primers containing mixed bases. Basically, the number of base mismatches for each primer was calculated for all HA genes by the same method as for FIP primers.
  • the mixed base was handled by the following method.
  • the mixed base R may be either the base A or the base G. Therefore, when the primer sequence is the mixed base R, the base sequence at the corresponding position of the HA gene is assumed to match the base A and the base G.
  • the base (C, T) was calculated as a base mismatch.
  • the base mismatch pattern of the 8 primer regions was clarified for each HA gene of 2211 strains.
  • the criteria for amplification by the LAMP method were performed with reference to the results in Table 3. That is, it was determined that an HA gene having a maximum number of base mismatches per primer region of 2 or less and a total number of mismatches of 10 or less can be amplified.
  • the S primer for the H5-HA gene of A / duck / Tsukuba / 9/2005 was set so as to straddle the cleavage site of HA (hemagglutinin).
  • F3, F2 and FL were set in the HA1 region
  • F1, B1, BL, B2 and B3 were set in the HA2 region.
  • the reason why the HA cleavage site is sandwiched is that the HA1 region is specific to the H5 subtype and the HA2 region is a highly conserved region between genes. By doing so, it became possible to detect all HA genes belonging to the H5 subtype with a small number of primers.
  • the HA1 region is a region related to pathogenicity, antigenicity, and diversity
  • the HA2 region is an HA2 protein that has pierced the viral envelope and serves to present the HA1 spike protein on the surface of the virus particle.
  • the S primer set is equivalent to a primer currently used as a primer for the LAMP method that has been reported. Using this, the detection spectra of 10 genetically highly diverse H5-HA genes were examined.
  • a PCR template synthesized by a PCR method using a long primer was used (Table 1).
  • the S primer set is as follows.
  • the M primer (a primer containing mixed bases) is an indispensable primer for detecting a wide variety of H5 subtype HA genes by PCR, but how effective is it when used in the LAMP method It was unknown whether it was. Therefore, M primers were designed in the same region as the S primer set region with reference to the primer database so that genes can be detected widely, and the gene detection rate was examined.
  • the M primer set is as follows. M primer set FIP; SEQ ID NO: 150 BIP; SEQ ID NO: 151 FL; SEQ ID NO: 152 BL; SEQ ID NO: 153 F3; SEQ ID NO: 154 B3: SEQ ID NO: 155
  • the inventors prepared the following P primer set based on the above-described primer design method in order to comprehensively detect the H5 subtype HA gene.
  • the FIP primer and the BIP primer are P primers, but the other F3, B3, FL, and BL primers could be implemented as primers containing mixed bases.
  • the primer set which uses P primer and M primer together is called PM primer.
  • the total number of primers was 16 (Version 2, FIP; SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119, BIP; SEQ ID NO :) 122 to SEQ ID NO: 128, FL; SEQ ID NO: 121, BL; SEQ ID NO: 130, F3; SEQ ID NO: 120, B3; SEQ ID NO: 129; “PM16 primer set”).
  • PM16 primer set the detection spectra for the above 10 types of H5-HA genes were examined. As a result, as shown in Table 2, all of the 10 types of H5-HA genes can be detected with the PM16 primer set, the average detection time is 44 minutes, and detection is performed when 114 P primers are used. It was equivalent to time (average 45 minutes).
  • Base mismatch analysis of reference strains Base mismatch analysis was performed between the nucleotide sequences of the 15 types of PCR templates used in this example and the primers of the PM16 primer set, and the results are summarized in Table 3. Since the P primers FIP and BIP were designed so that the number of base mismatches was 2 or less, the actual number of base mismatches was 2 or less as expected. On the other hand, in the regions of mixed base primers F3, B3, FL and BL, the number of base mismatches was 0 to 3, and there were relatively many base mismatches at the binding sites of F3 and B3 primers.
  • the primer ID of FIG. 10 is displayed in “primer combination” of FIG. 9.
  • the HA gene could be amplified within 60 minutes in 41 out of 46. If the total number of mismatches was 12 or less, the HA gene could be detected within 60 minutes. However, even in this case, it was confirmed that the number of base mismatches per primer region was 2 or less. For the 5 HA genes that could not be amplified within 60 minutes, if the total number of base mismatches was in the range of 14 to 16, it took 75 minutes to amplify the HA gene, 16 or more, or the primer region If there were 3 base mismatches per gene, gene amplification was difficult.
  • the HA gene can be amplified by the LAMP method when the number of base mismatches per primer is 2 or less and the total number of base mismatches in 8 regions is 10 or less.
  • the PM16 primer set is essential for widely detecting various H5 subtype HA genes by the LAMP method.
  • the number of base mismatches is divided into three parts: FIP region (F1 + F2), BIP region (B1 + B2), and other four regions (F3, B3, FL, BL), and the number of base mismatches and the number of HA genes is examined for each group. It was summarized in 5.
  • HA genes having 2 or 3 or more base mismatches in the FIP or BIP primer region, 62 in the BIP region, 5 in the BIP region, and the other 4 genes, respectively. There were 4 and 4 in the area. These HA genes are highly likely to be strongly influenced not only by the number of base mismatches in one primer region but also by base mismatches in other primer regions. Thus, for these, the possibility of gene amplification was determined from the base mismatch pattern of all primer regions (F1, B1, F2, B2, F3, B3, FL, and BL sites).
  • Table 6 shows 23 HA genes whose base amplifications were determined based on the base mismatch patterns of the eight primer regions and their base mismatch patterns. When the same gene was extracted in a plurality of primer regions, they were collected in one. When gene amplification was estimated according to the criteria in Table 4, the genes that were determined to be difficult to amplify were the A / duck / Taiwan / DV30-2 / 2005 (H5N2) HA gene (CY110933) and A / chicken / Only the HA gene (CY062604) of Egypt / 34-2 / 2008 (H5N1). For the other 21 HA genes, the total number of base mismatches was 2 to 7, and there was no bias of base mismatches in the primer region.
  • the HA gene of A / duck / Tsukuba / 168/2005 (H5N2) is the gene that was actually amplified in Table 2 and has a base mismatch pattern equivalent to this, A / duck / Korea / GJ54 / 2004 It was determined that the HA gene derived from (H5N2) can also be amplified. From these results, it was determined that 2209 HA genes out of 2211 H5-HA genes of EU strains registered in GenBank can be amplified by the LAMP method using PM16 primer set.
  • Detection sensitivity of LAMP method using PM16 primer set A PCR template derived from the HA gene of A / duck / Tsukuba / 9/2005 (H5N2) was diluted and adjusted so that the number of molecules per well was 10 6 to 1. Using this as a template, the detection sensitivity of the LAMP method was examined. Amplification was confirmed after culturing at 60 ° C. for 60 minutes. As a result, the detection limit was 1,000 molecules per well in both the plasmid template and the PCR template. The detection limit was also the same when the PCR template of A / whooper swan / Akita / 1/2008 (H5N1) was used. From these results, it was confirmed that the sensitivity of the LAMP method using the PM16 primer set according to the present invention was sufficiently sensitive to directly detect the viral gene from the clinical sample of the H5-HA gene.
  • FIP primers and BIP primers specialized for these genes were designed.
  • the PM18 primer set obtained by adding these primers to the PM16 primer set has a small number of base mismatches with respect to the 13 HA genes described above, and therefore, it is expected that the HA gene of the American strain can be amplified more reliably. From the above results, it was determined that the LAMP method using the PM18 primer set can reliably detect the H5-HA gene of HA subtype Eurasian strain and American strain.
  • the aligned gene sequences were reprinted on an Excel sheet, and a database dedicated to primers for Eurasian and North American strains was constructed. Using these primer-specific databases, the appearance rate (%) of A, G, T, or C at all base positions of the HA gene was determined for each strain.
  • the position of each primer (FIP, BIP, F3, B3, FL and BL) on the HA gene was set in the vicinity of the HA cleavage site (FIG. 11A). Also, two types of primer sets (S primer set and PM primer set) to be described later were all set in the same region so that the effectiveness could be correctly compared.
  • Primer design 2-1 Primer specific to the virus strain gene (S primer)
  • S primer is designed to target the HA gene (accession number; AB558257) of A / duck / Shiga / B149 / 2007 (H7N7) (abbreviated as V273 strain) and is currently in common use. It used for experiment as an example of the primer for LAMP methods.
  • 2-2. Primer containing mixed base (PM primer) From the experiment of the H5 subtype HA gene, it became clear that PM primer was useful for the ramp method. Therefore, PM primer was also used in the detection system of the H7 subtype gene.
  • PM primer is an M primer (Tsukamoto et al., J Clin Microbiol 48: 4275-4278, 2010.) (F3, B3, FL and BL regions) essential for detecting various HA genes widely by PCR. It is a primer set designed by combining P primers (population primers) (FIP and BIP regions) essential for widely detecting various HA genes by the ramp method.
  • primers for the H7 subtype gene were designed based on the same design guidelines as the H5 subtype HA gene.
  • the diversity of the H7 subtype gene is wider than that of the H5 subtype gene.
  • F3, B3, FL, and BL primers require many mixed bases and amplified. There was concern about low efficiency.
  • the number of P primers in the FIP and BIP regions was larger than expected.
  • the gene detection rate of these primer sets prepared with the same design guidelines as the H5 subtype was not as high as expected.
  • the design policy of the H5 subtype detection system was modified as follows. First, 0 or 1 mixed base number was used for the FIP region and BIP region P primers in the H5 subtype detection system, but in the H7 subtype detection system, the number of mixed bases was increased to 2 for detection. The number of primers was suppressed while expanding the spectrum.
  • the H5 detection system used 5 to 6 mixed bases per primer, and priority was given to reducing the number of primers.
  • the number of mixed bases was reduced to 3, and the number of primer molecules involved in amplification was increased.
  • simply reducing the number of mixed bases narrows the detection spectrum, so the number of primers per region was increased from 1 to 2 to 3 in order to maintain the broad detection spectrum.
  • the use of multiple primers in one region necessitates incorporating the idea of population primers in the design, so for these four region primers, the primers are designed in the same manner as the population primers. It was to be. These changes were expected to improve detection spectrum expansion and amplification efficiency, and to develop an H7 subtype detection system that can reliably detect H7 subtype genes that are more diverse than H5 subtype genes. .
  • the designed primer set consisted of 17 primers. This was hereinafter referred to as PM17 primer set.
  • HA gene to be detected is synthesized by 2-step PCR in the same manner as the H7 subtype gene, using a portion consisting of 270 bases including the amplified region, using 5 to 6 primers for each HA gene. did.
  • the targeted HA genes were selected from 8 genes from the Eurasian lineage and 4 genes from the North American lineage, and those that were genetically different were selected by judging from the base mismatch of the primer region.
  • the origin of the synthesized HA gene and the base sequence information of the primers used for gene synthesis are as follows.
  • S primer set and PM primer set The following primers were designed.
  • S primer set A set of FIP primers Sequence number 286 (primer name; P2571) A set of F3 primers ; Sequence number 282 (P2567) FL primer set ; Sequence number 284 (P2569) A set of BIP primers ; Sequence number 287 (P2572) Set of B3 primers ; Sequence number 283 (P2586) A set of BL primers ; Sequence number 285 (P2570)
  • PM primer set A set of FIP primers SEQ ID NO: 273 (primer name; P2472), SEQ ID NO: 274 (P2473), SEQ ID NO: 275 (P2474), SEQ ID NO: 276 (P2475), SEQ ID NO: 277 (P2476), and SEQ ID NO: 281 (P2573) A set of F3 primers ; SEQ ID NO: 264 (P2456), SEQ ID NO: 265 (P2469)
  • the eight synthetic genes that were not amplified had a total number of base mismatches of 11 to 32, and the accumulation of mismatch numbers that hinders amplification was confirmed in a plurality of primer regions. Conceivable.
  • base mismatch analysis for the PM17 primer set there was no synthetic gene with more than 11 base mismatches, and the shaded cell regions that caused amplification failure were V8, V9, and V10.
  • This HA gene has two mismatches in the F1 and F2 regions, and was not amplified by the ramp method.
  • the PM17 primer set is used, the accumulation of base mismatches can be eliminated by using other primers designed in the same region. Therefore, it is considered that the amplification conditions are secured when judged on a region basis. From the above, it is considered that a wide variety of HA genes of the H7 subtype can be detected by designing and mixing population primers for each gene population.
  • Primer database As H7 subtype HA genes registered in the gene bank, 1171 Eurasian strains and 688 North American strains were downloaded from Influenza virus Resource, and a primer-specific database was created.
  • FIG. 14 shows the position of each primer (forward primer, reverse primer and probe primer) on the HA gene. 2.
  • Primer design Primer design is based on “1. Primer database” in “(I) Method for determining influenza A virus H5 subtype” and “(II) Method for determining influenza A virus H7 subtype (ramp method)”. The F3 and B3 design methods described in “2. Primer design” were used. The number of mixed bases was 3 or less.
  • Synthetic genes used The names of the synthetic genes used are shown in FIG. Synthetic genes derived from 11 strains of the H7 subtype HA gene (V1 to V11) were synthesized by 2-step PCR and diluted 1000-fold with 10 mM Tris pH 8.0, and used as a template. However, V12 was not used in the real-time PCR experiment because the expected product could not be confirmed at the final stage of gene synthesis (in the ramp method, the synthesized product of the previous stage was used). .
  • Real-time PCR reaction 4-1 Preparation of Master Mix 0.5 ⁇ l each of forward primer (SEQ ID NO: 362 to SEQ ID NO: 365; 20 pmol / ⁇ l) and reverse primer (SEQ ID NO: 367 to SEQ ID NO: 369; 20 pmol / ⁇ l), probe primer (SEQ ID NO: 366; 10 pmol / ⁇ l) was mixed with 0.5 ⁇ l, (x2) Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara code RR039) was mixed with 5 ⁇ l, and Dye II was mixed with 0.2 ⁇ l (Total 9.2 ⁇ l). 4-2. Amplification program After reacting at 95 ° C.
  • Base mismatch analysis As a primer set for the real-time PCR method, the H7-PM8 primer set according to the present invention and both the H7-M3eu and H7-M3am primer sets currently used for diagnosis in Japan were used. These primer regions are the same as described previously (Tsukamoto et al., Journal of Clinical Microbiology 48: 4275-4278, 2010). For the number of base mismatches, the number of base mismatches with each primer was determined for each of the three primer regions of each gene, and then the mismatch pattern in the three primer regions for each gene was examined.
  • the number of mismatches of the primer with the smallest number of mismatches for each region The number of mismatches. Using the mismatch pattern of each gene obtained in this way, the number of genes was examined for each number of mismatches.
  • Primer setting positions used in the experiment are shown in FIG.
  • Primer sequences are shown in Tables 11 to 13 (1) H7-PM8 primer set (population primer designed by the method of the present invention) (2) H7-M3eu primer set (known primer for Eurasian strain) (3) H7-M3am primer set (known primers for North American strains)
  • FIG. 15 shows the results of real-time PCR reaction for each synthetic gene using H7-PM8 primers.
  • H7-PM8 primer set all 11 H7 subtype HA genes could be amplified (FIG. 16).
  • the number of base mismatches was within 2 in the three primer regions (forward primer, reverse primer and probe primer). It was confirmed that
  • H7-M3 primer set (known primers) Real-time PCR using H7-M3 primer set.
  • H7-M3eu set primer set 11 H7 subtype HA genes Of these, eight Eu strain genes were strong and one North American strain gene was weakly detected (FIG. 17A).
  • the M3am set was used, in addition to all three North American genes, two Eu gene genes (total of 5 genes) were amplified (FIG. 17B).
  • base mismatch analysis between these HA genes and H7-M3 primer set was performed (FIG. 18).
  • the gene was amplified if the number of base mismatches in the three primer regions (forward primer, reverse primer and probe primer) was within 3, but was hardly detected in the case of 4 or more. .
  • the Eu strain gene was detected in the M3am set, in some cases the gene was detected slightly weakly depending on the gene. From these results, it was revealed that the H7-M3 primer set can widely detect genes of the same strain, but cannot detect genes of other strains or detects some genes weakly. From the above results, when designing a primer for the PCR method, it is preferable to keep the number of base mismatches within two as much as possible if practical use in the field is desired.
  • the avian influenza virus is expected to continue to mutate and the number of mismatches is expected to increase, but the primer production method according to the present invention is designed by designing a primer for each population of genes and adding new ones as needed. Since the prepared primer can be added, it is possible to produce a useful primer set in the future. On the other hand, considering that the number of mixed bases that can be added to one primer is limited to 5 (see Tsukamoto et al., Journal of Clinical Microbiology, 50: 37-45, 2012), known primers The set M3 primer set already contains 4 to 5 mixed bases, and it is considered difficult to add additional mixed bases. Therefore, the known M3 primer set is determined to be difficult to detect some genes even in the present situation. However, when a new mutant appears, it may not be used for comprehensive subtyping. Is considered high. From this, it is considered that the M3 primer set may gradually become unusable for comprehensive subtyping in the future.
  • the present invention relates to a highly accurate primer for the LAMP method and a determination method, which detect a wide range of HA or NA genes of influenza viruses and determine HA and NA subtypes. Compared with the conventional method, this method significantly improves the detection omission of the target gene and enables subtype-specific and comprehensive detection of HA or NA genes. Can be significantly improved. This method is expected to be widely used as a technique that is easy to mutate and increases the reliability of the genetic diagnosis method for infectious diseases caused by various pathogens.

