CN113278717B - 一种靶向测序法检测血流感染的引物池、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多重扩增法的靶向高通量测序检测血流感染的引物池、试剂盒及方法，所述引物池包括正向单分子标签引物和反向单分子标签引物，在结构上均包含6部分，从5’‑3’端依次为tag通用扩增引物、分子标签UMI、目标特异引物序列、RNA残基、DNA保护碱基、封闭基团。本发明的试剂盒包括所述引物池，还包括独特的酶制剂和反应buffer。本发明的试剂盒可以进行绝对定量、具有高特异性同时能显著降低引物二聚体，并且可以根据预期目标需求随时增减引物，拓展性强，可以在单管中同时进行RNA和DNA的靶标共检测，覆盖全面、降低检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及感染性疾病临床检测技术领域，特别涉及一种基于多重扩增法的靶向高通量测序检测血流感染的引物池、试剂盒及方法。
背景技术
血流感染是严重的感染性疾病。在我国的血流感染细菌构成中革兰氏阳性菌占50％、革兰氏阴性菌占49.8％、厌氧菌占0.2％。真菌血症的微生物学鉴定相对困难，ICU念珠菌血症总体死亡率在30~50％。白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、新型隐球菌占据酵母型真菌血症病原菌的95~98％。脓毒症（Sepsis）又叫脓毒血症是由病原入血感染引起的宿主反应失调，进而导致循环功能障碍及器官功能损害的症候群。脓毒症早期不能得到及时有效的控制，即可进展为严重脓毒症、感染性休克，甚至出现多器官功能障碍综合征。全球每天约14000人死于脓毒症以及并发症，脓毒症更是ICU患者死亡的首要原因。
传统的血培养是血流感染以及脓毒症病原检测的金标准，但具有细菌生长缓慢、周期长、营养要求高、细胞内生长、血培养阳性率低等明显的缺陷。以荧光qPCR技术为代表的分子诊断技术的出现，在一定程度上解决了血培养的问题，但也存在诸如不能提供病原的基因序列，以及通量低的问题。近期火热的宏基因组测序（mNGS）解决了病原检测通量的短板，但宿主核酸比例高、检测敏感度低、周期长和成本高等问题仍待解决。针对以上技术限制，亟需开发一种新的针对血流感染的检测方法。
多重PCR靶向高通量测序是一种潜在可以替代或解决以上血液病原感染的检测问题的方法，此方法具有成本低、时效短、准确率高等优点，但因为多重PCR扩增的单个反应中，引物的数量往往达到几百甚至几千条，技术难度高；同时病原微生物序列相似度高，进一步加大了多重PCR建库的难度。近年也有报导利用多重PCR建库试剂盒进行病原微生物的检测，但大多只针对某一种类型样本的部分病原进行检测。除此之外，现有的病原微生物多重PCR法文库构建试剂盒因为在同一反应管中存在几百甚至几千条引物，而整个试剂盒的引物组及反应体系为整体分析优化的结果，因此，现有的病原微生物多重PCR建库试剂盒还存在以下的常见问题：（1）引物间相互干扰，形成大量二聚体，降低试剂盒性能；（2）非特异扩增，产生大量非目标扩增子，影响后续测序；（3）无法进行准确的定量；（4）扩增均一性无法保障；（5）扩展性、灵活性差。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种基于多重扩增的靶向高通量测序检测血流感染的引物池、试剂盒及方法，本发明基于独特的多重PCR引物池，配合独特的多重PCR酶制剂，提供了一种可以进行绝对定量的、高特异性同时能显著降低引物二聚体，并且可以根据预期目标需求随时增减引物的可扩展性多重PCR建库试剂盒。
本发明提供一种基于多重扩增的靶向高通量测序检测血流感染的多重PCR单分子标签引物池，包括正向单分子标签引物和反向单分子标签引物，所述正向单分子标签引物和所述反向单分子标签引物在结构上均包含6部分，从5’-3’端依次为tag通用扩增引物、分子标签UMI、目标特异引物序列、RNA残基、DNA保护碱基、封闭基团；所述tag通用扩增引物为一段非同源序列的通用序列；所述分子标签UMI由随机碱基N组成；所述目标特异引物序列为针对目标扩增序列利用生物信息学方法设计的一段特异序列；所述封闭基团为能阻止DNA聚合酶延伸扩增的修饰物。
进一步的，所述tag通用扩增引物的碱基数量为10~30个；所述分子标签UMI的随机碱基N数量为2~15个；所述目标特异引物序列的Tm值为50~65℃，GC含量为20~85%；所述RNA残基数量为1~20个；所述RNA残基类型为A、T、C、G、U中的任意一种或多种随机组合；所述DNA保护碱基数量为1~30个；所述DNA保护碱基类型为A、T、C、G中的任意一种或多种随机组合；所述封闭基团选自C3、C5、C6、氨基、双脱氧、碱基倒置、BHQ1、BHQ2、MGB中的任意一种。
进一步的，所述tag通用扩增引物为测序平台reads序列；所述分子标签UMI的随机碱基N数量为10个；所述目标特异引物序列的Tm值为56~60℃，GC含量为30~70%；所述RNA残基数量为1~10个；所述DNA保护碱基数量为1~10个。
本发明还提供一种基于多重扩增的靶向高通量测序检测血流感染的试剂盒，包括所述的多重PCR单分子标签引物池，还包括酶制剂和反应buffer。
进一步的，所述酶制剂包含3种酶：反转录酶、单分子标签酶和DNA聚合酶；所述单分子标签酶特异识别所述多重PCR单分子标签引物中的RNA残基，并在所述多重PCR单分子标签引物与扩增模板100%匹配杂交的情况下对RNA残基进行消解，进而解除多重PCR单分子标签引物的封闭效果。
进一步的，所述单分子标签酶选自RNaseA、DpnII、RNaseH、RNaseH2、RNaseH3中的任意一种或两种。
进一步的，所述反应buffer包括ddH2O、MgCl2、dNTP、(NH4)2SO4、曲拉通、NaCl、Tris-HCl、KCl、BSA、甘油、甜菜碱、海藻糖。
进一步的，所述反应buffer的反应体积为10~100 μL；所述ddH2O为双蒸水或无核酸酶水；所述Tris-HCl为buffer缓冲液，pH为6.5~9.0；所述MgCl2的浓度为0.5~5.0 mM；所述dNTP的浓度为每种100~500 nM；所述NaCl和所述KCl的浓度范围为10~150 mM；所述曲拉通的浓度为体积比0.001~1%；所述BSA的浓度为0.1~5 μg/μL；所述甘油的浓度为1~10%；所述甜菜碱的浓度为1~10 mM；所述海藻糖的浓度为0.05~1 mM。
进一步的，所述反应buffer的反应体积为20~50 μL；所述Tris-HCl的pH为7.5~8.5；所述MgCl2的浓度为1.0~3.0 mM；所述dNTP的浓度为每种150~250nM；所述NaCl和所述KCl的浓度为10~70 mM；所述曲拉通的浓度为体积比0.01~0.5%；所述BSA的浓度为0.4~0.8μg/μL；所述甘油的浓度为3~6%；所述甜菜碱的浓度为2~5 mM；所述海藻糖的浓度为0.1~0.5mM。
本发明的血流感染检测试剂盒既可以针对RNA靶标，也可以针对DNA靶标，或者RNA/DNA同时检测。因本发明的单分子标签引物的特殊设计，配合试剂盒酶制剂及能保证反转录酶、单分子标签酶和DNA聚合酶的活性都能充分发挥的独特反应buffer，达到可以实现RNA/DNA同时且单管检测的目的。
