CN114085892A - 用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系、试剂或试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系、试剂或试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN114085892A CN202111437007.6A CN202111437007A CN114085892A CN 114085892 A CN114085892 A CN 114085892A CN 202111437007 A CN202111437007 A CN 202111437007A CN 114085892 A CN114085892 A CN 114085892A
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Abstract

本发明涉及用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系、试剂或试剂盒及检测方法，其中用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系，包含向导ssDNA(gDNA)，死亡基因编辑酶Clostridium perfringens Argonaute(dAGO)和呈递脱氧核酸(DNAer)。与现有技术相比，本发明核酸检测方法灵敏度高、特异性好、价格低廉，可广泛应用于分子医学诊断、食品安全检测以及环境监测等诸多领域。

Description

用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系、试剂或试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于原核死亡AGO核酸酶(dAGO)用于病毒的可视化检测方法及其应用。
背景技术
病毒一直对人类构成威胁，病毒的核酸包括双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、双链RNA(dsRNA)、正单链RNA(+ssRNA)、负单链RNA(-ssRNA)五种不同类型。例如TT病毒(TTV)便是1997年日本学者首先从一例因输血引起转氨酶升高患者的血清中发现的ssDNA病毒，全世界约有10％的TTV感染者，所以对于该病毒的检测研究十分必要。DNA是目前诊断TTV感染的主要手段，由于不同基因区碱基序列的保守性具有一定区别，故应用PCR法仍是目前检测TTV的常用手段。几年来国内外这者在TTV研究中做了不少工作并取得一定成绩，但由于尚处于起步阶段，因此丰富相关的检测方法对于TTV病毒的研究很有意义。
AGO蛋白作为可剪切靶位点的核酸酶，且不受限于PAM序列，理论上比Cas9的精确性更高，因此对AGO蛋白进行基因编辑等方面的开发得到关注。
CN201810291873.0公开了一种基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用。具体地，该发明提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含向导ssDNAs，基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)和荧光报告核酸。但是该技术主要依靠向导ssDNAs，基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)和荧光报告核酸体系的检测方法是基于高温Argonaute的核酸检测方法，反应条件较苛刻，需要实验室具备PCR仪，Q-PCR仪等贵重仪器，且缺乏最直观的可视化检测过程。
目前，利用PCR法仍是目前检测TTV的常用手段，反应条件较苛刻，需要实验室具备PCR仪，Q-PCR仪等贵重仪器，且缺乏最直观的可视化检测方法。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种基于对目标DNA的灵敏度高、特异性好、室温下适用、肉眼可视化的用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系、试剂或试剂盒及检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系，该体系包含：
(a)向导ssDNA(gDNA)；
(b)突变剪切活性位点的死亡基因编辑酶Clostridium perfringens(dAGO)；和
(c)呈递脱氧核酸(DNAer)，所述呈递脱氧核酸带有生物素标记；
其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。
在另一优选例中，所述的向导ssDNA为5’-磷酸化的单链DNA分子。
在另一优选例中，所述的向导ssDNA的长度为n个碱基，且n≥14。
在另一优选例中，所述的n≤100，较佳地≤80，更佳地≤60。
在另一优选例中，所述的向导ssDNAs的长度为14-60nt，较佳地16-40nt。
在另一优选例中，所述AGO酶来源于古菌Clostridium perfringens。
在另一优选例中，所述的AGO酶包括野生型和突变型的CpAgo。
