CN111534641A - 一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液。本发明还提供了一种突变的Cpf1蛋白以及包含其的核酸检测试剂盒。本发明还提供了一种检测冠状病毒核酸的crRNA及包含其的核酸检测试剂盒。本发明进一步提供了所述核酸检测试剂盒的应用及核酸的检测方法。利用本发明的核酸检测试剂盒、突变的Cpf1蛋白或crRNA检测核酸(例如检测SARS相关冠状病毒或MERS冠状病毒的核酸)时，可显著提高检测时的信号强度从而减少检测时间、提高检测效率，且灵敏度高、特异性高、准确性高、检测可视化、成本低、无需复杂大型实验设备、操作简便。

Description

一种核酸检测试剂盒、检测方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种包括Cpf1检测体系的核酸检测试剂盒、检 测方法。本发明还涉及所述核酸检测试剂盒的应用，特别是在严重急性呼吸综合征相关冠状病毒和中东呼吸综合征冠状病毒的核酸的快速检测中的应用。
背景技术
冠状病毒属于套式病毒目Nidovirales，冠状病毒科Coronaviridae，冠状病毒属Coronavirus[6]。成熟的冠状病毒表面有囊膜，囊膜表面覆有纤突，纤突末端呈球形，故 整个纤突呈花瓣状或梨状，纤突之间有较宽的间隙。电镜下，囊膜纤突规则地排列成王 冠状，病毒颗粒因此而得名。目前尚无针对高度传染性的冠状病毒的有效疫苗和治疗药 物，及时诊断和隔离是控制该病暴发流行的有效方法。
快速、高效的核酸快速检测是临床上病毒性疾病防控的有效方法，针对病毒性疾病 现有的检测方法多以核酸检测为主，WHO发布的严重急性呼吸系统综合症(SevereAcute Respiratory Syndrome，缩写为SARS)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle Eastrespiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)的实验室确诊程序指导文件中推荐使用实时反转录聚 合酶链式反应(real time reverse transcription PCR，rRT-PCR)方法对病毒进行检测确诊。 rRT-PCR检测病毒核酸主要受制于：昂贵的PCR实验设备、能进行熟练稳定操作的工作 人员人数、检测时间较长等。免疫学检测方法也是病毒检测的重要手段，如双抗体夹心 ELISA、胶体金免疫层析试纸等方法。免疫学检查容易受到病程的影响，早期病人体内抗 体较少，需要等待一定的时间才可以产生相应的抗体，容易出现漏诊；患病后的康复病 人体内可能携带该类抗体，容易导致免疫诊断出现假阳性。为了有效的控制病毒性传染 疾病的传播，需要建立一种简便、快速、特异的新型检测方法。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是 细菌中的一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸[1,2]。 其中，CRISPR-Cpf1(Cpf1)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单 个RuvC催化结构域。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基 序(PAM)[3]，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟[4]，并特异性识别和 切割互补配对的双链DNA(dsDNA)[3]。当CRISPR/Cpf1蛋白以序列特异性方式识别切割 靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性[5]。Cpf1是 具有核酸内切酶活性，核酸内切酶的配体离子通常为镁离子。现有以Cpf1为基础的核酸 检测，信号强度仍旧不高，从而导致在实际检测中的检测时间过长，低浓度样品检测效 率低等缺陷。因此还需要进一步增强检测信号的强度以满足实际检测的需要。此外，在 检测核酸时的灵敏度、特异性和稳定性也迫切需要提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中检测核酸时成本过高、检测试剂 较长、检测效率低、特异性和灵敏性不够高等缺陷，提供了一种核酸检测试剂盒、一种突变的Cpf1蛋白、一种crRNA、检测方法及应用。利用本发明所述的核酸检测试剂盒、突 变的Cpf1蛋白或crRNA检测核酸(例如检测SARS相关冠状病毒或MERS冠状病毒的 核酸)时，可以显著提高检测时的信号强度从而减少检测时间、提高检测效率，且灵敏度 高、特异性高、准确性高、检测可视化、成本低、无需复杂大型实验设备、操作简便。
Cpf1是具有核酸内切酶活性，而在本领域中核酸内切酶的配体离子通常为镁离子。 而本发明人首次发现锰离子能够促进Cpf1对核酸探针(例如单链DNA探针)的切割能力，进而提高Cpf1检测的信号强度，从而可用于增强Cpf1介导的体外检测的信号以减 少检测时间、提高检测效率。此外，本发明还通过大量实验，意外发现当将某些Cpf1蛋 白进行特定突变后，也能够显著提高检测核酸时的信号强度。本发明人还首次采用Cpf1 荧光法检测SARS相关冠状病毒和MERS冠状病毒，经过大量实验摸索设计出能够用于 检测这些病毒的crRNA，将其用于检测病毒时灵敏度和特异性非常高，且准确性也很高。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1 检测体系，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液。
较佳地，所述含锰离子的溶液为硫酸锰、氯化锰或醋酸锰溶液。
较佳地，所述核酸探针为单链DNA探针，所述单链DNA探针优选包括荧光标记， 更优选在其5’端和3’端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步更优选为在其5’端 具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团。
其中，所述荧光基团可以为本领域常规，例如为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX。 所述荧光淬灭基团可以为本领域常规，例如为BHQ1、BHQ2或BHQ3。所述单链DNA 探针的序列按照本领域常规方法进行制备，例如可以为TTTATTT。
较佳地，所述Cpf1蛋白选自AsCpf1(Acidaminococcus sp.BV3L6)、BbCpf1(Beauveria bassiana KA00251)、BoCpf1(Bacteroidetes oral)、FnCpf1(Francisellanovicida U112)、 HkCpf1(Helcococcus kunzii)、Lb4Cpf1(Lachnospiraceae bacteriumMC2017)、Lb5Cpf1 (Lachnospiraceae bacterium NC2008)、LbCpf1(Lachnospiraceaebacterium ND2006)、 Oscpf1(Oribacterium sp.)和TsCpf1(Thiomicrospira sp.XS5)中的一种或多种。
较佳地，所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，其核苷酸序列优选如SEQID NO.14-23中的一个或多个所示。
较佳地，所述Cpf1蛋白为突变的Cpf1蛋白，所述突变的Cpf1蛋白优选其氨基酸序列与天然Cpf1蛋白具有98％优选99％以上的序列同源性。更佳地，所述突变的Cpf1蛋 白的序列包括将如SEQ ID NO.55所示的K180、E184、N607和K613中的一个或多个位 点突变为R后的序列，或将如SEQ ID NO.54所示的T148、T152、G532和K538中的一 个或多个位点突变为R后的序列。例如可以是将如SEQ ID NO.55所示的E184和N607 突变为R后的序列，可以是将如SEQ ID NO.55所示的E184、N607和K613突变为R后 的序列，可以是将如SEQ ID NO.55所示的K180、E184、N607和K613突变为R后的 序列，可以是将如SEQ ID NO.54所示的T152和G532突变为R后的序列，可以是将如 SEQ ID NO.54所示的T152、G532和K538突变为R后的序列，可以是将如SEQ ID NO. 54所示的T148、T152、G532和K538突变为R后的序列。进一步更佳地，所述突变的 Cpf1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.30-41所示。
较佳地，所述向导RNA为引导Cpf1蛋白特异性结合所述核酸的RNA，优选为crRNA；所述crRNA优选为检测病毒核酸的crRNA；更优选为检测SARS相关冠状病毒或MERS- CoV病毒的crRNA；所述SARS相关冠状病毒优选为冠状病毒SARS-CoV(严重急性呼 吸综合征冠状病毒)或SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2型)。更佳地，所 述crRNA为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒orf1a基 因的crRNA、检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒E基因 的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒M基因的 crRNA和/或检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA，所述orf1ab基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.11所示，所述orf1a基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，所述upE基 因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所 示，所述SARS-CoV-2-S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示；所述SARS-CoV-2- M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；所述SARS-CoV-2-N基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.81所示。进一步更佳地，所述crRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1-10、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.56-72中的一个或多 个所示。
较佳地，所述含锰离子的溶液中锰离子的浓度为5-600mM，例如6、7、8、9、10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500mM 等。所列点值仅为示例，并不是限制于此。并且应当理解的是，在这浓度范围内的任意点 值均可以自由组合，从而任意组合所行成的浓度范围均应该在本发明保护的范围内。例 如5-50、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、100-200、100-300、200-300等等这些均应 该在本发明的保护范围内。在实验中发明人发现锰离子的工作浓度在0.5-60mM都有效 果，试剂盒中一般是混合的10倍的储液，故储液浓度可以是5-600mM。在本发明某一较 佳实施例中，所用的含锰离子的溶液中锰离子的浓度为100mM。
较佳地，所述核酸探针的浓度为1-100pmol/μL；优选25pmol/μL。
较佳地，所述Cpf1蛋白的浓度为20-1000ng/μL；优选200ng/μL。
较佳地，所述向导RNA的浓度为0.1-50μM；优选1μM。
较佳地，所述核酸检测试剂盒还包括RNA酶抑制剂和缓冲液；所述RNA酶抑制剂 的浓度优选为10-200U/μL，优选40U/μL。
较佳地，所述缓冲液优选包括NaCl、Tris和BSA，所述缓冲液的pH优选7.9。在本 发明某一较佳实施例中，所用缓冲液为10×缓冲液，其组成为：1000mM NaCl，500mM Tris，1000ug/ml BSA，pH 7.9。
