CN112301161A

CN112301161A - 一种检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN112301161A
Application number: CN202010831493.9A
Authority: CN
Inventors: 崔大祥; 李雪玲; 田静; 徐艳; 陈晓敏; 刘泽熙; 梁辉
Original assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2021-02-02

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒，对当前的新型冠状病毒疫情防控具有较大意义。本发明提供了检测新型冠状病毒的引物组，所述引物组选自以下引物组A‑C之任意一组，含有SEQ ID NO 1‑SEQ ID NO 13所示序列中的任意一条或者若干条。本发明还包括基于上述引物组的新型冠状病毒的检测试剂盒，以及制备方法和应用。本发明的新型冠状病毒检测反应体系/试剂盒，具有操作便捷、检测速度快、灵敏度高、特异性和通用性好等优点。

Description

一种检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒，以及其应用。

背景技术

核酸检测涉及到提取、扩增、检测等环节，对实验室环境和操作人员要求较高，一个完整的新冠病毒核酸检测程序往往需要专业测试人员连续3小时以上的双手离台操作，涉及大型的荧光定量PCR仪，因此核酸检测的普及和现场应用受到限制，进而导致了大量疑似病s例患者和密切接触人群不能够及时得到确诊，同时由于某些方法由于反应体系灵敏度不够容易造成检测结果的假阴性从而出现漏检问题。因此有必要开发一种操作便捷、检测快速、灵敏度高的新型冠状病毒的反应体系/试剂盒。

发明内容

本发明目的在于：设计检测新型冠状病毒的引物组，针对新型冠状病毒具有通用性，对非新型冠状病毒具有特异性。

本发明的再一目的在于：提供使用上述引物组的试剂盒，以达到操作简便、检测时间短，灵敏度高，降低假阴性和漏检率。

本发明通过LAMP反应体系/试剂的优化，克服当前新型冠状病毒分子检测领域中所遇到的由于操作复杂、检测时间长而造成大量疑似病例患者和密切接触人群不能够及时得到确诊，以及由于反应体系灵敏度较低易造成检测结果呈假阴性从而出现漏检的问题。

本发明要解决的另一个技术问题是提供检测新型冠状病毒的引物及试剂盒。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展起来的一种新型等温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件保温约60 min，即可完成核酸扩增反应。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、等温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及操作便捷、检测时间短、灵敏度高、特异性强等优点。新冠疫情爆发后，研究人员基于LAMP原理研制了新冠病毒的检测方法，如Yinhua Zhang et al. (2020)[文献见：RapidMolecular Detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) Virus RNA Using ColorimetricLAMP. doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.26.20028373 ]以新型冠状病毒的ORF和N基因设计了LAMP扩增引物，其中检测灵敏度较高的包含引物组NA的反应体系最低可检测到120拷贝的RNA。为了进一步提高检测灵敏度，降低假阴性和漏检率，本发明开发了一种检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒，并在此基础上完成本发明。

本发明公开了一种检测新型冠状病毒（2019-nCoV/Sars-CoV-2）的引物组及试剂盒。所述引物组兼具特异性和通用性。所述试剂盒包括酶反应体系和显色剂，通过在酶反应体系下进行等温扩增反应，通过显色剂辅助判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在新型冠状病毒。本发明检测试剂盒具有操作便捷、检测速度快、灵敏度高特点，可以加快疑似病例患者和密切接触人群检测速度，同时最大限度地避免当前由检测灵敏度低引致的漏检问题。

