CN115873992B - 一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用 - Google Patents

一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115873992B
CN115873992B CN202211377459.4A CN202211377459A CN115873992B CN 115873992 B CN115873992 B CN 115873992B CN 202211377459 A CN202211377459 A CN 202211377459A CN 115873992 B CN115873992 B CN 115873992B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
primer
pathogen
barcode
blood flow
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211377459.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115873992A (zh
Inventor
王俊
宋驰
聂旋
范媛
杨路路
郑重文
杨轶成
蒋冕
田朝阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Bena Technology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Bena Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Bena Technology Co ltd filed Critical Wuhan Bena Technology Co ltd
Priority to CN202211377459.4A priority Critical patent/CN115873992B/zh
Publication of CN115873992A publication Critical patent/CN115873992A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115873992B publication Critical patent/CN115873992B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测血流感染病原的引物组合，所述引物组合由90对核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑180所示的正、反向引物组成，所述90对正、反向引物分别针对30种血流感染病原，每种病原设有3对引物。本发明还公开了一种基于高通量靶向纳米孔测序检测血流感染病原的试剂盒和检测方法。本发明通过ONT测序平台进行测序，比对病原数据库，快速准确的获得病原检测结果，能在6小时内出结果，相对普通PCR及qPCR的检测靶标更多，通量更高，检测成本更低。

Description

一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及用于检测血流感染病原的引物组合以及试剂盒，本发明还涉及一种基于高通量靶向纳米孔测序的血流感染病原检测方法，属于生物领域。
背景技术
血流感染(bloodstream infections，BSI)是一种严重的全身感染性疾病，细菌、真菌、病毒及寄生虫在循环血液中呈一过性、间歇性或持续性存在，对机体所有脏器，特别是心脏瓣膜、关节等造成损害，严重者可导致休克、多脏器衰竭、弥散性血管内凝血(DIC)，甚至死亡。血流感染包括菌血症、腋毒症，导管相关性血流感染。
目前临床的诊断方法仍然以血培养为主，该方法耗时较长，且培养阳性率较低，不利于及时诊断和精准用药。除了传统培养检测，分子生物学方法也常被用于病原检测，如聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR(qPCR)或多重PCR等方法，通过检测血流感染样本中病原体的特异性基因片段进行快速鉴定，PCR检测耗时短、灵敏度高，有望大大缩短检测时间、提高阳性检出率。但普通PCR方法检测通量低、靶标数少，不适宜多样本检测。
CN 110656188A公开了一种检测引发血流感染的杆菌的引物和探针组合物，使用常用的qPCR检测方法，受限于荧光通道个数，无法在单管实现超过荧光通道个数的靶标检测，检测物种数量受限，且分管检测操作复杂，样本使用量多，成本较高。
第二代测序(Next-generation sequencing，NGS)又称为高通量测序(High-throughput sequencing)，该测序技术的出现结合多重PCR技术，实现了多样本多靶标的同时检测，但多重PCR扩增重数亦受限于引物设计和反应体系，扩增重数受到限制。二代宏基因组技术可针对所有病原进行检测，但该方法有易污染、解读困难等问题。另外二代测序时间周期较长，无法快速诊断。