为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种突变的Cpf1蛋白，其序列包括 将SEQ ID NO.55所示的K180、E184、N607和K613中的一个或多个位点突变为R后 的序列；或者，其序列包括将SEQ ID NO.54所示的T148、T152、G532和K538中的一 个或多个位点突变为R后的序列。
较佳地，所述突变的Cpf1蛋白的序列包括将如SEQ ID NO.55所示的E184和N607突变为R后的序列。
较佳地，所述突变的Cpf1蛋白的序列包括将如SEQ ID NO.55所示的E184、N607 和K613突变为R后的序列。
较佳地，所述突变的Cpf1蛋白的序列包括将如SEQ ID NO.55所示的K180、E184、N607和K613突变为R后的序列。
较佳地，所述突变的Cpf1蛋白的序列包括将如SEQ ID NO.54所示的T152和G532突变为R后的序列。
较佳地，所述突变的Cpf1蛋白的序列包括将如SEQ ID NO.54所示的T152、G532 和K538突变为R后的序列。
较佳地，所述突变的Cpf1蛋白的序列包括将如SEQ ID NO.54所示的或T148、T152、G532和K538突变为R后的序列。
更佳地，所述突变的Cpf1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.30-41所示。
为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1 检测体系，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、核酸探针和如本发明第二方面所述的突变的Cpf1蛋白。
较佳地，所述向导RNA为引导Cpf1蛋白特异性结合所述核酸的RNA，优选为crRNA；所述crRNA优选为检测病毒核酸的crRNA；更优选为检测SARS相关冠状病毒或MERS- CoV病毒的crRNA；所述SARS相关冠状病毒优选为冠状病毒SARS-CoV或SARS-CoV- 2；所述crRNA优选为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA、检测MERS-CoV病 毒orf1a基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病 毒E基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒M 基因的crRNA和/或检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA，所述orf1ab基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO.11所示，所述orf1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述 upE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 46所示，所述SARS-CoV-2-S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示；所述SARS- CoV-2-M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；所述SARS-CoV-2-N基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO.81所示。更佳地，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-10、 SEQID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.56-72中的一个或多个所 示。
较佳地，所述核酸探针为单链DNA探针，所述单链DNA探针优选包括荧光标记， 更优选为在其两端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步更优选为在5’端具有荧光 基团和3’端具有荧光淬灭基团。所述荧光基团可为本领域常规，例如为6-FAM、TET、 CY3、CY5或ROX。所述荧光淬灭基团可为本领域常规，例如为BHQ1、BHQ2或BHQ3。 所述单链DNA探针可按本领域常规方法进行制备，其序列例如可以为TTTATTT。
较佳地，所述向导RNA的浓度为0.1-50μM；优选1μM。
较佳地，所述突变的Cpf1蛋白的浓度为20-1000ng/μL；优选200ng/μL。
较佳地，所述核酸探针的浓度为1-100pmol/μL；优选25pmol/μL。
较佳地，所述核酸检测试剂盒还包括含金属离子的溶液，例如含镁离子的溶液、含锰离子的溶液等；所述溶液中金属离子的浓度优选为5-600mM，例如6、7、8、9、10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500mM 等。所列点值仅为示例，并不是限制于此。并且应当理解的是，在这浓度范围内的任意点 值均可以自由组合，从而任意组合所行成的浓度范围均应该在本发明保护的范围内。例 如5-50、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、100-200、100-300、200-300等等这些均应 该在本发明的保护范围内。在实验中发明人发现金属离子的工作浓度在0.5-60mM都有 效果，试剂盒中一般是混合的10倍的储液，故储液浓度可以是5-600mM。在本发明某一 较佳实施例中，所用的含金属离子的溶液中金属离子的浓度为100mM。
较佳地，所述核酸检测试剂盒还包括RNA酶抑制剂和缓冲液；所述RNA酶抑制剂 的浓度优选为10-200U/μL，优选40U/μL。
较佳地，所述缓冲液优选包括NaCl、Tris和BSA，所述缓冲液的pH优选7.9。在本 发明某一较佳实施例中，所用缓冲液为10×缓冲液，其组成为：1000mM NaCl，500mM Tris，1000ug/ml BSA，pH 7.9。
为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种检测冠状病毒核酸的crRNA，所述crRNA为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒orf1a 基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒E基 因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒M基因 的crRNA和/或检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA，所述orf1ab基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO.11所示，所述orf1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述upE 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.46 所示，所述SARS-CoV-2-S基因的核苷酸序列如SEQID NO.79所示；所述SARS-CoV- 2-M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；所述SARS-CoV-2-N基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO.81所示。
较佳地，所述crRNA为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA的核苷酸序列如 SEQID NO.1-3中的一个或多个所示。
较佳地，所述检测MERS-CoV病毒orf1a基因的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-7中的一个或多个所示。
较佳地，所述检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8-10中的一个或多个所示。
较佳地，所述检测SARS-CoV-2病毒E基因的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.53中的一个或多个所示。
较佳地，所述检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 56-63中的一个或多个所示。
较佳地，所述检测SARS-CoV-2病毒M基因的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 64-68中的一个或多个所示。
较佳地，所述检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 69-72中的一个或多个所示。
在本发明某一较佳实施例中，所述crRNA的制备方法包括：针对SARS病毒核酸orf1ab基因，其序列为SEQ ID NO.11，寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序 列，设计44bp长度的crRNA。针对MERS病毒核酸upE基因，其序列为SEQ ID NO.12， 寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计44bp长度的crRNA。针对 MERS病毒核酸Orf1基因，其序列为SEQ ID NO.13，寻找包含cpf1识别序列(PAM) TTTN的靶向序列，设计44bp长度的crRNA。针对SARS-CoV-2病毒E基因，其序列 为SEQ ID NO.46，寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计44bp长度 的crRNA。针对SARS-CoV-2病毒S基因，其序列为SEQ IDNO.79，寻找包含cpf1识 别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计44bp长度的crRNA。针对SARS-CoV-2病毒 M基因，其序列为SEQ ID NO.80，寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计44bp长度的crRNA。针对SARS-CoV-2病毒N基因，其序列为SEQ ID NO.81，寻 找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计44bp长度的crRNA。设计完成 后，制备crRNA。crRNA的制备，可构建到载体pUC57-T7-crRNA，通过体外转录获得 目的crRNA；或可公司合成RNA序列。
为了解决上述技术问题，本发明第五方面提供了一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1 检测体系，所述Cpf1检测体系包括：如本发明第四方面所述的crRNA、Cpf1蛋白和核酸探针。
较佳地，所述Cpf1蛋白选自AsCpf1(Acidaminococcus sp.BV3L6)、BbCpf1(Beauveria bassiana KA00251)、BoCpf1(Bacteroidetes oral)、FnCpf1(Francisellanovicida U112)、 HkCpf1(Helcococcus kunzii)、Lb4Cpf1(Lachnospiraceae bacteriumMC2017)、Lb5Cpf1 (Lachnospiraceae bacterium NC2008)、LbCpf1(Lachnospiraceaebacterium ND2006)、 Oscpf1(Oribacterium sp.)和TsCpf1(Thiomicrospira sp.XS5)、或与其氨基酸序列具有 98％优选99％以上序列同源性的一种或多种。
较佳地，所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，其核苷酸序列优选如SEQID NO.14-23中的一个或多个所示。
