CN111705118A - 一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒 - Google Patents

一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒，包括以下试剂：PCR扩增缓冲液，dNTP，DNA聚合酶、BSA、特定扩增基因引物和一对U引物，所述特定扩增基因引物包括22种细菌、8种真菌、13种耐药基因和4种毒力基因的正向引物和反向引物，所述U引物包括正向引物5’‑TTCTTAGCGTATTGGAGCTC‑3’和反向引物5’‑AAGTATCAGTATTGCGTTGTT‑3’；本申请还涉及使用该试剂盒检测血流感染中病原微生物的方法。本申请提供的试剂盒采用靶基因高通量测序方法，可同时检测22种细菌、8种真菌、13种耐药基因和4种毒力基因，是一种测序和分析速度更快、测序成本更低的微生物检测试剂盒，检测结果的特异性和敏感性显著提高，为临床血流感染患者制定治疗方案提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。

Description

一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒
技术领域
本申请涉及一种试剂盒，尤其涉及一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒。
背景技术
血流感染是各种病原微生物(包括细菌、真菌等)入侵血液所引起的感染，包括菌血症与脓毒血症，其中菌血症是指细菌短暂入血，而临床表现上无明显的毒血症症状；脓毒血症则是由于病原微生物及毒素共同入血所引起的全身炎症反应综合征。许多欧洲和北美国家血流感染的病死率为12％～20％，是造成病人死亡的主要原因。血流感染能造成住院病人较高的死亡率，会随着正确使用抗生素时机而降低。如何快速确定血流感染的感染病原菌，是当前迫切需要解决的问题。
传统血流感染病原菌的检测主要包括血培养、再培养和药敏鉴定，具有耗时长(3-5天)、分辨率低和耗费人力的缺点；新型分子生物学技术如PCR-ESI MS、MagicPlex、FISH和Sanger测序等虽然缩短了测定周期，但存在通量不高、灵敏度不足和特异性参差不齐等问题。
发明内容
本申请提供了一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒，以解决传统检测技术周期长、分辨率低和耗费人力的缺点和新型分子生物学检测技术存在的通量不高且灵敏度不足、特异性参差不齐的问题。
本申请采用的技术方案如下：
一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒包括以下试剂：PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、BSA、特定扩增基因引物和一对U引物；
所述特定扩增基因引物包括用于检测22种细菌的引物序列SEQ ID NO：1～44，用于检测8种真菌的引物序列SEQ ID NO：45～60，用于检测13种耐药基因的引物序列SEQ IDNO：61～86，用于检测4种毒力基因的引物序列SEQ ID NO：87～94。
进一步地，所述U引物包括正向引物5’-TTCTTAGCGTATTGGAGCTC-3’和反向引物5’-AAGTATCAGTATTGCGTTGTT-3’。
采用本申请的技术方案的有益效果如下：
本申请提供的一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒，采用敏感性及特异性均较高的靶基因高通量测序法，可同时检测22种细菌、8种真菌、13种耐药基因和4种毒力基因，能快速、准确的检测血液中是否存在血流感染特定病原菌菌种、耐药基因和毒力基因，以及存在的血流感染特定病原菌菌种、耐药基因和毒力基因的Reads数，能及时有效地为临床提供血流感染的诊断依据，判定病情的严重程度，同时预测使用抗生素的疗效及耐药分析，为血流感染患者的诊断、制定治疗方案及疗效评价和预后提供了重要的检测手段；同时还采用人工设计与合成的内部阳性对照基因，监测基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒检测的整个过程，能有效地解决目前血流感染常规培养与鉴定检测过程中的假阳性、假阴性问题，使得检测结果更可靠，该试剂盒为临床血流感染患者制定治疗方案提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为具体实施例1中金黄色葡萄球菌及阳性对照检测示意图；
图2为部分病原微体及阳性对照检测示意图。
具体实施方式
下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。
本申请的技术思路是：通过分析大量文献，并结合血流感染细菌分子流行病学和MRSA细菌基因组学研究等成果发现：临床血流感染病原菌类型是有规律的，主要集中于27种病原菌、11种耐药基因和4种毒力基因相关的生物表型，它们之间相互组合能够鉴定病原菌耐药性。基于这些发现，本申请设计涵盖30种病原菌、13种耐药基因和4种毒力基因靶基因高通量测序检测试剂盒，使测序和分析速度更快、测序成本更低的微生物检测，完成对血流感染病原菌菌种、耐药和毒力的检测。
本申请提供一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒，包括以下试剂：PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、BSA、特定扩增基因引物和一对U引物；
特定扩增基因引物包括用于检测22种细菌的引物序列SEQ ID NO：1～44，用于检测8种真菌的引物序列SEQ ID NO：45～60，用于检测13种耐药基因的引物序列SEQ ID NO：61～86，用于检测4种毒力基因的引物序列SEQ ID NO：87～94，特定扩增基因引物序列如表1。
表1特定扩增基因引物
Figure BDA0002551823150000031
Figure BDA0002551823150000041
Figure BDA0002551823150000051
所述U引物包括正向引物5’-TTCTTAGCGTATTGGAGCTC-3’和反向引物5’-AAGTATCAGTATTGCGTTGTT-3’。