纳米孔测序(OxfordNanoporeTechnologies，简称ONT)是新一代基于纳米孔的单分子实时电信号测序技术。它能够直接实时分析任意长度的DNA或RNA片段。通过实时监测核酸通过蛋白纳米孔时的电流变化来工作，解码这些电流信号以确定碱基序列。该测序技术能边测序边分析，大大缩短了测序时间。但目前常用的16S、ITS等通用条形码鉴定序列，大部分能准确鉴定到属，无法精准鉴定到种，甚至亚种。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于检测血流感染病原的引物组合。
本发明提供的引物组合共由90对检测引物(180个正、反向引物)组成，这90对检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-180所示，它们是针对如下表所示的30种血流感染病原(19种细菌、7种真菌、4种病毒)设计的：
中文名 拉丁名 中文名 拉丁名
大肠埃希菌 Escherichia coli 奇异变形杆菌 Proteus mirabilis
肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae 化脓性链球菌 Streptococcus pyogenes
表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermidis 无乳链球菌 Streptococcus agalactiae
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 单增李斯特菌 Listeria monocytogenes
人葡萄球菌 Staphylococcus hominis 白色念珠菌 Candida albicans
屎肠球菌 Enterococcus faecium 热带念珠菌 Candida tropicalis
鲍曼不动杆菌 Acinetobacter baumannii 光滑念珠菌 Candida glabrata
铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 近平滑念珠菌 Candida parapsilosis
粪肠球菌 Enterococcus faecalis 马尔尼菲篮状菌 Talaromyces marneffei
头状葡萄球菌 Staphylococcus capitis 新型隐球菌 Cryptococcus neoformans
溶血葡萄球菌 Staphylococcus haemolyticus 克柔念珠菌 Pichia kudriavzevii
嗜麦芽窄食单胞菌 Stenotrophomonas maltophilia 单纯疱疹病毒Ⅰ型 Human alphaherpesvirus 1
肺炎链球菌 Streptococcus pneumoniae 单纯疱疹病毒Ⅱ型 Human alphaherpesvirus 2
缓症链球菌 Streptococcus mitis 人巨细胞病毒 Human betaherpesvirus 5
产酸克雷伯菌 Klebsiella oxytoca EB病毒 Human gammaherpesvirus 4
其中，每种病原分别设有3对引物，以确保检测结果的准确性。
利用上述引物组合中的引物对血流感染中的病原核酸进行多重PCR扩增，对扩增产物进行检测可判断检测样品中是否存在以上30种病原感染。这些引物特异性好，相互之间无交叉反应，检测准确度高。
本发明的第二个目的是利用上述引物组合，提供一种基于高通量靶向纳米孔测序检测血流感染病原的试剂盒。
为实现上述目的，本发明首先将上述引物组合中的所有正、反向引物与公共序列连接，混合后组成引物池，然后为了实现高通量检测，设计了若干个用于区分不同样本的barcode标签，并将这些barcode标签与公共序列连接，最后将引物池、barcode标签与PCR反应液、末端修复液、接头连接酶、缓冲液等纳米孔测序用常规试剂进行组装以获得试剂盒，其中，所述若干个barcode标签分开组装。
进一步地，所述引物池中还含有一对与公共序列连接的人源内参引物，所述人源内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：181-182所示。
进一步地，所述公共序列如SEQ ID NO：279所示，该公共序列分别与引物组合的5’端、barcode标签的3’端连接。
进一步地，本发明共设计了96个barcode标签，序列如SEQ ID NO：183-278所示，可同时区分96个不同样本。
本发明的第三个目的是利用上述试剂盒，提供一种基于高通量靶向纳米孔测序检测血流感染病原的方法，该方法包括以下步骤：
S1、取待测样本并提取核酸；