较佳地，所述Cpf1蛋白为突变的Cpf1蛋白，所述突变的Cpf1蛋白优选其氨基酸序列与天然Cpf1蛋白具有98％优选99％以上的序列同源性。更佳地，所述突变的Cpf1蛋 白的序列包括将如SEQ ID NO.55所示的K180、E184、N607和K613中的一个或多个位 点突变为R后的序列，或将如SEQ ID NO.54所示的T148、T152、G532和K538中的一 个或多个位点突变为R后的序列。例如可以是将如SEQ ID NO.55所示的E184和N607 突变为R后的序列，可以是将如SEQ ID NO.55所示的E184、N607和K613突变为R后 的序列，可以是将如SEQ ID NO.55所示的K180、E184、N607和K613突变为R后的 序列，可以是将如SEQ ID NO.54所示的T152和G532突变为R后的序列，可以是将如 SEQ ID NO.54所示的T152、G532和K538突变为R后的序列，可以是将如SEQ ID NO. 54所示的T148、T152、G532和K538突变为R后的序列。进一步更佳地，所述突变的 Cpf1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.30-41所示。
较佳地，所述核酸探针为单链DNA探针，所述单链DNA探针优选包括荧光标记， 更优选为在其两端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步更优选为在5’端具有荧光 基团和3’端具有荧光淬灭基团。所述荧光基团可以为本领域常规，例如为6-FAM、TET、 CY3、CY5或ROX。所述荧光淬灭基团可以为本领域常规，例如为BHQ1、BHQ2或BHQ3。 所述单链DNA探针可按本领域常规方法制备，其序列例如可以为TTTATTT。
较佳地，所述crRNA的浓度为0.1-50μM；优选1μM。
较佳地，所述Cpf1蛋白的浓度为20-1000ng/μL；优选200ng/μL。
较佳地，所述核酸探针的浓度为1-100pmol/μL；优选25pmol/μL。
较佳地，所述核酸检测试剂盒还包括含金属离子的溶液，例如含镁离子的溶液、含锰离子的溶液等；所述溶液中金属离子的浓度优选为5-600mM，例如6、7、8、9、10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500mM 等。所列点值仅为示例，并不是限制于此。并且应当理解的是，在这浓度范围内的任意点 值均可以自由组合，从而任意组合所行成的浓度范围均应该在本发明保护的范围内。例 如5-50、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、100-200、100-300、200-300等等这些均应 该在本发明的保护范围内。在实验中发明人发现金属离子的工作浓度在0.5-60mM都有 效果，试剂盒中一般是混合的10倍的储液，故储液浓度可以是5-600mM。 在本发明某一较佳实施例中，所用的含金属离子的溶液中金属离子的浓度为100mM。
较佳地，所述核酸检测试剂盒还包括RNA酶抑制剂和缓冲液；所述RNA酶抑制剂 的浓度优选为10-200U/μL，优选40U/μL。
较佳地，所述缓冲液优选包括NaCl、Tris和BSA，所述缓冲液的pH优选7.9。在本 发明某一较佳实施例中，所用缓冲液为10×缓冲液，其组成为：1000mM NaCl，500mM Tris，1000ug/ml BSA，pH 7.9。
为了解决上述技术问题，本发明第六方面提供了一种核酸的检测方法，利用如本发 明第一、三、五方面所述的核酸检测试剂盒中所述的Cpf1检测体系检测所述核酸。
较佳地，利用核酸快速释放试剂释放待测样品中的核酸。
较佳地，所述核酸通过扩增得到，优选利用RT-RPA扩增待测样品中的核酸。其中，所述扩增时的温度优选为25±5min，和/或，所述扩增的时间优选为39±5℃，和/或， 所述扩增时的引物优选如SEQ ID NO.24-29、SEQ ID NO.44-45、SEQ ID NO.73-78所示。
较佳地，所述Cpf1检测体系的反应温度为37±5℃。
较佳地，所述Cpf1检测体系的反应时间25±5min。
较佳地，所述方法还包括读取结果的步骤，优选利用酶标仪或荧光灯下肉眼进行读 取。
在本发明某一较佳实施例中，所述检测方法包括以下步骤：
步骤a：利用核酸快速释放试剂对样品病毒灭活和释放待测样品中核酸；
步骤b：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用SARS病毒核酸orf1ab基因片段的特异性引物SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25，或者MERS病毒 核酸upE基因片段的特异性引物SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27，或者MERS病毒核酸 upE基因片段的特异性引物，SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29，或者SARS-CoV-2病毒E 基因片段的特异性引物，SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45加入RT-RPA等温扩增体系， 或者SARS-CoV-2病毒S基因片段的特异性引物，SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74加入 RT-RPA等温扩增体系，或者SARS-CoV-2病毒M基因片段的特异性引物，SEQ ID NO.75 和SEQ ID NO.76加入RT-RPA等温扩增体系，或者SARS-CoV-2病毒N基因片段的特 异性引物，SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78加入RT-RPA等温扩增体系，在37℃反应 30min扩增获得特异性产物；
步骤c：利用Cpf1检测体系识别切割SARS病毒核酸orf1ab或者MERS病毒核酸 upE基因片段或者MERS病毒核酸Orf1基因片段或者SARS-CoV-2病毒E基因片段或 者SARS-CoV-2病毒S基因片段或者SARS-CoV-2病毒M基因片段或者SARS-CoV-2病 毒N基因片段时：将步骤b中产物加入Cpf1检测体系，于37℃反应25min；
步骤d：利用荧光酶标仪或荧光灯肉眼直接检测判读待检测样品中是否存在病毒核 酸。
为了解决上述技术问题，本发明第七方面提供了如本发明第一、三、五方面所述的核酸检测试剂盒、如本发明第二方面所述的突变的Cpf1蛋白或如本发明第四方面所述的crRNA在检测核酸优选病毒核酸，或制备检测核酸优选病毒核酸的试剂中的应用。
较佳地，所述病毒为SARS相关冠状病毒或MERS-CoV病毒；所述SARS相关冠状 病毒优选为SARS-CoV或SARS-CoV-2。
本发明提供的用于SARS和MERS病毒核酸快速检测的核酸检测试剂盒既可利用酶标仪荧光检测也可以利用荧光肉眼检测。本发明中核酸探针(例如ssDNA FQ reporter)，当使用酶标仪荧光检测时，设定检测激发光为485nm-520nm；当使用肉眼直接检测时， 选用可产生485nm波长光源的发光器进行检测。
本发明中，通常可以对临床样品进行病毒灭活处理，释放待检样品中核酸。在等温条件下，对病毒RNA进行反转录(RT)获得DNA，并进行重组酶聚合酶扩增(RPA) [9]。在使用荧光检测时，当Cpf1检测体系中存在病毒核酸，会由在特异性crRNA介导 下特异性激活Cpf1蛋白的核酸内切酶活性。激活后的Cpf1蛋白会切割由荧光基团和淬 灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光 读数或肉眼可见绿色反应。相对应的，待检测样品中不存在病毒核酸时，不会有荧光读 数或肉眼不可见绿色反应。
本发明中，所述的核酸探针一般也可称为荧光-淬灭单链DNA(ssDNA)报告系统，其一般含有荧光基团和淬灭基团，在完整状态荧光被淬灭基团淬灭，在反应过程中被切 割之后，从而发出荧光。在本发明某一较佳实施例中，所述核酸探针为5’端-6- FAM/TTTATTT/BHQ1-3’端。
在本发明某一较佳实施例中，所述Cpf1蛋白的制备方法可以包括：针对多种不同来 源的cpf1蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列SEQ ID NO.14-23，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测受试者中是否含有某种病毒(例 如被某种病毒感染)的方法，其包括使用如本发明第一、三、五方面所述的核酸检测试剂 盒、如本发明第二方面所述的突变的Cpf1蛋白或如本发明第四方面所述的crRNA进行检测。检测的目的是判断受试者中是否含有该病毒的核酸。
术语解释
术语crRNA是指CRISPR RNA，是短的引导Cas12a(Cpf1)到结合到靶标DNA序 列的RNA。
术语CRISPR是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，该序列是许多原核生物的免疫系统。
术语Cas蛋白是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。
术语Cpf1(又称Cas12a)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V 型(type V)的酶。
术语PAM是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是Cas12a切割所必 须，FnCas12a的PAM为TTN序列，LbCas12a的PAM为TTTN序列。
术语RT-RPA(reverse transcription-recombinase polymeraseamplification)为本领域常 规含义，通常是指反转录等温扩增，又称逆转录重组酶聚合酶扩增。
本发明中，所提供的核苷酸序列，一般默认是包含了终止子，这对于本领域技术人员来说都是可被理解的。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
利用本发明所述的核酸检测试剂盒、突变的Cpf1蛋白或crRNA检测核酸(例如检测SARS相关冠状病毒或MERS冠状病毒的核酸)时，可以显著提高检测时的信号强度 从而减少检测时间、提高检测效率，且灵敏度高、特异性高、准确性高、检测可视化(可 在荧光灯下肉眼直接可视检测)、成本低、无需复杂大型实验设备、操作简便。这些优势 使得本发明的试剂盒和检测方法更加适用于基层实验和临床一线对病毒例如SARS相关 冠状病毒和MERS冠状病毒的基层快速检测和鉴定诊断。在本发明某一较佳实施例中， 检测病毒时的信号强度较现有技术提高了高达3-5倍不等。在本发明某一较佳实施例中， 检测病毒的DNA样品时的检测灵敏度为1E8个拷贝病毒，检测病毒的RNA样品时的检 测灵敏度为5个拷贝病毒。
附图说明
图1为增强型Cpf1快速检测病毒核酸方法示意图。
图2为不同金属离子对于不同Cpf1信号的影响。
图3为锰离子对于不同Cpf1蛋白荧光检测效果的影响。
图4为不同锰盐对于不同Cpf1蛋白荧光检测效果的影响。
图5为不同crRNA检测SARS和MERS病毒不同基因荧光检测效果。
图6为增强型Cpf1荧光检测SARS和MERS病毒DNA灵敏度。
图7为增强型Cpf1荧光检测SARS和MERS病毒DNA灵敏度。
图8为荧光检测Cpf1快速检测SARS和MERS病毒DNA特异性。
图9为荧光检测Cpf1快速检测SARS和MERS病毒RNA特异性。
图10为模拟检测临床核酸样品荧光检测结果。
图11为锰离子对于不同Cpf1突变蛋白荧光检测效果的影响。
图12为不同crRNA检测SARS-CoV-2病毒基因的荧光检测效果。
图13为模拟检测临床核酸样品荧光检测结果。
图14为针对SARS-CoV-2的S基因、M基因和N基因的检测结果。
图15为cpf1的不同突变体通过酶标仪检测SARS-CoV2的E基因的结果图。
图16为cpf1的不同突变体通过酶标仪检测SARS-CoV2的S基因的结果图。
图17为cpf1的不同突变体通过酶标仪检测SARS-CoV2的M基因的结果图。
图18为cpf1的不同突变体通过酶标仪检测SARS-CoV2的N基因的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技 术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明 书选择。
本发明中，RPA扩增试剂盒
Figure BDA0002498776830000132