本发明提供一种检测新型冠状病毒的引物组，所述引物组选自以下引物组A-C之任意一组：

引物组A：

上游外引物A_F3: 5’-TTTCACAAATATTACCAGATCCA-3’（SEQ ID NO: 1）

下游外引物A_B3: 5’-AAACAGTAAGGCCGTTAAAC-3’（SEQ ID NO: 2）

上游内引物A_FIP: 5’-AGCATCTGCAAGTGTCACTTTTCAAAACCAAGCAAGAGGT-3’（SEQ IDNO: 3）

下游内引物A_BIP: 5’-GGCTTCATCAAACAATATGGTGATTTTGTGCACAAATGAGGTCT-3’（SEQID NO: 4）

环引物A_LB: 5’-GCCTTGGTGATATTGCTGCT-3’（SEQ ID NO: 5）

引物组B：

上游外引物B_F3: 5’-CATGTTCTTTTGGTGGTGT-3’（SEQ ID NO: 6）

下游外引物B_B3: 5’-TTAAACAGCCTGCACGTG-3’（SEQ ID NO: 7）

上游内引物B_FIP: 5’-CTTCTGTGCAGTTAACATCCTGATATAACACCAGGAACAAATACTTCT-3’（SEQ ID NO: 8）

下游内引物B_BIP: 5’-TCCCTGTTGCTATTCATGCAGATTAGAACCTGTAGAATAAACACG-3’（SEQID NO: 9）。

引物组C：

上游外引物C_F3: 5’- CAGTCAAGCCTCTTCTCGTT-3’（SEQ ID NO: 10）

下游外引物C_B3: 5’- AGAAGCCTCAGCAGCAGAT-3’（SEQ ID NO: 11）

上游内引物C_FIP: 5’- GCCAGCCATTCTAGCAGGAGAACCTCATCACGTAGTCGCAAC-3’（SEQ IDNO: 12）

下游内引物C_BIP: 5’- ATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCCTTGTTGTTGTTGGCCT-3’（SEQ IDNO: 13）。

基于上述引物组，本发明提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物组中的任意一组。

较好的，本发明所述的试剂盒，其还包括dNTP 溶液、Bst DNA聚合酶中的一种或多种。

较好的，本发明所述的试剂盒，其还包括逆转录酶。

较好的，本发明所述的试剂盒，还包括显色剂；所述显色剂选自Sybr Green I、Genefinder或GelRed。

较好的，本发明所述的试剂盒还包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg²⁺或者甜菜碱中的一种或者几种。

本发明的试剂盒可以采用常规技术方法制备。例如，根据引物序列，使用化学合成的方法逐个或者逐段的连接引物。

具体而言，本发明所述的试剂盒，其还包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg²⁺、甜菜碱、dNTP 溶液、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、显色剂中的一种或多种。

例如，当采用的模板为质粒DNA或cDNA时，在酶反应体系中可以不添加逆转录酶。

在一具体实施方案中，本发明试剂盒酶反应体系包括：1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液、6-8 mmol/L Mg²⁺、0.6 mol/L的甜菜碱、0.8-1.2 mmol/L dNTP，0.2 µmol/L的F3和B3引物，1.6 µmol/L的FIP和BIP引物，包括或不包括0.4 µmol/L的环引物、0.3-0.4 U/μL BstDNA聚合酶和0.06-0.08 U/μL逆转录酶。例如，1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含20mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，10 mmol/L KCl，10 mmol/L(NH4)₂SO4，0.1% Triton X-100，2 mM MgSO₄。

本发明所述的试剂盒中，上述各组分的浓度为工作浓度，在保存、运输的过程中，各组分的浓度可为工作浓度的2～100倍。各组分可以独立存在也可以预混合存在，例如，所述试剂盒包括缓冲液、酶和显色剂三个独立存在的试剂，其中预混试剂缓冲液包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg²⁺、甜菜碱和dNTP、引物F3、B3、FIP、BIP和LB，预混试剂酶包括Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶；也可以包括缓冲液、引物、酶和显色剂四个独立存在的试剂，其中预混试剂缓冲液包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg²⁺、甜菜碱、dNTP，预混试剂引物包括F3、B3、FIP、BIP和LB，预混试剂酶包括Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶。

另一方面，本发明提供了所述的引物组的应用，即所述的引物组在制备新型冠状病毒检测试剂中的应用，或者所述的引物组在筛选清除或者抑制新型冠状病毒核酸的药剂中的应用。

所述的应用包括如下步骤：

分离获得待测样品或者经过清除或者抑制新型冠状病毒核酸的药剂处理后的核酸；和/或

以待测样品的核酸为模板，使用上述引物组进行扩增。

较好的，所述的应用还包括根据扩增结果判断待测样品中是否含有新型冠状病毒核酸。

所述的扩增的条件为反应为在60～65⁰C条件下反应30～60 min。

所述等温扩增反应可以在普通PCR仪、荧光定量PCR仪、水浴锅、电加热器等控温装置上进行。

本发明中，所述显色剂选自Sybr Green I、Genefinder或GelRed。显色结果可通过肉眼观察，或借助紫外灯进行观察，当借助紫外灯观察时，所用波长为254 nm，365 nm，优选254 nm。