S2、以提取的核酸为模板，利用所述试剂盒中的引物池进行多重PCR扩增；
S3、将多重PCR扩增产物与所述试剂盒中barcode标签进行PCR连接，并根据检测样本的数量选择不同的barcode标签；
S4、将连接barcode标签的PCR产物混合并进行末端修复、接头连接和纯化，构建测序文库并上机测序，对下机数据进行生信分析，比对病原数据库，分析检测结果。
本发明的有益效果是：
本发明能准确区分不同样本，最多可同时区分96个不同样本，本发明不仅能检测样本中是否存在血流感染病原，而且还能鉴定出样本中存在哪些种类的病原，本发明最多能同时鉴定30种病原。
本发明不仅能对临床样本进行检测从而诊断患者是否患有血流感染，而且也能用于非诊断目的的血流感染病原菌实验室筛查鉴定。
本发明通过ONT测序平台进行测序，比对病原数据库，快速准确的获得病原检测结果，能在6小时内出结果，通量高、成本低、操作简单。测序仪器小巧便携，可做到随时随地进行测序检测。相对普通PCR及qPCR检测靶标更多，通量更高，检测成本更低。
附图说明
图1是利用引物组合对30个物种进行PCR扩增的条带胶图，图中上排第9和下排最后为Marker。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1检测方法与试剂盒的构建
1：血流感染病原目标物种选择
血流感染目标物种选择主要通过收集整理大量与血流感染相关的国内外文献、中国细菌耐药监测网结果、国家真菌病监测网以及市场上血流感染相关病原目标物种，最终确定了可引起血流感染的常见病原集合，具体为以下30个物种：
表1 30种血流感染相关病原的分类命名
2：30个物种特异性引物设计及验证
引物设计：从NCBI数据库中下载30个病原微生物及人的所有质量较好的基因组序列，通过生信比对分析，每个物种选取种内保守以及种间特异的特异性序列，利用primer5.0进行引物设计，扩增子长度400～600bp，优先选择分值靠前的引物。每个物种设计5-10对引物，按照引物设计打分进行排序，以第一个物种的前三对引物作为初始引物池，不断投入其他物种的引物，投入引物与引物池中已有引物进行引物二聚体分析，若判断易生成引物二聚体的引物舍去，选择其他备用引物，最终引物组合需满足每个物种至少3对特异性引物，人源特异性引物1对作为内参引物。
实验验证：通过30个病原微生物的标准菌株、标准核酸或临床阳性样本，对引物组合中的所有引物进行扩增，对于无扩增条带或产生交叉反应的引物进行剔除，重新设计引物进行补充并进行实验验证。未扩增出目标条带物种需重新进行引物设计。通过大量反复的实验测试，最终得到表2中的引物组合，引物组合中每个物种有3对可用引物，使用3对中任意一对引物即可实现该病原物种的检测，但同时使用可提高物种鉴定的准确性。每个物种3对同时使用以及加入的内参引物，一共91对引物组成的引物池，通过实验测序证明互相之间无交叉反应，引物序列干扰竞争较小，整体检测的灵敏度及特异性好，图1是30个物种分别用引物组合进行PCR扩增的胶图条带，分别按顺序对应表1中的30个物种。
表2引物组合中的91对引物序列
3：barcode标签设计
为了准确识别barcode序列，需增加barcode序列长度，并满足以下原则(1)GC含量在35％到65％之间；(2)连续重复碱基小于等于3；(3)barcode之间的莱文斯坦距离距离为大于等于8。根据以上原则最终获得以下96个barcode序列，并且通过实验测序验证，barcode之间拆分效率高，完全满足多样本区分需求。
表3 96个barcode标签序列
4：公共序列设计与筛选
为利用barcode序列区分不同样本，需利用公共序列进行二轮扩增以连接barcode序列，公共序列设计需满足以下2个原则：(1)公共序列不与任何物种模板产生非特异性反应；(2)公共序列能与一轮的特异性扩增产物进行扩增反应，且扩增效率较高。按照该原则设计合成了多对公共序列，并同时测试比较了目前市场上illumina、华大、以及ONT官方建库测序试剂盒中的公共序列，最终发现自合成的公共序列J：5’-ACGGCATCACCACTACGACT-3’(SEQ ID NO：279)扩增效果较好，使用单端公共序列还能有效减少引物二聚体。
5：血流感染病原检测引物组合
一轮反应使用的多重特异性反应序列组合，每条序列从5’端到3’端均由a段序列、b段序列组成，其中a段序列为公共序列J(SEQ ID NO：279)，b段序列为91对特异性引物的正反向序列(SEQ ID NO：1～182)，一共组合得到182条序列，按照一定浓度进行混合后使用，各引物在扩增体系的终浓度在10nM～100nM。在此给出大肠埃希菌3对引物组合作为举例：
表4用于一轮多重PCR扩增的引物池(以大肠埃希菌为例)
二轮反应使用的barcode序列，每条序列从5’端到3’端均由a段序列、b段序列组成，其中a段序列为96条barcode序列(SEQ ID NO：183～278)，b段序列为公共序列J(SEQ IDNO：279)，一共组合得到96条序列，可进行96个反应，每个反应挑选其中一条使用，Barcode在PCR体系的终浓度在100～400nM。在此给出BC01-BC05的序列组合作为举例：