Basic kit购自TwistAmp公司；crRNA体外转录盒子MEGAshortscript T7 Transcription Kit和纯化盒子MEGAclear Kit购自Ambion公司；常规试剂如Tris-Base,BSA,NaCl,Tris-HCl，EDTA,EGTA,CaCl2,CoCl2,CuSO4, MgCl2,NiSO4,FeSO4,MgSO4,MnCl2,MnSO4,ZnSO4,BSA和甘油等购自Thermo Fisher； 检测用核酸片段、ssDNA探针和RNA合成由南京金斯瑞公司完成；本发明使用购自诺 唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。
本发明的总体技术示意图如图1所示，包括以下3大部分：待检测核酸样品制备、Cpf1检测成分设计制备和体系构建和荧光检测。
实施例1：灵敏度增强型Cpf1检测方法
1.不同金属离子对于Cpf1检测的荧光强度的影响
本实施例中的不同物种的Cpf1基因经过密码子优化后，序列分别如SEQ IDNO.14- 23(密码子优化后的核苷酸序列分别对应AsCpf1、BbCpf1、BoCpf1、FnCpf1(氨基酸序 列如SEQ ID NO.55所示)、HkCpf1、Lb4Cpf1、Lb5Cpf1、LbCpf1(氨基酸序列如SEQ IDNO.54所示)、OsCpf1、TsCpf1)所示，将其克隆到pet28a质粒中(由南京金斯瑞公司完 成该步骤)，在大肠杆菌中表达，经过纯化后用于检测实验。
增强型Cpf1检测采用20μL体系如表1所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整，金属离子包括CaCl2、CoCl2、CuSO4、NiSO4、FeSO4、MgSO4、MnSO4、ZnSO4。
表1病毒cpf1检测体系
Figure BDA0002498776830000131
其中，10×缓冲液的组成为：1000mM NaCl，500mM Tris，1000ug/ml BSA，pH 7.9。ssDNA FQ reporter为6FAM/TTTATTT/3BHQ1。
依次检测不同的金属离子针对MERS病毒核酸的crRNA3(具体信息如下表2-1中 的SEQ ID NO.6所示)检测效率。在Cpf1检测体系中，各加入1μL 100mM金属离子母 液，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应30min，对上述反应产物进行后续结果 检测判定。
利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的 荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测30min荧光数值为反应 值。其反应检测结果如图2。结果表明，本发明检测体系中，针对AsCpf1、FnCpf1和 LbCpf1，锰离子均能提高信号强度，其荧光强度较其他金属离子显著提高，较镁离子、 铁离子提高3-5倍不等(图2中显示了AsCpf1、BbCpf1、BoCpf1的结果图，其他物种的 Cpf1所得结果类似)。
2.锰离子对于不同种属的Cpf1检测的荧光强度的影响
依次检测锰离子和镁离子对于不同种属的Cpf1的检测的荧光强度的影响。在Cpf1的检测体系中，各加入1μL上述不同种属的Cpf1，包括AsCpf1、BbCpf1、BoCpf1、 FnCpf1、HkCpf1、Lb4Cpf1、Lb5Cpf1、LbCpf1、OsCpf1、TsCpf1，其它各组分维持一致 (同第1部分)，混合均匀，37℃反应30min，对上述反应产物进行后续荧光强度检测 判定，用锰离子的荧光信号除以镁离子的荧光信号，其结果如图3所示。结果表明，本 发明的不同种属的Cpf1检测体系中，锰离子均能提高荧光信号强度，锰离子相对于镁离 子的应该强度增加比例为3.2-8倍不等。
3.锰离子对于不同种属的Cpf1突变蛋白检测的荧光强度的影响
依次检测锰离子和镁离子对于不同种属的Cpf1(LbCpf1和FnCpf1)的突变蛋白检测 的荧光强度的影响。在Cpf1的检测体系中，各加入1μL不同种属的Cpf1突变蛋白，包 括LbCpf1(氨基酸序列如SEQ ID NO.54所示)、LbCpf1-T148R(SEQ ID NO.36)、 LbCpf1-T152R(SEQ ID NO.37)、LbCpf1-G532R(SEQ ID NO.38)、LbCpf1-K536R(SEQ ID NO.42)、LbCpf1-K538R(SEQ ID NO.39)、LbCpf1-T152R/G532R(SEQ ID NO.40)、 LbCpf1-T152R/G532R/K538R(SEQ ID NO.41)、FnCpf1(氨基酸序列如SEQ ID NO.55 所示)、FnCpf1-K180R(SEQ IDNO.30)、FnCpf1-E184R(SEQ ID NO.31)、FnCpf1- N607R(SEQ ID NO.32)、FnCpf1-K611R(SEQ ID NO.43)、FnCpf1-K613R(SEQ ID NO.33)、FnCpf1-E184R/N607R(SEQ ID NO.34)、FnCpf1-E184R/N607R/K613R(SEQ ID NO.35)，其它各组分维持一致(同第1部分)，混合均匀，37℃反应30min，对上 述反应产物进行后续荧光强度检测，检测结果如图11所示。结果表明，本发明的不同种 属的Cpf1突变检测体系中，部分突变能够增强信号强度，但是LbCpf1-K536R和FnCpf1- K611R不能增加信号强度。锰离子能提高具有活性的突变蛋白的荧光信号强度，锰离子 相对于镁离子的应该强度增加比例为3-5倍不等。此外，相对于未突变的Cpf1蛋白而言， Cpf1的突变蛋白也相应提高了荧光信号强度，其中突变体FnCpf1-E184R、FnCpf1-N607R、 FnCpf1-K613R、FnCpf1-E184R/N607R、FnCpf1-E184R/N607R/K613R和LbCpf1-T152R、 LbCpf1-G532R、LbCpf1-K538R、LbCpf1-T152R/G532R、LbCpf1-T152R/G532R/K538R相 对于其未突变的蛋白而言，荧光信号强度提高了1/2-1倍不等。
4.不同形式的锰盐对于信号的增强作用
依次检测MnSO4、MnCl2和Mn(CH3COO)2对于不同种属的Cpf1的检测的荧光强度 的影响。在Cpf1的检测体系中，各加入1μL不同种属的Cpf1，包括AsCpf1、BbCpf1、 BoCpf1、FnCpf1、HkCpf1、Lb4Cpf1、Lb5Cpf1、LbCpf1、OsCpf1、TsCpf1，其它各组分 维持一致(同第1部分)，混合均匀，37℃反应30min，对上述反应产物进行后续荧光 强度检测判定，其结果如图4所示。结果表明，本发明的检测体系中，不同形式的锰盐 均能提高荧光信号强度。
实施例2：SARS和MERS病毒基因片段快速灵敏检测
2.1核酸制备
本实施例中，SARS-CoV病毒orf1ab基因参考NCBI上的AY278487基因，MERS病 毒upE基因片段参考NCBI上的JX869059基因，MERS病毒ORF1a基因片段参考NCBI 上的JX869059基因，SARS-CoV-2病毒E基因片段、S基因片段、M基因片段和N基因 片段参考NCBI上的NC045512基因组，均由南京金斯瑞公司合成，分别命名为SARS- ORF1ab、MERS-upE、MERS-ORF1a、SARS-CoV-2-E、SARS-CoV-2-S、SARS-CoV-2-M、 SARS-CoV-2-N对应序列分别为SEQ ID NO.11-13、SEQ ID No.46、SEQ ID No.79-81。
通过体外转录制备SARS-CoV病毒orf1ab基因，MERS病毒upE基因片段、ORF1a、SARS-CoV-2病毒E基因、SARS-CoV-2病毒S基因、SARS-CoV-2病毒M基因、SARS- CoV-2病毒N基因对应的RNA核酸样品。具体操作如下：使用MEGAshortscript T7转 录试剂盒(ThermoFisher Scientific)，分别以上述SARS-ORF1ab、MERS-upE和ORF1a、 SARS-CoV-2-E、SARS-CoV-2-S、SARS-CoV-2-M、SARS-CoV-2-N作为模板转录对应的 基因RNA样品pcRNA-SARS-orf1ab、pcRNA-MERS-upE和pcRNA-MERS-ORF1a、 pcRNA-SARS-CoV-2-E、pcRNA-SARS-CoV-2-S、pcRNA-SARS-CoV-2-M、pcRNA-SARS- CoV-2-N。转录后的RNA用MEGAclear试剂盒(ThermoFisher Scientific)纯化，并通过 乙醇沉淀法回收。检测转录后所得单链RNA(ssRNA)的质量和浓度，并保存在-80℃直 至使用。
2.2针对特异性crRNA的设计制备
针对特异性crRNA制备按照如下方案进行，针对SARS-ORF1ab、MERS-upE基因、MERS-ORF1a基因、SARS-CoV-2-E基因、SARS-CoV-2-S基因、SARS-CoV-2-M基因、 SARS-CoV-2-N基因，寻找包含cpf1识别序列(PAM，Protospacer Adjacent Motif)TTTN 的靶向序列，设计44bp长度的crRNA。分别命名为针对SARS-ORF1ab基因的SARS- orf1ab-crRNA1到SARS-orf1a-crRNA3、针对MERS-upE基因的MERS-upE-crRNA1到 MERS-upE-crRNA4、针对MERS-ORF1a基因的MERS-ORF1a-crRNA1到MERS-ORF1a- crRNA3、针对SARS-CoV2-E基因的Cov2-E-crRNA1到CoV2-E-crRNA7、针对SARS- CoV2-S基因的Cov2-S-cr3到CoV2-S-cr10、针对SARS-CoV2-M基因的Cov2-M-cr1到 CoV2-M-cr5、针对SARS-CoV2-N基因的Cov2-N-cr1到CoV2-N-cr4。设计完成后，制备 crRNA。crRNA的制备，可交与南京金斯瑞公司合成oligo，构建到载体pUC57-T7-crRNA， 通过体外转录获得目的crRNA，或可交由南京金斯瑞公司直接合成crRNA序列对应的 RNA。
本发明提供的SARS-ORF1ab、MERS-upE基因、MERS-ORF1a基因和SARS-CoV-2- E基因、SARS-CoV-2-S基因、SARS-CoV-2-M基因、SARS-CoV-2-N基因的crRNA包括 SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.47到SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.56到SEQ ID NO.72，具体信息如表2-1和表2-2所示：
表2-1针对SARS和MERS病毒核酸特异性crRNA
Figure BDA0002498776830000161
Figure BDA0002498776830000171
表2-2针对SARS和MERS病毒核酸特异性crRNA
Figure BDA0002498776830000181
Figure BDA0002498776830000191
2.3反转录等温扩增反应
本实施例中，利用反转录等温扩增(RT-RPA)对上述2.1中所制备的单链RNA(ssRNA) 病毒核酸进行预扩增，以便进行cpf1检测反应。按照等温扩增反应要求，设计并合成RT- RPA扩增引物RT-RPA-F(正向引物)和RT-RPA-R(反向引物)(表3)。参考RT-RPA 等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。具体操作如下：等温扩增在50μL反应体系 进行。将xμL RNA样品，(18.5-x)μL ddH2O,2μL表3中各自的RPA-F，2μL RPA-R和 25μL反应缓冲液混匀，加入反应管溶解混匀。最后，加入2.5μL乙酸镁，混匀后在39℃ 下孵育30分钟。RT-RPA产物样品进行下一步检测。
表3针对冠状病毒CoV核酸特异性RT-RPA引物序列
Figure BDA0002498776830000192
Figure BDA0002498776830000201
2.4本实施例中，增强型cpf1检测采用20μL体系如表4所示，但不限于此，包含 对相应成分的比例调整：
表4病毒cpf1检测体系
成分 用量/样品
10×缓冲液 2μL
金属离子溶液 1μL