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Abstract

本発明は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型、特にインフルエンザウイルスの亜型を判定するためのＰＣＲ法用およびＬＡＭＰ法用のプライマーのセット、該プライマーセットを用いた型または亜型の判定方法、該方法を実施するためのキットの提供を目的とする。　本発明は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の分類の基準となる遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）であって、該型または亜型に属する全ての遺伝子を、塩基配列の類似性に基づいていくつかの小グループに分け、各小グループに属する遺伝子を検出し得るプライマーを可能な限り少ない数になるように設計したプライマーである。さらに、本発明は、前述のように作製したプライマーを用いて、検出対象であるウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定する方法である。

Description

ウイルス、細菌および寄生虫等の病原体の型または亜型等の遺伝子型別方法
　本発明は、多様な遺伝子（ＲＮＡ、ＤＮＡ）の型別を高精度に行う判定方法に関するものであって、より具体的には、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定に関する遺伝子増幅法（または核酸増幅法）に使用するプライマーの設計方法、該プライマー、該プライマーを用いた遺伝子型別法および該判定のためのキットに関する。
　インフルエンザウイルスはヒトや家畜、家禽に重篤な呼吸器症状を引き起こす、人獣共通感染症の病原体である。
　鳥インフルエンザウイルスは、Ａ型のインフルエンザウイルスに属し、自然界においては、野生の水禽類を自然宿主として存在している。水禽類が鳥インフルエンザウイルスに感染しても、一般的には無症状であるが、ニワトリが感染すると高い致死性を示す場合があり、家禽を飼育する農場などにおいては、鳥インフルエンザウイルスの感染に対する対策は必要不可欠である。
　一般的には鳥インフルエンザウイルスはヒトには感染しないと考えられてきた。しかし、１９９７年に香港で高病原性のＨ５Ｎ１亜型の鳥インフルエンザウイルスによるヒトの感染が初めて報告され、鳥インフルエンザウイルスの感染によってヒトが高率に死亡することが明らかになった。これ以後、アジアを中心にして高病原性のＨ５Ｎ１亜型ウイルスによる家禽の感染が続いており、畜産業へ多大な経済的被害をもたらすと共に、ヒト感染の継続によって新型インフルエンザの誕生の脅威が続いている。また、２０１３年には中国で、低病原性のＨ７Ｎ９亜型ウイルスによるヒトの致死的感染が起こり、新たな脅威が加わっている。
　鳥インフルエンザの対策で重要なことは、早期摘発とそれによるウイルスの撲滅と蔓延防止である。本発明者らは、ウイルスの早期摘発をさらに強化するために、信頼度の高いＬＡＭＰ法の開発を行った。
　鳥インフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスの粒子表面には、ヘマグルチニン（ＨＡ；ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ；ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）と称されるスパイクタンパク質が存在している。ＨＡはウイルスが細胞にあるレセプターへ結合する際に必要な蛋白質で、ＮＡはレセプターを破壊する酵素で、細胞で作られた子孫ウイルスがレセプターを破壊して細胞表面からリリースされる際に必要な蛋白質である。Ａ型インフルエンザウイルスの場合、ＨＡは１６種類（Ｈ１～Ｈ１６）、ＮＡは９種類（Ｎ１～Ｎ９）に血清学的に分類される。また、インフルエンザウイルスはＨＡとＮＡの組み合わせによって、多くの亜型に分類されている。これら亜型の中で、Ｈ５亜型、Ｈ７亜型のＡ型インフルエンザウイルスによる家禽の感染は国際的に殺処分の対象である。また、これらの亜型のウイルスによるヒトへの感染は、時に高い致死率を招くことが知られており、緊急の対策が求められている。
　鳥インフルエンザの迅速な制圧に必要なことは、可能な限り速やかにウイルスの亜型を判定し、殺処分の対象となるウイルスか、人に高致死性を誘発する可能性が高いウイルスかを明らかにすることである。これらが確認されれば、迅速な防疫措置によって、感染の拡大、新型ウイルスの誕生を効果的に防止することが可能になる。
　現在、最も信頼度の高い鳥インフルエンザウイルスのＨＡ亜型の判定方法は、リアルタイムＰＣＲ法である（特許文献１）。この方法はＨ５亜型またはＨ７亜型のウイルスを幅広く、漏れなく検出できる利点を有しており、公定法として国内外で広く利用されている。しかし、リアルタイムＰＣＲ法は、検出工程が煩雑で、訓練された技術者と専用の高額機器を必要とするため、検査を実施できる機関が限定される。また、リアルタイムＰＣＲ法は検出に３時間を要するため、迅速性に問題がある。このため、リアルタイムＰＣＲ法は多検体の迅速な診断には不向きで、多くのサンプルが次々と持ち込まれると、個々に対応できず、診断の遅れ、感染の拡大を招くリスクが増大すると指摘されている。また、リアルタイムＰＣＲ法に用いられている、現行の混合塩基を使用したプライマー・プローブプライマーでは、現在においても検出漏れが起こる可能性があり、将来において遺伝子の多様性がさらに拡大すれば、検出漏れによって診断が困難になる可能性が高い。
　他方、ＬＡＭＰ法（特許文献２および３）は、検出工程が簡便で、迅速（１時間）にウイルスを検出でき、特殊な機器を有しないため、一般検査室で利用できる利点を有している。鳥インフルエンザにおいても、一部の限定されたウイルスを対象にして、高感度且つ迅速に検出する方法が報告されている（特許文献４および特許文献５）が、その信頼度はリアルタイムＰＣＲ法には及ばない。現行のＬＡＭＰ法は一部のウイルス集団を検出できても、多様なウイルス集団を幅広く検出することはできず、検出漏れが頻繁に起こると指摘されている。
　上述のように、ウイルス、特に鳥インフルエンザウイルスの検出およびその亜型の特定のためには、信頼性の高いＬＡＭＰ法の確立が待たれているところであるが、現在のところ、まだ、そのような方法は確立されていない。
特開2010-252659 WO2000/28082 WO2002/024902 WO2006/049061 特開2011-167207
　上記の事情に鑑み、本発明者らは、簡便かつ迅速に、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体、特にインフルエンザウイルスの亜型を漏れなく検出することを解決課題とし、鋭意研究を進めた。
　すなわち、本発明は、インフルエンザウイルスなどのウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を、遺伝子増幅法（または、核酸増幅法、例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法）で判定するためのプライマーの設計方法、該プライマーのセット、該プライマーセットを用いたウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定方法、該方法を実施するためのキットの提供を目的とする。
　発明者らは、インフルエンザウイルス、特に近年家禽への感染による被害の他、ヒトへの感染が懸念されているＡ型ウイルスのＨ５亜型、Ｈ７亜型等に属するインフルエンザウイルスの全てのＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子を漏れ無く検出し、任意のインフルエンザウイルスの亜型を確実に判定できる遺伝子増幅（または核酸増幅）用のプライマーの作製方法を検討した。
　任意の亜型に属するＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子のすべてを検出するには、該亜型に属する全てのＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子を、亜型特異的かつ高感度に増幅し得るプライマーを設計する必要があった。これのみならず、実用性を高めるためには、用いるプライマーの本数をできる限り少数にする必要もあった。
　そこで、本発明者らは、ＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子で、ある特定のＨＡ亜型（例えばＨ５亜型）に注目した。その亜型の母集団に属す全てのＨＡ遺伝子を、塩基配列に基づいていくつかのグループ（ポピュレーションあるいは母集団）に分け、各グループに属するＨ５亜型のＨＡ遺伝子を検出し得るプライマーを、可能な限り少ない数になるように設計する方法を見出し、本発明を完成させた。
　ポピュレーションプライマー（Ｐプライマー）とは、本発明によって、初めて示されるプライマーの概念であり、遺伝子の集団を近縁な遺伝子からなる母集団に分け、母集団毎に設計するプライマーのことである。母集団ごとに設計したＰプライマーを混合して使用すれば、多様な遺伝子を漏れなく検出できると考えられる。本発明の実施例においては、この着想を実証するべく、Ｐプライマーの新規設計方法を見出し、Ｐプライマーの有用性について検討した。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（４３）である。
（１）病原体の型または亜型判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列からなるフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、相同性が高い塩基が集積する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）フォワードプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
（２）前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする上記（１）に記載のフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程
（３）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４および配列番号３６５で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする上記（１）または（２）に記載のフォワードプライマーのセット。
（４）病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、上記（１）または（２）に記載のフォワードプライマーの塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーのセット。
（５）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号３６７、配列番号３６８および配列番号３６９で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする上記（４）に記載のリバースプライマーのセット。
（６）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＦ２領域およびＦ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列からなるＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｄ）Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＦ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＦ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれる各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程
（７）病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記工程（ａ）および／または工程（ｅ）が下記の工程であることを特徴とする上記（６）に記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｅ）前記工程（ｄ）でカウントされた塩基数が４以上である検査対象遺伝子、および、カウントされた塩基の数が３であってコンセンサス配列の塩基と異なる塩基がＦ１領域またはＦ２領域のいずれかに偏っている検査対象遺伝子を抽出する工程
（８）前記Ｆ１領域の５’末端の塩基とＦ２領域の５’末端の塩基との間に、４０塩基～６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基数が１０塩基～２５塩基であることを特徴とする上記（６）または（７）に記載のＦＩＰプライマーのセット。
（９）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（６）ないし（８）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号１～配列番号２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１１５～配列番号１１９および配列番号１５６で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３１～配列番号１３３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット
（１０）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７および配列番号２８１で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする上記（６）ないし（８）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット。
（１１）病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、上記（６）ないし（８）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーのセット。
（１２）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（１１）に記載のＢＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号４６～配列番号８２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２２～配列番号１２８および配列番号１５７で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３４～配列番号１３６で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット
（１３）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２７８、配列番号２７９および配列番号２８０で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする上記（１１）に記載のＢＩＰプライマーのセット。
（１４）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦ３領域のコンセンサス配列からなるＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（６）または（７）に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
（１５）前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする上記（１４）に記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（６）または（７）に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程
（１６）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、上記（６）または（７）に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦ３プライマーのセット。
（１７）前記Ｆ３領域の３’末端の塩基と前記Ｆ２領域の５’末端の塩基との間に０～６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ３領域の塩基数が１０塩基～２５塩基であることを特徴とする上記（１４）ないし（１６）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
（１８）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（１４）ないし（１７）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号２１～配列番号３４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３７～配列番号１３８で表される塩基配列のプライマーからなるセット
（１９）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２６４、配列番号２６５および配列番号２６６で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする上記（１４）ないし（１７）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
（２０）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、上記（１４）ないし（１７）のいずれかに記載のＦ３プライマーの塩基配列の相補配列からなるＢ３プライマーのセット。
（２１）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（２０）に記載のＢ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号８３～配列番号９２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２９で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４２で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット
（２２）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２６７で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする上記（２０）に記載のＢ３プライマーのセット。
（２３）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦＬ領域のコンセンサス配列からなるＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（６）または（７）に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
（２４）前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする上記（２３）に記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（６）または（７）に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程
（２５）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、上記（６）または（７）に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦＬプライマーのセット。
（２６）前記ＦＬ領域の塩基数が１０塩基～２５塩基であることを特徴とする上記（２３）ないし（２５）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
（２７）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（２３）ないし（２６）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号３５～配列番号４５で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３９～配列番号１４１で表される塩基配列のプライマーからなるセット
（２８）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２６８、配列番号２６９および配列番号２７０で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする上記（２３）ないし（２６）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
（２９）上記（２３）ないし（２６）のいずれかに記載のＦＬプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＬプライマーのセット。
（３０）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（２９）に記載のＢＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号９３～配列番号１１４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１３０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット
（３１）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２７１および配列番号２７２で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする上記（２９）に記載のＢＬプライマーのセット。
（３２）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットおよび上記（４）または（５）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
（３３）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、上記（３）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび上記（５）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いることを特徴とする、上記（３２）に記載の方法。
（３４）上記（６）ないし（１０）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセットおよび上記（１１）ないし（１３）のいずれかに記載のＢＩＰプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
（３５）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、上記（９）に記載のＦＩＰプライマーのセットおよび上記（１２）に記載のＢＩＰプライマーのセットを用いることを特徴とする、上記（３４）に記載の方法。
（３６）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、上記（１０）に記載のＦＩＰプライマーのセットおよび上記（１３）に記載のＢＩＰプライマーのセットを用いることを特徴とする、上記（３４）に記載の方法。
（３７）上記（１４）ないし（１９）のいずれかに記載のＦ３プライーのセットおよび上記（２０）ないし（２２）のいずれかに記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする上記（３４）に記載の方法。
（３８）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、上記（１８）に記載のＦ３プライマーのセットおよび上記（２１）に記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いることを特徴とする、上記（３５）に記載の方法。
（３９）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、上記（１９）に記載のＦ３プライマーのセットおよび上記（２２）に記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いることを特徴とする、上記（３６）に記載の方法。
（４０）上記（２３）ないし（２８）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセットおよび上記（２９）または（３１）に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする上記（３７）に記載の方法。
（４１）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、上記（２７）に記載のＦＬプライマーのセットおよび上記（３０）に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いることを特徴とする、上記（３８）に記載の方法。
（４２）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、上記（２８）に記載のＦＬプライマーのセットおよび上記（３１）に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いることを特徴とする、上記（３９）に記載の方法。
（４３）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、上記（４）もしくは（５）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、上記（６）ないし（１０）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット、上記（１１）ないし（１３）のいずれかに記載のＢＩＰプライマーのセット、上記（１４）ないし（１９）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット、上記（２０）ないし（２２）のいずれかに記載のＢ３プライマーのセット、上記（２３）ないし（２８）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット、または、上記（２９）ないし（３１）のいずれかに記載のＢＬプライマーのセットの少なくとも１つのプライマーのセットを含む、病原体の型または亜型を判定するためのキット。
　本発明により、所望のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのプライマーのセットを、該型または亜型毎にその分類基準に従って設計することが可能になる。例えば、該プライマーのセットを、インフルエンザウイルスの任意のヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ遺伝子）やノイラミニダーゼ遺伝子（ＮＡ遺伝子）の亜型毎に設計し、使用することにより、検査対象となる亜型に属す遺伝子を、迅速かつ簡便に、漏れなく判定することが可能となる。
　また、本発明にかかるプライマーのセット、特に、ＬＡＭＰ法用に設計されたプライマーを使用することにより、検査対象のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を、迅速かつ簡便に、漏れなく判定することが可能となる。