本发明还提供一种基于多重扩增的靶向高通量测序检测血流感染的方法，提取样本总核酸，所述总核酸为DNA、RNA、DNA和RNA的混合物中的任意一种，使用所述的多重PCR单分子标签引物池以及所述的酶制剂和所述的反应buffer进行RT-PCR扩增反应，进行扩增文库纯化，得到可以进行下游测序或电泳鉴定的多重PCR文库，经过测序和数据分析，确定样本中血流感染病原体的类型。
进一步的，所述血流感染病原体包括但不限于以下种类：大肠埃希菌、侵蚀艾肯菌、奇异变形杆菌、鲍曼不动杆菌、布鲁氏菌、洛菲不动杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌、伴放线杆菌、铜绿假单胞菌、脑膜败血性黄杆菌、金氏金杆菌、肺炎克雷伯菌、类志贺邻单胞菌、黏液玫瑰单胞菌、齿垢密螺旋体、梅毒密螺旋体、奥斯陆莫拉菌、卡他莫拉菌、非液化莫拉菌、微黄奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、浅黄奈瑟菌、干燥奈瑟菌、猕猴奈瑟菌、颊普雷沃菌、中间普雷沃菌、产黑色普雷沃菌、雷氏普罗维登斯菌、人心杆菌、黏质沙雷菌。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明的多重PCR单分子标签引物池以及含有上述引物池的试剂盒能显著降低引物二聚体的形成，提高目标扩增子的得率，排除测序干扰，提高测序目标数据量比例，从而降低成本。
2.本发明的检测血流感染的方法对原始模板进行分子标记，通过测序分子标签数量进行绝对定量，可用于病原微生物载量检测，提供临床诊疗决策参考依据。
3.本发明的检测血流感染的方法具有极佳的扩增均一性，最大可能保持模板目标物的相对比例，结果更接近实际情况。
4. 本发明的检测血流感染的方法扩增靶标可增加或减少，不影响体系内其他靶标的设计。因此本发明试剂盒具有很好的扩展性，可根据需求在原试剂盒的基础上增加目标病原扩增目标区域。
5.本发明的方法可以在单管中同时进行RNA和DNA的靶标共检测，达到覆盖全面、降低检测成本的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的多重PCR引物引物的结构示意图。
图2为本发明试剂盒工作原理的示意图。
图3为本发明试剂盒与其他厂家的试剂盒进行多重PCR对比的琼脂糖凝胶检测结果。
图4为添加20种扩增引物后，本发明试剂盒与其他厂家的试剂盒进行多重PCR对比的琼脂糖凝胶检测结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明的具体技术方案如下：
1. 设计绝对定量的多重PCR单分子标签引物池，包括正向单分子标签引物和反向单分子标签引物，所述正向单分子标签引物和所述反向单分子标签引物在结构上均包含6部分，从5’-3’依次为tag通用扩增引物、分子标签UMI、目标特异引物序列、RNA残基、DNA保护碱基、封闭基团，如图1所示。
所述tag通用扩增引物为一段非同源序列的通用序列，碱基数量为10~30个，优选的，tag通用扩增引物为测序平台reads序列。所述分子标签UMI由随机碱基N组成，数量为2~15个，优选为10个。所述目标特异引物序列为针对目标扩增序列，利用生物信息学方法进行设计的一段特异序列，其符合常规引物序列的要求，Tm值为50~65℃，优选为56~60℃；GC含量为20~85%，优选为30~70%。所述RNA残基数量为1~20个，优选为1~10个，更优选为1~5个；所述的RNA残基类型可以是A、T、C、G、U中的任何一种或多种随机组合。所述的DNA保护碱基数量为1~30个，优选为1~10个；所述DNA保护碱基类型为A、T、C、G中的一种或多种随机组合。所述封闭基团为能阻止DNA聚合酶延伸扩增的修饰物，可以选自C3、C5、C6、氨基、双脱氧、碱基倒置、BHQ1、BHQ2、MGB中的任意一种。
2. 可绝对定量的多重PCR建库试剂盒的酶制剂。所述的酶制剂包含3种酶：
一种为对病毒RNA基因组序列进行cDNA合成的反转录酶，所述反转录酶为市售的常见反转录酶。
另一种为特异识别所述多重PCR单分子标签引物中的RNA残基，并在多重PCR引物与扩增模板100%匹配杂交的情况下对RNA残基进行消解，进而解除多重PCR引物封闭效果的单分子标签酶；
所述的单分子标签酶为能特异识别单分子标签引物中的RNA残基，并且在单分子标签引物与模板100%特异结合时才被激活产生活性，并对RNA碱基进行消解。优选的，单分子标签酶是非温度失活酶（即高温不能使其失活），且最佳活性温度相对较低，如25~50℃之间，优选的，最佳活性温度为30~40℃。所述的单分子标签酶为家族酶，具有较广泛的来源，以保证本发明能广泛的应用，可选自RNaseA、DpnII、RNaseH、RNaseH2、RNaseH3中的任意一种或两种的组合。
第三种是DNA聚合酶，为高保真PCR扩增酶，其在单分子标签酶解除多重PCR引物封闭效果后进行延伸扩增，获得目标产物。所述的DNA聚合酶为任意一种市售商品化的可用于多重PCR扩增的DNA聚合酶。
3. 所述的单分子标签酶反应体系还包括适合于单分子标签酶的反应buffer，使单分子标签酶和DNA聚合酶均能较好的发挥反应活性。所述的反应buffer由ddH2O、MgCl2、dNTP、(NH4)2SO4、曲拉通、NaCl、Tris-HCl、KCl、BSA、甘油、甜菜碱、海藻糖等化学试剂按一定浓度配制而成。所述的buffer反应体积为10~100 μL，优选的，可以为20~50 μL。所述的ddH2O为双蒸水或无核酸酶水。所述的Tris-HCl为buffer缓冲液，pH范围为6.5~9.0，优选的，pH范围为7.5~8.5。所述的MgCl2作用为酶活性催化剂，其浓度为0.5~15.0 mM，优选的，其浓度可以是1.0~5.0 mM。所述的dNTP为三磷酸腺苷，为cDNA或DNA合成的原料底物，其浓度范围为每种100~500 nM，优选的，浓度范围为150~250nM。所述的NaCl和KCl作用为反应buffer提供合适的盐离子强度，浓度范围为10~150 mM，优选的，浓度范围可以是10~70 mM。所述的曲拉通、BSA、甘油、甜菜碱和海藻糖组合物为本发明的另一创新点，专为单分子标签酶提供高效的酶活性体系，其中曲拉通具有促进单分子标签酶活性的作用，其浓度范围为体积比0.001~1%，优选的，其浓度范围可以是0.01~0.5%，更优选的，其浓度范围为0.01~0.1%；BSA的作用为稳定单分子标签酶，其浓度为0.1~5 μg/μL，优选的，浓度范围是0.4~0.8μg/μL；甘油与甜菜碱配合，除了可稳定单分子标签酶的作用外，还有能降低打开高GC含量序列高级结构的难度，提高DNA扩增效率，保证扩增特异性的作用，其中甘油的浓度为1~10%，优选的，浓度为3~6%，而甜菜碱的浓度为1~10 mM，优选的，浓度范围为2~5 mM；海藻糖具有促进DNA模板与单分子标签酶结合的作用，其浓度为0.05~1 mM，优选的，浓度为0.1~0.5 mM。本发明的试剂盒工作原理如图2所示。
实施例1本发明的试剂盒具体使用方法
1. 单分子标签引物池准备：针对若干病原菌的目标靶区域，设计出符合要求的各靶区域扩增引物；将各扩增引物按照单分子标签引物要求，加上tag通用扩增引物、分子标签UMI、RNA残基、DNA保护碱基及3’端封闭基团。