Rnase Inhibitors(40U/μL) 1μL
CRISPR-cpf1(200ng/μL) 1μL
ssDNA FQ reporter(25pmol/μL) 1μLl
crRNA(1μM) 1μL
样品 XμL
H<sub>2</sub>O(RNA free) Up to 20μL
2.5全波长酶标仪荧光检测
酶标仪荧光检测中，Cpf1对目的基因检测体系依次加入2μL 10×缓冲液、1μLRnase Inhibitors、1μL Cpf1、1μL ssDNA FQ reporter、5μL上述2.3中所得RT-RPA产物样品、 1μL crRNA和9μL H2O。各组分混合均匀后于37℃反应30min。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cpf1为200ng/μL，ssDNA FQ reporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1nM/μL。
首先，依次检测针对SARS-CoV病毒orf1ab基因、MERS病毒upE基因、MERS病 毒ORF1a基因、SARS-CoV-2病毒E基因、SARS-CoV-2病毒S基因、SARS-CoV-2病 毒M基因、SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA检测效率。在Cpf1检测体系中，各加入1μL crRNA，其它各组分维持一致，混合均匀，37℃反应30min，对上述反应产物进行 后续结果检测判定。
利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的 荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测30min荧光数值为反应 值。针对SARS-CoV病毒和MERS病毒的不同crRNA，其反应检测结果如图5。结果表 明，本发明检测体系中，针对不同基因片段的crRNA均能高效特异的检测对应的基因片 段。针对SARS-CoV-2的E基因的检测结果如图12所示，其中，CoV2-E-Cr4和CoV2- E-Cr5无法检出，CoV2-E-Cr3和CoV2-E-Cr6检测效率较低，CoV2-E-Cr1、CoV2-E-Cr2 和CoV2-E-Cr7检测效率较高。后续实验将CoV2-E-Cr1、CoV2-E-Cr2和CoV2-E-Cr7混 合在一起制备SARS-CoV2-Crmix用于后续检测SARS-CoV-2-E基因。针对SARS-CoV-2 的S基因、M基因和N基因的检测结果如图14所示，针对不同基因片段的crRNA均能 高效特异的检测对应的基因片段。其中，CoV2-S-Cr3、CoV2-S-Cr5和CoV2-S-Cr6对SARS- CoV-2-S基因的检测效率较高，后续实验将这三个crRNA混合，制备成CoV2-S-Crmix用 于后续监测SARS-CoV-2-S基因；其中CoV2-M-Cr1、CoV2-M-Cr2和CoV2-M-Cr4对 SARS-CoV-2-M基因的检测效率较高，后续实验将这三个crRNA混合，制备成CoV2-M- Crmix用于后续监测SARS-CoV-2-M基因；其中CoV2-N-Cr1、CoV2-N-Cr2和CoV2-N- Cr6对SARS-CoV-2-N的检测效率较高，后续实验将这三个crRNA混合，制备成CoV2-N-Crmix用于后续监测SARS-CoV-2-N基因。
鉴于本实施例中针对SARS-ORF1ab和MERS-upE基因的crRNA有一致的检测效 果，将针对SARS-ORF1ab基因的SARS-O-crRNA1到SARS-O-crRNA3等比例混合获得 SARS-O-Crmix；将针对MERS-upE基因的MERS-E-crRNA1到MERS-E-crRNA4等比例 混合获得MERS-E-Crmix；将针对MERS-Orf基因的MERS-O-crRNA1到MERS-O-crRNA3 等比例混合获得MERS-O-Crmix。后续检测中，SARS-O-Crmix检测SARS-ORF1ab基因， MERS-E-Crmix检测MERS-upE基因，MERS-O-Crmix检测MERS-Orf基因。
实施例3：基于cpf1荧光法高灵敏度检测病毒核酸
本实施例中，为测定cpf1荧光法对检测灵敏度的影响，进行以下检测。
(1)首先，根据实施例2中2.1所述的SARS-ORF1ab、MERS-upE和MERS-Orf1 基因片段对应的DNA样品，计算检测片段分子量，并进行梯度稀释，获得每微升含有 5E9、1E9、5E8、1E8、5E7、1E7拷贝数(copy/μL)的测试样品。
利用荧光法，对上述稀释样品进行cpf1特异性反应，参照实施例2中检测步骤进行检测和荧光结果判读。操作简述如下：1μL梯度稀释样品，加入到20μL cpf1荧光核酸 检测体系(其中所添加的crRNA即为上述检测SARS-ORF1ab基因的SARS-O-Crmix、 检测MERS-upE基因的MERS-E-Crmix或检测MERS-Orf基因的MERS-O-Crmix)，混 合均匀，37℃反应30min进行荧光结果判读。
本实施例中，应用增强型cpf1荧光法检测SARS和MERS病毒，分别采用酶标仪检 测(结果见图6)，可实现对1E8个拷贝病毒的高灵敏度检出，灵敏度高。
(2)其次，根据实施例2中2.1所述的SARS-ORF1ab、MERS-upE和MERS-Orf1 基因片段对应的RNA样品，计算检测片段分子量，并进行梯度稀释，获得每微升含有 1000、100、10、5拷贝数(copy/μL)的测试样品。
利用荧光法，对上述稀释样品进行cpf1特异性反应，参照实施例2中检测步骤进行检测和荧光结果判读。操作简述如下：1μL梯度稀释样品，加入到50μL RT-RPA等温 扩增反应体系进行扩增。取10μL等温扩增产物，加入到20μL cpf1荧光核酸检测体系 (其中所添加的crRNA即为上述检测SARS-ORF1ab基因的SARS-O-Crmix、检测MERS- upE基因的MERS-E-Crmix或检测MERS-Orf基因的MERS-O-Crmix)，混合均匀，37℃ 反应25min进行荧光结果判读。
本实施例中，应用cpf1荧光法检测SARS和MERS病毒RNA，分别采用酶标仪检 测(结果见图7)，可实现对5个拷贝病毒的高灵敏度检出，灵敏度高。
实施例4：基于cpf1荧光法高特异性检测病毒核酸
本实施例中，为检测cpf1荧光法能否进行高特异反应，能否有效区分SARS-CoV病毒和MERS病毒，进行以下检测。
(1)首先，针对病毒DNA的特异性进行测试。
根据本发明中针对SARS-CoV病毒和MERS病毒核酸检测区段SARS-ORF1ab和 MERS-upE，参照实施例2中的方法，制备MERS病毒对应基因序列DNA样品：SARS- ORF1ab，MERS-upE和MERS-Orf1。
参照实施例2，将上述DNA样品混合，在增强型Cpf1检测体系中，依次加入2μLBuffer、1μLRnase Inhibitors、1μL Cpf1、1μL ssDNA FQ reporter、1μL crRNA(其中所 添加的crRNA即为上述检测SARS-ORF1ab基因的SARS-O-Crmix、检测MERS-upE基 因的MERS-E-Crmix或检测MERS-Orf基因的MERS-O-Crmix)和1μL检测样品。各组 分混合均匀，在37℃反应30min。本检测体系中，Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cpf1 浓度为200ng/μL，ssDNADB reporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1nM/μL。
本实施例中，利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测 量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，取检测30min时荧 光数值为反应值。检测结果如图8a(图8中的T1、T2、T3、T4分别为配制样品，其中， T1：已知是没有SARS或者MERS-upE基因的DNA，T2：已知是含有SARS基因的DNA； T3：已知是含有MERS-upE基因的DNA；T4：已知是含有SARS和MERS-upE基因的 DNA。图8中的MERS-Crmix是指上述MERS-E-Crmix，SARS-Crmix是指上述SARS- O-Crmix)。同时，将上述cpf1检测反应30min后产物，置于在485nm激光灯下，可由 肉眼直接进行结果判读。当crRNA特异性识别靶核酸片段后，反应产物颜色由无色变为 荧光绿；对应的，如果待检测无对应靶核酸，反应产物颜色仍为无色。在cpf1检测反应 30min后，在荧光下进行肉眼判读，并拍照记录。如图8b所示，针对不同基因片段的 crRNA均能高效特异的检测对应的基因片段，特异性高且检测结果准确。
(2)其次，针对病毒RNA的特异性进行测试。
根据本发明中针对SARS-CoV病毒和MERS病毒核酸检测区段SARS-ORF1ab， MERS-upE和MERS-Orf1，参照实施例2中方法，制备MERS病毒对应基因序列RNA 样品：SARS-ORF1ab，MERS-upE和MERS-Orf1。
参照实施例2，通过RT-RPA反应，分别扩增制备SARS-CoV病毒和MERS病毒检 测样品。将RNA样品混合，在增强型Cpf1检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μLRnaseInhibitors、1μL Cpf1、1μL ssDNA FQ reporter、1μL crRNA和10μL检测样品。各组分 混合均匀，在37℃反应30min。本检测体系中，Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cpf1浓 度为200ng/μL，ssDNA DB reporter浓度为25pM/μL，crRNA浓度为1nM/μL。
本实施例中，利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测 量检测反应的荧光，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，取检测30min时荧 光数值为反应值。检测结果如图9a(图9中的T5、T6、T7、T8分别为配制样品，其中， T5：已知是没有SARS或者MERS-upE基因的RNA，T6：已知是含有SARS基因的RNA； T7：已知是含有MERS-upE基因的RNA；T8：已知是含有SARS和MERS-upE基因的 RNA。图9中的MERS-Crmix是指MERS-E-Crmix，SARS-Crmix是指上述SARS-O- Crmix)。同时，将上述cpf1检测反应30min后产物，置于在485nm激光灯下，可由肉 眼直接进行结果判读。当crRNA特异性识别靶核酸片段后，反应产物颜色由无色变为荧 光绿；对应的，如果待检测无对应靶核酸，反应产物颜色仍为无色。在cpf1检测反应30 min后，在荧光下进行肉眼判读，并拍照记录。如图9b所示，针对不同基因片段的crRNA 均能高效特异的检测对应的基因片段，特异性高且检测结果准确。
实施例5：模拟cpf1荧光法快速检测临床病毒核酸
本实施例模拟临床组织样品的核酸进行快速检测，本检测不涉及任何临床SARS和MERS病毒样品，且所有操作合格按照有关法律法规和相关规定进行。
本实施例中，首先，将实施例2中SARS-CoV病毒核酸对应RNA样品(SARS-orf1ab)和MERS病毒核酸对应RNA样品(MERS-orf1ab和MERS-upE)，点涂到咽拭子，模拟 临床样品进行检测。
(1)首先，对病毒灭活和病毒核酸释放。本实施例使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。步骤如下：将咽拭子加入50μL PBS，模拟溶解病毒到液体。 取3μl待检测样品加入20μl核酸裂解液，加入RNA酶抑制剂，常温静置3分钟，加入 20μL中和液，混匀后进行下一步检测。在Cpf1检测中，每个待检测样品取5μL进行 RT-RPA预扩增，步骤与实施例1中相同，获得Cpf1检测样品。
在Cpf1检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μL Rnase Inhibitors、1μL Cpf1、1μLssDNA FQ reporter、10μL RPA sample、1μL crRNA。各组分混合均匀，在37℃反应25 min。