図１は、第１の実施形態のフォワードプライマー設定領域（または、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、ＦＬ領域）の選定方法を示した模式図である。 図２は、第１の実施形態のフォワードプライマー設定領域（または、Ｆ３、ＦＬ領域）に対するプライマーの設計過程を模式的に示した図である。 図３は、第１の実施形態のフォワードプライマーと第２の実施形態のリバースプライマーのプライマー設定領域（図中の「プライマー領域」）を、ＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法を例として説明した図である。 図４は、ＦＩＰ領域（Ｆ１領域およびＦ２領域）に、ＦＩＰプライマーを設計する過程を模式的に示した図である。 鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型判定用の１１４本のＰプライマーセット（バージョン１）の設定位置を模式的に示した図（Ａ）と遺伝子（インフルエンザウイルスＶ１２４株）配列上にその位置を示した図である（Ｂ）。図中のＦ１ｃおよびＢ１ｃは、各々、Ｆ１およびＢ１の配列の相補鎖の配列（配列領域）を示す。 鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型判定用の１６本のＰＭ１６プライマーセットの設定位置を模式的に示した図（Ａ）と遺伝子（インフルエンザウイルスＶ１２４株）配列上にその位置を示した図である（Ｂ）。図中のＦ１ｃおよびＢ１ｃは、各々、Ｆ１およびＢ１の配列の相補鎖の配列（配列領域）を示す。 鳥インフルエンザウイルスＨ５型判定用の１１４本のＰプライマーセット（バージョン１）の各プライマー設定領域における各塩基の塩基出現率を示した図である。 図８は本実施例で用いた、Ｈ５亜型の鳥インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子について、１５株のＰＣＲテンペレートの塩基配列をアライメントした図である。 図９は、鳥インフルエンザウイルスＨ５型の判定における塩基ミスマッチ解析に使用したプライマーの番号とその組み合わせを示した図である。 図１０は、鳥インフルエンザウイルスＨ５型の判定における塩基ミスマッチ解析で使用したプライマーの番号とその塩基配列を示した図である。 鳥インフルエンザウイルスＨ７亜型のランプ法による判定用の１７本のＰＭ１７プライマーセットの設定位置を模式的に示した図（Ａ）と遺伝子（A/duck/Tsukuba/30/2007(H7N7)株を基準にした）配列上にその位置を示した図である（Ｂ）。 ＰＭ１７プライマーセットを使用して鳥インフルエンザウイルスＨ７型ＨＡの合成遺伝子をランプ法で増幅した場合の増幅の有無と、塩基ミスマッチ解析を行った結果を示す。 鳥インフルエンザウイルスＨ７型ＨＡ遺伝子について、ＰＭ１７プライマーセットでランプ法による増幅を行った場合に、増幅困難と判断される遺伝子との塩基ミスマッチ解析を行った結果を示す。 鳥インフルエンザウイルスＨ７亜型のリアルタイムＰＣＲ法による判定用のＰＭ８プライマーセットの設定位置を模式的に示した図（Ａ）と遺伝子（A/duck/Tsukuba/30/2007(H7N7)株を基準にした）配列上にその位置を示した図である（Ｂ）。図中のＦ１ｃおよびＢ１ｃは、各々、Ｆ１およびＢ１の配列の相補鎖の配列（配列領域）を示す。 Ｈ７－ＰＭ８プライマーセットを使用してリアルタイムＰＣＲ法で鳥インフルエンザウイルスＨ７型ＨＡの合成遺伝子を増幅した結果を示す。 Ｈ７－ＰＭ８プライマーセットを使用してリアルタイムＰＣＲ法で鳥インフルエンザウイルスＨ７型ＨＡの合成遺伝子を増幅した場合の増幅の有無と、塩基ミスマッチ解析の結果を示す。 Ｈ７－Ｍ３プライマーセットを使用してリアルタイムＰＣＲ法で鳥インフルエンザウイルスＨ７型ＨＡの合成遺伝子を増幅した結果を示す。Ａはユーラシア系統用のプライマー（ｅｕ）を用いた結果で、Ｂは北米系統用のプライマー（ａｍ）を用いた結果である。 Ｈ７－Ｍ３（ｅｕ；ユーラシア系統用、ａｍ；北米系統用）プライマーセットを使用してリアルタイムＰＣＲ法で鳥インフルエンザウイルスＨ７型ＨＡの合成遺伝子を増幅した場合の増幅の有無と、塩基ミスマッチ解析の結果を示す。 登録されているＨ７亜型ＨＡ遺伝子と各プライマーセットとの塩基ミスマッチ解析の結果を示す。各塩基ミスマッチ数（最左列に示す）を持つ各プライマーの数をまとめた。
　本発明の方法は、遺伝学的に分類されている遺伝子（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の型別に関係する遺伝子、より具体的にはインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子やＮＡ遺伝子など）の型別に利用することができる。例えば、Ａ型、Ｂ型またはＣ型インフルエンザウイルスのＨＡ亜型およびＮＡ亜型、特に、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ５亜型、Ｈ７亜型などについて、好適に実施することができる。
　本発明は、核酸増幅法、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法と称される核酸増幅法などを使用して、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体、特にインフルエンザウイルスの亜型を判定するためのプライマーのセットを提供するものである。また、ＬＡＭＰ法に限定されることなく、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ハイブリダーゼーション法など、広く遺伝子検査に用いるプライマーやプローブプライマー（本発明の実施形態に開示されるプライマーはプローブプライマーとしても利用することができる）の設計に利用することができる。
　また、本発明に係る実施例においては、ＬＡＭＰ法で遺伝子を検出する際に、何個の塩基ミスマッチ（使用するプライマーの塩基配列と増幅対象である遺伝子側のプライマー結合領域の塩基配列との間におけるミスマッチ）までならば、遺伝子検出が可能かについて、プライマーの領域毎に検討し、その成績を実施例に示した（詳細については、実施例を参照のこと）。
　その成績を参考にすれば、本発明のプライマーを用いることで、鳥インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ遺伝子に限定されることなく、それ以外のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の多様な遺伝子や、宿主の同一遺伝子ファミリーに属す遺伝子など、多様な遺伝子を、ＬＡＭＰ法等の遺伝子検査によって、正確に型別する際に応用できることが理解できる。
　ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子（検査対象となる遺伝子）の６つの領域に対して４種類のプライマーを、または、８つの領域に対して６種類のプライマーを設計し、鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼにより、恒温条件にて、検査対象遺伝子を増幅する方法である（特許文献１および特許文献２などを参照のこと）。例えば、４種類のプライマーを使用してＬＡＭＰ法を行う場合、検査対象遺伝子のセンス配列（アミノ酸をコードするセンス鎖の塩基配列）の５’側から、Ｆ３領域、Ｆ２領域およびＦ１領域を選択し、これらの領域の塩基配列を有する少なくとも２種類のプライマーのセットと、増幅対象の遺伝子のアンチセンス配列の５’側から、Ｂ３領域、Ｂ２領域およびＢ１領域を選択し、これらの領域の塩基配列を有する少なくとも２種類のプライマーのセットを対として、標的領域の増幅を行う。
　また、場合によっては、Ｆ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列の相補鎖の塩基配列を有するプライマー（ＦＬプライマー）と、Ｂ１領域とＢ２領域の間に存在する塩基配列の相補鎖の塩基配列を有するプライマー（ＢＬプライマー）を、上記４種類のプライマーにさらに加えた、６種類のプライマーでＬＡＭＰ法を実施してもよい。
　本発明の第１の実施形態は、遺伝子増幅検査（または核酸増幅検査）（例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法など）および核酸検出法（ＤＮＡチップ法、ＤＮＡハイブリダイゼーション法など）を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の型または亜型判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列からなるフォワードプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）フォワードプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
　まず、本明細書における「試料」とは、インフルエンザウイルスなどのウイルスの他、細菌、寄生虫等の病原体に感染している可能性がある動物（ヒトまたは非ヒト動物）の生体または排泄物から取得されたものを用いることができ、特に限定はしないが、例えば、血液試料、組織試料、より具体的には、喀痰、鼻汁、血液、唾液、血清、血漿、排泄物（尿、便など）などの他、組織等を洗浄した液（例えば、うがい液、鼻腔洗浄液など）などを挙げることができる。
　また、「検査対象遺伝子」とは、試料中のウイルスが、例えば、インフルエンザウイルスのＨＡ５亜型に属するものかどうかを判定する場合には、インフルエンザウイルスのＨ５亜型に属する全てのヘマグルチニン遺伝子のことである。つまり、試料中のウイルスが属すると予測されるウイルスの型または亜型の分類基準となる遺伝子であって、該型または亜型に属する全ての遺伝子のことである。ここで、「検査対象遺伝子」とは、特に限定はしないが、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型のインフルエンザウイルスの任意のＨＡ亜型またはＮＡ亜型に属する全てのヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ遺伝子）もしくはノイラミニダーゼ遺伝子（ＮＡ遺伝子）などを例示することができる。
　また、センス配列とは、データベースなどで、翻訳フレームとして登録されている鎖の遺伝子配列のことを指し、アンチセンス配列とは、センス配列の相補鎖の塩基配列を指す。
　検査対象遺伝子の塩基配列情報は、公知のデータベースや論文等から入手することができる。例えば、検査対象のウイルスが、Ａ型、Ｂ型またはＣ型のインフルエンザウイルスである場合、これらのウイルスの任意のＨＡ亜型に属する全てのウイルスのヘマグルチニン遺伝子の塩基配列情報、または任意のＮＡ亜型に属する全てのウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の塩基配列情報をデータベース（例えば、Influenza Sequence Database(http://www.flu.lanl.gov)など）または論文等から入手することができる。
　本発明の第１の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士のアライメントを行い、相同性が高い塩基が集積する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程である。アライメント（複数の塩基配列を整列させること）するには、公開されているアライメントソフトウェア（例えば、CLUSTAW(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)など）や市販のソフトウェア（例えば、ジェネティクス社製など）等を利用して行ってもよい。なお、アライメントした際にギャップが含まれていてもよい。
　フォワードプライマー設定領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。フォワードプライマー設定領域の塩基配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０～２５塩基程度、好ましくは、１５～２０塩基程度であればよい。
　ここで、「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域」を例示することができる。
　図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をフォワードプライマー設定領域として選択する方法を模式的に示した。図１では、任意の亜型に属するウイルス遺伝子が２２０３遺伝子存在すると仮定した。工程（ａ）の「高い相同性を有する領域」は、例えば、検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは９８％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または単一の塩基では出現率が低いが、上位２種類（場合によっては、上位３種類）の塩基の出現率の和が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上となる混合塩基Ｙから構成され、これらが９０％以上、望ましくは１００％となる、１０～３０個ほどの塩基が連続する領域のことである。
　まず、プライマーを作成する対象となる型または亜型に含まれる遺伝子センス配列（検査対象遺伝子のセンス配列）を全てアライメントし、対応する位置（図１では、位置１、位置２・・・のように示す）の塩基を比較して対応する全ての塩基位置について、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの出現率を求める。
　図１の位置１、位置４、位置５および位置１４に出現する塩基は、各々の位置において全て同一であり、「対応する位置の塩基の８０％以上が同一」であり、「単一塩基Ｘ」は、各々、Ａ（位置１）、Ｇ（位置４）、Ｇ（位置５）およびＡ（位置１４）である。また、位置２、位置７～位置１１、位置１３および位置１５については、いずれの位置においても最も多く出現する塩基が９７％以上の割合を占めているため、「対応する位置の塩基の８０％以上が同一」となり、「単一塩基Ｘ」は、各々、Ｃ（位置２）、Ｃ（位置７）、Ｔ（位置８）、Ｃ（位置９）、Ａ（位置１０）、Ｇ（位置１１）、Ａ（位置１３）、Ａ（位置１５）、Ｔ（位置１１）である。さらに、位置３、位置６、位置１２に出現する塩基ついては、出現頻度の高い上位２種類の塩基（位置３ではＴとＣ、位置６ではＡとＧ、位置１２ではＡとＧ）の出現率の和が、全塩基数（図１の場合は、２２０３個）の９０％以上を占めるので、「対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基」であり、「混合塩基Ｙ」は、各々、Ｙ（位置３）、Ｒ（位置６）、Ｒ（位置１２）である。
　なお、本明細書において混合塩基の表記は、ＩＵＰＡＣの表記法に基づく。
　以上のように、上記「高い相同性を有する領域」をフォワードプライマー設定領域として選択することができる。
　なお、後述のＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦＬ領域における「高い相同性を有する領域」も同様に選択することができる。
　本発明の第１の実施形態の工程（ｂ）は、各検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列を決定する工程である。
　ここで、コンセンサス配列とは、母集団を構成する検査対象遺伝子をアライメントし、それぞれの塩基位置において出現率が最も高い塩基からなる配列のことである。具体的には、アライメントさせた配列の全ての塩基位置において、４種類の塩基の出現率をそれぞれ求め、塩基出現率が最も高い塩基だけを順番に並べたものがコンセンサス配列である。コンセンサス配列を構成する各塩基の出現率は、「コンセンサス配列の塩基と同一の塩基を持つ検査対象遺伝子数/母集団を構成する全ての検査対象遺伝子数（％）」で示される。塩基出現率が高ければ保存性が高いと判定され、低ければ保存性が低いと判定される。母集団を構成する検査対象遺伝子をより多く検出するには、保存性の高い塩基から構成される領域にプライマーを設計する必要がある。また、母集団を構成する検査対象遺伝子が変われば、コンセンサス配列も異なるため、コンセンサス配列を基に設計するプライマーの塩基配列も異なることになる。
　本発明の第１の実施形態の工程（ｃ）は、工程（ｂ）で決定したコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程である。
　図２Ａを参照しながら説明する。例えば、遺伝子８の領域においては、左から（５’側から）３番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「１」である。また、遺伝子１１の領域においては、左から３番目、６番目、１５番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「３」である。
　なお、実施例においては、「コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数」を「塩基ミスマッチ数」と記載する（以下、同じ）。
　本発明の第１の実施形態の工程（ｄ）は、工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。
　ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値であり、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる数値である。
　塩基ミスマッチの限界値は、第１の実施形態のフォワードプライマーと後述の第２の実施形態のリバースプライマーを１組とし、次の様にして求めることができる。
　まず、検査対象遺伝子の中から、検査対象遺伝子を一つ選択する。これをテンペレートにして、上述の工程（ａ）で決定されるフォワードプライマー領域と、第２の実施形態の工程（ａ）で決定されるリバースプライマー領域に、一定数の塩基ミスマッチ（例えば、２０塩基のプライマーあたり、０～３個程度）を導入したプライマーを種々、設計する。それらのプライマーの様々なペアについて、ＰＣＲ等による遺伝子増幅の可否を調べる。これによって、増幅を許容するプライマーまたはプライマーペアあたり、遺伝子増幅を許容できる塩基ミスマッチ数の上限を明らかにできる。本明細書の実施例、「（Ｉ）鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型の判定方法」、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５－ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。
　「一定数」、すなわち、塩基ミスマッチの限界は、検査対象遺伝子によって異なるが、例えば、検査　対象遺伝子が、例えば、鳥インフルエンザウイルスの任意のＨＡ５またはＨＡ７亜型に属するＨＡ遺伝子の場合には、１～５の整数、好ましくは、２～４の整数、より好ましくは、３であり、さらに好ましくは２である。
　図２において一定数が「３」の場合には、抽出される遺伝子は、遺伝子１１、遺伝子１９および遺伝子２０となる（図２Ｂ）。
　本発明の第１の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたフォワードプライマー設定領域に新たなコンセンサス配列を決定する工程である（図２Ｂ）。
　そして、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）を行う。この工程（ｃ）～（ｅ）を抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで繰り返す。図２Ｃでは、２回目に抽出した検査対象遺伝子が遺伝子１９のみとなり（従って、この段階におけるコンセンサス配列は遺伝子１９の塩基配列となる）、さらに抽出する遺伝子は存在しないので、フォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列が全て決定されることになる。
　決定されたフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列の５’側から３’側に向かう配列をフォワードプライマーの配列として決定する。なお、「フォワードプライマーのセット」は、決定されたフォワードプライマーの全塩基配列を網羅するように混合塩基を含む混合塩基プライマーのセットとしてもよい。この場合、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
　各実施形態の「セット」とは、最初に決定されるコンセンサス配列およびその後の繰り返し工程で得られるコンセンサス配列（例えば、第１の実施形態であれば、工程（ｂ）および工程（ｃ）～（ｅ）を繰り返し行って得られる工程（ｅ）のコンセンサス配列）から構成されるプライマーの集団のことである（他の実施形態においても同じ）。
　本発明の第１の実施形態は、上記の工程を経て決定されるフォワードプライマーである。本実施形態のフォワードプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスがＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号３６２～３６５で表される配列からなるプライマーの集団を例示することができる。
　本発明の第２の実施形態は、第１の実施形態のフォワードプライマーの塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーである。第１の実施形態のフォワードプライマーと第２の実施形態のリバースプライマーを１組として、核酸増幅法に使用することができる。ただし、第１の実施形態で選択したフォワードプライマー設定領域と第２の実施形態で選択したリバースプライマー設定領域は、増幅したい領域を挟んで５’側に第１の実施形態のフォワードプライマー設定領域が、３’側に第２の実施形態のリバースプライマー設定領域が選択される必要がある。ＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法を例にして、第１の実施形態のフォワードプライマーおよび第２の実施形態のリバースプライマーのプライマー設定領域（図中の「プライマー領域」）を図３に例示したので参照のこと。
　リバースプライマーを作製するために第１の実施形態を行う場合には、第１の実施形態に記載した「フォワードプライマー設定領域」を、「リバースプライマー設定領域」と読み替えるものとする。
　すなわち、本発明の第２の実施形態は、遺伝子増幅検査（または核酸増幅検査）（例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法など）および核酸検出法（DNAチップ法、DNAハイブリダイゼーション法など）を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の型または亜型の判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるリバースプライマー設定領域のコンセンサス配列の相補配列からなるリバースプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をリバースプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）リバースプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のリバースプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のリバースプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のリバースプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
　工程（ｄ）の「一定数」については、第１の実施形態の工程（ｄ）の説明箇所を参照のこと。
　なお、「リバースプライマーのセット」は、決定されたリバースプライマーの全塩基配列を網羅するように混合塩基を含む混合塩基プライマーのセットとしてもよい。この場合、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
　本発明の第２の実施形態は、上記の工程を経て決定されるリバースプライマーである。本実施形態のリバースプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスがＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号３６７～３６９で表される配列からなるプライマーの集団を例示することができる。
　本発明の第１の実施形態は、リアルタイムＰＣＲ法に使用されるプローブプライマーの作製にも用いることができる。すなわち、第１の実施形態における「オリゴヌクレオチドプライマー」と「フォワードプライマー」または第２の実施形態における「リバースプライマー」を「プローブプライマー」に置き換えて、実施することで、リアルタイムＰＣＲ法に使用されるプローブプライマーの作製が可能である。
　本発明の第３の実施形態は、ＬＡＭＰ法を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＦ２領域およびＦ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列からなるＦＩＰプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程、
（ｄ）Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＦ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＦ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれる、各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数が、各領域のコンセンサスの塩基配列とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程
　本発明の第３の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであるＦＩＰプライマーのセットに関するものである。
　第３の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士のアライメントを行い、相同性の高い領域をＦ２領域として選択する工程であり、Ｆ２領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。Ｆ２領域の配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０～２５塩基程度、好ましくは、１５～２０塩基程度であればよい。
　検査対象遺伝子の情報の入手およびアライメントについては、第１の実施形態の工程（ａ）に関する説明を参照のこと。
　第３の実施形態の工程（ａ）の「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域」を例示することができる。
　図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をＦ２領域として選択する流れを模式的に示した。なお、詳細は、第１の実施形態の工程（ａ）の部分を参照のこと。
　Ｆ２領域（およびＦ１領域（後述））は、全ての対応する塩基位置において、塩基出現率が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上となる条件を満たす単一塩基Ｘ、および／または単一の塩基では出現率が低いが、上位２種類（場合によっては、上位３種類）の塩基の出現率の和が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上となる混合塩基Ｙから構成される領域で、１０～３０個ほどの塩基が連続する領域である。
　以上のようにして、Ｆ２領域を選択することができる。
　本発明の第３の実施形態の工程（ｂ）では、Ｆ１領域を選択する工程で、工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流の領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程である。
　「Ｆ２領域の３’末端より３’側下流の領域」を選択する場合、Ｆ２領域の３’末端からＦ１領域の５’末端までの距離は、特に限定はしないが、この部分は、ＬＡＭＰ法による核酸の増幅が行われるときに、ループを形成する部分になるため、例えば、Ｆ２領域の５’末端の塩基とＦ１領域の５’末端の塩基との間に、３０～７０塩基程度、好ましくは、４０～６０塩基程度存在するとよい。Ｆ１領域の配列の長さは、Ｆ２領域と同様、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよく、例えば、１０～２５塩基程度、好ましくは、１５～２０塩基程度である。
　Ｆ１領域は、さらに、Ｆ２領域の選択を行う場合に満たすべき要件を満たす必要がある。すなわち、Ｆ１領域とは、Ｆ２領域の３’末端より３’側下流の領域であるいう要件に加えて、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域」という要件を満たす必要がある。ここで、「高い相同性を有する領域」とは、例えば、限定はしないが、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域」のことである。
　本発明の第３の実施形態の工程（ｃ）は、各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列（第１の実施形態の工程（ｂ）の説明箇所を参照のこと）を決定しペアとして選択する工程である。ここで、「ペアとして選択する」のは、工程（ｃ）で決定したＦ１領域のコンセンサス配列とＦ２領域のコンセンサス配列を１組のコンセンサス配列として選択し、この１組のＦ１領域とＦ２領域の塩基配列を最終的にはＦＩＰプライマーの塩基配列とするためである。