表5用于二轮标签连接的barcode序列(以BC01-BC05为例)
引物 序列5’-3’
BC01 GTGTGCTACAAGTACATCCAATAT ACGGCATCACCACTACGACT
BC02 GCCAATCCTCAGAAGTTGACTCGGACGGCATCACCACTACGACT
BC03 GAGTGCTCTTCCAAGCCTGAAGGCACGGCATCACCACTACGACT
BC04 ACAGATATCACCTCCAGCCAGGAAACGGCATCACCACTACGACT
BC05 ACCGTGAATATATTCCATTCTACGACGGCATCACCACTACGACT
6：试剂盒组装
本发明提供一种基于靶向纳米孔测序的血流感染病原检测试剂盒，包括多重PCR反应试剂、barcode连接PCR反应试剂和ONT文库构建试剂，试剂盒组分如下表所示：
7：检测血流感染病原的操作流程：
(1)样本前处理及核酸提取
分别取200μl待测血液样本，推荐使用QIAGEN的QIAamp UCP Pathogen Mini Kit(50214)，具体提取方法请参照相应说明书。
(2)一轮多重靶向特异性反应
将提取后的核酸及阳性质控、阴性质控按照下表反应体系进行多重PCR扩增：
本试剂盒一轮多重扩增体系：
试剂 体积
PCR Mix A 10μl
Primer Mix A 10μl
DNA模板 5μl
总计 25μl
扩增程序：
(3)二轮barcode连接PCR反应
取一轮反应产物按照下表进行barcode连接PCR反应，不同样本选取不同barcode标签：
PCR程序：
(4)混合与纯化
4.1取新的1.5ml EP管，将连接barcode的PCR产物等体积均匀混合。
4.2通过涡旋重悬AMPure XP磁珠。
4.3取200μl混合后PCR产物，中加入140μl AMPure XP磁珠，并通过轻弹EP管进行混合后，室温孵育5分钟。
4.4在磁力架上静置EP管，直到洗脱液清澈无色，然后移出上清液。
4.5将EP管放在磁力架上，用200μl新鲜制备的80％乙醇清洗磁珠，取出乙醇并丢弃。
4.6重复上一步。
4.7瞬时离心并将EP管放回磁力架上，移去所有残留的乙醇。干燥约30秒，但不要干燥到颗粒开裂的程度。
4.8从磁力架上取出EP管，将磁珠重悬于52μl EP中，在室温孵育2分钟。
4.9将EP管放在磁力架上，直到洗脱液透明无色。
4.10取全部上清液至新的1.5ml EB管中。
4.11取1μl纯化产物用Qubit dsDNA HS Assay Kit检测浓度。
(5)末端修复及纯化
5.1配置体系(以下部分试剂使用ONT公司的SQK-LSK110试剂盒建库)
试剂 体积
上步纯化DNA(1μg) 50μl
End Repair Mix 15μl
总计 65μl
5.2将PCR反应管置于PCR仪上；程序：30℃5min，65℃5min。(反应时间5min-15min，为缩短检测时间，5min即可满足反应需求，若为提高反应效果可适当延长反应时间)
5.3将PCR产物转移至新的1.5ml EP管，加入65μl AMPure XP磁珠，按照步骤(3)中方法进行磁珠纯化，38μl NFW洗脱得到纯化DNA。
(6)接头连接及纯化
6.1配置体系
组分 用量
上步纯化DNA 35μl
Ligation buffer 50μl
DNA Ligase 10μl
Adapter Mix 5μl
总计 100μl
6.2将PCR反应管置于PCR仪上；程序：24℃10min。(反应时间10min-30min，为缩短检测时间，10min即可满足反应需求，若为提高反应效果可适当延长反应时间)
6.3将PCR产物转移至新的1.5ml EP管，加入80μl AMPure XP磁珠，按照步骤(3)中方法进行磁珠纯化，将80％乙醇换成Short Fragment Buffer(SFB)进行清洗，20μl EB洗脱得到纯化DNA。
6.4取1μl纯化产物用Qubit dsDNA HS Assay Kit检测浓度。
(7)上机测序
7.1在室温下融化Sequencing Buffer II(SBII)、Loading Beads II(LBII)、Flush Tether(FLT)、Flush Buffer(FB)，涡旋振荡混匀、瞬时离心，冰上备用。
7.2将30μL FLT加到一管FLB中，涡旋振荡混匀，配制成引发混合液。
7.3打开芯片的清洗口盖子，按照如下操作除去气泡：
A.将1000μL的移液器调至200μL；
B.枪尖轻轻插入清洗口，垂直于芯片的平面保持住；
C.转动移液器转轮直至刻度显示为220～230μL，或看到小容量缓冲液进入移液器吸头。
7.4在芯片清洗口中加入800μL的引发混合液，加入过程中避免产生气泡，静置5min；
7.5静置过程中配置上机文库：
成分 体积
Sequencing Buffer II(SBII) 37.5μl