2. 将单分子标签引物及tag通用扩增引物发送至引物合成公司进行单分子标签引物合成，并将单分子标签引物、tag通用扩增引物干粉溶解，混合为单分子标签引物池，并将单分子标签引物池稀释至合适的使用浓度。
3. 单分子标签酶反应体系的配制：将ddH2O、MgCl2、dNTP、(NH4)2SO4、曲拉通、NaCl、Tris-HCl、KCl、BSA、甘油、甜菜碱、海藻糖等化学试剂按照优选浓度配制，再添加一定活性单位的单分子标签酶和PCR扩增酶，组成单分子标签酶反应体系。
4. 提取样本总核酸，本实施例为DNA和RNA共提取，因为有些病毒是RNA类型的，可以同时对RNA病毒进行检测。只提取DNA或者只提取RNA同样适用于以下的步骤，从原理上无异。
5. 取第2步的单分子标签引物池加入到第3步的单分子标签酶反应体系中，混合均匀后分装至0.2 mL的薄壁PCR管，同时加入1~1000ng的样本总核酸，盖上PCR管盖。需要指出的是本发明的方法中可以实现单管反应，所谓单管反应是指RNA和DNA所有的反应过程都在一个PCR管内进行，用一套程序就可以完成，而现有的其它试剂盒是分2步进行，先进行反转录，结束后换管或者添加一些试剂后再进行DNA扩增。
6. 在PCR扩增仪上设置多重PCR反应程序，如下表为示例程序：
7. 第6步反应结束后，进行扩增文库纯化，得到可以进行下游测序或电泳鉴定的多重PCR文库。
实施例210例脓毒症患者感染病原准确定量检测
1.临床样本收集：从合作医院重症医学科（ICU）分别收集10例确诊脓毒症的血液样本，每个患者抽两管血，一管血送检mNGS，一管血做本发明试剂盒检测，患者临床信息如下：
其中，CRP表示C反应蛋白，PCT表示降钙素原，两者均为临床上判断脓血症的参考指标，SOFA评分常用于评估脓毒症风险。
2.选取常见的病原微生物32种，利用生物信息学分析各物种的特异区域序列，分别设计1对特异引物，并且按照本发明单分子标签引物要求进行设置；另外再设置2对人内参基因引物及2对植物源基因外源质控引物，具体序列见下表：
2.根据第1步的单分子标签引物序列进行合成，同时合成2个外源质控质粒和32个病原扩增区阳性质粒，作为本发明试剂盒的标准品参照。对单分子标签引物及通用引物进行溶解、稀释、混合为单分子标签引物池，引物池内各引物浓度均为4 μM；标准品质粒溶解后，稀释混合为阳性标准样品CK，每个质粒浓度为500 copies/μL。
3.根据本发明单分子标签酶及反应buffer配制方法，配制试剂盒反应buffer。
4.根据下表配方进行反应体系配制，以及相应反应程序进行多重PCR扩增。
5.多重PCR建库结束后，使用1×磁珠进行纯化，然后进行文库稀释，pool，使用Illumina Miniseq测序平台进行测序。
6.测序结果见下表：
本发明的试剂盒实现绝对定量的原理如下：
1.多重PCR扩增时，加入反应体系的原始核酸模板，其拷贝数已经确定；
2.多重PCR扩增起始2个循环时，单分子标签引物与原始核酸模板相结合并扩增，添加上唯一的分子标签UMI；
3.经NGS测序后，过滤低质量数据，并去除UMI重复标签序列；
4.去除重复后的分子标签序列的总量即代表原始核酸模板的拷贝数，因此可以通过统计测序后单分子标签的数量进行样本原始模板的目标核酸总拷贝数，达到绝对定量的目的。
由以上结果可知，本发明试剂盒均能成功检测到目标病原菌，与mNGS结果相一致；mNGS未能检出的，本发明的方法也能够检测到病原。
而根据分子标签数量进行绝对定量，500拷贝的阳性质粒定量结果介于495~505拷贝之间，显示出极佳的定量性能，据此类推，目标病原菌定量结果为准确结果。
实施例3外购100重病原微生物检测试剂盒与本发明试剂盒的实验对比。
为进一步验证本发明试剂盒性能，向提供多重PCR产品定制的成熟厂家定制相同100重PCR建库试剂盒，与本发明试剂盒进行多重PCR对比，选取部分样本进行琼脂糖凝胶检测，结果如图3所示。
由扩增结果胶图可知，与市售定制试剂盒相比，本发明试剂盒有极少的引物二聚体与非特异扩增，且具有很好的扩增均一性，整体性能具有明显优势。
为验证本发明试剂盒具有很好的灵活可扩展性，分别向市售定制试剂盒与本发明试剂盒随机添加20种扩增引物，用相同样本进行多重PCR扩增，选取部分样本进行琼脂糖凝胶检测，结果见图4。
图中01为本发明试剂盒，02为市售定制试剂盒，从结果可以看出，本发明试剂盒在随机添加20种扩增引物后，本发明试剂盒性能不受影响，依然取得很好的扩增效果；而市售试剂盒却产生大量的引物二聚体及非特异扩增，严重影响目标产物的扩增。因此，本发明试剂盒具有很好的扩展性，可根据需求在原试剂盒的基础上增加目标病原扩增目标区域。
综合以上实施例，本发明提供了一种基于多重扩增法的靶向高通量测序检测血流感染的引物池、试剂盒及方法，所述引物池包括正向单分子标签引物和反向单分子标签引物，在结构上均包含6部分，从5’-3’端依次为tag通用扩增引物、分子标签UMI、目标特异引物序列、RNA残基、DNA保护碱基、封闭基团。本发明的试剂盒包括所述引物池，还包括独特的酶制剂和反应buffer。所述酶制剂包含3种酶：反转录酶、单分子标签酶和DNA聚合酶。所述反应buffer包括ddH2O、MgCl2、dNTP、(NH4)2SO4、曲拉通、NaCl、Tris-HCl、KCl、BSA、甘油、甜菜碱、海藻糖。正是由于本发明特别的单分子标签引物设计和酶制剂以及配合的独特反应buffer，能够显著降低引物二聚体的形成，提高目标扩增子的得率，排除测序干扰，提高测序目标数据量比例，能够对原始模板进行分子标记，通过测序分子标签数量进行绝对定量，可用于病原微生物载量检测，提供临床诊疗决策参考依据。本发明的检测血流感染的方法具有极佳的扩增均一性，最大可能保持模板目标物的相对比例，结果更接近实际情况。扩增靶标可增加或减少，可根据需求在原试剂盒的基础上增加目标病原扩增目标区域。本发明的方法可以在单管中同时进行RNA和DNA的靶标共检测，达到覆盖全面、降低检测成本的目的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO.1
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGCTTCCATGGGGATAGCTG/rtrc/ACCGACTG
SEQ ID NO.2
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTAGGCAGACGTCTAGGCAGA/rarg/TACAGAGA
SEQ ID NO.3
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCGTGGCGTTTCAATGGAA/rarg/TTACCAAA
SEQ ID NO.4
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCGTTCGTCATTTGATTCGG/rgrc/CCATACGG
SEQ ID NO.5
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCATTCATCTGCCTATCCCCA/rcrc/GGAGGCCCA
SEQ ID NO.6
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCTTTATCACCTCTCCCCC/rcra/TTTTACCC
SEQ ID NO.7