在另一优选例中，所述的死亡基因编辑酶(dAGO)是将第608位氨基酸D突变为A(D608A)。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子的不同分型对应的突变位点在向导ssDNA的第10、11位。
在另一优选例中，所述的检测体系还含有(d)缓冲液。
在另一优选例中，所述的检测体系还包括用于显色反应的链霉亲和素-辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)；
在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述的靶标核酸分子与被所述呈递脱氧核酸(DNAer)进行退火操作后，产生Target-DNAer复合物。
在另一优选例中，所述的Target-DNAer复合物与所述的向导ssDNA(gDNA)是互补的。
在另一优选例中，dAGO酶引导所述的Target-DNAer复合物与所述的向导ssDNA(gDNA)互补结合后，通过加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，从而产生可检测的信号(如光密度信号值)。
在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1pM-200μM，较佳地1-1000pM，更佳地1-100pM，最佳地1-20pM。
在另一优选例中，所述死亡AGO核酸酶的工作温度为25-37℃。
在另一优选例中，所述的检测体系中，所述向导ssDNA(gDNA)的浓度为100-1000nM。
在另一优选例中，所述的检测体系中，所述向导ssDNA(gDNA)与所述Target-DNAer复合物的摩尔比为1：1至10：1，较佳地2：1至4：1。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括cDNA。
在另一优选例中，磷酸化修饰基团独立地位于所述向导ssDNA(gDNA)的5’端，生物素标记基团独立地位于所述呈递脱氧核酸(DNAer)的3’端。
在另一优选例中，所述的呈递脱氧核酸(DNAer)的长度为9-100nt，较佳地10-60nt，更佳地15-40nt。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、微生物、病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)本发明第一方面所述的检测体系或用于配制所述检测体系的试剂；和
(ii)使用说明书，所述说明书描述了用所述的检测体系检测靶标核酸分子的方法。
在另一优选例中，所述试剂盒还可以包括缓冲液。
在另一优选例中，所述的试剂盒包括：
(a)第一容器以及位于所述第一容器的向导ssDNA(gDNA)；
(b)第二容器以及位于第二容器的死亡核酸酶Clostridium perfringensArgonaute(dAGO)；和
(c)第三容器以及位于第三容器的呈递脱氧核酸(DNAer)。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：
(d)第四容器以及位于第四容器的用于酶进行结合反应的缓冲液。
在另一优选例中，所述的用于酶进行结合反应的缓冲液含有MnCl2。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
(f)第五容器以及位于第五容器的用于显色反应的链霉亲和素-辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)；和
(g)任选的第六容器以及位于第六容器的用于靶标核酸分子与被所述呈递脱氧核酸(DNAer)进行退火操作的缓冲液。
在本发明的第三方面，提供了一种检测样本中是否存在靶标核酸分子的方法，包括以下步骤：
(a)提供本发明第一方面所述的用于检测靶标核酸分子的检测体系；和
(b)将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成第一反应溶液；
(c)对所述第一反应溶液进行检测，从而获得光密度(OD)信号值；
其中，所述第一反应溶液中检测到450nm处的光密度(OD)信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述第一反应溶液中没有检测到450nm处的光密度(OD)信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子。
在另一优选例中，所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或核酸扩增)的样本。
在另一优选例中，所述方法用于检测靶位点处的核酸是否在SNP、点突变、缺失、和/或插入。
在另一优选例中，在步骤(c)中所述光密度检测采用酶标仪进行检测。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。
在本发明的第四方面，提供了一种死亡基因编辑酶Clostridium perfringensArgonaute(dAGO)的用途，用于制备基于特异性结合检测靶标核酸分子的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述酶Clostridium perfringens Argonaute来源于古菌Clostridium perfringens；或是其具备相同或相似功能的同源类似物。