本申请提供的血流感染检测试剂盒用于检测怀疑血流感染的人外周血血浆中提取的DNA样本。在检测DNA样本时，该试剂盒的混合扩增体系如表2。
表2本申请试剂盒的混合扩增体系
组分 终浓度
ddH<sub>2</sub>O +20μl
PCR扩增缓冲液 2×
dNTP 0.3mM
特定扩增基因引物 0.02μM
U引物 0.2μM
DNA聚合酶 1.5U
BSA 0.18mg/ml
DNA 1ng
具体实施例一：
本申请具体实施例提供一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒，包括以下试剂：PCR扩增缓冲液，dNTP，DNA聚合酶、BSA、特定扩增基因引物和一对U引物；
特定扩增基因引物包括22种细菌的引物对SEQ ID NO：1～44、8种真菌的引物对SEQ ID NO：45～60、13种耐药基因的引物对SEQ ID NO：61～86和4种毒力基因的引物对SEQID NO：87～94；
U引物包括正向引物5’-TTCTTAGCGTATTGGAGCTC-3’和反向引物5’-AAGTATCAGTATTGCGTTGTT-3’；
混合扩增体系的组分及各组分的终浓度如表2所示。
使用本实施例提供的试剂盒对已知金黄色葡萄球菌血流感染患者外周血血浆提取的DNA样本进行检测，具体检测方法如下：
第一步：取已知金黄色葡萄球菌血流感染患者外周血血浆提取的DNA样本，以及阳性对照核DNA样本及引物，加入到本实施例提供的试剂盒中进行PCR混合扩增，扩增程序如下：首先，95℃预变性5min，然后94℃变性30s，65℃退火1.5min，5个循环；再94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；最后72℃终延伸5min。
第二步：用0.9×SPRI磁珠纯化上述PCR产物，20μl洗脱，使用Qubit法定量浓度。
第三步：用Hyper Prep Kit试剂盒建立DNA文库，建库起始模板定量5ng，用Library Quantification Kit对DNA文库进行绝对定量。
第四步：用S5系统测序：
S5测序数据统计，采用S5 2x200bp的双末端测序，测序后的原始reads序列分为正向读长和反向的读长，通过S5自带软件将正反向的reads序列进行合并，合并的参数是100％的相似性，两端至少重叠10bp。数据结果为：原始结果一共有15337对测序的reads，能够合并的reads为8982对。
第五步：利用Ion Reporter软件对上述序列进行统计，首先修改软件的配置文件，配置文件中包含对上述序列进行分型统计。如图1和图2所示，图1为本实施例中金黄色葡萄球菌及阳性对照检测示意图，此分型结果和所取样本本身的分型结果相同，证明通过S5测序可以得到预期的结果。图2为部分病原微体及阳性对照检测示意图；
第六步：通过BLAST将reads比对模板序列，长度覆盖和比对的相似度都设定为95％，将细菌reads读数超过10reads的认定为阳性(例如表3所示)，阳性结果采用PCR扩增阳性细菌特异性基因后凝胶电泳进行确认。
使用本申请提供的试剂盒并采用上述检测方法对已知金黄色葡萄球菌血流感染患者外周血血浆提取的DNA样本进行平行测试50次，以考察本申请提供的试剂盒混合扩增体系的稳定性以及效果。测试表明：在50次测试中，混合扩增体系引物均对其目的靶基因位点进行了有效扩增，靶基因无缺失，说明本申请试剂盒涉及引物稳定有效。
具体实施例二：
取30例疑似血流感染患者外周血，采用磁珠法提取血浆提取的DNA样本，使用本申请提供的试剂盒及试剂盒检测方法对该DNA样本进行检测，靶基因高通量测序阳性结果采用PCR技术检测特性基因结果进行验证。表3为本申请提供的试剂盒检测疑似血流感染患者外周血中病原体的结果。
表3本申请提供的试剂盒检测疑似血流感染患者外周血中病原体的结果
Figure BDA0002551823150000071
Figure BDA0002551823150000081
同时对上述30例疑似血流感染患者外周血标本使用常规培养与鉴定法进行检测，并与本申请提供的试剂盒采用的靶基因测序法进行检测的结果进行对比分析，如表4所示为本申请提供的试剂盒采用的靶基因测序法与常规培养与鉴定法检测30例疑似血流感染患者外周血中病原微生物结果比较。
表4两种不同方法检测30例疑似血流感染患者外周血中病原微生物结果比较
Figure BDA0002551823150000091
由表4和表5分析可知，本申请提供的试剂盒及该试剂盒采用的靶基因高通量测序法：
①特异性为62.5％；
②敏感性100％；
③阳性预测值88％；
④阴性预测值100％；
⑤重复性：多次重复实验结果一致；
⑥检测周期：本申请提供的试剂盒及该试剂盒采用的靶基因高通量测序法检测时间约为6h，耗时短，而常规培养与鉴定法检测一般要24h以上；
⑦本申请提供的试剂盒采用人工合成特异性序列作为阳性对照，防止检测过程中出现假阳性、假阴性问题。
上述对比可以说明，本申请提供的试剂盒及该试剂盒采用敏感性及特异性均较高的靶基因高通量测序法，其检测结果的特异性和敏感性均显著提高，采用体检人群作为阴性对照和人工合成特异性序列作为阳性对照监控整个检测过程，能有效地解决目前血流感染常规培养与鉴定法检测过程中的假阳性、假阴性问题，使得检测结果更可靠，该试剂盒为临床血流感染患者制定治疗方案提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。

Claims (2)

1.一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：PCR扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、BSA、特定扩增基因引物和一对U引物；
所述特定扩增基因引物包括用于检测22种细菌的引物序列SEQ ID NO：1～44，用于检测8种真菌的引物序列SEQ ID NO：45～60，用于检测13种耐药基因的引物序列SEQ ID NO：61～86，用于检测4种毒力基因的引物序列SEQ ID NO：87～94。
2.根据权利要求1所述的一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒，其特征在于，所述U引物包括正向引物5’-TTCTTAGCGTATTGGAGCTC-3’和反向引物5’-AAGTATCAGTATTGCGTTGTT-3’。
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