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTACCTTCGATCGATCCCTCTCAGA/rcra/GATTACTCTCAGA
SEQ ID NO.8
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCCTCAACTGGTCCATGAA/rtra/ACATAGAA
SEQ ID NO.9
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTTGAGATGACCTGGGGTAAA/rgra/TATCGGTAAA
SEQ ID NO.10
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTCCTGGGAAGGTCTGTATT/rura/TAACATATT
SEQ ID NO.11
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAGGAACGTCGATCCCTGAG/rgra/CATAGGAG
SEQ ID NO.12
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTTCTTTTTCTGCGTCCCG/rgrc/ATGAACCG
SEQ ID NO.13
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGTTCTTCGTTTCCCCTTCCAA/rcra/CAATATCCAA
SEQ ID NO.14
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATGAAACAGTTGGATAGTTTCTAGC/rgrc/TTCATATTTCTAGC
SEQ ID NO.15
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTCCGGGTTGTCAATCCCGT/rurg/AGCAACGT
SEQ ID NO.16
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTGTATGAGTTCTTTTTCGTCAATG/rgrc/AACAGTTCGTCAATG
SEQ ID NO.17
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTCCCTACCTACCGGACCAC/rcrg/ACAGACAC
SEQ ID NO.18
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAAGCTATTGGAGAGTTTGCC/rcra/CAAAGTGCC
SEQ ID NO.19
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCAGTTGAATGGCAAGTTGACA/rarc/TTAAAATGACA
SEQ ID NO.20
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTCTCATTACAATTCTCAAATCATCA/rarc/ATAAACAAATCATCA
SEQ ID NO.21
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCAACTTCTTTCTCCCTAGCCAAC/rurc/TTTAGAAGCCAAC
SEQ ID NO.22
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAATTAGCGGACGAACTCG/rtra/AAGCATCG
SEQ ID NO.23
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAATCTTGTCCGTGGATGTTGA/rcrc/TACCGTTGA
SEQ ID NO.24
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAACTTTGTGGATCGGCGG/rcrg/AATTAGG
SEQ ID NO.25
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACGCAATCCTTTCTCGCGTA/rgrg/AGCTAGTA
SEQ ID NO.26
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCATCATGAAATCACGAAAAAGTAAA/rgrc/AGCGAAAAAAGTAAA
SEQ ID NO.27
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGTACTCGGTTTTGGGGTA/rarc/TTTCTAGTA
SEQ ID NO.28
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCAAAGCGGATATGGATGCTC/rgrc/TACGATGCT
SEQ ID NO.29
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGTCAAAGTGGCATTAAAGACAGT/rcra/GATCAAGACAGT
SEQ ID NO.30
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGGGTATTCCGCTGCACT/rarg/AAATGCT
SEQ ID NO.31
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGAGTCGCTGCAACCTCATC/rarg/CAAGAATC
SEQ ID NO.32
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTCGACCGCCTTACGCTG/rcra/CCCGATG
SEQ ID NO.33
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGACCAGAAACGCCTTGTACT/rcrg/TGCAGTACT
SEQ ID NO.34
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAAGAAGCGCGAGGAAGAGGT/rgrc/CCCCGAGG
SEQ ID NO.35
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTAACTGACGCCACCCCC/rgra/AATTACC
SEQ ID NO.36
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCGTGAGCTTGCACCTTT/rgrc/TTCTGATT
SEQ ID NO.37
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTGAGAGCAGGGCGGTTT/rurc/AGGTGTT