　　本発明の第３の実施形態の工程（ｄ）は、Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列、および、Ｆ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する塩基同士を比較し、Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子のセンス配列毎にカウントする工程である。ここで、「Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数」とは、Ｆ１領域においてコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数と、Ｆ２領域においてコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を合計した数のことである。
　図４を参照しながら説明する。例えば、遺伝子１１のＦ２領域においては、左から（５’側から）３番目、６番目、１５番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「３」となり、Ｆ１領域においては、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「０」である。遺伝子１２のＦ２領域においては、左から６番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「１」となり、Ｆ１領域においては、左から６番目、１２番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「２」となる。また、遺伝子１４のＦ２領域においては、左から６番目、１２番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「２」となり、Ｆ１領域においては、左から６番目、１５番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「２」となる。
　本発明の第３の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値である。
　遺伝子増幅を許容する塩基ミスマッチ数の限界は、塩基ミスマッチを導入したプライマーを組合せた、様々なプライマーセットを用いて、ある１つの検査対象遺伝子の増幅の可否をＬＡＭＰ法で総当り的に調べれば、明らかにすることができる。用いるプライマーとしては、その標的遺伝子と塩基配列が完全に一致する６本のプライマーと、それらのプライマーに、標的遺伝子に対して一定数の塩基ミスマッチが生ずるように設計した変異プライマーである。
　６本のプライマーの中で、第３の実施形態のＦＩＰプライマーと後述の第４の実施形態のＢＩＰプライマーは、位置的に左右が逆であっても、増幅に果たす役割は同じと考えられる。同様に、後述の第５の実施形態のＦ３プライマーと後述の第６の実施形態のＢ３プライマー、また後述の第７の実施形態のＦＬプライマーと後述の第８の実施形態のＢＬプライマーも、遺伝子増幅において果たす役割は同じと考えられる。この点を考慮した上で、塩基ミスマッチ数の限界を次の様にして求めることができる。
　まず、第３の実施形態で選択されるＦ１およびＦ２領域、第４の実施形態で選択されるＢ１およびＢ２領域、第５の実施形態で選択されるＦ３領域、第６の実施形態で選択されるＢ３領域、第７の実施形態で選択されるＦＬ領域および第８の実施形態で選択されるＢＬ領域の各領域に結合するプライマー配列を、検査対象遺伝子の中から１つ選択した遺伝子について、各々設計する。また、ここで決定されるプライマーの塩基配列に、検査対象遺伝子の塩基配列とは異なる塩基（例えば、２０塩基あたり、０～３個程度）を一定数、導入したプライマーから構成されるセットを準備する。この際に、ＦＩＰとＢＩＰ、Ｆ３とＢ３、ＦＬとＢＬが左右対称であることを踏まえて、再現性がある結論が得らえるように、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数を左右対称にする。こうして組み合わせたプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法による検査対象遺伝子の増幅を調べる。その結果、増幅できたプライマーセットの各領域に含まれる変異ミスマッチ数と、増幅できなかったプライマーセットの各領域に含まれる変異ミスマッチ数を分析して、各プライマー領域当たりの塩基ミスマッチの限界値を決定することができる。（なお、本明細書の実施例、「（Ｉ）鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型の判定方法」、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５－ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。）
　「一定数」、すなわち、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数の限界値は、原則としてどの領域でも同じと考えられる。もっとも、ＦＩＰとＢＩＰは、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬと比べて２倍程度の長さがあるので、プライマー当たりの塩基ミスマッチ数は２倍になるが、プライマーとテンペレートの結合は、原則として、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数に規定される。したがって、これらのことを踏まえて、ＦＩＰプライマー（ＢＩＰも同様）を設計する際には、合計の塩基ミスマッチ数と、塩基ミスマッチがＦ１（Ｂ１）領域またはＦ２（Ｂ２）領域のいずれか一方に偏らないように配慮することも重要である。あるいは、それぞれの領域に全て塩基ミスマッチがある場合と、一部の領域に塩基ミスマッチがある場合では、遺伝子増幅の難易では異なる。そこで、８領域の合計塩基ミスマッチ数を踏まえて、総合的に増幅を推定する必要がある。同様に、Ｆ１領域（Ｂ１領域も同じ）が塩基ミスマッチによって弱く結合しているところに、Ｆ１領域にある塩基ミスマッチによって、Ｆ１領域がさらに弱く結合するとすれば、単独領域からなるＦ３、ＦＬ（Ｂ３、ＢＬも同じ）プライマーに比べて、遺伝子増幅はより困難になると考えらえる。これらのことを踏まえて、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数の限界値と、全てのプライマー領域の合計ミスマッチ数を実験によって明らかにすることができる。また、実験の再現性が得らえるように、左右対称性を踏まえて、様々なプライマーの組合せについて検討し、塩基ミスマッチ数の限界値を明らかにすることができる。
　工程（ｅ）を、「工程（ｄ）でカウントされた塩基数が４以上である検査対象遺伝子、および、カウントされた塩基の数が３であって、それがＦ１領域またはＦ２領域のいずれかに偏っている検査対象遺伝子を抽出する工程」として実施する場合について、図４を参照しながら説明をする。
　例えば、遺伝子１４では、コンセンサス配列と異なる塩基の数はＦ２領域で「２」で、Ｆ１領域では「２」であることから、「Ｆ１領域および他のＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数」は、「４」となる。従って、遺伝子１４のＦ１領域とＦ２領域は工程（ｅ）において抽出の対象となる。
　また、遺伝子１１のＦ２領域では、コンセンサス配列とは異なる塩基の数は「３」であり、Ｆ１領域については「０」であることから、「Ｆ１領域および他のＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数」は、「３」となる。ここで、コンセンサス配列と異なる塩基が、Ｆ１またはＦ２領域に偏っているかどうかを確認すると、コンセンサス配列と異なる塩基は、Ｆ１領域に偏っている。従って、遺伝子１１のＦ１領域とＦ２領域も工程（ｅ）において抽出の対象となる。
　次に、遺伝子１２の遺伝子のＦ２領域では、コンセンサス配列と異なる塩基の数は「１個」であり、Ｆ１領域については「２個」であることから、「Ｆ１領域および他のＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数」は、「３個」となる。しかし、コンセンサス配列とは異なる塩基がＦ１領域とＦ２領域のいずれか一方に偏らないことから、遺伝子１２のＦ１領域とＦ２領域は抽出の対象とはならない（図４Ａを参照）。
　本発明の第３の実施形態の工程（ｆ）は、工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程である。
　そして、工程（ｇ）において、工程（ｆ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｄ）、工程（ｅ）および工程（ｆ）を行い、抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｄ）～（ｆ）を繰り返す。
　以上の工程を行った後、決定されたＦ１領域とＦ２領域のコンセンサス配列のペアを全て選択し、各コンセンサス配列のペアにおいて、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の相補鎖の塩基配列（Ｆ１ｃ配列とする）を５’末端側に有する塩基配列をＦＩＰプライマーの塩基配列として決定する。なお、「ＦＩＰプライマーのセット」は、決定されたＦＩＰプライマーの全塩基配列を網羅するように混合塩基を含む混合塩基プライマーのセットとしてもよい。この場合、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
　本発明の第３の実施形態は、上記の工程を経て決定されるＦＩＰプライマーのセットである。本実施形態のＦＩＰプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号１～配列番号２０（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１１５～配列番号１１９および配列番号１５６（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１３１～１３３（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＦＩＰプライマーのセットとして例示することができる。
　本発明の第４の実施形態は、第３の実施形態のＦＩＰプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーである。第３の実施形態のＦＩＰプライマーと第４の実施形態のＢＩＰプライマーを１組として（つまり、順方向プライマーと逆方向プライマーとして）、ＬＡＭＰ法による核酸増幅法に使用することができる。
　ただし、第３の実施形態で選択したＦ２領域と第４の実施形態で選択したＢ２領域は、増幅したい領域を挟んで、５’側に第３の実施形態のＦ２領域が、３’側に第４の実施形態のＢ２領域が設定される必要がある。詳細は、図５または図６のＡを参照のこと。
　なお、第４の実施形態のＢＩＰプライマーを作製するために第３の実施形態を実施する場合には、第３の実施形態に記載の「ＦＩＰ」、「Ｆ１」および「Ｆ２」を、各々、「ＢＩＰ」、「Ｂ１」および「Ｂ２」と読み替えるものとする。
　すなわち、本発明の第４の実施形態は、ＬＡＭＰ法を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＢ２領域およびＢ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｂ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＢ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｂ２領域と同じ要件を満たす領域をＢ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＢ１領域の塩基配列同士およびＢ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＢ１領域の塩基配列およびＢ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程、
（ｄ）Ｂ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＢ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＢ１領域およびＢ２領域の塩基配列に含まれる、各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数が、各領域のコンセンサスの塩基配列とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＢ１領域の塩基配列同士およびＢ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＢ１領域の塩基配列およびＢ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程
　工程（ｅ）の「一定数」については、第３の実施形態の工程（ｅ）の説明箇所を参照のこと。
　なお、「ＢＩＰプライマーのセット」は、決定されたＢＩＰプライマーの全塩基配列を網羅するように混合塩基を含む混合塩基プライマーのセットとしてもよい。この場合、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
　本発明の第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であるかどうかを判定する場合に好適に使用できる配列番号４６～配列番号８２（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２２～配列番号１２８および配列番号１５７（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）または配列番号１３４～１３６（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＢＩＰプライマーのセットとして例示することができる。
　本発明の第５の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦ３領域のコンセンサス配列からなるＦ３プライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
　Ｆ３領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。Ｆ３領域の配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０～２５塩基程度、好ましくは、１５～２０塩基程度にしてもよい。
　また、Ｆ３領域は、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’末端よりも、５’側に存在する領域に選択される。Ｆ２領域の５’末端の塩基とＦ３領域の３’末端の塩基との間に、例えば、０～６０塩基程度、好ましくは、５～４０塩基程度、より好ましくは、１０～２５塩基程度存在するとよい。
　本発明の第５の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程である。
　ここで、「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域」を例示することができる。
　図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をＦ３領域として選択する方法を模式的に示した。詳細な説明は第１の実施形態の工程（ａ）の説明部分を参照のこと。
　本発明の第５の実施形態の工程（ｂ）は、Ｆ３領域同士をアライメントし、アライメントした各Ｆ３領域からコンセンサス配列（第１の実施形態の工程（ｂ）の説明箇所を参照のこと）を決定する工程である。
　本発明の第５の実施形態の工程（ｃ）は、Ｆ３領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列について、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程である。「コンセンサス配列と異なる塩基の数」については、第１の実施形態の工程（ｃ）の説明箇所を参照のこと。
　本発明の第５の実施形態の工程（ｄ）は、工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。
　ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値であり、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる数値である。
　塩基ミスマッチの限界値は、第３の実施形態のＦＩＰプライマーと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのペア、第５の実施形態のＦ３プライマーと後述の第６の実施形態のＢ３プライマーのペア、必要な場合には、後述第７の実施形態のＦＬプライマーと後述の第８の実施形態のＢＬプライマーのペアを１セットとして、次の様にして求めることができる。
　まず、第３の実施形態で選択されるＦ１およびＦ２領域、第４の実施形態で選択されるＢ１およびＢ２領域、第５の実施形態で選択されるＦ３領域、第６の実施形態で選択されるＢ３領域、第７の実施形態で選択されるＦＬ領域および第８の実施形態で選択されるＢＬ領域の各領域に結合するプライマー配列を各々決定する。ここで決定されたプライマーの塩基配列に対し、一定数の変異（例えば、２０塩基あたり、０～５または０～３個程度の変異）を導入したプライマーペア（すなわち、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーとＢＬプライマーのペア）を、各々、複数ペア設計し、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーおよびＢＬプライマーのペアからなるプライマーのセットを複数セット準備する。準備したプライマーセットを用いて、検査対象遺伝子の中から、１つの遺伝子を選択し、この遺伝子をテンペレートとして、ＬＡＭＰ法を実施する。その結果、増幅することができたプライマーセットの各領域に含まれる変異の数と増幅できなかったプライマーセットの各領域に含まれる変異の数を調べ、各プライマー領域当たり何個の塩基ミスマッチまでなら遺伝子増幅が起こるのか、各プライマー領域の合計で何個の塩基ミスマッチ数なら遺伝子増幅はされるのか、塩基ミスマッチの影響を受けやすいプライマー領域はあるのか、などの点に基づいて、塩基ミスマッチ数の限界値を決定することができる。本明細書の実施例、「（Ｉ）鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型の判定方法」、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５－ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。
　「一定数」、すなわち、塩基ミスマッチの限界は、検査対象遺伝子によって異なるが、例えば、検査　対象遺伝子が、例えば、鳥インフルエンザウイルスの任意のＨＡ５亜型に属するＨＡ遺伝子の場合には、１～５の整数、好ましくは、２～４の整数、より好ましくは、３である。
　図２において一定数が「３」の場合には、抽出される遺伝子は、遺伝子１１、遺伝子１９および遺伝子２０となる（図２Ｂ）。
　本発明の第５の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程である（図２Ｂ）。
　そして、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）を行い、抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｃ）～（ｅ）を繰り返す。図２Ｃでは、２回目に抽出した検査対象遺伝子が遺伝子１９のみとなり（従って、この段階におけるコンセンサス配列は遺伝子１９のＦ３領域の塩基配列である）、さらに抽出する遺伝子は存在しないので、Ｆ３領域のコンセンサス配列を全て決定されることになる。
　決定されたＦ３領域のコンセンサス配列の５’側から３’側に向かう配列をＦ３プライマーの配列として決定する。
　本発明の第５の実施形態に係るＦ３プライマーは、上記工程（ａ）により決定されたＦ３領域について、工程（ｂ）～（ｅ）を行わずに、あるいは、工程（ｂ）～（ｅ）を行った上で、全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦ３領域の塩基配列を網羅する（全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦ３領域の塩基配列を含む）ように混合塩基を含む混合塩基プライマーを調製し、Ｆ３プライマーとしてもよい。なお、混合塩基プライマーを作製する場合は、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
　本発明の第５の実施形態のＦ３プライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号２１～配列番号３４（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２０（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統の統合用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１３７、１３８で表される配列（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）からなるプライマーの集団をＦ３プライマーのセットとして例示することができる。
　本発明の第６の実施形態は、第５の実施形態のＦ３プライマーの塩基配列の相補配列からなるＢ３プライマーである。第５の実施形態のＦ３プライマーと第６の実施形態のＢ３プライマーを１組として（つまり、順方向プライマーと逆方向プライマーとして）、ＬＡＭＰ法による核酸増幅法に使用することができる。
　ただし、第５の実施形態で選択したＦ３領域と第６の実施形態で選択したＢ３領域は、増幅したい領域を挟んで５’側に第５の実施形態のＦ３領域が、３’側に第６の実施形態のＢ３領域が設定される必要がある。詳細は、図５または図６のＡを参照のこと。
　なお、第６の実施形態のＢ３プライマーを作製するために第５の実施形態を実施する場合には、第３の実施形態に記載の「Ｆ２」および「Ｆ３」を、各々、「Ｂ２」および「Ｂ３」と読み替えるものとする。
　すなわち、本発明の第６の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＢ３領域のコンセンサス配列の相補配列からなるＢ３プライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第４の実施形態におけるＢ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＢ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＢ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＢ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
　工程（ｄ）の「一定数」については、第５の実施形態の工程（ｄ）の説明箇所を参照のこと。
　なお、Ｂ３プライマーは、Ｆ３プライマーと同様に、混合塩基を含む混合塩基プライマーとしてもよい。この場合、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
　本発明の第６の実施形態のＢ３プライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるインフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ５亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号８３～配列番号９２（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２９（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１４２（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＢ３プライマーのセットとして例示することができる。
　本発明の第７の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦＬ領域のコンセンサス配列からなるＦＬプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
　ＦＬ領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。Ｆ３領域の配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０～２５塩基程度、好ましくは、１５～２０塩基程度にしてもよい。
　また、ＦＬ領域は、上記Ｆ１領域とＦ２領域の間に選択される。ＦＬ領域とＦ１領域またはＦ２領域との距離は特に限定されない。
　本発明の第７の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程である。
　ここで、「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域」を例示することができる。
　図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をＦＬ領域として選択する方法を模式的に示した。詳細な説明は第１の実施形態の工程（ａ）の説明部分を参照のこと。
　本発明の第７の実施形態の工程（ｂ）は、ＦＬ領域同士をアライメントし、アライメントした各ＦＬ領域からコンセンサス配列（第１の実施形態の工程（ｂ）の説明箇所を参照のこと）を決定する工程である。
　本発明の第７の実施形態の工程（ｃ）は、ＦＬ領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程である。「コンセンサス配列と異なる塩基の数」については、第１の実施形態の工程（ｃ）の説明箇所を参照のこと。
　本発明の第７の実施形態の工程（ｄ）は、工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。
　ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値であり、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる数値である。
　塩基ミスマッチの限界値は、第３の実施形態のＦＩＰプライマーと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのペア、第５の実施形態のＦ３プライマーと第６の実施形態のＢ３プライマーのペア、第７の実施形態のＦＬプライマーと後述の第８の実施形態のＢＬプライマーのペアを１セットとして、次の様にして求めることができる。
　まず、第３の実施形態で選択されるＦ１およびＦ２領域、第４の実施形態で選択されるＢ１およびＢ２領域、第５の実施形態で選択されるＦ３領域、第６の実施形態で選択されるＢ３領域、第７の実施形態で選択されるＦＬ領域および第８の実施形態で選択されるＢＬ領域の各領域に結合するプライマー配列を各々決定する。ここで決定されたプライマーの塩基配列に対し、一定数の変異（例えば、２０塩基あたり、０～５または０～３個程度の変異）を導入したプライマーペア（すなわち、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーとＢＬプライマーのペア）を、各々、複数ペア設計し、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーおよびＢＬプライマーのペアからなるプライマーのセットを複数セット準備する。準備したプライマーセットを用いて、検査対象遺伝子の中から、１つの遺伝子を選択し、この遺伝子をテンペレートとして、ＬＡＭＰ法を実施する。その結果、増幅することができたプライマーセットの各領域に含まれる変異の数と増幅できなかったプライマーセットの各領域に含まれる変異の数を調べ、各プライマー領域当たり何個の塩基ミスマッチまでなら遺伝子増幅が起こるのか、各プライマー領域の合計で何個の塩基ミスマッチ数なら遺伝子増幅はされるのか、塩基ミスマッチの影響を受けやすいプライマー領域はあるのか、などの点に基づいて、塩基ミスマッチ数の限界値を決定することができる。本明細書の実施例、「（Ｉ）鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型の判定方法」、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５－ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。
　「一定数」、すなわち、塩基ミスマッチの限界は、検査対象遺伝子によって異なるが、例えば、検査　対象遺伝子が、例えば、鳥インフルエンザウイルスの任意のＨＡ５亜型に属するＨＡ遺伝子の場合には、１～５の整数、好ましくは、２～４の整数、より好ましくは、３である。
　図２において一定数が「３」の場合には、抽出される遺伝子は、遺伝子１１、遺伝子１９および遺伝子２０となる（図２Ｂ）。
　本発明の第７の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程である（図２Ｂ）。