基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。

本发明为临床诊断技术提供了一种检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒，对当前的新型冠状病毒疫情防控具有较大意义。本发明有益效果包括：采用本发明新型冠状病毒检测反应体系/试剂盒具有操作便捷、检测速度快、灵敏度高、特异性和通用性好等优点。与目前常用检测方法相比，本发明采用的等温扩增法，可以在等温条件下进行，只需采用简单的控温装置，不需要PCR实验中的昂贵仪器，不需要对扩增产物进行电泳检测等步骤，因而，非常适于广泛应用检测部门推广使用，即使在分子生物学专业知识和技能基础相对不足的环境下也可充分应用。

附图说明

图1表明本发明实施例2对引物组A采用试剂盒F进行测试的结果；

图2表明本发明实施例3对引物组A采用试剂盒E进行测试的结果；

图3表明本发明实施例4对引物组A采用试剂盒D进行测试的结果；

图4表明本发明实施例5对引物组B采用试剂盒D进行测试的结果；

图5表明本发明实施例6对引物组C采用试剂盒D进行测试的结果。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

新型冠状病毒LAMP检测引物的设计及特异性、通用性分析

按照专利ZL201510559179.9中的方法，从NCBI的FTP下载新型冠状病毒及非新型冠状病毒的所有病毒的全基因组序列（分别为75条和19万条）。设定集合G_1，其包含目标基因组序列（即，新型冠状病毒的75个全基因组序列），所设计引物应当能够检测出对应的75株新型冠状病毒，即具有通用性；设定集合G_2，其包含非目标基因组序列（即，除新型冠状病毒的前述75个目标基因组序列之外的其他病毒的全基因组序列），所设计的引物应当不能够检测到除新型冠状病毒之外的其他病毒，即，具有特异性。以NC 045512.2为参考序列，依次进行设计单条引物、引物序列比对、单条序列组合和引物组检测，输出符合条件的引物组10个，其中包括引物组A、引物组B、引物组C。

根据引物组A在NC 045512.2的新型冠状病毒基因组上的位置，分别将F3到B3之间的扩增区域序列（包含F3和B3）与数据库中新型冠状病毒的另外74个全基因组序列进行Blast比对，结果显示，引物区序列均完全匹配，表明引物组A可以扩增目前已有的75株新型冠状病毒，通用性很好。

此外，将引物组A与其它所有非新型冠状病毒的病毒基因组进行Bowtie比对（将参数设置为“-a -n 3”，即允许不超过3个碱基不匹配），发现该引物组的序列在非新型冠状病毒的病毒基因组中不存在，表明引物组A特异性很好。

按照上述方法，分别对引物组B、引物组C进行通用性和特异性检测，结果表明，引物组B、引物组C可以扩增目前已有的75株新型冠状病毒，通用性很好。此外，两组引物组的序列在非新型冠状病毒的病毒基因组中也不存在，表明引物组B和引物组C特异性很好。

实施例2

对引物组A采用试剂盒F进行测试

新型冠状病毒质粒DNA样品（2019-nCoV S全长质粒）来自生工生物工程（上海）上海股份有限公司，原始浓度为1.492×10¹¹拷贝/μL。

表1为新型冠状病毒检测试剂盒种类及主要组成成分，表2为本发明试剂盒检测新型冠状病毒的反应条件。

本实施例采用引物组A（含环引物LB）、试剂盒F配制反应体系，模板按照4000、2000、1000、500、250、125、63和0拷贝，Mg²⁺浓度为 8 mmol/L，dNTP浓度为1.0 mmol/L，BstDNA聚合酶浓度分别为0.16、0.24、0.32、0.40和0.48 U/μL，不加逆转录酶，其他成份按照表2中所述条件。63℃条件下进行等温扩增反应40 min，82℃下终止反应7 min。反应后加入2.5 μL显色剂GelRed（终浓度50×）。在254 nm紫外灯下进行扩增结果确认。