SEQ ID NO.38
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCCACAAGTGCCCGCAG/rcra/TCTCAG
SEQ ID NO.39
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGCGTCATCGTCCCGTG/rcra/GAAAAG
SEQ ID NO.40
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTTCTTTCCTGGAGTACGTAGGTTC/rcra/GCTGGGTAGGT
SEQ ID NO.41
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACTATGCGCGCTGGAAGATCA/rgra/TCGTGGATCA
SEQ ID NO.42
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGATCCATCACACCACCAC/rgrc/GTATACAC
SEQ ID NO.43
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTTCGCACTTTCCCCCG/rcrg/TTATGAG
SEQ ID NO.44
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGCCAGTAAGGAAGTCGATAATG/rcra/TGGCGATAATG
SEQ ID NO.45
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGTTCGACGCGTTTTCCAAC/rgra/AGATGAAC
SEQ ID NO.46
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGTCAGAGGGTAATGGCGG/rtrg/TTGGGACGG
SEQ ID NO.47
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACGAGCTAAAACACTTAGATGTTGC/rarc/CCGAGGATGTTGC
SEQ ID NO.48
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGACGGCGAGATGTTCCTT/rarg/AGTGACT
SEQ ID NO.49
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGCCTGTAGTCTTCTCGGC/rtrc/GTCAAGGC
SEQ ID NO.50
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAACGGTCACTTGTTTCCCC/rcrg/TTTTGAACCC
SEQ ID NO.51
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCGAAATCGGTGATGCGGTA/rcrg/GTCAAGTA
SEQ ID NO.52
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGTGGTTTAATTCCAAAGGCTCTTT/rcrg/TACCAGGCTCTTT
SEQ ID NO.53
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATCCCATGGTCGCTGCTT/rgrc/GGTTATT
SEQ ID NO.54
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCAACAAAGCTACGCCTACAATGG/rarg/CCCTAACAATG
SEQ ID NO.55
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGCTTCATCGATAGCATGTTGC/rarg/TTTATAGTTGC
SEQ ID NO.56
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGTTTTCAGTACGCTCGGT/rcra/GACTAGGT
SEQ ID NO.57
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACAGGTTACAATTGTCATGGCTTG/rcra/TACCATGGCTTG
SEQ ID NO.58
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCTCACTTGCACTCGCTC/rarc/GGTCAT
SEQ ID NO.59
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTAGTGGCAGTGCGTGACTT/rarc/AGCTACTT
SEQ ID NO.60
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGCTTGGTGTACATCCGGAA/rcrg/TTGAATGGAA
SEQ ID NO.61
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCGCTGCAGCTTGACGTAA/rarc/GGAAATAA
SEQ ID NO.62
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTATCCGAGTTTTGTTTCTTTTGGC/rgrc/GACCACTTTTGGC
SEQ ID NO.63
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGAAGGCCGGCGCTATTC/rgra/CCAAAC
SEQ ID NO.64
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACGTTTATTATTGCGTAAATCGTTAAG/rarg/CAATACTAATCGTTAAG
SEQ ID NO.65
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGGAAGCCTATGAATGTTCTGAAAAA/rgrc/AGCAGTCTGAAAA
SEQ ID NO.66
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAACAAGAATTGAAGTCCTAAAAAGGCT/rarg/CTGGACTAAAAAGG
SEQ ID NO.67
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCATTTTGGTCTTCTGTTTTGC/rarg/ACTA
SEQ ID NO.68
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCATTTTGGTCTTCTGTTTTGC/rarg/ACTA