　そして、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）を行い、抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｃ）～（ｅ）を繰り返す。図２Ｃでは、２回目に抽出した検査対象遺伝子が遺伝子１９のみとなり（従って、この段階におけるコンセンサス配列は遺伝子１９のＦ３領域の塩基配列である）、さらに抽出する遺伝子は存在しないので、ＦＬ領域のコンセンサス配列を全て決定されることになる。
　決定されたＦＬ領域のコンセンサス配列の５’側から３’側に向かう配列をＦＬプライマーの配列として決定する。
　本発明の第７の実施形態に係るＦＬプライマーは、上記工程（ａ）により決定されたＦＬ領域について、工程（ｂ）～（ｅ）を行わずに、あるいは、工程（ｂ）～（ｅ）を行った上で、全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦＬ領域の塩基配列を網羅する（全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦＬ領域の塩基配列を含む）ように混合塩基を含む混合塩基プライマーを調製し、ＦＬプライマーとしてもよい。なお、混合塩基プライマーを作成する場合は、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
　本発明の第７の実施形態のＦＬプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ５亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号３５～配列番号４５（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２１（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統の統合用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１３９～１４１で表される配列（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）からなるプライマーの集団をＦＬプライマーのセットとして例示することができる。
　本発明の第８の実施形態は、第７の実施形態のＦＬプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＬプライマーである。第７の実施形態のＦＬプライマーと第８の実施形態のＢＬプライマーを加えることで、ＬＡＭＰ法による核酸の検出時間を短縮するのに有効である。
　ただし、第７の実施形態で選択したＦＬ領域と第８の実施形態で選択したＢＬ領域は、増幅したい領域を挟んで５’側に第７の実施形態のＦＬ領域が、３’側に第８の実施形態のＢＬ領域が設定される必要がある。詳細は、図５または図６のＡを参照のこと。
　なお、第８の実施形態のＢＬプライマーを作製するために第７の実施形態を実施する場合には、第７の実施形態に記載の「Ｆ１」、「Ｆ２」および「ＦＬ」を、各々、「Ｂ１」、「Ｂ２」および「ＢＬ」と読み替えるものとする。
　すなわち、本発明の第８の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＢＬ領域のコンセンサス配列の相補配列からなるＢＬプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第４の実施形態におけるＢ１領域とＢ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＢＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＢＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＢＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
　工程（ｄ）の「一定数」については、第７の実施形態の工程（ｄ）の説明箇所を参照のこと。
　なお、ＢＬプライマーは、ＦＬプライマーと同様に、混合塩基を含む混合塩基プライマーとしてもよい。この場合、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。
　本発明の第８の実施形態のＢＬプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であるかどうかを判定する場合に好適に使用可能な、配列番号９３～配列番号１１４（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１３０（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１４３（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＢＬプライマーのセットとして例示することができる。
　本発明の第１～第８の実施形態のプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成法として当該分野において公知の方法（例えば、ホスホジエステル法など）により、ＤＮＡ自動合成装置などを用いて合成してもよく、あるいは、受託合成を行う機関等に委託して合成してもよい。
　本発明の第９の実施形態は、少なくとも本発明の第１の実施形態のフォワードプライマーのセットと第２の実施形態のリバースプライマーのセットのペア、あるいは、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットのペアを用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法である。少なくとも本発明の第１の実施形態のフォワードプライマーのセットと第２の実施形態のリバースプライマーのセットのペア、あるいは、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットのペアを用いて核酸増幅反応を行い、増幅断片が得られた場合（または、得られた断片の長さ等を確認して想定される長さであった場合）、想定される型または亜型由来の遺伝子由来であると判定することができる。
　第１の実施形態のフォワードプライマーと第２の実施形態のリバースプライマーのセットは、従来のＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ－リアルタイムＰＣＲなどの他、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法など、核酸増幅のためのプライマーペアを使用して、目的の核酸領域を増幅する方法全てに使用することができる。
　また、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットは、核酸増幅法全般に使用してもよいが、特に、ＬＡＭＰ法による核酸増幅法に好適に使用することができる。ＦＩＰプライマーのセットとＢＩＰプライマーのセットに加えて、さらに、本発明の第５の実施形態のＦ３プライマーのセットと本発明の第６の実施形態のＢ３プライマーのセット、および／または本発明の第７の実施形態のＦＬプライマーのセットと本発明の第８の実施形態のＢＬプライマーのセットを用いて、ＬＡＭＰ法を行ってもよい。
　なお、本発明の実施形態のプライマーを用いて、ＬＡＭＰ法により試料中の病原体の型または亜型を判定する場合、各型または亜型に含まれる１遺伝子当たり、全てのプライマーの塩基ミスマッチ数（最小値）の合計が、７個以下となることが望ましい。
　第１の実施形態のフォワードプライマーのセットと第２の実施形態のリバースプライマーのセットのペア（リアルタイムＰＣＲ法の場合はプローブプライマーを加えた３種類のプライマーセット）、あるいは、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットのペアを用いて、核酸増幅法を実施すると、フォワードプライマーとリバースプライマー（リアルタイムＰＣＲ法の場合はプローブプライマーを加えた３種類のプライマーセット）、あるいは、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーで挟まれる遺伝子領域を含む領域が増幅される（例えば、図３、図５および図６のＡを参照のこと）。従って、フォワードプライマーとリバースプライマー、あるいは、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーによって挟まれる領域が、核酸合成酵素によって増幅可能な距離となるように、Ｆ２領域およびＢ２領域を選択する必要がある。ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーで挟まれる距離は、特に限定はしないが、例えば、５０ベース～３００ベース程度、好ましくは、１００ベース～２００ベース程度である。
　なお、本発明の第１～第８の実施形態のプライマーのセットのいずれかを使用し、ペアとなる他方のプライマーは、本発明にかかるプライマー以外のプライマーを使用して、核酸増幅法を実施することは可能であるから、本発明の第１～第８の実施形態のプライマーのいずれか１つを使用した場合も、本発明の実施にあたることは言うまでもない。
　本発明の第９の実施形態に係る亜型の判定方法において、判定対象が鳥インフルエンザウイルスのＨ７亜型である場合、リアルタイムＰＣＲ法を実施するためのプライマーセット（フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブプライマー）に含まれるプライマーの塩基配列を、表１１に示した（実施例を参照のこと）。
　本発明の第９の実施形態に係る亜型の判定方法において、判定対象が鳥インフルエンザウイルスのＨ５亜型である場合、ＬＡＭＰ法を実施するためのプライマーセット（ＦＩＰ、Ｆ３、ＦＬ、ＢＩＰ、Ｂ３およびＢＬプライマーからなるセット）に含まれるプライマーの塩基配列を、以下に配列番号で例示する。
（１）プライマーセット（Ｈ５亜型のユーラシア系統用「バージョン１」）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１～配列番号２０
Ｆ３プライマーのセット；配列番号２１～配列番号３４
ＦＬプライマーのセット；配列番号３５～配列番号４５
ＢＩＰプライマーのセット；配列番４６～配列番号８２
Ｂ３プライマーのセット；配列番号８３～配列番号９２
ＢＬプライマーのセット；配列番号９３～配列番号１１４
（２）プライマーセット２（Ｈ５亜型のユーラシア系統用「ＰＭ１６プライマーセット」）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１１５～配列番号１１９
Ｆ３プライマーのセット；配列番号１２０
ＦＬプライマーのセット；配列番号１２１
ＢＩＰプライマーのセット；配列番１２２～配列番号１２８
Ｂ３プライマーのセット；配列番号１２９
ＢＬプライマーのセット；配列番号１３０
（３）プライマーセット３（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１３１～配列番号１３３
Ｆ３プライマーのセット；配列番号１３７～配列番号１３８
ＦＬプライマーのセット；配列番号１３９～配列番号１４１
ＢＩＰプライマーのセット；配列番号１３４～配列番号１３６
Ｂ３プライマーのセット；配列番号１４２
ＢＬプライマーのセット；配列番号１４３
（４）プライマーセット４（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用「ＰＭ１８プライマーセット」）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１１５～配列番号１１９および配列番号１５６
Ｆ３プライマーのセット；配列番号１２０
ＦＬプライマーのセット；配列番号１２１
ＢＩＰプライマーのセット；配列番１２２～配列番号１２８および配列番号１５７
Ｂ３プライマーのセット；配列番号１２９
ＢＬプライマーのセット；配列番号１３０
　また、判定対象が鳥インフルエンザウイルスのＨ７亜型である場合、ＬＡＭＰ法を実施するためのプライマーセット（ＦＩＰ、Ｆ３、ＦＬ、ＢＩＰ、Ｂ３およびＢＬプライマーからなるセット）に含まれるプライマーの塩基配列を、以下に配列番号で例示する。
ＦＩＰプライマーのセット；
配列番号２７３（プライマー名；P2472）、配列番号２７４（P2473）、配列番号２７５（P2474）、配列番号２７６（P2475）、配列番号２７７（P2476）および配列番号２８１（P2573）
Ｆ３プライマーのセット；
配列番号２６４（P2456）、配列番号２６５（P2469）および配列番号２６６（P2470）
ＦＬプライマーのセット；
配列番号２６８（P2459）、配列番号２６９（P2460）および配列番号２７０（P2461）
ＢＩＰプライマーのセット；
配列番号２７８（P2477）、配列番号２７９（P2478）および配列番号２８０（P2479）
Ｂ３プライマーのセット；
配列番号２６７（P2458）
ＢＬプライマーのセット；
配列番号２７１（P2461）および配列番号２７２（P2462）
　ここで、ウイルスの遺伝子の抽出あるいはｃＤＮＡの調製は、常法に従って行うことができる。例えば、判定対象のウイルスがインフルエンザウイルスである場合、インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスであるため、試料からインフルエンザウイルス遺伝子であるＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型にして、ＬＡＭＰ法を行ってもよい。あるいは、ＬＡＭＰ法の核酸増幅反応を行う反応液中に逆転写酵素を添加し、核酸増幅反応を行ってもよい。ＬＡＭＰ法による核酸増幅を行うために使用するＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する鎖型依存性核酸合成酵素であれば、特に限定されない。このような酵素としては、Bst DNAポリメラーゼ、Bct(exo-)DNAポリメラーゼ、Csa DNAポリメラーゼなどが挙げられる。
　また、本実施形態で使用される逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する活性を持つ酵素であればいかなる酵素であってもよく限定はされないが、あえて例示するなら、例えば、M-MVL（Moloney Murine Leukemia Virus）やAMV（Avian Myeloblastosis Virus）などのレトロウイル由来の逆転写酵素、好熱性真正細菌Thermus thermophilusHB8由来の逆転写酵素などを挙げることができる。
　ＬＡＭＰ法による増幅産物の検出は公知の方法によって行うことができる。例えば、増幅反応の過程で生じるピロリン酸マグネシウムの量が増大すると反応液が白濁するため、目視により増幅産物の存在を確認することができる。また、反応液中にカルセインを添加しておくと、反応前はマンガンイオンと結合して消光しているカルセインが、増幅反応の過程において生成するピロリン酸イオンによってマンガンイオンが奪われることにより、蛍光を発すようになり、増幅産物の存在を確認することができる。あるいは、増幅産物をアガロース電気泳動によって分離するとラーダー上のバンドが複数生じるため、このバンドを検出することで増幅産物の存在を確認してもよい。
　本発明の第１０の実施形態は、本発明の第１～第８の実施形態のプライマーのセットの少なくともいずれか１セットを含む、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのキットである。また、本発明の実施形態に係るキットには、ＲＮＡを抽出するための試薬、核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ－リアルタイムＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法など）による核酸増幅に必要なバッファーや試薬等のほか、使用説明書等を含んでいてもよい。
　本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書中に英語の不定冠詞である「a」、「an」および定冠詞である「the」が含まれる場合、これらの冠詞は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数および複数のいずれをも指すものとして用いられる。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
（Ｉ）鳥インフルエンザウイルスＨ５亜型の判定方法
材料および実験方法
１．プライマーデータベース
　鳥インフルエンザウイルス、ユーラシア系統のＨ５亜型に属する２２１１個のＨＡ遺伝子の塩基配列は、 “Influenza Virus Resource” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)より取得し、取得した全てのＨＡ遺伝子をアライメントした。アライメントした遺伝子配列をExcelシートに転載し、プライマー用のデータベースを作成した。このプライマー用データベースを用いて、２２１１個のＨＡ遺伝子について、全ての塩基位置における、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣの出現率（％）を求めた。
　ＨＡ遺伝子上の各プライマー（ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬ）の位置は、ＨＡ開裂部位の近傍に設定した（図４Ａおよび図５Ａ）。また、後述する３種類のプライマーセット（Ｓプライマーセット、ＭプライマーセットおよびＰプライマーセット）は、有効性を正しく比較できるように、全てを同じ領域に設定した。
２．プライマーの設計
２－１．ウイルス株の遺伝子に特異的なプライマー（Ｓプライマー）
　Ｓプライマーは、A/duck/Tsukuba/9/2005 (H5N2)（Ｖ１２４株と略す） のＨＡ遺伝子（アクセッション番号； BAJ23243)を標的に設計されたもので、現在、一般的に使用されているＬＡＭＰ法用のプライマーの例として用いたものである。
２－３．混合塩基を含むプライマー（Ｍプライマー）
　Ｍプライマーは、多様なＨＡ遺伝子をＰＣＲ法を用いて幅広く検出するために必須のプライマーである（Tsukamotoら, J Clin Microbiol 48:4275-4278, 2010.）。そこで本実施例では、ＭプライマーがＬＡＭＰ法によるＨＡ遺伝子の広範な検出にどの程度有用かを検討した。ＨＡ遺伝子の各塩基位置において、単一の塩基（Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ）では、使用した２２１１個の遺伝子の９８％以上をカバーできない塩基がある場合には、遺伝子のカバー率を高めるために混合塩基を用いて、Ｍプライマーを設計した。プライマー当たりの混合塩基の数は原則として５個以下としたが、それでも塩基カバー率が低い塩基位置がある場合には６個以上の混合塩基を用いても良いとした。
２－４．ポピュレーションプライマー（Ｐプライマー）
　Ｐプライマーは、ＬＡＭＰ法によって多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出するために、本発明者らが初めて開発したプライマーである。Ｐプライマーのセットは、プライマー領域において、塩基配列が近縁なＨＡ遺伝子の集団毎にプライマーを設計し、それらを集めたプライマーのセットである。
　本研究において（後述）、Ｐプライマーの塩基配列と遺伝子側の塩基配列の間に塩基ミスマッチが２個以内の場合は、該Ｐプライマーで遺伝子増幅が可能であった。これに対して、塩基ミスマッチが３個以上ある遺伝子は、該Ｐプライマーで増幅に６０分以上を必要とするか、増幅されない場合があり、安定した遺伝子検出が困難であった。そこで、各プライマー領域において、塩基ミスマッチ数が２個以下になるようにＰプライマーを設計し、３個以上の遺伝子については、その遺伝子集団を構成する遺伝子をなるべく多くカバーするように、これらのコンセンサス配列からなる新規Ｐプライマーを設計した。新規Ｐプライマーでもカバーできない遺伝子の集団については、新らたな新新規Ｐプライマーを設計した。これを繰り返すことによって、２２１１個の全ての遺伝子に対して、塩基ミスマッチ数が２個以下になるような、Ｐプライマーのセットが設計された。以下にＰプライマーの設計方法を詳述する。
（１）プライマー領域の設定
　多くの報告では、プライマーセットの設計には、栄研化学株式会社がウェブ上に公開している、ＬＡＭP法専用のプライマー設計ソフトウェアである「Primer Explorer」が使用されている。しかし、多様性がある鳥インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ遺伝子を標的にした場合、Primer Explorerで設計したプライマー領域は、保存性の低い領域に設定される場合が多く、スペクトルの狭いプライマーになり、野外遺伝子を幅広く検出することができない。
　この問題を克服するには、多様なＨＡ遺伝子に広く保存されている領域にプライマー領域に選定しなければならない。そこで、遺伝子バンクからダウンロードした２２１１株のＨ５－ＨＡ遺伝子の全ての塩基位置（約１８００塩基）について、センス配列をアライメントしたプライマー専用データベースを構築し、それを用いて保存性の高い領域を探した。具体的には其々の塩基位置毎に、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの出現率をそれぞれ求め、最も出現率が高い塩基だけを順番に配列したコンセンサス配列を構築した（図７）。このコンセンサス配列を構成する各塩基が遺伝子の何％をカバーするかを求めて、これを其々の塩基位置の塩基カバー率とした。
　プライマー領域は、塩基カバー率が高い、良く保存された塩基が２０個程度連続する領域でなければならない。具体的には、プライマー領域の塩基出現率が８０％以上（望ましくは９０％以上、より望ましくは９８％以上）となる単一塩基、または、単一塩基の出現率は８０％未満であっても、塩基出現率が高い上位２種類の塩基の出現率の和が８０％以上（望ましくは９０％以上、より望ましくは９８％以上）となる混合塩基が、２０個程度連続する領域をプライマー領域の候補とした。
　これらの候補領域について、ウイルス株Ｖ１２４株の人工Ｈ５－ＨＡ遺伝子（Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子）と完全に塩基配列が一致するプライマーを設計した。それらのプライマーの組合せの中から、実際に実験によってＶ１２４株の遺伝子を３０分以内に増幅できるプライマーのセットとした。このプライマーセットはある株に特異的なプライマーセット（Strain-specific primer set）との意味を込めて、Ｓプライマーセットと命名した。なお、Ｓプライマーセットは現在、一般に利用されている鳥インフルエンザウイルスのプライマーと同等であることから、本研究ではこれを現行のランプ法のプライマーの例として使用した。
（２）Ｐプライマーの設計
　決定されたプライマー領域に個々のＰプライマーを設計する手順について説明する。ＬＡＭＰ法では、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーが遺伝子増幅に最も重要な役割を果たしている。ＦＩＰプライマーの長さはＦ３プライマーやＦＬプライマーの２倍ほどあるため、ＦＩＰプライマーにおいて、多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出することは特に難しい。ＦＩＰプライマーを設計する際には、プライマー領域の塩基配列が類似した、特定の遺伝子ポピュレーション毎に、プライマーを設計することが重要と考えられる。そこで先ず、ＦＩＰプライマーの設計手順を説明する。
（ｉ）コンセンサス配列の設計：
　アライメントしたプライマー用データベースを用いて、其々の塩基位置毎にＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの出現率を求め、最も高い塩基出現率を示す塩基だけを順番に配列させたのがコンセンサス配列となる。
　２２１１株のＨ５－ＨＡ遺伝子からなる母集団に対して、Ｆ２領域とＦ１領域をセットにしたコンセンサス配列を構築した（図４を参照）。
（ｉｉ）塩基ミスマッチ数のカウント：
　Ｆ２領域とＦ１領域に対するコンセンサス配列と、其々のＨＡ遺伝子の相当する位置の塩基を比較して、両者の種類が一致しない数（「塩基ミスマッチ数」と呼ぶ。）をＨＡ遺伝子毎に、また領域毎にカウントした。
（ｉｉｉ）増幅判定：
　Ｆ２領域またはＦ１領域のコンセンサス配列と、其々のＨＡ遺伝子の相当する位置の塩基配列を比較して、何れか一方の領域における塩基ミスマッチ数が３個以上となるＨＡ遺伝子、およびＦ２領域とＦ１領域の塩基ミスマッチ数が共に２個以上（計４以上）となるＨＡ遺伝子は、上記コンセンサス配列を基に設計するＰプライマーでは増幅困難と判定した。
（ｉｖ）新規母集団の編成：
　増幅困難と判定されたＨＡ遺伝子を抽出し、新規母集団を編成した。
（ｖ）新規コンセンサス配列の設計：
　新規母集団を編成する遺伝子に対して、工程（ｉ）にしたがって、Ｆ２領域とＦ１領域をセットにした新規コンセンサス配列を設計した。
（ｖｉ）検出困難と判定されるＨＡ遺伝子が存在しなくなるまで上記の工程（ｉ）～（ｖ）を繰り返すことによって、Ｆ２領域とＦ１領域をペアにした、複数のコンセンサス配列のセットを設計した。これによって、全てのＨＡ遺伝子が、Ｆ２領域またはＦ１領域の塩基ミスマッチ数がそれぞれ２個以下で、且つ合計でも３個以下となるコンセンサス配列でカバーされることになる。
（Ｖｉｉ）ＦＩＰプライマーの設計：
　得られたコンセンサス配列の各セットにおいて、Ｆ１領域の相補鎖のコンセンサス配列を５末端に、Ｆ２領域のコンセンサス配列を３末端にした融合したＦＩＰプライマーを設計する（配列番号１～配列番号２０）。これによって、ＦＩＰ領域に対するＰプライマーのセットが設計される。
　ＦＩＰプライマー領域の長さはＦ２領域とＦ１領域ともに２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。最初に設計したＦＩＰプライマー（Ｌｏｎｇ　ＦＩＰプライマー）の本数は２０本であったが、Ｆ２領域を２０塩基から１６塩基へ、Ｆ１領域を２０塩基から１４塩基へ短縮させたＳｈｏｒｔ　ＦＩＰプライマーにしたところ、本数を計５本にまで減らすことができた（配列番号１１５～配列番号１１９）。なお、このセットは８種類のプライマー分子の混合物であるが、当該技術分野においては、混合塩基を含めて合成すれば５本のプライマーとして扱われるため、本明細書においては５本と表記する。
　ＦＩＰプライマーの位置は、鳥インフルエンザウイルスのＶ１２４株を基準にした場合、Ｌｏｎｇ　ＦＩＰプライマーのＦ２領域は塩基番号９５０～９６９、Ｆ１（Ｆ１ｃ）領域は塩基番号９９８～１０１７に（図５）、Ｓｈｏｒｔ　ＦＩＰプライマーのＦ２領域は塩基番号９５４～９６９に、Ｆ１（Ｆ１ｃ）領域は塩基番号１００４～１０１７であった（図６）。
（ｖｉｉｉ）ＢＩＰプライマーの設計：
　ＢＩＰプライマーはＢ２領域とＢ１領域から構成され、５’末端にはＢ１領域の相補鎖の配列を、３末端にはＢ２領域を融合したプライマーである。ＢＩＰプライマーの設計方法はＦＩＰプライマーの設計と同様である。プライマー領域の塩基配列が類似する、遺伝子ポピュレーション毎にＢＩＰプライマーを設計する。具体的には工程（ｉ）～工程（ｖｉｉ）を経て、ＢＩＰ領域に対するＰプライマーセットを設計した。
　ＢＩＰプライマー領域の長さはＢ１領域とＢ２領域ともに２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できればそれより短くても良い。最初に設計したＢＩＰプライマーの本数は３７本（配列番号４６～配列番号８２）であったが、Ｂ１領域を１７塩基から１１／１２塩基へ、Ｂ２領域を１９塩基から１７塩基へ短縮させたＳｈｏｒｔ　ＢＩＰプライマーでは、合計７本（配列番号１２２～配列番号１２８）まで本数を減らすことができた。なお、このセットは１０種類のプライマー分子の混合物であるが、当該技術分野では混合塩基を含めて合成すれば７本のプライマーとして扱われるため、本明細書では７本と表記する。
　ＢＩＰプライマーの位置は、Ｖ１２４株を基準にした場合、Ｌｏｎｇ　ＢＩＰプライマーのＢ２領域は塩基番号１０７１～１０８９、Ｂ１（Ｂ１ｃ）領域は塩基番号１０２４～１０４０に（図５）、Ｓｈｏｒｔ　ＦＩＰプライマーのＢ２領域は塩基番号１０７３～１０８９に、Ｂ１（Ｂ１ｃ）領域は塩基番号１０２２～１０３３であった（図６）。
（ｉｘ）Ｆ３プライマーの設計：
　２２１１株のＨ５－ＨＡ遺伝子を用いて構築したプライマー専用データベースから、Ｆ３領域を切り出した。次に、Ｆ３領域のコンセンサス配列（図７を参照）と、個々のＨＡ遺伝子のＦ３領域の塩基配列を比較して、一致しない塩基数（塩基ミスマッチ数）をカウントした。Ｆ３領域において塩基ミスマッチが３以上となるＨＡ遺伝子は、コンセンサス配列を基に設計するプライマーでは増幅困難と判定し、これらを抽出して新規母集団を編成した。新規母集団に対して新規コンセンサス配列を設計し、新規コンセンサス配列と新規母集団に属す各ＨＡ遺伝子の配列を比較して、ＨＡ遺伝子当たりの塩基ミスマッチ数をカウントした。塩基ミスマッチ数が３以上となるＨＡ遺伝子は、新規コンセンサス配列を基に設計するプライマーでは増幅困難と判定し、これらの増幅困難遺伝子を抽出して次の母集団を編成した。この工程を増幅困難な遺伝子がなくなるまで繰り返すことによって、Ｆ３領域に対して、２２１１株のＨ５－ＨＡ遺伝子の其々に対して、塩基ミスマッチ数が２個以下となるＰプライマーのセットが設計される。