在另一优选例中，所述的dAGO包括死亡的野生型和突变型CpAgo。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明首次开发了一种针对目标DNA的灵敏度高、操作简便、检测成本低、耗时短的核酸检测方法，本发明方法利用死亡AGO酶的特性，即在由呈递脱氧核酸(DNAer)结合靶标核酸分子，在合适的反应温度(如约25-37℃)下，向导ssDNA(gDNA)介导结合靶标核酸分子，之后利用显色物质完成检测过程。结果表明，本发明方法不仅可以对痕量核酸分子进行快速地可视化地检测，而且可以准确地给出检测结果，从而为病原体检测、基因分型、病程监测等提供帮助。
2、本发明提供了一种针对目标核酸分子的中温下适用、肉眼可视化的核酸检测方法，对于条件落后的地区适用性更广一些。本发明中应用的死亡核酸酶CpAgo是一种中温基因编辑酶，而其他现有方法应用的Argonaute是高温基因编辑酶；另外核酸检测的可视化应用也是首次与核酸酶联合应用。
附图说明
图1显示了本发明死亡基因编码酶dAGO的可视化检测示意图，其中针对靶标核酸分子设计一个向导ssDNA(gDNA)和一个呈递脱氧核酸(DNAer)，其末端修饰的生物素由太阳表示，dAGO酶作用后形成一个特异性地三者复合物。之后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)完成显色过程，其中发光的四角星星代表辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)反应产生的有色产物。
图2显示了本发明死亡基因编辑酶(dAGO)的突变位置图，是将CpAgo第608位氨基酸D突变为A(D608A)。
图3显示了本发明死亡基因编辑酶(dAGO)与基因编辑酶(AGO)的酶剪切活性结果图。
图4显示了本发明使用凝胶迁移实验(EMSA)验证dAGO对于向导ssDNA(gDNA)和向导ssRNA(gRNA)的结合能力结果图。
图5显示了本发明中向导ssDNA(gDNA)，呈递脱氧核酸(DNAer)和靶标核酸分子特异性结合的三者复合物状态。
图6显示了本发明中一个实施例中靶标核酸样本与空白对照的实验结果。
图7A显示了以靶标核酸分子样本为浓度梯度的实验结果；
图7B显示了以靶标核酸分子样本为浓度梯度的标准曲线。
图8A显示了检测临床样本高危型亚型TS14/TS15的实验结果；
图8B显示了检测临床样本高危型亚型TS14/TS15的柱状图。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种针对目标DNA的灵敏度高、操作简便、检测成本低、耗时短的核酸检测方法。本发明方法利用死亡CpAgo酶的特性，即在由呈递脱氧核酸(DNAer)结合靶标核酸分子，在合适的反应温度(如约25-37度)下，向导ssDNA(gDNA)介导结合靶标核酸分子，之后利用显色物质完成检测过程。结果表明，本发明方法不仅可以对痕量核酸分子进行快速地可视化地检测，而且可以准确地给出检测结果，从而为病原体检测、基因分型、病程监测等提供帮助。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明检测体系”、“基于原核死亡AGO核酸酶(dAGO)蛋白的核酸检测体系”可互换使用，指本发明第一方面中所述的检测体系。
如本文所用，术语“本发明检测方法”、“基于原核死亡AGO核酸酶(dAGO)蛋白的核酸检测方法”可互换使用，指本发明第二方面中所述的检测方法。
如本文所用，术语“死亡基因编辑酶Clostridium perfringens”、“死亡核酸酶Clostridium perfringens”、“死亡CpAgo酶”、“dAGO”可互换使用，指本发明第一方面中所述的酶。
如本文所用，术语“三者复合物”指在本发明检测方法中，由呈递脱氧核酸(DNAer)结合靶标核酸分子，在合适的反应温度(如约25-37度)下，向导ssDNA(gDNA)介导结合靶标核酸分子，形成的向导ssDNA(gDNA)-靶标核酸(Target)-呈递脱氧核酸(DNAer)三者复合物。在本发明中，三者复合物的结合都是结合。
dAGO酶
在本发明的检测体系和检测方法中，一个核心成分是死亡基因编辑酶，例如dAGO酶。
在本发明中，优选的AGO酶是CpAgo酶，其来自于古菌Clostridium perfringens，基因长度2235bp，氨基酸序列由745个氨基酸组成。如图2所示，所述的死亡基因编辑酶(dAGO)是将CpAgo酶第608位氨基酸D突变为A(D608A)。
CpAgo酶的结合酶切特性为：该酶可利用5’磷酸化的寡聚核酸作为向导ssDNA指导该酶对目标核酸序列的精确结合；剪切位点位于与向导ssDNA的第10与11位核酸对应的目标核酸(ssDNA)之间的磷酸二酯键。死亡基因编辑酶dAGO酶则是去除该酶的酶切活性，只保留其与向导ssDNA对应的目标核酸相结合的能力。
通常，CpAgo酶的优选工作温度为37±2℃。
向导ssDNA(gDNA)
在本发明的检测体系和检测方法中，一个核心成分是向导ssDNA(gDNA)。
在本发明中，优选的向导ssDNA均为长度为14-24nt(如16nt)的寡聚核酸，其5’第一个核酸均为磷酸化修饰的胸腺嘧啶(T)。