本实施例中，可通过荧灯裸眼观察或者酶标仪直接判定cpf1检测结果。如图10所示，本发明中cpf1荧光法可通过酶标仪检测可有效对模拟临床阴阳性样品判定。同样的，在荧光灯下裸眼可有效对模拟临床阴阳性样品判定(图10，图中的CS1-CS6分别为配制 样品，其中，CS1、CS2和CS6为已知是SARS-CoV病毒阳性的样品，其余均为已知是 SARS阴性和MERS阴性的样品。图中的MERS-Crmix是MERS-E-Crmix，SARS-Crmix 是指上述SARS-O-Crmix)。可见本发明的检测方法快速、可视、成本低、操作简便的同 时，所得结果准确性还很高。
(2)类似的，模拟临床制备CS7到CS12的样品，其中CS8、CS10和CS11已知为 SARS-CoV-2阳性的样品，CS9已知为MERS-CoV阳性的样品，其余均为已知是SARS- CoV-2阴性和MERS-CoV阴性的样品。通过与上述(1)中类似的方法进行检测，然后通 过荧灯裸眼观察或者酶标仪直接判定cpf1检测结果。如图13所示(图中MERS-Crmix是 MERS-E-Crmix)，本发明中cpf1荧光法可通过酶标仪检测可有效对模拟临床阴阳性样品 判定。可见本发明的检测方法准确性很高。
此外，综合上述实施例的结果进一步可知，将反应体系中Cpf1的配体离子替换为锰 离子时，在检测不同的病毒(SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2等)核酸时都能够 显著提高检测的信号强度，可见该锰离子体系具有普适性。
实施例6：模拟cpf1荧光法快速检测临床SARS-CoV-2病毒核酸的不同基因
本实施例模拟临床组织样品的核酸进行快速检测，本检测不涉及任何临床SARS-CoV-2病毒样品，且所有操作合格按照有关法律法规和相关规定进行。
本实施例中，首先，将SARS-CoV-2病毒核酸对应RNA样品(CoV2-E-基因，CoV2- S-基因,CoV2-M-基因,CoV2-N-基因)，点涂到咽拭子，模拟临床样品进行检测。
(1)首先，对病毒灭活和病毒核酸释放。本实施例使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。步骤如下：将咽拭子加入50μL PBS，模拟溶解病毒到液体。 取3μl待检测样品加入20μl核酸裂解液，加入RNA酶抑制剂，常温静置3分钟，加入 20μL中和液，混匀后进行下一步检测。在Cpf1检测中，每个待检测样品取5μL进行 RT-RPA预扩增，步骤与实施例1中相同，获得Cpf1检测样品。
在Cpf1检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μL Rnase Inhibitors、1μL Cpf1或Cpf1 突变蛋白、1μL ssDNA FQ reporter、10μL RPA sample、1μL crRNA、加入1μL Mn2+或者Mg2+，各组分混合均匀，在37℃反应25min。
本实施例中，可通过酶标仪直接判定cpf1及其突变的检测结果。如图15、16、17、18所示，本发明中cpf1的不同突变体可以通过酶标仪检测SARS-CoV2的S基因、M基 因、N基因和E基因。在加入Mg2+和Mn2+离子均可以有效的检测，但是Mn2+的加入信 号更强，锰离子的体系具有普适性。
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<213> Artificial Sequence
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<223> FnCpf1-K611R
<400> 43
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<213> Lachnospiraceae bacterium ND2006
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<213> Francisella novicida U112
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Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
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Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala
435 440 445
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Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala
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Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile
675 680 685
Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln
690 695 700
Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe
705 710 715 720
Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp
725 730 735
Phe Gly Phe Arg Phe Ser Asp Thr Gln Arg Tyr Asn Ser Ile Asp Glu
740 745 750
Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn
755 760 765
Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr
770 775 780
Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg
785 790 795 800
Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn
805 810 815
Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr
820 825 830
Arg Lys Gln Ser Ile Pro Lys Lys Ile Thr His Pro Ala Lys Glu Ala
835 840 845
Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu
850 855 860
Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe
865 870 875 880
His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe
885 890 895
Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His
900 905 910
Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu
915 920 925
Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile
930 935 940
Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile
945 950 955 960
Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn
965 970 975
Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile
980 985 990
Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu
995 1000 1005
Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val
1010 1015 1020
Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu
1025 1030 1035
Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg
1040 1045 1050
Ala Tyr Gln Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly
1055 1060 1065
Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser
1070 1075 1080
Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys
1085 1090 1095
Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp
1100 1105 1110
Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe
1115 1120 1125
Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr
1130 1135 1140
Ile Ala Ser Phe Gly Ser Arg Leu Ile Asn Phe Arg Asn Ser Asp
1145 1150 1155
Lys Asn His Asn Trp Asp Thr Arg Glu Val Tyr Pro Thr Lys Glu
1160 1165 1170
Leu Glu Lys Leu Leu Lys Asp Tyr Ser Ile Glu Tyr Gly His Gly
1175 1180 1185
Glu Cys Ile Lys Ala Ala Ile Cys Gly Glu Ser Asp Lys Lys Phe
1190 1195 1200
Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg
1205 1210 1215
Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val
1220 1225 1230
Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys
1235 1240 1245
Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu
1265 1270 1275
Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu
1280 1285 1290
Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn
1295 1300
<210> 56
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S-cr3
<400> 56
uaauuucuac uaaguguaga uacaagacuc acguuaacaa uauu 44
<210> 57
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S-cr4
<400> 57
uaauuucuac uaaguguaga uacacgagag uaaacguaaa aaga 44
<210> 58
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S-cr5
<400> 58
uaauuucuac uaaguguaga uaacacgaga guaaacguaa aaag 44
<210> 59
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S-cr6
<400> 59
uaauuucuac uaaguguaga uuacguuuac ucucguguua aaaa 44