　Ｆ３プライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。Ｆ３領域のＰプライマーの本数は１４本であった（配列番号２１～配列番号３４）。
　Ｆ３プライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号９１７～９３６に設定された（図５および図６）。
　なお、Ｆ３領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることも可能であった（配列番号１２０）。
（ｘ）ＦＬプライマーの設計：
　プライマー専用データベースから、ＦＬ領域を切り出し、この情報を基に工程（ｉｘ）に準じてＦＬ領域に対するＰプライマーのセットを設計した。
　ＦＬプライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。ＦＬ領域のＰプライマーの本数は１１本であった（配列番号３５～配列番号４５）。
　ＦＬプライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号９７４～９９３に設定された（図５および図６）。
　なお、ＦＬ領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることができる（配列番号１２１）。
（ｘｉ）Ｂ３プライマーの設計：
　プライマー専用データベースから、Ｂ３領域を切り出し、この情報を基に、工程（ｉｘ）に準じてＢ３領域に対するＰプライマーセットを設計した。
　Ｂ３プライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。Ｂ３領域のＰプライマーの本数は１０本であった（配列番号８３～配列番号９２）。
　Ｂ３プライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号１０９２～１１１０に設定された（図５および図６）。
　なお、Ｂ３領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることができる（配列番号１２９）。
（ｘｉｉ）ＢＬプライマーの設計：
　プライマー専用データベースから、ＢＬ領域を切り出し、この情報を基に、工程（ｉｘ）に準じてＢＬ領域に対するＰプライマーセットを設計した。
　ＢＬプライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。ＢＬ領域のＰプライマーの本数は２２本であった（配列番号９３～配列番号１１４）。
　ＢＬプライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号１０４９～１０６８または塩基番号１０５２～１０７１（混合塩基プライマーの場合）に設定された（図５および図６）。
　なお、ＢＬ領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることができる（配列番号１３０）。
　８ヶ所のプライマー領域について、それぞれＰプライマーを設計したところ、合計で１１４本からなるＰプライマーセット（バージョン１）が得られた。
３．テンペレートの調製
３－１．ＰＣＲテンペレート
　インフルエンザウイルス（ｃＤＮＡを含む）を入手することは困難なことから、本研究では、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子の増幅部位を、遺伝子バンク情報を基にして、ＰＣＲによって人工合成したテンペレートを用いた。人工合成したＤＮＡテンペレートの大きさは２７０塩基で、遺伝学的に異なる１５株のＨ５亜型の鳥インフルエンザウイルスを選んだ。それらの塩基配列をアライメントしたものを図８に示す。
　これら１５株の遺伝子のうち、７株は１９７６年～２００９年の間に日本において水鳥の渡り鳥から単離したＬＰＡＩウイルスに由来し、８株は２００３年～２０１３年の間にAsian H5N1 subtype HPAIのＨ５亜型ＨＡ遺伝子に由来している。これらのＨＡ遺伝子テンペレートは、５本の７０塩基長のオリゴヌクレオチドペアを用いて、２段階のＰＣＲにより合成した。使用したオリゴヌクレオチドは以下の通りである（塩基配列は配列番号で示す）。
Bangladesh 2009株
Forward Primer（プラス鎖、以下同じ）：配列番号１５８、配列番号１５９
Reverse Primer（マイナス鎖）、以下同じ：配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２
Bangladesh 2012株
Forward Primer：配列番号１６３、配列番号１６４
Reverse Primer：配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７
Dk Egypt 2013株
Forward Primer：配列番号１６８、配列番号１７２
Reverse Primer：配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１
Dk VN 2012株
Forward Primer：配列番号１７３、配列番号１７４
Reverse Primer：配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７
Falcon HK 2009株
Forward Primer：配列番号１７８、配列番号１７９
Reverse Primer：配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２
V124株
Forward Primer：配列番号１８３、配列番号１８４
Reverse Primer：配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７
V144株
Forward Primer：配列番号１８８、配列番号１８９
Reverse Primer：配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２
V177株
Forward Primer：配列番号１９３、配列番号１９４
Reverse Primer：配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７
V265株
Forward Primer：配列番号１９８、配列番号１９９
Reverse Primer：配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２
V372株
Forward Primer：配列番号２０３、配列番号２０４
Reverse Primer：配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７
V382株
Forward Primer：配列番号２０８、配列番号２０９
Reverse Primer：配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２
V44株
Forward Primer：配列番号２１３、配列番号２１４
Reverse Primer：配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７
V463株
Forward Primer：配列番号２１８、配列番号２１９
Reverse Primer：配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２
V77株
Forward Primer：配列番号２２３、配列番号２２４
Reverse Primer：配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７
V80株
Forward Primer：配列番号２２８、配列番号２２９
Reverse Primer：配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２
　７０塩基長のオリゴヌクレオチドペアは、隣接するオリゴヌクレオチドの両末端部分と２０塩基がオーバーラップするようにデザインしてある。最初のＰＣＲでは、Ex Taq（Takara, Shiga, Japan）を含む各チューブに、プライマー１（プラス鎖）および２（マイナス鎖）と、プライマー３（プラス鎖）及び４（マイナス鎖）の２組の組合せで、１５サイクルのＰＣＲ反応を行い、それぞれ１２０塩基のＤＮＡを増幅した。その合成ＤＮＡを１００倍に希釈し、両端の７０塩基長の２つのプライマー（プライマー１（プラス鎖）および５（マイナス鎖））を用いて、３０サイクルのＰＣＲ反応を行って、２７０塩基長のＤＮＡをＰＣＲテンペレートＤＮＡとした。塩基配列解析により、これらの合成ＤＮＡの塩基配列が正しいことを確認してから実験に用いた。
　ＰＣＲテンペレートＤＮＡをＬＡＭＰ法に使用する場合、ＰＣＲ増幅産物の１，０００倍希釈液を使用したが、この希釈液には１０６乗分子のテンペレートが含まれている。この濃度は尿膜腔液由来のウイルス液から調製したｃＤＮＡの１０倍希釈液に相当する分子を含んでいる。
３－２．ウイルスｃＤＮＡテンペレート
　鳥インフルエンザウイルス（Ｈ１～Ｈ４亜型、Ｈ６亜型、Ｈ８～Ｈ１２亜型）、鶏伝染性気管支炎ウイルス（Infectious bronchitis virus、IBV）およびニューキャッスル病ウイルス（Newcastle disease virus、NDV）のウイルスゲノムRNAは、感染発育鶏卵の尿膜腔液からViral RNA Purification Kit (Qiagen)を用いて精製した。次に、これを鋳型にしてSuperScript III reverse transcriptase (Takara, Shiga, Japan)を用いて、ウイルスゲノムＲＮＡからウイルスｃＤＮＡを合成した（Tsukamotoら, J Clin Microbiol 48:4275-4278, 2010.）。ＬＡＭＰ法およびリアルタイムＰＣＲには、得られたｃＤＮＡを１０倍に希釈した液を使用した。
４．ＬＡＭＰ法
　ＰＣＲテンペレートＤＮＡ（１，０００倍希釈）１μＬ、８０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー溶液を各々０．５μＬ、４０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー溶液を各々０．５μＬ、５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー溶液を各々０．５μＬ、（ｘ２）酵素反応液を５．０μＬ、Bst DNA polymerase（New England BioLabs, Tokyo）を０．５μＬ、蛍光検出試薬（Eiken Chemical, Tokyo, Japan）を０．５μＬ含む、ＬＡＭＰ法の反応溶液を用いて、総量１０μＬの系で反応させた。（ｘ１）酵素反応液の組成は、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＳＯ４、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ベタイン（Sigma, USA）および１．４ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ（Promega, USA）とした。
　テンペレートを含む反応液を６０℃で６０分間反応させた後、９５℃で２分間の処理によって反応を停止させた。その反応チューブにＵＶを照射し、緑色蛍光の有無から遺伝子増幅の有無を判定した。緑色発光した場合はＨ５亜型のＨＡ遺伝子が陽性と判定した。
５．特異性の検討
　Ｈ５亜型の　鳥インフルエンザウイルスを検出するＬＡＭＰ法の反応特異性の検討は、１２種類のＨＡ亜型の鳥インフルエンザウイルスと、鳥インフルエンザウイルス以外の２種類の鶏ウイルスを用いて行った。
　反応特異性の検討に使用するテンペレートとしては、鳥インフルエンザウイルスのＨ５亜型およびＨ７亜型については、７０塩基長のプライマーを用いて、人工合成したＰＣＲテンペレートを１，０００倍希釈して用いた。それら以外のＨＡ亜型（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１およびＨ１２亜型）の鳥インフルエンザウイルス、ＮＤＶ（Ｂ１株）およびＩＢＶ（Ｈ１２０株）については、ウイルスｃＤＮＡの１０倍希釈液を反応特異性の検討に使用した。
　ＬＡＭＰ法の増幅反応は上記５と同様に、６０℃で６０分間の培養後に反応を停止させてから、紫外線照射によって判定したが、非特異反応の有無は、より厳格に確認するために、増幅反応時間は１２０分まで延長した。
６．感度の検討
　ＬＡＭＰ法の標的となるＨ５亜型のＨＡ遺伝子の断片（A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)株由来）の人工合成ＤＮＡ（４００塩基長、１０１０コピー／μｌ）を挿入したプラスミドテンペレートを１０倍階段希釈して、テンペレートの分子数を１０６コピー／μＬ～１コピー／μＬの範囲に調製して、プラスミドテンペレートの階段希釈液を準備した。
　またＰＣＲで増幅した、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子（A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)株由来）のＰＣＲテンペレート（２７０塩基長、１０９コピー／μＬ）（上述）を１０倍階段希釈して、テンペレートの分子数を１０６コピー／μＬ～１コピー／μＬの範囲に調製したＰＣＲテンペレートの希釈液を準備した。
　これらの希釈液を用いて、Ｈ５亜型のＬＡＭＰ法の検出限界を調べた。ＬＡＭＰ法の増幅条件は、上記５と同様であるが、増幅時間は１２０分間とした。
７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響
　鳥インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子のような多様な遺伝子を標的とした場合、プライマーと標的遺伝子の塩基配列の間には、多数の塩基ミスマッチが起こると考えられる。塩基ミスマッチ数はウイルス株によって大きく異なると推察され、その数が少なければ遺伝子は容易に増幅されるが、多ければ増幅は困難となる。しかし、実際にどの程度の塩基ミスマッチ数を許容できるのかについては解明されておらず、プライマー設計の指針を構築する際の障害となっていた。
　本研究では、ＰＣＲテンペレートとして、A/w. swan/Akita/1/2008 (H5N1)のＨ５－ＨＡ遺伝子を用いて、上記２（２）で設定した６種類、８領域のプライマー領域について、人工的に０～３個の塩基ミスマッチを導入した各種プライマーを設計した。それらのプライマーを組み合わせてＬＡＭＰ法を行うことによって、プライマー領域当たり何個の塩基ミスマッチまでなら遺伝子増幅が起こるのか、合計で何個の塩基ミスマッチ数なら遺伝子増幅はされるのか、塩基ミスマッチの影響を受けやすいプライマー領域はあるのか、などについて調べた。調べた組合せ（全部で４６セット）を図９に示し、使用したプライマーの塩基配列を図１０に示した。なお、ＬＡＭＰ法の増幅と判定は上記４と同様の方法で行った。
８．塩基ミスマッチ解析
８－１．塩基ミスマッチ数の算出方法
　プライマーとして、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーの領域にはＰプライマー（ＦＩＰ；配列番号１１５～配列番号１１９、ＢＩＰ；配列番号１２２～配列番号１２８）を用い、他の４つのプライマー領域（Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬ）にはＭプライマー（ＦＬ；配列番号１２１、ＢＬ；配列番号１３０、Ｆ３；配列番号１２０、Ｂ３；配列番号１２９）を用いて、塩基ミスマッチ解析をおこなった。
　ＦＩＰプライマーに対して、プライマーデータベースに登録された２２１１個のＨ５－ＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数を算出する方法について説明する。
　データベースにある２２１１個のＨＡ遺伝子の塩基配列のうち、ＦＩＰプライマーのＦ１とＦ２の２領域の塩基配列を取りだし、それらをＥｘｃｅｌ上で連結させ、一体の遺伝子としてデータベースを構築する。次に、上記２（２）の「Ｐプライマーの設計」で説明したように、あるＦＩＰプライマーとＨＡ遺伝子との間にある塩基ミスマッチ数を、全てのＨＡ遺伝子について求める。ただし、ＦＩＰプライマーは最終的に５本の短いＰプライマーが設計されているので、それぞれのプライマーに対して、全てのＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数を算出することになる。具体的な例で説明する。
　例えば、５本のＦＩＰ－Ｐプライマーのそれぞれに対して、あるＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数が（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ１＋Ｆ２）の順番で表記したとして、１本目（０，１，１）、２本目（１，１，２）、３本目（０，０，０）、４本目（２，１，３）、５本目（２，３，５）となったと仮定する。この場合、塩基ミスマッチ数が最少となる３本目のプライマー（０，０，０）であり、これが遺伝子増幅に関係することから、本ＦＩＰ－Ｐプライマーセットに対するこのＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数は（０，０，０）と算出される。
　ＢＩＰ-Ｐプライマーの塩基ミスマッチについても、ＦＩＰ－Ｐプライマーの方法に準じて、全てのＨＡ遺伝子についてＢ１領域、Ｂ２領域、Ｂ１＋Ｂ２領域毎に塩基ミスマッチ数を、７本のＰプライマーのそれぞれについて求めた。その中で、最少となる塩基ミスマッチ数をそのＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数として、全てのＨＡ遺伝子について算出した。
　Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬのプライマー領域は、いずれも混合塩基を含むＭプライマーである。基本的にはＦＩＰプライマーと同様の方法で、各プライマーに対する塩基ミスマッチ数を全てのＨＡ遺伝子について算出した。その際に混合塩基の取扱いについては、以下の方法で行った。例えば、混合塩基Ｒは塩基Ａまたは塩基Ｇのいずれでも良いので、プライマーの配列が混合塩基Ｒの場合は、ＨＡ遺伝子の相当する位置の塩基配列は塩基Ａと塩基Ｇは合致するとし、それ以外の塩基（Ｃ，Ｔ）は塩基ミスマッチとして算出した。
８－２．Ｈ５－ＨＡ遺伝子増幅の推定
　塩基ミスマッチ数が算出されたプライマー領域が、その遺伝子の増幅を可能にするか否かの判定は、上記２（２）「Ｐプライマーの設計」の（ｉｉｉ）「増幅判定」の基準に従って行った。
　ＢＩＰ-Ｐプライマーの増幅の可否は、上記２（２）「Ｐプライマーの設計」の（ｉｉｉ）「増幅判定」の基準にしたがって、ＢＩＰプライマー領域単独として判定した。
また、個々のプライマー領域にある塩基ミスマッチ解析だけでなく、８ヶ所のプライマー領域の合計塩基ミスマッチ数からも、遺伝子増幅の可否を判定した。これによって、今回開発したＰＭ１６プライマーを用いた場合について、２２１１株のＨＡ遺伝子毎に、８ヶ所のプライマー領域の塩基ミスマッチのパターンを明らかにした。
　ＬＡＭＰ法による増幅の判定基準は、表３の成績を参考にして行った。即ち、プライマー領域当たりの最大塩基ミスマッチ数が２以下で、かつ合計ミスマッチ数が１０個以下のＨＡ遺伝子は増幅可能と判定した。
結果
１．プライマー領域の設定
　ユーラシア系統のＨ５－ＨＡ遺伝子に関し、A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)のＨ５－ＨＡ遺伝子に対するＳプライマーは、ＨＡ（ヘマグルチニン）の開裂部位を跨ぐように設定した。Ｆ３、Ｆ２およびＦＬは、ＨＡ１領域に、Ｆ１、Ｂ１、ＢＬ、Ｂ２およびＢ３は、ＨＡ２領域に設定した。ＨＡ開裂部位を挟むように設定したのは、ＨＡ１領域がＨ５亜型に特異的であり、ＨＡ２領域が遺伝子間で保存性が高い領域であるからである。こうすることで、少ない本数のプライマーでＨ５亜型に属する全てのＨＡ遺伝子を検出できるようになった。なお、ＨＡ１領域は病原性、抗原性、多様性に関係する領域であり、ＨＡ２領域はウイルス外被に突き刺さったＨＡ２蛋白質で、ＨＡ１のスパイク蛋白質をウイルス粒子表面に提示する働きがある。
上記プライマーセットを用いて、プラスミドテンペレートに含まれるA/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)のＨ５－ＨＡ遺伝子をＬＡＭＰ法で検出できるかを調べたところ、２０分で検出することができた。
２．Ｐプライマーの有用性の検討
　Ｓプライマーセットは、現在、報告されているＬＡＭＰ法用のプライマーとして利用されているプライマーと同等のものである。これを用いて、遺伝学的に多様性の高い１０株のＨ５－ＨＡ遺伝子の検出スペクトルを調べた。なお、テンペレートとしては、長いプライマーを用いたＰＣＲ法により合成したＰＣＲテンペレートを使用した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　その結果、Ｓプライマーを使用した場合は、１０株のＨＡ遺伝子のうち、４遺伝子しか検出することができなかった。Ｓプライマーセットは以下の通りである。
Ｓプライマーセット
ＦＩＰ；配列番号１４４
ＢＩＰ；配列番号１４５
ＦＬ　；配列番号１４６
ＢＬ　；配列番号１４７
Ｆ３　；配列番号１４８
Ｂ３　；配列番号１４９
　また、Ｍプライマー（混合塩基を含むプライマー）は、多様性の高いＨ５亜型のＨＡ遺伝子を幅広くＰＣＲで検出するためには欠かせないプライマーであるが、ＬＡＭＰ法で使用した場合、どの程度有効であるかは不明であった。そこで、幅広く遺伝子を検出できるように、プライマーデータベースを参考にして、Ｓプライマーの設定領域と同じ領域にＭプライマーを設計し、その遺伝子検出率を調べた。その結果、ＰＣＲ法における有効性とは異なり、ＬＡＭＰ法においてＭプライマーを使用したとしても、１０のＨＡ遺伝子のうち、６遺伝子のみが検出できたに過ぎなかった。
　このことから、ＭプライマーはＳプライマーセットより広い検出スペクトルを有するものの、多様な遺伝子を幅広く検出することはできなかった。
　以上の結果から、ＬＡＭＰ法で多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出するためには、新たなプライマーのセットが必要であることが明らかにされた。Ｍプライマーセットは以下の通りである。
Ｍプライマーセット
ＦＩＰ；配列番号１５０
ＢＩＰ；配列番号１５１
ＦＬ　；配列番号１５２
ＢＬ　；配列番号１５３
Ｆ３　；配列番号１５４
Ｂ３　；配列番号１５５
　そこで、発明者らは、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子を網羅的に検出するために、以下のＰプライマーセットを上述のプライマー設計方法に基づいて作製した。
　基本的には、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはＰプライマーであるが、その他のＦ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬプライマーは、混合塩基を含むプライマーとしても実施可能であった。このようにＰプライマーとＭプライマーを併用するプライマーセットは、ＰＭプライマーと称する。
（３）Ｐプライマーセット（ユーラシア系統用）
ＦＩＰ；配列番号１～配列番号２０
ＢＩＰ；配列番号４６～配列番号８２
ＦＬ　；配列番号３５～配列番号４５
ＢＬ　；配列番号９３～配列番号１１４
Ｆ３　；配列番号２１～配列番号３４
Ｂ３　；配列番号８３～配列番号９２
（４）ＰＭプライマーセット（ＰプライマーとＭプライマーを併用したプライマーセット）
（４）－１．ユーラシア系統用（「ＰＭ１６プライマーセット」）
ＦＩＰ；配列番号１１５～配列番号１１９
ＢＩＰ；配列番号１２２～配列番号１２８
ＦＬ　；配列番号１２１
ＢＬ　；配列番号１３０
Ｆ３　；配列番号１２０
Ｂ３　；配列番号１２９
（４）－２．アメリカ系統用
ＦＩＰ；配列番号１３１～配列番号１３３
ＢＩＰ；配列番号１３４～配列番号１３６
ＦＬ　；配列番号１３９～配列番号１４１
ＢＬ　；配列番号１４３
Ｆ３　；配列番号１３７～配列番号１３８
Ｂ３　；配列番号１４２
　ユーラシア系統のＨ５亜型ＨＡ遺伝子に対する１１４本のプライマー（ＦＩＰ；配列番号１～配列番号２０、ＢＩＰ；配列番号４６～配列番号８２、ＦＬ；配列番号３５～配列番号４５、ＢＬ；配列番号９３～配列番号１１４、Ｆ３；配列番号２１～配列番号３４、Ｂ３；配列番号８３～配列番号９２）から構成されるＰプライマーセットを上述の方法により設計した。
　１１４本のＰプライマーを用いてＬＡＭＰ法を行ってみたところ、驚くべきことに、１０種類のＨＡ遺伝子の全てが６０分以内に増幅されることが分かった（表１）。このことから、ＬＡＭＰ法で多様な遺伝子を幅広く検出するには、Ｐプライマーが必須であることが明らかになった。
　しかし、Ｐプライマーの総数は１１４本と多いため、その数を減らすために、ＰプライマーをＭプライマーと置き換えることが可能かについて検討した。まず、Ｆ３およびＢ３のプライマーサイトをＭプライマーで置き換えたところ、プライマー数を８６本に減らすことができ、１０種類全てのＨＡ遺伝子が増幅できた。また、ＦＬおよびＢＬのプライマーサイトをＭプライマーで置き換えたところ、プライマー数を７６本に減らすことができ、１０種類全てのＨＡ遺伝子が増幅できた（表１）。さらに、４つの領域（Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬ）のＰプライマーをＭプライマーに置き換えた場合、プライマーの総数は５６本ともっとも減らすことができ、かつ１０種類全てのＨＡ遺伝子を増幅できた。他方、ＦＩＰおよびＢＩＰのプライマーをＭプライマーに置き換えると、１株ではあったが検出漏れが生じることが分かった（表１）。
　以上の結果から、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬの領域にはＭプライマー、ＦＩＰとＢＩＰの領域にはＰプライマーを用いれば、検出スペクトルの広さとプライマー数の減少を兼ねた実用的なＬＡＭＰ法を構築できることが明らかになった。
３．ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの長さの検討
　鳥インフルエンザウイルスの診断にＬＡＭＰ法を普及させるためには、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの数をさらに少なくすることが望ましい。Ｐプライマーの設計を何度もやり直したが、プライマーの数を減らすことはできなかった。プライマーの本数が増える原因は、多様性がある領域を広くカバーしようとすることに起因していたので、プライマーの長さを短くして、多様性を確保することを検討した。その結果、１１４本のＰプライマーセット（「バージョン１」とする）のＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーは、各々、４０ベースと３６ベースであったが、ＦＩＰプライマーを３０ベース（配列番号１１５～配列番号１１９）に、ＢＩＰプライマーを２８ベース（配列番号１２２～１２８）に調製した結果、プライマーの総数を１６本にすることができた（バージョン２、ＦＩＰ；配列番号１１５～配列番号１１９、ＢＩＰ；配列番号１２２～配列番号１２８、ＦＬ；配列番号１２１、ＢＬ；配列番号１３０、Ｆ３；配列番号１２０、Ｂ３；配列番号１２９；「ＰＭ１６プライマーセット」）。
　ＰＭ１６プライマーセットを用いて、前述の１０種類のＨ５－ＨＡ遺伝子に対する検出スペクトルを調べた。その結果、表２に示すように、１０種類のＨ５－ＨＡ遺伝子の全てを、ＰＭ１６プライマーセットで検出することができ、検出時間は平均４４分で、１１４本のＰプライマーを使用した場合の検出時間（平均４５分）と同等であった。
　バージョン２のＰＭ１６プライマーセットについて、プライマー濃度を２倍に濃くしたところ、検出時間は平均３５分で、バージョン１のＰプライマーセットを使用した場合の検出時間よりも約１０分に短縮された。この実験には、最近、アジアで流行しているH5N1亜型ウイルスのＨＡ遺伝子５株のＰＣＲテンペレートを追加した。表２に示すように、１５種類のユーラシア系統のＨ５－ＨＡ遺伝子は、ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によって全て検出された。
以上の結果から、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーをより短くし、使用濃度を濃くすると、プライマー数を顕著に減らせ、多様なインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子を幅広く、迅速に検出することが可能になった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
４．参照株の塩基ミスマッチ解析
　本実施例で使用した１５種のＰＣＲテンペレートのヌクレオチド配列と、ＰＭ１６プライマーセットのプライマーとの塩基ミスマッチ解析を行い、その結果を表３にまとめた。ＰプライマーのＦＩＰとＢＩＰは、塩基ミスマッチ数が２以下となるように設計したため、実際の塩基ミスマッチ数は、予想通り２以下であった。他方、混合塩基プライマーであるＦ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬの領域では、塩基ミスマッチ数が０～３であり、塩基ミスマッチは、Ｆ３およびＢ３プライマーの結合サイトに比較的多く存在していた。以上の結果から、プライマーの塩基配列とテンペレートとの塩基ミスマッチ数が、プライマー領域当たり１～２個であれば、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の支障にはならないことが示唆された。