SEQ ID NO.69
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCAGGTAACGAGGTCAATGC/rcrg/GTCA
SEQ ID NO.70
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCAGGTAACGAGGTCAATGC/rcrg/GTCA
SEQ ID NO.71
ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGACTCCATTGTCAATCCCCA/rgrc/AGCCA
SEQ ID NO.72
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCATATATGTTGACATCTTGAGCAAAT/rara/TCTGGAC
SEQUENCE LISTING
<110> 广州赛哲生物科技股份有限公司
<120> 一种靶向测序法检测血流感染的引物池、试剂盒及方法
<130> 2021.08.20
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tagcttccat ggggatagct grtrcaccga 60
ctg 63
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttaggcaga cgtctaggca garargtaca 60
gaga 64
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aa 62
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcgttcgt catttgattc ggrgrcccat 60
acgg 64
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tgcattcatc tgcctatccc carcrcggag 60
gccca 65
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcctttat cacctctccc ccrcratttt 60
accc 64
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tctaccttcg atcgatccct ctcagarcra 60
gattactctc aga 73
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgccctcaa ctggtccatg aartraacat 60
agaa 64
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tccttgagat gacctggggt aaargratat 60
cggtaaa 67
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctactcctgg gaaggtctgt attrurataa 60
catatt 66
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tcaggaacgt cgatccctga grgracatag 60
gag 63
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accg 64
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc ttgttcttcg tttccccttc caarcracaa 60
tatccaa 67
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctatgaaaca gttggatagt ttctagcrgr 60
cttcatattt ctagc 75
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tgtccgggtt gtcaatcccg trurgagcaa 60
cgt 63
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctccttgtat gagttctttt tcgtcaatgr 60
grcaacagtt cgtcaatg 78
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<223> Artificial sequence
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tgtccctacc taccggacca crcrgacaga 60
cac 63
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcaagctat tggagagttt gccrcracaa 60
agtgcc 66
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tccagttgaa tggcaagttg acararctta 60
aaatgaca 68
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctactctcat tacaattctc aaatcatcar 60
arcataaaca aatcatca 78
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<212> DNA
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<223> Artificial sequence
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc ttcaacttct ttctccctag ccaacrurct 60
ttagaagcca ac 72
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<212> DNA
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgcaattag cggacgaact cgrtraaagc 60
atcg 64
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc taatcttgtc cgtggatgtt garcrctacc 60
gttga 65
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgaactttg tggatcggcg grcrgaatta 60
gg 62
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<223> Artificial sequence