<210> 60
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S-cr7
<400> 60
uaauuucuac uaaguguaga uuaacacgag aguaaacgua aaaa 44
<210> 61
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S-cr8
<400> 61
uaauuucuac uaaguguaga uacguuuacu cucguguuaa aaau 44
<210> 62
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S-cr9
<400> 62
uaauuucuac uaaguguaga ucguuuacuc ucguguuaaa aauc 44
<210> 63
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S-cr10
<400> 63
uaauuucuac uaaguguaga uacuccuggu gauucuucuu cagg 44
<210> 64
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-M-cr1
<400> 64
uaauuucuac uaaguguaga uuagaagcgg ucuggucaga auag 44
<210> 65
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-M-cr2
<400> 65
uaauuucuac uaaguguaga uggcaggucc uugaugucac agcg 44
<210> 66
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-M-cr3
<400> 66
uaauuucuac uaaguguaga uuuuaggcag guccuugaug ucac 44
<210> 67
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-M-cr4
<400> 67
uaauuucuac uaaguguaga uuaauaagaa agcguucgug augu 44
<210> 68
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-M-cr5
<400> 68
uaauuucuac uaaguguaga uuuauuacaa auugggagcu ucgc 44
<210> 69
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-N-cr1
<400> 69
uaauuucuac uaaguguaga uuugaacugu ugcgacuacg ugau 44
<210> 70
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-N-cr2
<400> 70
uaauuucuac uaaguguaga ucugcugcuu gacagauuga acca 44
<210> 71
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-N-cr3
<400> 71
uaauuucuac uaaguguaga ucucucaagc ugguucaauc uguc 44
<210> 72
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-N-cr4
<400> 72
uaauuucuac uaaguguaga ugccuuguug uuguuggccu uuac 44
<210> 73
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S- RPA-F
<400> 73
ggaaagtgag ttcagagttt attctagtgc ga 32
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-S- RPA-R
<400> 74
cacagtctac agcatctgta atggttccat 30
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-M- RPA-F
<400> 75
ctacttcatt gcttctttca gactgtttgc 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-M- RPA-R
<400> 76
ttatagttgc caatcctgta gcgactgtat 30
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-N- RPA-F
<400> 77
atcgtgctac aacttcctca aggaacaaca 30
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CoV2-N- RPA-R
<400> 78
gcaatttgcg gccaatgttt gtaatcagtt 30
<210> 79
<211> 416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV2-S-基因
<400> 79
ggaaagtgag ttcagagttt attctagtgc gaataattgc acttttgaat atgtctctca 60
gccttttctt atggaccttg aaggaaaaca gggtaatttc aaaaatctta gggaatttgt 120
gtttaagaat attgatggtt attttaaaat atattctaag cacacgccta ttaatttagt 180
gcgtgatctc cctcagggtt tttcggcttt agaaccattg gtagatttgc caataggtat 240
taacatcact aggtttcaaa ctttacttgc tttacataga agttatttga ctcctggtga 300
ttcttcttca ggttggacag ctggtgctgc agcttattat gtgggttatc ttcaacctag 360
gacttttcta ttaaaatata atgaaaatgg aaccattaca gatgctgtag actgtg 416
<210> 80
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV2-M-基因
<400> 80
ctacttcatt gcttctttca gactgtttgc gcgtacgcgt tccatgtggt cattcaatcc 60
agaaactaac attcttctca acgtgccact ccatggcact attctgacca gaccgcttct 120
agaaagtgaa ctcgtaatcg gagctgtgat ccttcgtgga catcttcgta ttgctggaca 180
ccatctagga cgctgtgaca tcaaggacct gcctaaagaa atcactgttg ctacatcacg 240
aacgctttct tattacaaat tgggagcttc gcagcgtgta gcaggtgact caggttttgc 300
tgcatacagt cgctacagga ttggcaacta taa 333
<210> 81
<211> 446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV2-N-基因
<400> 81
atcgtgctac aacttcctca aggaacaaca ttgccaaaag gcttctacgc agaagggagc 60
agaggcggca gtcaagcctc ttctcgttcc tcatcacgta gtcgcaacag ttcaagaaat 120
tcaactccag gcagcagtag gggaacttct cctgctagaa tggctggcaa tggcggtgat 180
gctgctcttg ctttgctgct gcttgacaga ttgaaccagc ttgagagcaa aatgtctggt 240
aaaggccaac aacaacaagg ccaaactgtc actaagaaat ctgctgctga ggcttctaag 300
aagcctcggc aaaaacgtac tgccactaaa gcatacaatg taacacaagc tttcggcaga 360
cgtggtccag aacaaaccca aggaaatttt ggggaccagg aactaatcag acaaggaact 420
gattacaaac attggccgca aattgc 446

Claims (10)

1.一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，其特征在于，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液。
2.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述含锰离子的溶液为硫酸锰、氯化锰或醋酸锰溶液；
和/或，所述核酸探针为单链DNA探针，所述单链DNA探针优选包括荧光标记，更优选在其5’端和3’端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步更优选为在其5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团；所述荧光基团优选为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2或BHQ3，所述单链DNA探针的序列例如为TTTATTT；
和/或，所述Cpf1蛋白选自AsCpf1、BbCpf1、BoCpf1、FnCpf1、HkCpf1、Lb4Cpf1、Lb5Cpf1、LbCpf1、Oscpf1和TsCpf1中的一种或多种；
和/或，所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，其核苷酸序列优选如SEQ IDNO.14-23中的一个或多个所示；
和/或，所述Cpf1蛋白为突变的Cpf1蛋白，所述突变的Cpf1蛋白优选其氨基酸序列与天然Cpf1蛋白具有98％优选99％以上的序列同源性；所述突变的Cpf1蛋白的序列更优选包括将如SEQ ID NO.55所示的K180、E184、N607和K613中的一个或多个位点突变为R后的序列，或将如SEQ ID NO.54所示的T148、T152、G532和K538中的一个或多个位点突变为R后的序列；进一步更优选包括将如SEQ ID NO.55所示的E184和N607，E184、N607和K613，或K180、E184、N607和K613突变为R后的序列，或将如SEQ ID NO.54所示的T152和G532，T152、G532和K538，或T148、T152、G532和K538突变为R后的序列；最优选其核苷酸序列如SEQ ID NO.30-41所示。
3.如权利要求1或2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述向导RNA为引导Cpf1蛋白特异性结合所述核酸的RNA，优选为crRNA；所述crRNA优选为检测病毒核酸的crRNA；更优选为检测SARS相关冠状病毒或MERS-CoV病毒的crRNA；所述SARS相关冠状病毒优选为冠状病毒SARS-CoV或SARS-CoV-2；