如图1所示1-8分别为4000、2000、1000、500、250、125、63和0拷贝，第一排至第五排Bst DNA聚合酶浓度分别为0.16、0.24、0.32、0.40和0.48 U/μL。图1中，当Bst DNA聚合酶浓度为0.32和0.40 U/μL时，模板为4000、2000、1000、500、250、125、63拷贝时各处理的反应产物在紫外灯下呈现为亮粉色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物在紫外灯下为暗粉色，为阴性结果；当Bst DNA聚合酶浓度为0.16、0.24和0.48 U/μL时，仅有部分阳性处理呈现为阳性结果，表明结果不稳定。上述结果表明，当引物组A在Bst DNA聚合酶浓度为0.32～0.40 U/μL时，检测效果最好。

实施例3

对引物组A采用试剂盒E进行测试的结果

新型冠状病毒质粒DNA样品（2019-nCoV S全长质粒）来自生工生物工程（上海）上海股份有限公司，浓度为1.492×10¹¹拷贝/μL。

采用引物组A（含环引物LB）、试剂盒E配制反应体系，模板按照4000、2000、1000、400、200、100、40、20、10、4、2、1和0拷贝，Mg²⁺浓度为6 mmol/L，dNTP浓度为1.2 mmol/L，BstDNA聚合酶浓度为0.32 U/μL，不加逆转录酶，其他成份按照表2中所述条件。63℃条件下进行等温扩增反应40 min，82℃下终止反应7 min。反应后加入2.5 μL显色剂Genefinder（终浓度50×）。通过肉眼观察和借助紫外灯（254 nm）进行扩增结果确认。

如图2所示1-13分别为4000、2000、1000、400、200、100、40、20、10、4、2、1和0拷贝，上图为肉眼观察结果，下图为紫外灯下观察结果。图2中，肉眼观察，模板为4000、2000、1000、400、200、100、40、20、10、4、2和1拷贝时各阳性处理的反应产物呈现为绿色，为阳性结果，而0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物呈现为橙色，为阴性结果。紫外灯下观察，模板为4000、2000、1000、400、200、100、40、20、10、4、2和1拷贝时各阳性处理的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物为暗绿色，为阴性结果。检测结果表明，当每个反应管中最低含1拷贝的模板时仍可被检出，灵敏度较高。

实施例4

对引物组A采用试剂盒D进行测试

采用引物组A（含环引物LB）、试剂盒D的预混套装，其中，按表1中试剂1～4、试剂5～9分别制备成预混试剂I、II配制反应体系，模板浓度为100、40、20、10、4、2、1和0拷贝，染色剂为Sybr Green I，其他成份和条件按照实施例3。

如图3所示1-8分别为100、40、20、10、4、2、1和0拷贝，上图为肉眼观察结果，下图为紫外灯下观察结果。图3中，肉眼观察，模板为100、40、20、10、4、2和1拷贝时各阳性处理的反应产物呈现为绿色，为阳性结果，而0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物呈现为橙色，为阴性结果。紫外灯下观察，模板为100、40、20、10、4、2和1拷贝时各阳性处理的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，0拷贝处理（即阴性对照）的反应产物为暗绿色，为阴性结果。检测结果表明，当每个反应管中最低含1拷贝的模板时仍可被检出，灵敏度较高。

实施例5

对引物组B采用试剂盒D进行测试

采用引物组B、试剂盒D的预混套装，按表1中试剂1～8制备成预混试剂I配制反应体系，模板浓度分别为50000、5000、500、50、5、2、1和0拷贝，染色剂为Sybr Green I，其他成份和条件按照实施例3。

如图4所示1-8分别为50000、5000、500、50、5、2、1和0拷贝。图4中，肉眼观察，模板为50000、5000、500和50拷贝时各阳性处理的反应产物呈现为绿色，为阳性结果，而模板为5、2、1和0拷贝时，各处理的反应产物呈现为橙色，为阴性结果。检测结果表明，当每个反应管中最低含50拷贝的模板时仍可被检出，灵敏度较高。

实施例6

对引物组C采用试剂盒D进行测试

新型冠状病毒RNA样品为上海市计量测试技术研究院提供的体外转录RNA标准物质（包含核壳蛋白N基因全长、包膜蛋白E基因全长、开放阅读框1ab基因片段），编号GBE（E）091112，N基因浓度为2.9×10⁷拷贝/μL。

采用引物组C、试剂盒D的预混套装，按表1中试剂1～8制备成预混试剂I、试剂10～11制备成预混试剂II配制反应体系，模板浓度为20000、2000、200、20、5、2和0拷贝，AMV浓度为0.06 U/μL，染色剂为Sybr Green I，其他成份和条件按照实施例3。