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tacgcaatcc tttctcgcgt argrgagcta 60
gta 63
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttgcatcat gaaatcacga aaaagtaaar 60
grcagcgaaa aaagtaaa 78
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<223> Artificial sequence
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tgggtactcg gttttggggt ararctttct 60
agta 64
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaccaaagc ggatatggat gctcrgrcta 60
cgatgct 67
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<220>
<223> Artificial sequence
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atcaagacag t 71
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<220>
<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgggtat tccgctgcac trargaaatg 60
ct 62
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<223> Artificial sequence
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tagagtcgct gcaacctcat crargcaaga 60
atc 63
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctattcgacc gccttacgct grcracccga 60
tg 62
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc ttgaccagaa acgccttgta ctrcrgtgca 60
gtact 65
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctaaagaagc gcgaggaaga ggtrgrcccc 60
cgagg 65
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tgttaactga cgccaccccc rgraaattac 60
c 61
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcccgtgag cttgcacctt trgrcttctg 60
att 63
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<223> Artificial sequence
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t 61
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctacccacaa gtgcccgcag rcratctcag 60
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgttctttc ctggagtacg taggttcrcr 60
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tggatca 67
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<220>
<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttcgatcca tcacaccacc acrgrcgtat 60
acac 64
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<223> Artificial sequence
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcgccagta aggaagtcga taatgrcrat 60
ggcgataatg 70
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<223> Artificial sequence
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aac 63
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcagtcaga gggtaatggc ggrtrgttgg 60
gacgg 65
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctgtgacggc gagatgttcc ttrargagtg 60
act 63
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ggc 63
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctcaacggtc acttgtttcc ccrcrgtttt 60
gaaccc 66
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gtaccaggct cttt 74
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
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t 61
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<220>
<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctccaacaaa gctacgccta caatggrarg 60
ccctaacaat g 71
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<220>
<223> Artificial sequence
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atagttgc 68