また、１株当たりの塩基ミスマッチ数０～７個で、この範囲内であれば、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の障害にはならないことが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響
　プライマーの塩基配列とプライマーの結合領域との間の塩基ミスマッチ数が、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅にどの程度影響を及ぼすかは明らかにされていない。そこで、プライマーとテンペレートの間に塩基ミスマッチ生じるように作製したプライマー使用してＬＡＭＰ法を行い、遺伝子増幅がどう影響を受けるか調べた。実験では、テンペレートとして、A/w. swan/Akita/1/2008(H5N1)　由来のＨＡ遺伝子のＰＣＲテンペレートを用い、それぞれのプライマー領域には０～３個の塩基ミスマッチを導入し、遺伝子が６０分以内に増幅されるか否かを調べた。調べたプライマーの組合せは図９に示したとおり、合計で４６通りに及んだ。また、用いたプライマー配列を図１０（図１０のプライマーIDが図９の「プライマーの組み合わせ」に表示されている）に示す。
　その結果、表４に示すように、４６通り中４１通りにおいて、６０分以内にＨＡ遺伝子を増幅することができた。ミスマッチ数合計が１２個以内であれば、６０分以内にＨＡ遺伝子を検出することが可能であった。ただし、この場合であっても、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数は２個以内であることが確認された。６０分以内にＨＡ遺伝子を増幅できなかった５個のＨＡ遺伝子について、塩基ミスマッチ数の合計が１４～１６個の範囲では、ＨＡ遺伝子の増幅に７５分を要し、１６個以上、あるいはプライマー領域当たり３個の塩基ミスマッチがあると、遺伝子増幅は困難であった。
　これらの結果から、プライマー当たりの塩基ミスマッチ数が２個以内で、８領域の塩基ミスマッチ数の合計が１０個以内であれば、ＬＡＭＰ法によりＨＡ遺伝子を増幅できることが明らかになった。また、多様なＨ５亜型のＨＡ遺伝子をＬＡＭＰ法で幅広く検出するには、ＰＭ１６プライマーセットは必須であることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５－ＨＡ遺伝子の増幅推定
　表４の塩基ミスマッチ解析の成績から、本実施例で開発したＰＭ１６プライマーセットは、多様な遺伝子を幅広く検出できる可能性が示唆された。そこで、GenBankに登録されている２２１１個のＨ５－ＨＡ遺伝子（ユーラシア系統）を用いて、ＰＭ１６プライマーセットを用いた場合のＬＡＭＰ法の遺伝子検出率の推定を行った。個々のＨＡ遺伝子の増幅は、ＰＭ１６プライマーセットと個々のＨＡ遺伝子との塩基ミスマッチ数を基に推定した。
　塩基ミスマッチ数は、ＦＩＰ領域（Ｆ１＋Ｆ２）、ＢＩＰ領域（Ｂ１＋Ｂ２）、他の４領域（Ｆ３，Ｂ３，ＦＬ，ＢＬ）の３つに分けて、グループ毎に塩基ミスマッチとＨＡ遺伝子数を調べ、表５にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＦＩＰプライマー領域に関して、ＨＡ遺伝子の９５％（２０１７遺伝子）が、ＢＩＰプライマー領域に関しては９７％（２１４４遺伝子）が、塩基ミスマッチが０または１個であった。表４の成績から、これらの塩基ミスマッチは遺伝子増幅の障害にはならないと考えられるため、これらの遺伝子は増幅可能と判定された。
　表４の結果から、ＦＩＰプラマーおよびＢＩＰプライマーの塩基ミスマッチ数が３個であっても、Ｆ１領域とＦ２領域のいずれか、Ｂ１領域とＢ２領域のいずれかに偏ってなければ、増幅可能と判断することができた。
　一方、表５から、ＦＩＰまたはＢＩＰのプライマー領域に２個または３個以上の塩基ミスマッチを持つＨＡ遺伝子は、ＦＩＰ領域でそれぞれ１００個、４個、ＢＩＰ領域では６２個、５個、他の４領域では４個、４個であった。これらのＨＡ遺伝子については、１つのプライマー領域にある塩基ミスマッチ数だけでなく、他のプライマー領域にある塩基ミスマッチの影響を強く受ける可能性が高い。そこでこれらについては、全てのプライマー領域（Ｆ１、Ｂ１、Ｆ２、Ｂ２、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬの８サイト）の塩基ミスマッチパターンから、遺伝子増幅の可否を判定した。
　表６には、８つのプライマー領域の塩基ミスマッチパターンに基づいて、遺伝子増幅を判定することになった２３個のＨＡ遺伝子とその塩基ミスマッチパターンを示した。同一遺伝子が複数のプライマー領域で抽出された場合は一方にまとめた。
　これらについて、表４の基準にしたがって遺伝子増幅を推定したところ、増幅困難と判定された遺伝子は、A/duck/Taiwan/DV30-2/2005(H5N2)のＨＡ遺伝子（CY110933）とA/chicken/Egypt/34-2/2008(H5N1) のＨＡ遺伝子（CY062604）だけであった。それら以外の２１個のＨＡ遺伝子は、合計の塩基ミスマッチ数は２～７個で、プライマー領域にある塩基ミスマッチの偏りもなかった。なお、A/duck/Tsukuba/168/2005(H5N2)のＨＡ遺伝子は、表２で実際に増幅できた遺伝子であり、これと同等の塩基ミスマッチパターンを持つ、A/duck/Korea/GJ54/2004(H5N2)由来のＨＡ遺伝子も増幅可能と判定された。
　これらの成績から、GenBankに登録されているＥＵ系統の２２１１個のＨ５－ＨＡ遺伝子のうち、２２０９個のＨＡ遺伝子は、ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法で増幅可能と判定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
７．本実施例のプライマーを使用したＬＡＭＰ法の反応特異性
　本実施例のプライマー（ＰＭ１６プライマーセット）を使用したＨ５亜型のＬＡＭＰ法の反応特異性について、Ｈ１～Ｈ１２亜型の鳥インフルエンザウイルス遺伝子、ＮＤＶ（Ｂ１株）およびＩＢＶ（Ｈ１２０株）を用いて検討した。
　その結果、ＰＭ１６プライマーセットを使用したＨ５亜型のＬＡＭＰ法では、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子のみが検出され、他のＨＡ亜型及び鶏病ウイルスは検出されなかった。なお、コントロール実験として行ったリアルタイムＰＣＲによっても、Ｈ５亜型のテンペレートのみが検出された。
　この結果から、本実施例のプライマーを使用したＬＡＭＰ法は、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子を特異的に検出することが確認できた。
８．ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法の検出感度
A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)のＨＡ遺伝子に由来するＰＣＲテンペレートを希釈して、１ウエル当たりの分子数として１０６～１となるようにして調整した。これをテンペレートにしてＬＡＭＰ法の検出感度を調べた。６０℃、６０分間の培養後、増幅を確認したところ、プラスミドテンペレートとＰＣＲテンペレートのいずれにおいても、検出限界は１ウエル当たり１，０００分子であった。また、A/whooper swan/Akita/1/2008 (H5N1)のＰＣＲテンペレートを用いた場合の検出限界も同様であった。
これらの結果から、本発明に係るＰＭ１６プライマーセットを使用したＬＡＭＰ法の感度は、Ｈ５－ＨＡ遺伝子を臨床サンプルからウイルス遺伝子を直接検出するのに十分に高感度であることが確認できた。
　また、ユーラシア系統用の「ＰＭ１６プライマーセット」は、ユーラシア系統のＨ５亜型ＨＡ遺伝子を広く検出できたことから、アメリカ系統のＨ５亜型-ＨＡ遺伝子をどの程度、検出可能かについて検討した。
　アメリカ系統のＨ５－ＨＡ遺伝子３８６個の塩基配列を”Influenza Virus Resource”からダウンロードし、アメリカ系統Ｈ５プライマーデータベースを作製した。このデータベースを使用して、ＰＭ１６プライマーセットによる検出の可否を調べた。以下の判定基準（表７）を満たすＨＡ遺伝子は検出可能と判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　その結果、３５３個のアメリカ系統のＨ５－ＨＡ遺伝子は検出できると判断された。残りの３３個のＨＡ遺伝子は８領域全ての塩基ミスマッチパターンを調べ、表８にまとめた。Ｆ１、Ｂ１またはＢ２の領域に３個の塩基ミスマッチを４個持つ遺伝子（１，５，６，９）が認められた。このうち２個は同一パターン（５，６）だったので、３個の遺伝子についてＰＣＲテンペレートを合成し、ＰＭ１６プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の可否を調べた。その結果、３個の遺伝子（１，５，９）は何れも増幅された。また残りの遺伝子は、ＢＩＰに４個の塩基ミスマッチを持つ３個の遺伝子と、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬのいずれかに２個の塩基ミスマッチを持つ６個の遺伝子（表８）であることが解った。表４の成績を参考にして、これら9遺伝子の検出の可否を推定した。その結果、これらの９遺伝子は全て増幅可能と判定された。以上の結果から、ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によって、アメリカ系統のＨ５－ＨＡ遺伝子（３８６個株）は全て増幅可能と判定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　また、上記１３個のＨＡ遺伝子を確実に検出するために、これらに特化したＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーを設計した。
ＦＩＰプライマー：GCAAGRACCAGTTTATGTTCATCCTCTTAC（配列番号１５６）
ＢＩＰプライマー：GGACTAAGAAACCCTTCTATRAATCCTGC（配列番号１５７）
これらのプライマーをＰＭ１６プライマーセットに加えた、ＰＭ１８プライマーセットは、上記１３個のＨＡ遺伝子に対して塩基ミスマッチ数が少ないことから、アメリカ系統のＨＡ遺伝子をより確実に増幅可能と期待される。
以上の結果から、ＰＭ１８プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法は、ＨＡ亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統のＨ５－ＨＡ遺伝子を確実に検出できると判定された。
（ＩＩ）鳥インフルエンザウイルスＨ７亜型の判定方法（ランプ法）
材料および実験方法
　上述のＨ５亜型の判定方法を同様に行っているため、必要に応じて、「（Ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型の判定方法」の項も参照のこと。
１．プライマーデータベース
　鳥インフルエンザウイルス、ユーラシア系統のＨ７亜型に属する１１４５個のＨＡ遺伝子及び、北米系統に属す６８９個のHA遺伝子について、それらの塩基配列を、 “Influenza Virus Resource” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)より取得し、別々に全てのＨＡ遺伝子をアライメントした。アライメントした遺伝子配列をExcelシートに転載し、ユーラシア系統と北米系統のプライマー専用データベースを構築した。これらのプライマー専用データベースを用いて、系統毎にＨＡ遺伝子の全ての塩基位置における、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣの出現率（％）を求めた。
　ＨＡ遺伝子上の各プライマー（ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬ）の位置は、ＨＡ開裂部位の近傍に設定した（図１１Ａ）。また、後述する２種類のプライマーセット（Ｓプライマーセット、ＰＭプライマーセット）は、有効性を正しく比較できるように、全てを同じ領域に設定した。
２．プライマーの設計
２－１．ウイルス株の遺伝子に特異的なプライマー（Ｓプライマー）
　Ｓプライマーは、A/duck/Shiga/B149/2007 (H7N7)（Ｖ273株と略す） のＨＡ遺伝子（アクセッション番号； AB558257）を標的に設計されたもので、現在、一般的に使用されているＬＡＭＰ法用のプライマーの例として実験に用いた。
２－２．混合塩基を含むプライマー（ＰＭプライマー）
　Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子の実験から、ランプ法にはＰＭプライマーが有用なことが明らかになったことから、Ｈ７亜型遺伝子の検出系においても、ＰＭプライマーを使用することにした。ＰＭプライマーとは、多様なＨＡ遺伝子をＰＣＲ法で幅広く検出するために必須のＭプライマー（Tsukamotoら, J Clin Microbiol 48:4275-4278, 2010.）（Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬ領域）と、多様なＨＡ遺伝子をランプ法で幅広く検出するのに必須のＰプライマー（ポピュレーションプライマー）（ＦＩＰおよびＢＩＰ領域）を組み合わせて設計したプライマーセットのことである。
　最初、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子の設計指針と同様の設計指針に基づいて、Ｈ７亜型遺伝子用のプライマーを設計した。しかし、Ｈ７亜型遺伝子の多様性がＨ５亜型遺伝子よりも広く、供試した１８３４株のＨＡ遺伝子をカバーするには、Ｆ３，　Ｂ３，　ＦＬ，　ＢＬプライマーに多くの混合塩基を必要とし、増幅効率の低さが懸念された。また、ＦＩＰとＢＩＰ領域のＰプライマーの本数が予想よりも多くなった。さらに予備実験において、Ｈ５亜型と同様の設計指針で作製したこれらのプライマーセットの遺伝子検出率は期待したほど高くはなかった。
　そこで、Ｈ７検出系においては、Ｈ５亜型検出系の設計方針を次のように修正した。先ず、ＦＩＰ領域とＢＩＰ領域のＰプライマーには、Ｈ５亜型検出系では０または１個の混合塩基数を使用したが、Ｈ７亜型検出系では、混合塩基数を２個に増やして、検出スペクトルの拡大を図りつつ、プライマーの本数の抑制を図った。
　次に、遺伝子の増幅効率に関わるＦ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬ領域のプライマーについては、Ｈ５検出系では、プライマー当たり５～６個の混合塩基を使用し、プライマー数を減らすことを優先した。しかし、これでは増幅に関わるプライマーの分子数が不足し、増幅効率が低下する懸念が考えられた。そこでＨ７検出系では、混合塩基数を３個に減らし、増幅に関与するプライマーの分子数を増やすようにした。また、単に混合塩基数を減らすだけでは、検出スペクトルが狭くなることから、検出スペクトルの広さを維持するために、１領域当たりのプライマー数を１本から２～３本に増やした。１領域に複数のプライマーを使用することは、その設計において、ポピュレーションプライマーの考えを取り入れる必要が生じることから、これらの４領域のプライマーについても、ポピュレーションプライマーと同様の方法でプライマーを設計することにした。これらの変更によって、検出スペクトルの拡大と増幅効率の向上が改善され、Ｈ５亜型遺伝子より多様性に富んだＨ７亜型遺伝子を確実に検出できるＨ７亜型検出系が開発されると期待された。設計されたプライマーセットは１７本のプライマーから構成された。これを以後、ＰＭ１７プライマーセットと呼ぶことにした。
３．テンペレートの調製（Ｈ７亜型のＨＡ遺伝子の合成）
　検出の標的となるＨＡ遺伝子は、その増幅領域を含む２７０塩基からなる部分を、各ＨＡ遺伝子当たり５～６本のプライマーを用いて、Ｈ７亜型遺伝子と同様の方法で、2ステップＰＣＲによって合成した。
　標的としたＨＡ遺伝子はユーラシア系統から８遺伝子、北米系統から４遺伝子とし、それぞれが遺伝学的に異なるものを、プライマー領域の塩基ミスマッチから判断して、選定した。合成したＨＡ遺伝子の由来、遺伝子合成に使用したプライマーの塩基配列情報は、以下の通りである。
A/duck/Shiga/B149/2007(H7N7)（アクセッション番号；AB558257）
Forward Primer：配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１
Reverse Primer：配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５
A/chicken/Wenzhou/610/2013(H7N7)（アクセッション番号；KF259013）
Forward Primer：配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８
Reverse Primer：配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１
A/turkey/Italy/5662/2000(H7N1）（アクセッション番号；KF493470）
Forward Primer：配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４
Reverse Primer：配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７
A/softbill/CA/33445-158/1992(H7N1)（アクセッション番号；GU186594）
Forward Primer：配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０
Reverse Primer：配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３
A/quail/Aichi/1/2009(H7N6)（アクセッション番号；AB538456）
Forward Primer：配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６
Reverse Primer：配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９
A/duck/Fujian/5408/2008（アクセッション番号；KF258959）
Forward Primer：配列番号３２０、配列番号３２１
Reverse Primer：配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３５８
A/duck/Taiwan/Ya103/1993（アクセッション番号；AB297925）
Forward Primer：配列番号３２５、配列番号３２６
Reverse Primer：配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、配列番号３５９
A/mallard/Sweden/885/2002（アクセッション番号；CY184504）
Forward Primer：配列番号３３０、配列番号３３１
Reverse Primer：配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３６０
A/red knot/Delaware Bay/242/1994(H7N7)（アクセッション番号；CY185895）
Forward Primer：配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７
Reverse Primer：配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０
A/shorebird/Delaware Bay/2696/1988(H7N3)（アクセッション番号；CY185837）
Forward Primer：配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３
Reverse Primer：配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６
A/muscovy duck/New York/31621-10/2005(H7N2)（アクセッション番号；CY095052）
Forward Primer：配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９
Reverse Primer：配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２
A/duck/Guangdong/1/1996（アクセッション番号；JQ988864）
Forward Primer：配列番号３５３、配列番号３５４
Reverse Primer：配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３６１
　１ｓｔＰＣＲでは、隣接する２本のプライマーを１つのチューブに入れた、２つの組合せについてＰＣＲによる増幅を行った。２ｎｄＰＣＲでは、その増幅産物を１００倍希釈したものを１本のチューブに入れ、２本の両サイドのプライマーを入れて、増幅反応を行った。得られた２７０塩基からなる増幅産物を電気泳動で確認した。合成したテンペレートをランプ法に使用する場合、ＰＣＲ増幅産物を10mM Tris pH 8.0で１，０００倍希釈したものを用いた。
結果
１．ＳプライマーセットおよびＰＭプライマーセット
　以下のプライマーを設計した。
（１）Ｓプライマーセット
ＦＩＰプライマーのセット；
配列番号２８６（プライマー名；P2571）
Ｆ３プライマーのセット；
配列番号２８２（P2567）
ＦＬプライマーのセット；
配列番号２８４（P2569）
ＢＩＰプライマーのセット；
配列番号２８７（P2572）
Ｂ３プライマーのセット；
配列番号２８３（P2586）
ＢＬプライマーのセット；
配列番号２８５（P2570）
（２）ＰＭプライマーセット
ＦＩＰプライマーのセット；
配列番号２７３（プライマー名；P2472）、配列番号２７４（P2473）、配列番号２７５（P2474）、配列番号２７６（P2475）、配列番号２７７（P2476）および配列番号２８１（P2573）
Ｆ３プライマーのセット；
配列番号２６４（P2456）、配列番号２６５（P2469）および配列番号２６６（P2470）
ＦＬプライマーのセット；
配列番号２６８（P2459）、配列番号２６９（P2460）および配列番号２７０（P2461）
ＢＩＰプライマーのセット；
配列番号２７８（P2477）、配列番号２７９（P2478）および配列番号２８０（P2479）
Ｂ３プライマーのセット；
配列番号２６７（P2458）
ＢＬプライマーのセット；
配列番号２７１（P2461）および配列番号２７２（P2462）
２．Ｐプライマー（ＰＭプライマーセット）の有用性の検討
　Ｈ７亜型のＳプライマーセットとＨ７亜型のＰＭ１７プライマーセットを用いて、ランプ法により、１２株の合成遺伝子の検出を行った。ＦＩＰとＢＩＰは、各プライマー濃度がそれぞれ40pmol/μＬになるように混合液を調製した。同様に、ＦＬとＢＬは各プライマー濃度が20pmol/μＬ、Ｆ３およびＢ３は5 pmol/μＬとなるように混合液を調製した。次に、反応液量10μＬに対して、各プライマー混合液0.3μＬ、蛍光発色試薬（FD）0.4μＬ、鎖置換型酵素（Bst）0.4μＬ、DW2.3μＬ、(x2)緩衝液5μＬ、テンペレート1μＬとなるよう混合した。反応時間は６０℃、６０分間とし、反応後にＵＶ照射し、緑色を示したものについて、増幅したと判定した。その結果、Ｓプライマーでは３株（ときに４株）、ＰＭ１７プライマーセットでは９株が増幅された。これらの結果は図１２にまとめた。
　このことから、ＰＭ１７プライマーセットはＳプライマーセットよりも、Ｈ７亜型の多様なＨＡ合成遺伝子をランプ法で幅広く増幅する際に有用なことが再確認された。
３．ＰＭ１７プライマーセットに対する合成遺伝子の塩基ミスマッチ解析
　遺伝子増幅と塩基ミスマッチ数との関連を知るために、Ｈ７－ＳプライマーセットとＨ７－ＰＭ１７プライマーセットが、用いた１２株の合成ＨＡ遺伝子に対して、何個の塩基ミスマッチを有するかを調べ、そのパターンを図１２にまとめた。この図では、増幅の障害となるミスマッチの集積がある領域を網がけで表示した。
　Ｓプライマーセットでは、合計塩基ミスマッチ数が１０個以下となる株は４株に限られており、この内、ランプ法で増幅されたV2はＦＩＰの領域にミスマッチの集積（３個）があったにも関わらず、他の領域に障害となるミスマッチの集積がなかったことから、増幅されたと考えられる。増幅されなかった８個の合成遺伝子は、塩基ミスマッチ数の合計が１１個から３２個と多く、増幅の障害となるミスマッチ数の集積が複数のプライマー領域で確認されたことから、増幅されなかったと考えられる。
　一方、ＰＭ１７プライマーセットに対して塩基ミスマッチ解析を行った結果、塩基ミスマッチ数が１１個を超える合成遺伝子はなく、増幅障害となる網がけのセルの領域は、V8、V9およびV10であった。このＨＡ遺伝子は、Ｆ１とＦ２の領域に２個ずつのミスマッチを持つもので、ランプ法では増幅されなかった。ＰＭ１７プライマーセットを用いた場合、同じ領域に設計した他のプライマーを用いて、塩基ミスマッチの集積を無くすことができることから、領域単位で判定した場合に増幅条件が担保されると考えられる。
　以上のこのことから、ポピュレーションプライマーをそれぞれの遺伝子集団ごとに設計し、混ぜることによって、Ｈ７亜型の多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出することができると考えられる。
４．ＰＭ１７プライマーセットによる、遺伝子バンク登録遺伝子の増幅推定
　ユーラシア系統１１４５株のＨＡ遺伝子について、ＰＭ１７プライマーセットに対する塩基ミスマッチパターンを調べた。その結果、ＦＩＰのＦ１領域とＦ２領域にそれぞれ２個のミスマッチを持つＨＡ遺伝子１１株が確認された。この遺伝子は、合成遺伝子V8のＦＩＰ領域と同様のミスマッチパターンを持つことから、検出困難と判定された。また、ミスマッチ数の合計が７個以上のＨＡ遺伝子数１９株が確認された。Ｈ７検出系では、Ｈ５検出系と比較して、検出がやや遅れる傾向があったことから、これらは検出遅延と判定された。１９株のうち４株はＦＩＰに増幅障害となる４個のミスマッチを持つ遺伝子であった。これらのＨＡ遺伝子（合計２６株）を除く、１１１９株はＰＭ１７プライマーセットを用いたランプ法で６０分以内に検出できると判定された。系統のHA遺伝子の推定検出率は９８%（１１１９株/１１４５株）であった。
　また、北米系統のＨＡ遺伝子６８９個についても同様の増幅推定解析を行った。その結果、ＢＩＰのＢ１領域とＢ２領域にそれぞれ２個のミスマッチを持つHA遺伝子３株が確認されたが、これらは増幅されなかった合成遺伝子V8のＦＩＰ領域と同様のミスマッチパターンを持つことから、これらは検出困難と判定された。また、合計ミスマッチ数が７個以上の遺伝子がこれ以外に１個、確認されたので、これは検出遅延と判定した。これらの４個のHA遺伝子を除く６８５個は、ＰＭ１７プライマーセットを用いたランプ法で６０分以内に検出できると判定された。北米系統のＨＡ遺伝子の推定検出率は９９%（６８５株/６８９株）で、両系統を合わせた総合検出率は推定で９８％（１８０６株/１８３４株）となった。
（ＩＩＩ）鳥インフルエンザウイルスＨ７亜型の判定方法（リアルタイムＰＣＲ法）
実験方法
１．プライマーデータベース
　遺伝子バンクに登録されているＨ７亜型のＨＡ遺伝子として、ユーラシア系統の１１７１個および北米系の６８８個をInfluenza virus Resourceからダウンロードし、プライマー専用データベースを作成した。ＨＡ遺伝子上の各プライマー（フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブプライマー）の位置を図１４に示す。
２．プライマーの設計
　プライマーの設計は、「（Ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型の判定方法」および「（ＩＩ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ７亜型の判定方法（ランプ法）」の「１．プライマーデータベース」、「２．プライマーの設計」の項に記載されるＦ３およびＢ３の設計方法に即して行った。なお、混合塩基の数は、３個以下とした。
３．使用した合成遺伝子
使用した合成遺伝子の株名等は図１４に示した。１１株のＨ７亜型ＨＡ遺伝子（V1～V11）に由来する合成遺伝子を、２ステップＰＣＲで合成し、それを10ｍM Tris pH8.0で1000倍に希釈したものをテンペレートに使用した。ただし、V12については遺伝子合成の最後の段階で、予想される産物が確認できなかったために、リアルタイムＰＣＲの実験には使用しなかった（ランプ法では、その一段階前の合成産物を使用した）。
４．リアルタイムＰＣＲ反応
４－１．マスターミックスの調製
　フォワードプライマー（配列番号３６２～配列番号３６５；20 pmol/μl）およびリバースプライマー（配列番号３６７～配列番号３６９；20 pmol/μl）を各0.5μl、プローブプライマー (配列番号３６６；10 pmol/μl) を0.5μl、(x2) Premix Ex Taq (Perfect Real Time)(Takara code RR039) を5 μl、Dye II を0.2 μl(Total 9.2 μl)混合した。