如图5所示1-7分别为20000、2000、200、20、5、2和0拷贝。图5中，肉眼观察，模板为20000、2000、200、20和5拷贝时各处理的反应产物呈现为绿色，为阳性结果，而模板为2和0拷贝时，各处理的反应产物呈现为橙色，为阴性结果。检测结果表明，当每个反应管中最低含5拷贝的模板时仍可被检出，灵敏度较高。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准

。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司

<120> 一种检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒

<130> DL20182

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

tttcacaaat attaccagat cca 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

aaacagtaag gccgttaaac 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

agcatctgca agtgtcactt ttcaaaacca agcaagaggt 40

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

ggcttcatca aacaatatgg tgattttgtg cacaaatgag gtct 44

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

gccttggtga tattgctgct 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

catgttcttt tggtggtgt 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

ttaaacagcc tgcacgtg 18

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

cttctgtgca gttaacatcc tgatataaca ccaggaacaa atacttct 48

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

tccctgttgc tattcatgca gattagaacc tgtagaataa acacg 45

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

cagtcaagcc tcttctcgtt 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

agaagcctca gcagcagat 19

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

gccagccatt ctagcaggag aacctcatca cgtagtcgca ac 42

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

atgctgctct tgctttgctg ctgccttgtt gttgttggcc t 41

Claims

1.一种检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述引物组选自以下引物组A-C之任意一组：

所述的引物组A的引物包括下列序列：

上游外引物A_F3: 5’-TTTCACAAATATTACCAGATCCA-3’ （SEQ ID NO: 1），

下游外引物A_B3: 5’-AAACAGTAAGGCCGTTAAAC-3’ （SEQ ID NO: 2），

上游内引物A_FIP: 5’-AGCATCTGCAAGTGTCACTTTTCAAAACCAAGCAAGAGGT-3’ （SEQ IDNO: 3），

下游内引物A_BIP: 5’-GGCTTCATCAAACAATATGGTGATTTTGTGCACAAATGAGGTCT-3’ （SEQID NO: 4），

环引物A_LB: 5’-GCCTTGGTGATATTGCTGCT-3’（SEQ ID NO: 5）；

所述的引物组B的引物包括下列序列：

上游外引物B_F3: 5’-CATGTTCTTTTGGTGGTGT-3’ （SEQ ID NO: 6），

下游外引物B_B3: 5’-TTAAACAGCCTGCACGTG-3’（SEQ ID NO: 7），

上游内引物B_FIP:

5’-CTTCTGTGCAGTTAACATCCTGATATAACACCAGGAACAAATACTTCT-3’ （SEQ ID NO: 8），

下游内引物B_BIP:

5’-TCCCTGTTGCTATTCATGCAGATTAGAACCTGTAGAATAAACACG-3’（SEQ ID NO: 9）；

所述的引物组C的引物包括下列序列：

上游外引物C_F3: 5’- CAGTCAAGCCTCTTCTCGTT-3’（SEQ ID NO: 10），

下游外引物C_B3: 5’- AGAAGCCTCAGCAGCAGAT-3’（SEQ ID NO: 11），

上游内引物C_FIP: 5’- GCCAGCCATTCTAGCAGGAGAACCTCATCACGTAGTCGCAAC-3’ （SEQID NO: 12），

2.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其还包括dNTP、Bst DNA聚合酶中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其还包括逆转录酶。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其还包括显色剂，所述显色剂选自SybrGreen I、Genefinder或GelRed。

6.根据权利要求2-5中任意一种所述的试剂盒，其特征在于，其还包括Bst DNA聚合酶反应缓冲液、Mg²⁺或者甜菜碱中的一种或者几种。

7.权利要求1所述的引物组的应用，其特征在于，所述的引物组在制备新型冠状病毒检测试剂中的应用，或者所述的引物组在筛选清除或者抑制新型冠状病毒核酸的药剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用包括如下步骤：

分离获得模板中的核酸；和/或

使用权利要求1所述的引物组扩增模板；

所述的模板选自：

待测样品的核酸，或者

经过清除或者抑制新型冠状病毒核酸的药剂处理的核酸。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用还包括根据扩增结果判断待测样品中是否含有新型冠状病毒核酸。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的扩增的条件为在60～65℃条件下反应30～60 min。