如图5所示，针对一条DNA单链的向导ssDNA结合于靶标核酸分子，其对应的结合位点由基因序列标出，CpAgo酶作用后形成一个复合物。
呈递脱氧核酸(DNAer)
在本发明的检测体系和检测方法中，一个核心成分是携带生物素标记的呈递脱氧核酸(DNAer)。
优选的呈递脱氧核酸(DNAer)是携带生物素标记。例如，在3’端标记生物素基团(Biotin)。图1中示出了一个呈递脱氧核酸(DNAer)，其长度为17nt，3’端标记生物素基团(Biotin)。
在本发明中，呈递脱氧核酸(DNAer)是根据目标核酸的基因序列所决定的；由呈递脱氧核酸(DNAer)对目标核酸序列进行结合，形成二者复合物，称之为Target-DNAer复合物，之后由向导ssDNA(gDNA)对复合物进行结合，形成gDNA-Target-DNAer三者复合物。
检测体系
(a)向导ssDNA(gDNA)；
(b)突变剪切活性位点的死亡基因编辑酶Clostridium perfringens(dAGO)；和
(c)呈递脱氧核酸(DNAer)，所述呈递脱氧核酸带有生物素标记；
其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。
检测方法
在本发明还提供了基于死亡基因编辑酶Clostridium perfringens(dAGO)的核酸检测方法。
为了便于理解，本发明人提供了本发明检测方法的原理。应理解，本发明的保护范围并不受所述原理的限制。
参见图1和图2。在本发明方法中，突变基因编辑酶Clostridium perfringens的剪切活性位点，得到死亡基因编辑酶dAGO。如图3显示了本发明死亡基因编辑酶(dAGO)与基因编辑酶(AGO)的酶剪切活性结果图，从图中可以看出control样本的第一孔道只显示底物Target条带；当使用核酸酶AGO进行剪切反应时，第二孔道能够看到清晰的目标Product条带；而当使用死亡核酸酶dAGO进行剪切反应时，第三孔道不会产生目标Product条带。这说明死亡核酸酶dAGO已经失去核酸酶AGO的剪切能力。
基于呈递脱氧核酸(DNAer)与目标核酸序列相匹配，通过退火操作得到二者复合物。再基于dAGO酶的结合活性，可根据目标核酸序列的不同设计出向导ssDNA(gDNA),向导ssDNA(gDNA)靶向于待检测核酸并介导dAGO酶对目的片段进行结合。之后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)完成显色过程，从而达到对目标核酸的检测。
在本发明中，根据向导ssDNA(gDNA)的设计要求，可通过特殊设计使dAGO酶可以选择性地对存在部分位点存在差异的核酸序列进行选择性结合，从而实现分型检测。图4显示了本发明使用凝胶迁移实验(EMSA)验证dAGO对于向导ssDNA(gDNA)和向导ssRNA(gRNA)的结合能力结果图，从图中可以看出对于向导ssDNA(左边四个孔道)，随着dAGO酶的浓度的增高，下方条带逐渐减少，上方条带逐渐增多；对于向导ssRNA(右边四个孔道)，随着dAGO酶的浓度的增高，也是下方条带逐渐减少，上方条带逐渐增多。这说明dAGO酶对于ssDNA和ssRNA均具有binding结合能力。
在本发明中，当用于区分不同分型，在向导ssDNA(gDNA)设计时，将不同分型对应的突变位点置于向导ssDNA(gDNA)的第10、11两位，由于dAGO酶的选择特异性，连续两点突变时可抑制结合活性，从而达到了对不同分型的检测。
在优选例中，本发明中提供了用于核酸检测的向导ssDNA(gDNA)及呈递脱氧核酸(DNAer)，例如，分别用于检测目标基因TTV、或用于检测TTV病毒的两种分型TS14和TS15。
本发明方法非常适合用于可视化检测痕核酸。通过结合呈递脱氧核酸，具有特定序列的向导ssDNA以及显色体系，本发明可以快速可视化检测低至pM浓度的靶核酸。
在一个优选例中，本发明检测方法包括如下步骤：
步骤1：针对不同的目标待检核酸序列设计向导ssDNA(gDNA)及呈递脱氧核酸(DNAer)；
步骤2：采集待检样本，提取含目标序列的核酸复合物；
步骤3：将获取的待检样本作为模板加入呈递脱氧核酸(DNAer)进行退火反应；
步骤4：在步骤3反应体系中加入特异性的寡核酸向导ssDNA(gDNA)及dAGO酶在37℃持续保温的条件下进行特异性结合；
步骤5：对步骤4的体系进行辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)的显色定量分析；
步骤6：分析OD值后调节基准线，判定结果。
试剂盒
本发明还提供了一种用于本发明检测方法的试剂盒。
典型地，所述的试剂盒包括：
(a)第一容器以及位于所述第一容器的向导ssDNA(gDNA)；
(b)第二容器以及位于第二容器的死亡核酸酶Clostridium perfringensArgonaute(dAGO)；和
(c)第三容器以及位于第三容器的呈递脱氧核酸(DNAer)。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：
(d)第四容器以及位于第四容器的用于酶进行结合反应的缓冲液。
在另一优选例中，所述的用于酶进行结合反应的缓冲液含有MnCl2。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