４－２．増幅プログラム
　95℃で30秒反応後、95℃で10秒、50℃で20秒および60℃で0秒のサイクルを35回行った。
４－３．遺伝子増幅の判定
　2 %　アガロースゲルを用いて、ウエル当たり増幅産物の2 μlを電気泳動してから、エチジウムブロマイドで染色後、UV照射し、DNAバンドの有無から遺伝子増幅を判定した。
　なお、既知のプライマーであるH7-M3プライマーセットは、-20℃に長期間保存してあったために、波形を確認できなかったため、H7-PM7プライマーセットについても、増幅波形ではなく、ゲル電気泳動の写真から増幅を判定した。なお、H7-PM7プライマーセットについては増幅波形でも増幅が確認されている。）
５．塩基ミスマッチ解析
　リアルタイムＰＣＲ法用のプライマーセットとして、本発明にかかるＨ７－ＰＭ８プライマーセットと、現在、国内で診断に使用されているＨ７－Ｍ３ｅｕ及びＨ７－Ｍ３ａｍの両プライマーセットを使用した。それらのプライマー領域は同一で、既報（Tsukamotoら, Journal of Clinical Microbiology 48:4275-4278,2010）の通りである。塩基ミスマッチ数は、各遺伝子の３か所のプライマー領域について、それぞれのプライマーとの塩基ミスマッチ数を一つ一つ求めてから、遺伝子毎に３ヶ所のプライマー領域にあるミスマッチのパターンを調べた。なお、Ｈ７－ＰＭ８プライマーセットについては、フォワード及びリバースのプライマーが複数あることから、全てのプライマーについて、塩基ミスマッチ数を算出した後で、領域毎にミスマッチ数が最も少ないプライマーのミスマッチ数をその領域のミスマッチ数とした。これによって得られた、各遺伝子のミスマッチパターンを用いて、ミスマッチの数毎に、遺伝子数を調べた。
結果
１．プライマー
　実験に使用したプライマーの設定位置は、図１４に示す。
また、プライマーの配列は表１１～１３に示す
（１）Ｈ７－ＰＭ８プライマーセット（本発明の方法で設計したポピュレーションプライマー）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 （２）Ｈ７－Ｍ３ｅｕプライマーセット（ユーラシア系統用の既知のプライマー）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 （３）Ｈ７－Ｍ３ａｍプライマーセット（北米系統用の既知のプライマー）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
２．リアルタイムＰＣＲ反応の結果
２－１．Ｈ７－ＰＭ８プライマーセット（本発明にかかるポピュレーションプライマー）を使用した結果
　Ｈ７－ＰＭ８プライマーを用いて各合成遺伝子に対しリアルタイムＰＣＲ反応を行った結果を図１５に示す。
　Ｈ７－ＰＭ８プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った結果、１１株のＨ７亜型ＨＡ遺伝子の全てを増幅することができた（図１６）。また、これらのＨＡ遺伝子とＨ７－ＰＭ８プライマーセットとの塩基ミスマッチ解析を行った結果、３か所のプライマー領域（フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブプライマー）において、塩基ミスマッチ数は２個以内に収まっていることが確認された。
２－２．Ｈ７－Ｍ３プライマーセット（既知のプライマー）を使用した結果
　Ｈ７－Ｍ３プライマーセットを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った結果、Ｈ７－Ｍ３ｅｕセットプライマーセットを用いた場合は、１１個のＨ７亜型ＨＡ遺伝子のうち、８個のＥｕ系統遺伝子は強く、１個の北米系統遺伝子は弱く検された（図１７Ａ）。一方、Ｍ３ａｍセットを用いた場合は３個全ての北米系統遺伝子に加えて、２個のＥｕ系統遺伝子（計５個）が増幅された（図１７Ｂ）。
　次に、これらのＨＡ遺伝子とＨ７－Ｍ３プライマーセットとの塩基ミスマッチ解析を行った（図１８）。その結果、３か所のプライマー領域（フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブプライマー）における塩基ミスマッチ数が３個以内であれば、遺伝子が増幅されたが、４個以上の場合は、ほとんど検出されなかった。ただし、Ｍ３ａｍセットでＥｕ系統の遺伝子を検出した場合にみられたように、３個の場合は遺伝子によってはやや弱く検出される場合があった。
　これらのことから、Ｈ７－Ｍ３プライマーセットは同系統の遺伝子を幅広く検出できるが、別系統の遺伝子を検出できないか、一部の遺伝子を弱く検出することが明らかになった。
　　以上の結果から、ＰＣＲ法用のプライマーを設計する場合、野外での実用化を図るのであれば、塩基ミスマッチ数はできる限り２個以内に収めることが好ましいと考えられる。
３．登録されているＨ７亜型ＨＡ遺伝子と各プライマーセットとの塩基ミスマッチ解析
　バンク登録されたＨ７亜型のＨＡ遺伝子に対する塩基ミスマッチ解析の結果を図１９にまとめた。Ｈ７－ＰＭ８プライマーセットの場合は、各プライマー領域に対する最小の塩基ミスマッチ数は、両系統のＨＡ遺伝子に対して、２個以内に収まっていることが確認された。このことから、Ｈ７－ＰＭ８プライマーセットを用いれば、供試したＨ７亜型のＨＡ遺伝子の全てを検出できると推定された。
　これに対して、従来のＨ７－Ｍ３プライマーセットの場合は、ユーラシア系統遺伝子の６０個がユーラシア系統のプライマーセットに対して３個以上の塩基ミスマッチを持っていた。また、北米系統遺伝子の５個が北米系統のプライマーセットに対して３個以上の塩基ミスマッチを持っていた。従って、Ｍ３プライマーセットでは検出困難な遺伝子が少なからず存在することが明らかになった。
　以上、本発明にかかるＨ７－ＰＭ８プライマーセットは、登録遺伝子を網羅的に検出するのに有用と考えられる。
　鳥インフルエンザウイルスは今後も変異を続け、ミスマッチ数が増加していくと予想されているが、本発明にかかるプライマー作製方法は、遺伝子のポピュレーション毎にプライマーを設計し、必要に応じて新たに作製したプライマー追加できることから、将来においても有用なプライマーセットを作製することが可能である。
　他方、１本のプライマーに加えることができる混合塩基数は５個が限界である（Tsukamotoら, Journal of Clinical Microbiology, 50:37-45,2012を参照のこと）ことを考慮すると、既知のプライマーセットであるＭ３プライマーセットは、すでに混合塩基を４～５個含んでおり、さらなる混合塩基を追加することは難しいと考えられる。従って、既知のＭ３プライマーセットは、現状においても一部の遺伝子は検出困難と判定されているところ、新たな変異株が出現した場合には、網羅的な亜型判定には使用できなくなる可能性が高いと考えられる。このことから、Ｍ３プライマーセットは網羅的な亜型判定に今後、次第に使用できなくなる可能性が考えられる。
　本発明は、インフルエンザウイルスの多様なＨＡまたはＮＡ遺伝子を幅広く検出し、ＨＡ及びＮＡ亜型を判定する、精度の高いＬＡＭＰ法用プライマーおよび判定方法に関するものである。本方法は従来法と比較すると、標的遺伝子の検出漏れを顕著に改善し、ＨＡまたはＮＡの遺伝子を亜型特異的且つ網羅的に検出することを可能にしたもので、迅速、簡便なＬＡＭＰ法の実用性を著しく向上させることができる。本法は、変異し易く、多様な病原体によって引き起こされる感染症に対する遺伝子診断法の信頼度を高める技術として、その活用が多いに期待されるものである。

Claims (43)

  1. 　病原体の型または亜型判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列からなるフォワードプライマーのセット。
    （ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、相同性が高い塩基が集積する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
    （ｂ）フォワードプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
    （ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
    （ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
    （ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
    （ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
  2. 　前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする請求項１に記載のフォワードプライマーのセット。
    （ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
    （ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程
  3. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４および配列番号３６５で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする請求項１または２に記載のフォワードプライマーのセット。
  4. 　病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項１または２に記載のフォワードプライマーの塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーのセット。
  5. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号３６７、配列番号３６８および配列番号３６９で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする請求項４に記載のリバースプライマーのセット。
  6. 　病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＦ２領域およびＦ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列からなるＦＩＰプライマーのセット。
    （ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
    （ｂ）工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程、
    （ｃ）各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
    （ｄ）Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＦ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＦ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれる各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
    （ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
    （ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
    （ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程
  7. 　病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記工程（ａ）および／または工程（ｅ）が下記の工程であることを特徴とする請求項６に記載のＦＩＰプライマーのセット。
    （ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域をＦ２領域として選択する工程、
    （ｅ）前記工程（ｄ）でカウントされた塩基数が４以上である検査対象遺伝子、および、カウントされた塩基の数が３であってコンセンサス配列の塩基と異なる塩基がＦ１領域またはＦ２領域のいずれかに偏っている検査対象遺伝子を抽出する工程
  8. 　前記Ｆ１領域の５’末端の塩基とＦ２領域の５’末端の塩基との間に、４０塩基～６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基数が１０塩基～２５塩基であることを特徴とする請求項６または７に記載のＦＩＰプライマーのセット。
  9. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項６ないし８のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット。
    （ａ）配列番号１～配列番号２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
    （ｂ）配列番号１１５～配列番号１１９および配列番号１５６で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
    （ｃ）配列番号１３１～配列番号１３３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット
  10. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７および配列番号２８１で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする請求項６ないし８のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット。
  11. 　病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項６ないし８のいずれかに記載のＦＩＰプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーのセット。
  12. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項１１に記載のＢＩＰプライマーのセット。
    （ａ）配列番号４６～配列番号８２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
    （ｂ）配列番号１２２～配列番号１２８および配列番号１５７で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
    （ｃ）配列番号１３４～配列番号１３６で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット
  13. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２７８、配列番号２７９および配列番号２８０で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする請求項１１に記載のＢＩＰプライマーのセット。
  14. 　病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦ３領域のコンセンサス配列からなるＦ３プライマーのセット。
    （ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項６または請求項７に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程、
    （ｂ）各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
    （ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
    （ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
    （ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
    （ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
  15. 　前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする請求項１４に記載のＦ３プライマーのセット。
    （ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項６または請求項７に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択する工程、
    （ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程
  16. 　病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、請求項６または請求項７に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦ３プライマーのセット。
  17. 　前記Ｆ３領域の３’末端の塩基と前記Ｆ２領域の５’末端の塩基との間に０～６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ３領域の塩基数が１０塩基～２５塩基であることを特徴とする請求項１４ないし請求項１６のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
  18. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項１４ないし１７のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
    （ａ）配列番号２１～配列番号３４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
    （ｂ）配列番号１２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
    （ｃ）配列番号１３７～配列番号１３８で表される塩基配列のプライマーからなるセット
  19. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２６４、配列番号２６５および配列番号２６６で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする請求項１４ないし１７のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
  20. 　病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項１４ないし１７のいずれかに記載のＦ３プライマーの塩基配列の相補配列からなるＢ３プライマーのセット。
  21. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項２０に記載のＢ３プライマーのセット。
    （ａ）配列番号８３～配列番号９２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
    （ｂ）配列番号１２９で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
    （ｃ）配列番号１４２で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット
  22. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２６７で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする請求項２０に記載のＢ３プライマーのセット。
  23. 　病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）～（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦＬ領域のコンセンサス配列からなるＦＬプライマーのセット。
    （ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項６または請求項７に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦＬ領域として選択する工程、
    （ｂ）各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
    （ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
    （ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
    （ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
    （ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程
  24. 　前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする請求項２３に記載のＦＬプライマーのセット。
    （ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項６または請求項７に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦＬ領域として選択する工程、
    （ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程
  25. 　病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、請求項６または請求項７に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦＬプライマーのセット。
  26. 　前記ＦＬ領域の塩基数が１０塩基～２５塩基であることを特徴とする請求項２３ないし２５のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
  27. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項２３ないし２６のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
    （ａ）配列番号３５～配列番号４５で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
    （ｂ）配列番号１２１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
    （ｃ）配列番号１３９～配列番号１４１で表される塩基配列のプライマーからなるセット
  28. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２６８、配列番号２６９および配列番号２７０で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする請求項２３ないし２６のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
  29. 　請求項２３ないし２６のいずれかに記載のＦＬプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＬプライマーのセット。
  30. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）～（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項２９に記載のＢＬプライマーのセット。
    （ａ）配列番号９３～配列番号１１４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
    （ｂ）配列番号１３０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
    （ｃ）配列番号１４３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット
  31. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、配列番号２７１および配列番号２７２で表される塩基配列のプライマーからなるセットであることを特徴とする請求項２９に記載のＢＬプライマーのセット。
  32. 　請求項１ないし３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットおよび請求項４または５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
  33. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよび請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
  34. 　請求項６ないし１０のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセットおよび請求項１１ないし１３のいずれかに記載のＢＩＰプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
  35. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、請求項９に記載のＦＩＰプライマーのセットおよび請求項１２に記載のＢＩＰプライマーのセットを用いることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
  36. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、請求項１０に記載のＦＩＰプライマーのセットおよび請求項１３に記載のＢＩＰプライマーのセットを用いることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
  37. 　請求項１４ないし１９のいずれかに記載のＦ３プライーのセットおよび請求項２０ないし２２のいずれかに記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  38. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、請求項１８に記載のＦ３プライマーのセットおよび請求項２１に記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
  39. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、請求項１９に記載のＦ３プライマーのセットおよび請求項２２に記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
  40. 　請求項２３ないし２８のいずれかに記載のＦＬプライマーのセットおよび請求項２９または３１に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
  41. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、請求項２７に記載のＦＬプライマーのセットおよび請求項３０に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
  42. 　前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ７亜型であり、請求項２８に記載のＦＬプライマーのセットおよび請求項３１に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
  43. 　請求項１ないし３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、請求項４もしくは請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、請求項６ないし１０のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット、請求項１１ないし１３のいずれかに記載のＢＩＰプライマーのセット、請求項１４ないし１９のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット、請求項２０ないし２２のいずれかに記載のＢ３プライマーのセット、請求項２３ないし２８のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット、または、請求項２９ないし３１のいずれかに記載のＢＬプライマーのセットの少なくとも１つのプライマーのセットを含む、病原体の型または亜型を判定するためのキット。
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