较佳地，所述crRNA为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒orf1a基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒E基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒M基因的crRNA和/或检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA，所述orf1ab基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述orf1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述upE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.46所示；所述SARS-CoV-2-S基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.79所示；所述SARS-CoV-2-M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；所述SARS-CoV-2-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示；
更佳地，所述crRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1-10、SEQ ID NO.47、SEQ IDNO.48和SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.56-72中的一个或多个所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述含锰离子的溶液中锰离子的浓度为5-600mM，优选100mM；
和/或，所述核酸探针的浓度为1-100pmol/μL；优选25pmol/μL；
和/或，所述Cpf1蛋白的浓度为20-1000ng/μL；优选200ng/μL；
和/或，所述向导RNA的浓度为0.1-50μM；优选1μM；
和/或，所述核酸检测试剂盒还包括RNA酶抑制剂和缓冲液；所述RNA酶抑制剂的浓度优选为10-200U/μL，优选40U/μL；所述缓冲液优选包括NaCl、Tris和BSA，所述缓冲液的pH优选7.9。
5.一种突变的Cpf1蛋白，其特征在于，其序列包括将SEQ ID NO.55所示的K180、E184、N607和K613中的一个或多个位点突变为R后的序列；或者，其序列包括将SEQ ID NO.54所示的T148、T152、G532和K538中的一个或多个位点突变为R后的序列；
较佳地，所述突变的Cpf1蛋白的序列包括将如SEQ ID NO.55所示的E184和N607，E184、N607和K613，或K180、E184、N607和K613突变为R后的序列，或将如SEQ ID NO.54所示的T152和G532，T152、G532和K538，或T148、T152、G532和K538突变为R后的序列；
更佳地，所述突变的Cpf1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.30-41所示。
6.一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，其特征在于，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、核酸探针和如权利要求5所述的突变的Cpf1蛋白；
较佳地，所述向导RNA为引导Cpf1蛋白特异性结合所述核酸的RNA，优选为crRNA；所述crRNA优选为检测病毒核酸的crRNA；更优选为检测SARS相关冠状病毒或MERS-CoV病毒的crRNA；所述SARS相关冠状病毒优选为冠状病毒SARS-CoV或SARS-CoV-2；所述crRNA优选为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒orf1a基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒E基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒M基因的crRNA和/或检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA，所述orf1ab基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述orf1a基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，所述upE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示，所述SARS-CoV-2-S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示；所述SARS-CoV-2-M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；所述SARS-CoV-2-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示；所述crRNA的核苷酸序列更优选如SEQ ID NO.1-10、SEQ ID NO.47、SEQID NO.48和SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.56-72中的一个或多个所示；
和/或，所述核酸探针为单链DNA探针，所述单链DNA探针优选包括荧光标记，更优选为在其两端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步更优选为在5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团；所述荧光基团优选为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2或BHQ3，所述单链DNA探针的序列例如为TTTATTT；
和/或，所述向导RNA的浓度为0.1-50μM；优选1μM；
和/或，所述突变的Cpf1蛋白的浓度为20-1000ng/μL；优选200ng/μL；
和/或，所述核酸探针的浓度为1-100pmol/μL；优选25pmol/μL；
和/或，所述核酸检测试剂盒还包括含金属离子的溶液；所述溶液中金属离子的浓度优选为5-600mM，优选100mM；
和/或，所述核酸检测试剂盒还包括RNA酶抑制剂和缓冲液；所述RNA酶抑制剂的浓度优选为10-200U/μL，优选40U/μL；所述缓冲液优选包括NaCl、Tris和BSA，所述缓冲液的pH优选7.9。
7.一种检测冠状病毒核酸的crRNA，其特征在于，所述crRNA为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒orf1a基因的crRNA、检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒E基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA、检测SARS-CoV-2病毒M基因的crRNA和/或检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA，所述orf1ab基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述orf1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述upE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示，所述SARS-CoV-2-S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示；所述SARS-CoV-2-M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；所述SARS-CoV-2-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示；
其中，所述crRNA为检测SARS-CoV病毒orf1ab基因的crRNA的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.1-3中的一个或多个所示；所述检测MERS-CoV病毒orf1a基因的crRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4-7中的一个或多个所示；所述检测MERS-CoV病毒upE基因的crRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8-10中的一个或多个所示；所述检测SARS-CoV-2病毒E基因的crRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.53；所述检测SARS-CoV-2病毒S基因的crRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.56-63中的一个或多个所示；所述检测SARS-CoV-2病毒M基因的crRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.64-68中的一个或多个所示；所述检测SARS-CoV-2病毒N基因的crRNA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.69-72中的一个或多个所示。
8.一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，其特征在于，所述Cpf1检测体系包括：如权利要求7所述的crRNA、Cpf1蛋白和核酸探针；
较佳地，所述Cpf1蛋白选自AsCpf1、BbCpf1、BoCpf1、FnCpf1、HkCpf1、Lb4Cpf1、Lb5Cpf1、LbCpf1、Oscpf1和TsCpf1，或与其氨基酸序列具有98％优选99％以上序列同源性的一种或多种；
和/或，所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，其核苷酸序列优选如SEQ IDNO.14-23中的一个或多个所示；
和/或，所述核酸探针为单链DNA探针，所述单链DNA探针优选包括荧光标记，更优选为在其两端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步更优选为在5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团；所述荧光基团优选为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2或BHQ3，所述单链DNA探针的序列例如为TTTATTT；
和/或，所述crRNA的浓度为0.1-50μM；优选1μM；
和/或，所述Cpf1蛋白的浓度为20-1000ng/μL；优选200ng/μL；
和/或，所述核酸探针的浓度为1-100pmol/μL；优选25pmol/μL；
和/或，所述核酸检测试剂盒还包括含金属离子的溶液；所述溶液中金属离子的浓度优选为5-600mM，优选100mM；
和/或，所述核酸检测试剂盒还包括RNA酶抑制剂和缓冲液；所述RNA酶抑制剂的浓度优选为10-200U/μL，优选40U/μL；所述缓冲液优选包括NaCl、Tris和BSA，所述缓冲液的pH优选7.9。
9.一种核酸的检测方法，其特征在于，利用如权利要求1～4、6和8中任一项所述的核酸检测试剂盒中所述的Cpf1检测体系检测所述核酸；
较佳地，利用核酸快速释放试剂释放待测样品中的核酸；
和/或，所述核酸通过扩增得到，优选利用RT-RPA扩增待测样品中的核酸；所述扩增时的温度优选为25±5min，所述扩增的时间优选为39±5℃，所述扩增时的引物优选如SEQ IDNO.24-29、SEQ ID NO.44-45、SEQ ID NO.73-78所示；
和/或，所述Cpf1检测体系的反应温度为37±5℃；
和/或，所述Cpf1检测体系的反应时间25±5min；
和/或，所述方法还包括读取结果的步骤，优选利用酶标仪或荧光灯下肉眼进行读取。
10.如权利要求1～4、6和8中任一项所述的核酸检测试剂盒、如权利要求5所述的突变的Cpf1蛋白或如权利要求7所述的crRNA在检测核酸优选病毒核酸，或制备检测核酸优选病毒核酸的试剂中的应用；
较佳地，所述病毒为SARS相关冠状病毒或MERS-CoV病毒；所述SARS相关冠状病毒优选为SARS-CoV或SARS-CoV-2。
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