(f)第五容器以及位于第五容器的用于显色反应的链霉亲和素-辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)；和
(g)任选的第六容器以及位于第六容器的用于靶标核酸分子与被所述呈递脱氧核酸(DNAer)进行退火操作的缓冲液。
应用
本发明特别适合可视化快速检测靶标核酸分子，具有广泛的应用性。
在本发明中，靶标核酸分子可以是ssDNA，也可以是ssRNA。当靶标核酸分子是RNA时，可通过设计对应的呈递核酸(RNAer)进行检测。
在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、微生物、病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。
在另一优选例中，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。
本发明在疾病监控方面，可对疾病做到预测、预防等积极主动管理，做到早期发现早期治疗，或提早预测提早预防。由于本发明的检测灵敏度非常高，适合进行早期诊断，对症下药，节省患者治疗时间，提高治疗成功率。本发明减少高额医疗成本浪费，和争取治疗黄金时机。
在环境监控方面，本发明可便捷、快速的对环境污染物中的核酸分子进行准确鉴定，提供有效的环境检测数据。
本发明的主要优点包括：
1)本发明所述的基于原核死亡AGO核酸酶(dAGO)的核酸检测方法充分发挥了该酶的特异结合特性，使之成为一种特异性高的检测手段；
2)本发明所述的反应体系中可加入待检测的目标核酸，对应的向导ssDNA(gDNA)以及呈递脱氧核酸(DNAer)和用于显色反应的试剂，实现可视化检测；
3)本发明所述的核酸检测方法具有较高的灵敏度，对核酸的检测限为pM级别；
4)本发明所述的核酸检测方法具有很好的特异性，能够区分不同分型的核酸序列；
5)本发明所述的核酸检测方法操作便捷，设计简单，价格低廉，仪器只需要水浴锅便可操作。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
序列信息
实施例中涉及3组目标基因退火及特异性结合寡核酸序列如下表所示。
组号 组分 TTV TS14 TS15
1 目标核酸 SEQ ID No.1； SEQ ID No.4； SEQ ID No.7；
2 向导ssDNA SEQ ID No.2； SEQ ID No.5； SEQ ID No.8；
3 呈递脱氧核酸 SEQ ID No.3； SEQ ID No.6； SEQ ID No.9；
Figure BDA0003382104370000111
实施例1
检测试剂的制备和检测方法
在本实施例中，提供了用于本发明基于死亡核酸酶Clostridium perfringensArgonaute(dAGO)的核酸检测方法的试剂盒及其使用方法。
1.1检测试剂和试剂盒
在本实施例中，以检测TTV基因野生型为例，相应的特异性目标核酸序列5’-TCCTGGGGCGTGTCTACGAGGTCTATATAAGCAACAGCGGTGACGAAT-3’，SEQ ID No.：1。
基于本发明方法，相应的检测试剂包括以下：
(1)、特异性向导ssDNA(gDNA)，具体序列如下：
5’P-ATTCGTCACCGCTGTTGCTTAT-3’(SEQ ID No.2)
(2)、呈递脱氧核酸(DNAer)，具体序列如下：
5’-ATAGACCTCGTAGACACGCCCCAGGA-3’B(SEQ ID No.3)
(3)、显色反应试剂：例如链霉亲和素-辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
(4)、退火反应试剂：例如退火Buffer(10×)。
(5)、MnCl2溶液：10mM MnCl2溶液。
1.2检测方法
本发明的基于死亡基因编辑酶Clostridium perfringens Argonaute(dAGO)的核酸检测方法的示意图如图1所示，具体操作步骤如下：
本发明死亡基因编码酶dAGO的可视化检测示意图，其中针对靶标核酸分子设计一个向导ssDNA(gDNA)和一个呈递脱氧核酸(DNAer)，其末端修饰的生物素由太阳表示，dAGO酶作用后形成一个特异性地三者复合物。之后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)完成显色过程，其中发光的四角星星代表辣根过氧化物酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)反应产生的有色产物。
(1)、所述的向导ssDNA(gDNA)干粉用超纯水溶解制成10μM的储存液；所述的呈递脱氧核酸(DNAer)干粉用超纯水溶解制成10μM的储存液；
(2)、用退火Buffer(10×)制剂与超纯水、呈递脱氧核酸(DNAer)和靶标核酸分子制成退火反应体系(终浓度为500nM)；
(3)、将向导ssDNA(gDNA)、dAGO酶、MnCl2加入反应体系，反应体系为20μL(dAGO酶终浓度为200nM,MnCl2终浓度为500μM,向导ssDNA终浓度为2μM)；
(4)、将扩增体系放入37℃水浴锅中进行特异性结合反应20min，之后稀释加入96孔板中进行孵育2h；
(5)、孵育反应结束后，向步骤(4)中加入清洗溶液对孔板进行5次清洗，以洗掉未特异性结合的向导ssDNA(gDNA)；