Loading Beads II(LBII) 25.5μl
DNA library(100ng) 12μl
总计 75μl
7.6在芯片清洗口再加入剩余的200μL引发混合液，加入过程中避免引入气泡。
7.7通过芯片进样口以逐滴方式将75μL上样混合液加到芯片中。
7.8关闭芯片进样口和芯片清洗口
7.9将芯片载入至GridION/MinION进行测序。
(8)生信分析
对下机数据进行生信分析，比对病原数据库，分析检测结果。
实施例2
使用上述方法对30株阳性标准菌株及8株非检测物种的阴性菌株进行检测，将38个检测样品分别与引物池反应，从96个barcode标签中任选38个与一轮PCR产物连接，然后混合，经常规处理后上机测序，结果如下：
编号 样本类型 浓度 Reads 结果
P1 大肠埃希菌 10^6copies/mL 38766 阳性
P2 肺炎克雷伯菌 10^6copies/mL 72917 阳性
P3 表皮葡萄球菌 10^6copies/mL 18176 阳性
P4 金黄色葡萄球菌 10^6copies/mL 12596 阳性
P5 人葡萄球菌 10^6copies/mL 40215 阳性
P6 屎肠球菌 10^6copies/mL 38849 阳性
P7 鲍曼不动杆菌 10^6copies/mL 15675 阳性
P8 铜绿假单胞菌 10^6copies/mL 44599 阳性
P9 粪肠球菌 10^6copies/mL 36975 阳性
P10 头状葡萄球菌 10^6copies/mL 34432 阳性
P11 溶血葡萄球菌 10^6copies/mL 17827 阳性
P12 嗜麦芽窄食单胞菌 10^6copies/mL 32427 阳性
P13 肺炎链球菌 10^6copies/mL 25884 阳性
P14 缓症链球菌 10^6copies/mL 34513 阳性
P15 产酸克雷伯菌 10^6copies/mL 32949 阳性
P16 奇异变形杆菌 10^6copies/mL 39962 阳性
P17 化脓性链球菌 10^6copies/mL 61245 阳性
P18 无乳链球菌 10^6copies/mL 16885 阳性
P19 单增李斯特菌 10^6copies/mL 23000 阳性
P20 白色念珠菌 10^6copies/mL 28049 阳性
P21 热带念珠菌 10^6copies/mL 30610 阳性
P22 光滑念珠菌 10^6copies/mL 38766 阳性
P23 近平滑念珠菌 10^6copies/mL 72917 阳性
P24 马尔尼菲篮状菌 10^6copies/mL 18176 阳性
P25 新型隐球菌 10^6copies/mL 38131 阳性
P26 克柔念珠菌 10^6copies/mL 41080 阳性
P27 单纯疱疹病毒Ⅰ型 10^6copies/mL 22221 阳性
P28 单纯疱疹病毒Ⅱ型 10^6copies/mL 35128 阳性
P29 人巨细胞病毒 10^6copies/mL 27201 阳性
P30 EB病毒 10^6copies/mL 38014 阳性
N1 人型支原体 10^5copies/mL 0 阴性
N2 解脲支原体 10^5copies/mL 0 阴性
N3 淋病奈瑟菌 10^5copies/mL 0 阴性
N4 生殖支原体 10^5copies/mL 0 阴性
N5 流感嗜血杆菌 10^5copies/mL 0 阴性
N6 产气克雷伯菌 10^5copies/mL 0 阴性
N7 卡他莫拉菌 10^5copies/mL 0 阴性
N8 弗劳地枸橼酸杆菌 10^5copies/mL 0 阴性
检测结果阳性符合率100％，阴性符合率100％。
实施例3
使用三个混合标准品ZymoBIOMICSTM Microbial Community Standard，将3个检测样品分别与引物池反应，从96个barcode标签中任选3个与一轮PCR产物连接，然后混合，经常规处理后上机测序，检测结果如下：
该标准品检测不同菌株能检出到30.2～250copies/mL浓度。
实施例4
使用临床qPCR检测阳性和阴性全血样本用上述方法进行检测，结果如下：
不同检测方法结果对比，本发明与qPCR结果一致性100％，说明本方法可对血流病原进行有效检出。
附：序列表说明
SEQ ID NO：1-180：检测30种血流感染病原的90对引物序列，包括正、反向引物。
SEQ ID NO：181-182：人源内参引物序列，包括正、反向引物。
SEQ ID NO：183-278：96个barcode标签序列。
SEQ ID NO：279：用于连接barcode标签的公共序列。
序列表若与说明书内容不一致，则以说明书为准。

Claims (3)