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat cttggttttc agtacgctcg gtrcragact 60
aggt 64
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<223> Artificial sequence
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accatggctt g 71
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<223> Artificial sequence
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gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctggctcact tgcactcgct crarcggtca 60
t 61
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<220>
<223> Artificial sequence
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actctttccc tacacgacgc tcttccgatc tttagtggca gtgcgtgact trarcagcta 60
ctt 63
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atggaa 66
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<223> Artificial sequence
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taa 63
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Claims (9)
1.一种基于多重扩增的靶向高通量测序检测血流感染的多重PCR单分子标签引物池，其特征在于，包括正向单分子标签引物和反向单分子标签引物，所述正向单分子标签引物和所述反向单分子标签引物在结构上均包含6部分，从5’-3’端依次为tag通用扩增引物、分子标签UMI、目标特异引物序列、RNA残基、DNA保护碱基、封闭基团；
所述tag通用扩增引物为一段非同源序列的通用序列；所述分子标签UMI由随机碱基N组成；所述目标特异引物序列为针对目标扩增序列利用生物信息学方法设计的一段特异序列；所述封闭基团为能阻止DNA聚合酶延伸扩增的修饰物；
所述正向单分子标签引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ IDNO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.39、SEQ IDNO.41、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.51、SEQ IDNO.53、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.63；
所述反向单分子标签引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.52、SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.64。
2.一种基于多重扩增的靶向高通量测序检测血流感染的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多重PCR单分子标签引物池，还包括酶制剂和反应buffer。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述酶制剂包含3种酶：反转录酶、单分子标签酶和DNA聚合酶；所述单分子标签酶特异识别所述多重PCR单分子标签引物中的RNA残基，并在所述多重PCR单分子标签引物与扩增模板100％匹配杂交的情况下对RNA残基进行消解，进而解除多重PCR单分子标签引物的封闭效果。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述单分子标签酶选自RNaseA、DpnII、RNaseH、RNaseH2、RNaseH3中的任意一种或两种。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应buffer包括ddH2O、MgCl2、dNTP、(NH4)2SO4、曲拉通、NaCl、Tris-HCl、KCl、BSA、甘油、甜菜碱、海藻糖。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反应buffer的反应体积为10～100μL；所述ddH2O为双蒸水或无核酸酶水；所述Tris-HCl为buffer缓冲液，pH为6.5～9.0；所述MgCl2的浓度为0.5～15.0mM；所述dNTP的浓度为每种100～500nM；所述NaCl和所述KCl的浓度范围为10～150mM；所述曲拉通的浓度为体积比0.001～1％；所述BSA的浓度为0.1～5μg/μL；所述甘油的浓度为1～10％；所述甜菜碱的浓度为1～10mM；所述海藻糖的浓度为0.05～1mM。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反应buffer的反应体积为20～50μL；所述Tris-HCl的pH为7.5～8.5；所述MgCl2的浓度为1.0～5.0mM；所述dNTP的浓度为每种150～250nM；所述NaCl和所述KCl的浓度为10～70mM；所述曲拉通的浓度为体积比0.01～0.5％；所述BSA的浓度为0.4～0.8μg/μL；所述甘油的浓度为3～6％；所述甜菜碱的浓度为2～5mM；所述海藻糖的浓度为0.1～0.5mM。
8.权利要求1所述的多重PCR单分子标签引物池或权利要求2～7任一项所述的试剂盒在制备检测血流感染病原体产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述血流感染病原体为以下种类：大肠埃希菌、侵蚀艾肯菌、奇异变形杆菌、鲍曼不动杆菌、布鲁氏菌、洛菲不动杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌、伴放线杆菌、铜绿假单胞菌、脑膜败血性黄杆菌、金氏金杆菌、肺炎克雷伯菌、类志贺邻单胞菌、黏液玫瑰单胞菌、齿垢密螺旋体、梅毒密螺旋体、奥斯陆莫拉菌、卡他莫拉菌、非液化莫拉菌、微黄奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、浅黄奈瑟菌、干燥奈瑟菌、猕猴奈瑟菌、颊普雷沃菌、中间普雷沃菌、产黑色普雷沃菌、雷氏普罗维登斯菌、人心杆菌、黏质沙雷菌。
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