(6)、向96孔板中加入稀释后的链霉亲和素-辣根过氧化物酶100μL(终浓度为0.4μg/mL)，放入37℃水浴锅中孵育30min。之后加入清洗溶液对孔板进行5次清洗，加入TMB-H2O2溶液100μL，轻轻混匀，在37℃下避光温育10min。
(7)、将步骤(6)中的反应体系放置在酶标仪上进行检测(450nm处的OD值)。
实施例2
针对不同浓度的待检核酸进行检测
对特异性目标核酸(SEQ ID NO.：1)进行稀释，分别稀释成0μM、2μM、4μM、6μM、8μM的标准母液。将不同浓度的核酸标准母液分别加入到实施例1所述的反应体系中，按步骤进行加样反应，并通过酶标仪检测450nm处的光密度信号值。
结果如图6所示，样本control为非目标核酸为抽提自正常人血清的总DNA。结果表明，即使在体系中加入无关的非目标核酸，仍不会产生阳性结果。
结果如图7A-7B所示。其中，图7A中的目标核酸的浓度分别为0μM、2μM、4μM、6μM、8μM，图7B为目标核酸检测的标准曲线。
结果表明，本发明的方法可最低检测至pM级别的目标核酸分子。另外，对于非目标核酸，即使加入检测体系的成分，也不会产生阳性信号，因此本发明方法的特异性非常高。
实施例3
特异性试验及分型检测
配置浓度为200pM的不同类型目标核酸溶液，分别为TTV病毒的两种分型TS14和TS15。
配置分型混合检测体系：将2对特异性扩增引物交叉加入到检测扩增体系中，将目标检测核酸按如下6组加入到检测扩增体系中：(1)Target TS14+gDNA TS14；(2)TargetTS15+gDNA TS14；(3)空白对照；(4)Target TS14+gDNA TS15。(5)Target TS15+gDNA TS15；(6)空白对照。(图8中分别验证了向导ssDNA和呈递脱氧核酸的特异性，在一个反应体系中可以进行分型检测)
结果如图8A-8B所示。结果表明：当检测目标核酸为空白对照时，光密度信号值很低，可视化颜色也非常浅；当检测目标核酸与向导ssDNA和呈递脱氧核酸相对应时，光密度信号值高，可视化颜色深。由此说明本发明核酸检测方法可用于病毒的分型检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系，其特征在于，该检测体系包括：
(a)向导ssDNA(gDNA)；
(b)突变剪切活性位点的死亡基因编辑酶Clostridium perfringens(dAGO)；和
(c)呈递脱氧核酸(DNAer)，所述呈递脱氧核酸带有生物素标记；
其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系，其特征在于，所述的向导ssDNA为5’-磷酸化的单链DNA分子；
所述的向导ssDNA的长度为n个碱基，且100≥n≥14；
所述的向导ssDNAs的长度为14-60nt。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系，其特征在于，所述的死亡基因编辑酶来源于古菌Clostridium perfringens；包括野生型和突变型的CpAgo；
所述的死亡基因编辑酶(dAGO)是将第608位氨基酸D突变为A(D608A)。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系，其特征在于，所述的靶标核酸分子的不同分型对应的突变位点在向导ssDNA的第10、11位。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系，其特征在于，待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1pM-200μM。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系，其特征在于，所述的靶标DNA选自：单链DNA、单链RNA、或其组合。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测靶标核酸分子的可视化检测体系，其特征在于，靶标核酸分子或其扩增产物被所述dAGO酶结合后，产生复合物。
8.一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的检测体系或用于配制所述检测体系的试剂。
9.一种检测样本中是否存在靶标核酸分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)提供权利要求1所述的用于检测靶标核酸分子的检测体系；和
(b)将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成第一反应溶液；
(c)对所述第一反应溶液进行光密度检测，从而获得光密度(OD)信号值；
当所述第一反应溶液中检测到光密度(OD)信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；当所述第一反应溶液中没有检测到光密度(OD)信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子。
10.一种死亡基因编辑酶Clostridium perfringens(dAGO)的用途，其特征在于，用于制备基于特异性结合检测靶标核酸分子的试剂或试剂盒。
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