1.一种基于高通量靶向纳米孔测序检测血流感染病原的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物池和用于区分不同样本的barcode标签，所述引物池为与公共序列连接的用于检测血流感染病原的引物组合，所述引物组合的每条序列从5’端到3’端均由a段序列和b段序列组成，其中a段序列为SEQ ID NO：279所示的公共序列，b段序列为91对特异性引物的正反向序列SEQ ID NO：1-182，一共组合得到182条序列，其中，SEQ ID NO：1-180所示序列为分别针对30种血流感染病原的90对特异性引物，每种病原设有3对引物，所述30种血流感染病原是：
SEQ ID NO：181-182所示序列为针对人源内参的特异性引物；
所述barcode标签共有96个，每条序列从5’端到3’端均由barcode序列和SEQ ID NO：279所示的公共序列组成，所述barcode序列如SEQ ID NO：183-278所示，可同时区分96个不同样本。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应液和用于构建测序文库的末端修复液、接头连接酶和缓冲液。
3.一种基于高通量靶向纳米孔测序非诊断目的检测血流感染病原的方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、取待测样本并提取核酸；
S2、以提取的核酸为模板，利用权利要求1所述试剂盒中的引物池进行多重PCR扩增；
S3、将多重PCR扩增产物与权利要求1所述试剂盒中barcode标签进行PCR连接，并根据检测样本的数量选择不同的barcode标签；
S4、将连接barcode标签的PCR产物混合并进行末端修复、接头连接和纯化，构建测序文库并上机测序，对下机数据进行生信分析，比对病原数据库并分析检测结果。
CN202211377459.4A 2022-11-04 2022-11-04 一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用 Active CN115873992B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211377459.4A CN115873992B (zh) 2022-11-04 2022-11-04 一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211377459.4A CN115873992B (zh) 2022-11-04 2022-11-04 一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115873992A CN115873992A (zh) 2023-03-31
CN115873992B true CN115873992B (zh) 2023-09-26

Family

ID=85759459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211377459.4A Active CN115873992B (zh) 2022-11-04 2022-11-04 一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115873992B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117604079B (zh) * 2023-09-14 2024-07-19 北京金匙医学检验实验室有限公司 感染宏基因组靶向测序的多重扩增引物设计筛选方法
CN117363767B (zh) * 2023-12-07 2024-04-05 上海美吉生物医药科技有限公司 一种用于靶基因实时荧光pcr检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111269995A (zh) * 2018-12-04 2020-06-12 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法
CN111705118A (zh) * 2020-06-23 2020-09-25 宁夏医科大学总医院 一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒
CN112831604A (zh) * 2021-02-05 2021-05-25 美格医学检验所(广州)有限公司 基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法
CN114196743A (zh) * 2021-12-27 2022-03-18 武汉明德生物科技股份有限公司 一种病原微生物快速检测方法及其试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111269995A (zh) * 2018-12-04 2020-06-12 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法
CN111705118A (zh) * 2020-06-23 2020-09-25 宁夏医科大学总医院 一种基于靶基因高通量测序的血流感染检测试剂盒
CN112831604A (zh) * 2021-02-05 2021-05-25 美格医学检验所(广州)有限公司 基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法
CN114196743A (zh) * 2021-12-27 2022-03-18 武汉明德生物科技股份有限公司 一种病原微生物快速检测方法及其试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
利用高通量宏基因组测序技术检测血液病患者感染性病原体的横断面研究;杨理等;中华实验和临床感染病杂志(电子版)(第02期);第17-21页 *
张胜联等.现代医院感染管理培训教材.西安：第四军医大学出版社,2007,第26-27,32-33页. *
血流感染病原学分析及与相关炎性因子的应用价值研究;何家花等;现代检验医学杂志(第04期);第145-148页 *
高俊发.新编医院感染学.赤峰：内蒙古科学技术出版社,2008,第242页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115873992A (zh) 2023-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115873992B (zh) 一种用于检测血流感染病原的引物组合及其应用
CN112831604B (zh) 基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法
CN110551853B (zh) 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒
CN112501268B (zh) 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用
CN112852937B (zh) 一种呼吸道病原微生物检测引物组合、试剂盒及其应用
CN107955832B (zh) 一套同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病的引物组及方法
CN114075607B (zh) 一种基于sherlock检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用
CN108913768B (zh) 一种同时检测七个氨基糖胺类耐药基因的多重液相基因芯片引物、试剂盒及其分析方法
CN116064753A (zh) 高效率的测序文库的构建方法及引物组和试剂盒
CN112725410B (zh) 用于检测病原微生物的引物组
CN116287357A (zh) 一种基于靶向扩增子测序的呼吸道病原菌检测试剂盒
CN113278717A (zh) 一种靶向测序法检测血流感染的引物池、试剂盒及方法
CN111440886A (zh) 一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法
CN111411144B (zh) 一种用于血流感染病原诊断的血浆游离dna标志物
CN115992267B (zh) 一种高通量高精度检出多种病原菌的引物组、试剂盒及方法
CN116377118A (zh) 一种用于茄科三种病原菌多重pcr检测方法和应用
CN110923349B (zh) 小肠结肠炎耶尔森氏菌的种特异性检测分子标签3283、3316及其快速检测方法
CN115478114A (zh) 一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组及分枝杆菌和真菌感染的测序方法
CN111996274B (zh) 一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法
KR20220127761A (ko) 차세대 염기서열 분석방법을 이용하여 식중독균을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출방법
CN109762941B (zh) 一种检测致禽类死亡病原的液态芯片
CN116287479B (zh) 一种检测呼吸道病毒的引物组合及其应用
CN111073951A (zh) 一种甲基化基因免pcr扩增分析方法及其在基因检测领域的应用
CN116949156B (zh) 一种基于核酸变体的通用型检测人t细胞的分析方法
CN117512154A (zh) 引物组合物、基于ont测序检测生殖感染病原的试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant