CN117604079B - 感染宏基因组靶向测序的多重扩增引物设计筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于生物信息学技术领域，具体涉及一种基于生信的感染宏基因组测序中多重扩增引物的设计筛选方法，该方法有效解决现有技术中关于引物稳定性差、引物二聚体、非特异扩增、扩增效率和综合成本高等问题。

Description

感染宏基因组靶向测序的多重扩增引物设计筛选方法
技术领域
本申请属于生物信息学技术领域，具体涉及一种基于生信的感染宏基因组靶向测序的多重扩增引物设计与筛选方法。
技术背景
病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。近年来，造成人类感染的病原微生物日益复杂，种类增多，抗菌药物滥用致使细菌耐药，病原微生物已成为全球关注的焦点。据WHO统计，在中国，感染性疾病占所有疾病的50％以上。面对重症感染患者，能否快速确认感染病原体，成为后续对症治疗的关键。传统的病原微生物鉴定方法主要有涂片镜检、分离培养、生化反应和质谱等方法，但其存在周期长、过程复杂及灵敏度低等缺点，在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限，一些苛养菌及病毒对培养条件要求极其苛刻，甚至不能培养，而且对于未知或者罕见的病原微生物无法快速识别。据统计，约70％的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原体信息，不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。而基于宏基因组的新一代测序技术(metagenomics Next-Generation Sequencing,mNGS)为解决这一问题提供了一个可能的突破方向。
与传统基于分离培养的病原体检测技术相比，宏基因组学第二代测序(mNGS)则无需对病原体进行分离培养，也不依赖已知核酸序列，可无偏倚、全覆盖的检测各类微生物(如：病毒、细菌、真菌、寄生虫等)，且无需特异性扩增，大大节省了检测时间，提高了诊断效率，在对未知物种及难以培养的病原体鉴定方面更是具有无可比拟的优势。2014年新英格兰医学杂志报道了一个通过宏基因组辅助检测治愈了一位原因不明、反复发热、具有癫痫及脑积水症状的14岁男孩的案例，这是历史上首个宏基因组临床应用成功的案例。文章报道这个常规治疗及病原筛查都没有确诊原因，随后对脑脊液样本mNGS筛查，结合生物信息学分析结果发现一种可疑的致病菌Leptospira infection，随后针对性地使用万古霉素和头孢吡肟治疗后出院。该团队确认这是一种尚未报道过的病原微生物。由此，临床宏基因组正式应用于微生物诊断拉开了帷幕。
然而，mNGS检测为非靶向检测，只要是样本中的核酸就可以检测出来，因此如果提取出来的核酸存在大量宿主会导致微量病原核酸淹没在海量的宿主背景之下，导致测不到引起假阴性结果，因此对高宿主含量样本进行高效的宿主剔除是mNGS应考虑的重要环节，此外，mNGS检测成本较高，外送检测周转时间较长。
病原靶向测序(targeted Next-Generation Sequencing,tNGS)通过超多重PCR扩增与高通量测序两种技术的结合，能够对待测样本中几十种至几百种已知病原微生物及其毒力和/或耐药基因进行检测。对低浓度的病原微生物的检测，特别是其毒力和/或耐药基因检测，与病原宏基因组测序(mNGS)相比，tNGS具有病原谱范围明确、测序成本低等优势。因此，tNGS在临床检验领域正受到越来越多的关注。鉴于此，提出本申请。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请提出了一种感染宏基因组领域tNGS流程中超多重PCR引物设计及筛选方法，解决了现有技术中关于引物稳定性差、引物二聚体、非特异扩增、扩增效率和综合成本高等方面问题。
具体的，本申请所采用的技术方案如下：
本申请首先提供一种适用于感染宏基因组靶向测序的超多重PCR引物的简易设计方法，包括如下步骤：
1)超多重PCR引物的初步设计；
2)基于生信分析的引物复筛；
3)湿实验筛选高扩增效率引物；
优选的，还包括如下步骤：
4)基于电泳图像灰度评价确定最终引物组合。
进一步的，所述1)超多重PCR引物的初步设计为针对所有靶基因采用引物设计软件或引物设计网站设计初步引物；
优选的，所述引物的设计克服了感染宏基因组中人源核酸非特异扩增问题，具体设置或条件如下：
所述引物扩增子长度为100-600bp，优选150-300bp；
所述引物序列GC含量为45-65％，优选57-60％；
所述引物长度为17-25bp，优选18-21bp；
两个引物间不超过5个碱基严格互补，其ΔG值>-9000cal/mol；
所述引物没有连续超过5个碱基的多聚序列。
进一步的，所述2)基于生信分析的引物复筛中，所述复筛包括：特异性、二聚体和覆盖度的复筛；进一步优选的，所述复筛具体包括如下步骤：使用PrimerSuite对引物序列的二聚体和特异性进行检验，得到高特异性和低二聚体的复筛引物，同时使用Primer-BLAST进行覆盖度检验。
进一步的，所述Primer-BLAST的参数设置如下：Organism选项选择Bacteria，Fungi，Virus；Max target amplicon size优选设为1000；Max target to show优选设置为1,000,000；Max primer pair to screen优选设置为2000
进一步的，所述3)湿实验筛选高扩增效率引物包括如下步骤：
(1)核酸样本制备：包括病原物培养，DNA和RNA核酸提取，cDNA制备，核酸浓度测定和参考品拷贝数配置；
(2)根据PCR扩增试剂盒要求，进行单物种PCR扩增体系反应；
(3)对PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，基于肉眼评价引物扩增效率并筛选。
进一步的，所述步骤4)中，所述评价为基于电泳结果中目标扩增产物灰度值/基准灰度值进行引物评价。
进一步的，所述步骤4)中，所述电泳条件为:针对步骤3的PCR扩增结果，采用1.25-1.75％TAE的琼脂糖凝胶电泳体系进行电泳，通过100-110V电压条件，电泳40-45min。
进一步的，所述步骤4)中，所述最终引物的序列如SEQ ID NO.1-40所示。
进一步的，所述步骤4)中，所述图像灰度的获得使用Image J软件，包括如下步骤：电泳结果图片校正后，使用Image J软件获得要分析的电泳条带影像强度，区分图形中有条带区域和没有条带区域，使用魔术棒工具点选要分析区域，结果对话视窗出现分析数据，通过依序点选获得每个条带的分析数据值，包括灰度值；以电泳点样Marker为基准对照，对每一个条带进行亮度矫正，对所测试引物组按照定量灰度值进行排名，保留单物种排名靠前引物组对进行混池。
本申请还提供上述任一所述简易设计方法在感染宏基因组靶向测序中的应用。
本申请还提供一种感染宏基因组靶向建库的方法，包括利用上述任一所述简易设计方法进行引物设计，基于设计的引物进行感染样本的靶向扩增和建库。
本申请还提供一种感染宏基因组靶向测序的方法，包含上述建库方法，并进一步包括基于NGS进行建库的步骤。
本申请有益技术效果：
本申请有效提高了感染宏基因组测序中超多重扩增引物的设计和筛选性能，通过该方法能够解决现有技术中关于引物稳定性差、引物二聚体、非特异扩增、扩增效率和综合成本高等问题，进而筛选到有效的引物组合，具有更高的引物有效性和特异性，以及更佳的临床扩增性能。
本申请方法所用仪器简单，只需普通PCR扩增仪和电泳仪即可完成引物的筛选确认，相比qPCR或者二代测序方法，成本更低，操作简便，筛选效果更好。此外，本申请方法从引物设计上克服了感染宏基因组中人源核酸非特异扩增所带来的干扰，有效提高病原菌检出的占比。
附图说明
图1.不同电压下的扩增条带检测结果。分别使用110V和130V电压凝胶电泳，结果表明110V时，曝光结果条带更加清晰，条带分离更加均匀，为后续取样定量提供便利。
图2.不同电泳时间下的扩增条带检测结果。分别使用45min和60min在110V电压下进行凝胶电泳分析，可见在45min时条带清晰可辨，60min时条带有变形，不利于对照和处理样本的定量。
图3.不同电泳缓冲液下的扩增条带检测结果。使用45min在110V电压下进行凝胶电泳分析，可见在TAE缓冲液中的条带清晰可辨，而在TBE的缓冲液体系中条带有变形与不清晰，不利于后续的样本分析处理和定量。
图4.不同浓度TAE的扩增条带检测结果。其中，M代表DNA marker，1-6分别代表：1为大肠杆菌扩增条带，2为金黄色葡萄球菌扩增条带，3为白色念珠菌扩增条带，4为大肠杆菌扩增阴性对照，5金黄色葡萄球菌扩增阴性对照，6为白色念珠菌扩增阴性对照。
图5.PCR产物电泳胶图结果。
图6.本方法设计和筛选到的引物组信息。
图7.未经过本方法筛选的引物组胶图。其中，Aba代表鲍曼不动杆菌；Ecc代表阴沟肠杆菌；Hin代表流感嗜血杆菌；Sau代表金黄色葡萄球菌；Afl代表黄曲霉；Cal代表白色念珠菌。序号1代表引物组1；序号2代表引物组2；左边数字为DNA分子marker大小，单位为bp。
图8.经过本方法筛选的引物组胶图。其中，Aba代表鲍曼不动杆菌；Ecc代表阴沟肠杆菌；Hin代表流感嗜血杆菌；Sau代表金黄色葡萄球菌；Afl代表黄曲霉；Cal代表白色念珠菌。序号1代表引物组1；序号2代表引物组2；左边数字为DNA分子marker大小，单位为bp。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
部分术语定义
除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本申请中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本申请描述的实施方案能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。
下面结合具体实施例来阐述本申请。
实施例1.本申请基础方法体系的建立
1、设计适用于mNGS的多重PCR引物
在多重PCR扩增体系中需要保证所用引物的效率高、覆盖度高、特异性高。同时在引物设计时，需要考虑过多的PCR引物容易形成引物二聚体，因此避免形成引物二聚体也是多重PCR引物设计需要考虑的重要因素。为此，本申请使用如下引物设计方法对多重PCR引物进行设计和筛选，所用方法包括如下步骤：
(1)为了确保多重PCR体系中Tm值相接近并避免人源非特异扩增，设计时的引物序列GC含量为45-65％，优选57，58，59，60。
(2)为了减少成本和二聚体出现的可能性，同时为了提高特异性，引物长度规定为17-25bp，优选18，19，20，21。
(3)基于二代测序的扩增子长度为100-600bp，PCR产物可以做打断或者不打断处理后建库，优选150，200，300。
(4)单个引物二级结构可以不考虑无所谓，但是两个引物间不超过5个碱基严格互补，其ΔG值>-9000cal/mol；优选不超过4，5个碱基严格互补。
(5)单个引物最好没有连续超过5个碱基的多聚序列(如(A/T/C/G)n<＝5)；优选4，5个碱基的多聚序列。
2、生物信息学筛选高特异性和二聚体形成能力弱或者无二聚体形成的引物
针对设计出来的引物，通过使用PrimerSuite(www.primer-dimer.com/)对引物二聚体和特异性进行检验，同时通过Primer-BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)对筛选过的引物进行覆盖度的检验。
所用方法包括如下步骤：
(1)登录PrimerSuite在线工具进行引物二聚体筛选，筛选模式选择“MultiplexAnalysis”。最终筛选依据网站导出的“PrimerDimer Report”进行确定。优选不超过5个互补配对的引物组。
(2)登录Primer-BLAST在线工具进行引物覆盖度分析，筛选高覆盖度的引物。具体参数设置如下：Organism选项选择Bacteria，Fungi，Virus；Max target amplicon size优选设为1000；Max target to show优选设置为1,000,000；Max primer pair to screen优选设置为2000。其他均为默认参数设置。
(3)将筛选到的多重PCR引物送往引物合成供应商进行合成。优选上海生工(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行引物合成。
3、湿实验筛选高扩增效率的多重PCR引物
通过生物信息学手段和软件设计的多重PCR引物，虽然在理论算法上可以保证非常高的覆盖度和特异性(>95％),同时也保证其在PCR体系中的高扩增效率，但是实际的湿实验过程由于不同扩增试剂、PCR仪、实验操作人员、操作过程等多因素影响，最终在PCR扩增反应中的效率还是会受到影响。为了保证多重PCR引物的高扩增效率，需要通过以下湿实验操作进行高扩增效率引物的湿实验筛选。
所用方法包括如下步骤：
(1)核酸样本准备。涉及到病原物培养、DNA和RNA核酸提取、cDNA制备、核酸浓度测定、参考品等拷贝数配置等步骤。
(2)根据PCR扩增试剂盒要求，进行单物种PCR扩增体系反应。
(3)对PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，依据结果判断PCR引物是否可用于后续的多重PCR引物组合中。导出结果图片后保存。
4、通过图像学分析湿实验数据，最终确定合格引物组合
通过使用Image J软件对每个扩增条带进行相对定量分析，最终明确每一对引物的相对扩增效率。为最终引物选定提供依据。
所用方法包括如下步骤：
1)导入保存好的图片。然后做图片校正。参数为：选择Analyze底下的Calibrate选项，再选择校正的模式，使用Uncalibrated OD，再按ok。
2)在要分析的第一条(First lane)加上一个长型框(工具列第一个选项)，再按下Analyze/Gels/Select First Lane快速键(Ctr+1)，此时框架中会出现一个号码1，之后可以移动框架到第二个Lane再选择Analyze/Gels/Select Second Lane快速键(Ctr+2)，当然可以一直加下去，最后按Analyze/Gels/Plot Lanes快速键(Ctr+3)。
3)分析以后会出现图型表示你刚选择的框内的影像强度，此时可以看到有几个比较高的区段，就是我们想定量的条带，使用直线工具(工具列第五个选项)先将图形中高点为有条带的区域和没有条带的区域分开再，使用魔术棒工具(工具列第八个选项)点选要分析的区域。
4)当点选分析时，在Result的对话视窗会出现分析的数据，依序点选就会出现每个条带的值。
5)以点样Marker倒数第二个条带为校准对照，对每一个条带进行亮度矫正。从而对所测试引物组按照定量灰度值进行排名，选择单物种排名靠前(1-5对)的引物组对进行混池。
5、二代测序验证多重PCR引物组合
对通过1-4步获得的引物进行合成和混合，确认设计和筛选到的引物组合能够有效扩增参考品病原菌的核酸。
所用方法包括如下步骤：
(1)将所筛选到的引物按照等摩尔比进行混合，记为多重PCR扩增引物组。
(2)根据PCR扩增试剂盒要求，进行多物种多重PCR扩增体系反应。
(3)纯化PCR产物后进行MGI高通量测序。
(4)运用生物信息学方法对所测得数据进行分析，确定多重PCR引物扩增效率和特异性等参数。
实施例2、本申请电泳体系的优化过程
为保证高敏感的引物评价，本实施例对电泳体系进行了优化评价，以探究适于本申请方法学的最适灰度体系。
具体的，本实施例研究了电泳灰度评价过程中相应的凝胶浓度、电泳液、电压和时间等对评价灵敏度的影响。操作上，分别配制1.0x、1.5x、2.0x不同浓度的琼脂糖凝胶，以及分别在不同电泳液1xTAE、1xTBE中，在不同电压(110V和130V)和电泳时间下(45min和60min)的检测条带情况，通过目标条带的清晰度来评价该体系。
具体参见图1-4。图1中不同电压下(110V和130V)的检测结果可知，在110V电压下，曝光结果条带更加清晰，条带分离更加均匀，这为后续取样定量提供便利。图2中不同电泳时间下的检测结果，使用45min和60min在110V电压下进行凝胶电泳分析，在45min时条带清晰可辨，60min时条带存在变形，不利于对照和处理样本的定量。图3中不同电泳缓冲液下的检测结果，使用45min在110V电压下进行凝胶电泳分析，在TAE缓冲液中的条带清晰可辨，而在TBE的缓冲液体系中条带有变形与不清晰，不利于后续的样本分析处理和定量。图4中不同浓度TAE的检测结果，在1.5％TAE条件下效果最好。
通过上述试验，最终确定了最佳琼脂糖电泳检测体系参数为：100-110V和40-45min可以获得最佳的引物筛选结果，同时，在1.25-1.75％的TAE电泳体系为最佳的电泳检测参数。
实施例3、基于本申请引物设计和样本检测
本实施例基于确定的方法体系进行全流程检测，具体方法步骤如下：
S1、引物准备：
(1)按照实施例1的方法，同时结合实施例2的电泳体系，设计和筛选超多重引物组合，引物由北京擎科生物科技有限公司(Tsingke Biotechnology Co.,Ltd.)进行合成；
(2)按照引物序号放置引物，全速离心2-5min，使液体全部离至管底；
(3)放置4℃或-20℃保存备用。
S2、核酸样本准备：
1.纯菌样本DNA提取流程
1.1细菌培养：
(1)使用接种环挑取单菌落，接种于1mL无酶水中，振荡混匀，取100uL混合菌液到900uL无酶水中，以此类推，将菌液梯度稀释到10-5，取浓度10-5的菌液50uL，均匀涂布于平板上，置于培养箱培养18-48h；
(2)挑取平板上单菌落，接种于10mL液体培养基，置于恒温摇床，过夜培养18～24h，待溶液浑浊拿出；
1.2细菌DNA提取：该过程使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(#DP302-02)进行细菌基因组提取。
(1)取1mL菌液至1.5mL离心管中，使用高速离心机(Thermo，42542137)8000-8500rpm，离心2-3min，使菌体全部富集至管底；
(2)弃去上清液，加入1mL无菌生理盐水(0.9％)，吹打混匀，清洗菌体，8000-8500rpm，离心2-3min，使菌体全部富集至管底；
(3)弃去上清液，加入0.8mL无酶水，吹打混匀；
(4)将0.8mL液体全部转移至Lysing Matrix E破碎管中；
(5)在MP样本快速制备系统(Mp fastprep-24 5G)设置破碎参数：6m/sec，40sec，运行一次；
(6)高速离心机全速离心5-10min，吸取500μL上清转入新的2.0mL EP管中，进入核酸提取环节。
(7)向破壁完成上清中加入500μL的缓冲液B(裂解液buffer)和25μL的蛋白酶K(W9629)，混匀后置于恒温震荡金属浴(MSC-100)中，56℃1000rpm孵育10min；
(8)向孵育完成的离心管中，加入500μL的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5min；
(9)将静置完成的样本分两次转入准备好的吸附柱中(吸附柱置于收集管中)，6200g(8000rpm)离心30sec，弃废液；
(10)向吸附柱中加入500μL的缓冲液C(使用前确定已经添加无水乙醇)，6200g(8000rpm)离心30sec，弃废液；
(11)向吸附柱中加入600μL的漂洗液(使用前确定已经添加无水乙醇)，6200g(8000rpm)离心30sec，弃废液，重复此步骤一次；
(12)12000rpm空离2min，弃废液；
(13)将吸附柱开盖转入一新的1.5mL离心管中，室温放置2min至乙醇完全挥发；
(14)向吸附膜中间位置悬空滴加50μL的Nuclease-Free Water，室温静置2min；
(15)12000rpm离心2min，保留1.5mL离心管中的洗脱液，弃吸附柱；
(16)取1uL洗脱产物进行Qubit定量；
2.临床样本病毒核酸提取流程：该过程使用ZYMO Quick-DNA/RNATMViral KitViral DNA&RNA from any biological sample试剂盒(D7020)进行病毒基因组提取。
(1)将800uL Viral DNA/RNA Buffer(检查是否加入β-巯基乙醇)添加到400uL样本中(2：1)并混合均匀，混匀后室温静置1min；
(2)将混合物转移到吸附柱Zymo-SpinTMIIC-XLR Column中(放在收集管中)，14000g，离心2min，将吸附柱转移到新的收集管中；
(3)向吸附柱中加入500uL Viral Wash Buffer(检查是否加入乙醇)，12000g，离心30sec，弃废液，重复此步骤；
(4)在吸附柱中加入500uL无水乙醇(95％-100％)，12000g，离心1min，以确保完全去除洗脱液。换新的收集管，空甩12000g，离心1min，小心地将柱子转移到新的无核酸酶的1.5mL离心管中；
(5)向吸附膜中间位置悬空滴加50uL的DNase/RNase-Free Water(AmbionTMNuclease Free water Not DEPC Treated，invitrogen)，室温静置2min后，14000g，离心30sec，保留1.5mL离心管中的洗脱液，弃吸附柱；
(6)取1uL洗脱产物进行Qubit定量；
S3、Qubit浓度测定：使用诺维赞EQ121-02#1×dsDNA HS Assay Kit(EQ121-01)进行Qubit浓度测定。
(1)使用前，将试剂盒中各组分平衡至室温；
(2)配制检测标准品：取190μL试剂盒中Equalbit 1×dsDNA HS WorkingSolution至标准品PCR管中，再分别加入10μL Equalbit 1×dsDNA HS Standard#1和Standard#2至相应的标准品PCR管中，轻轻涡旋振荡2-3sec，尽量避免产生气泡，此步骤中请确保移液器加量准确；
(3)配制检测样本：取199μL Equalbit 1×dsDNA HS Working Solution至样本PCR管中，分别加入1μL待测dsDNA样本，使得每个检测样本PCR管中终体积为200μL，轻轻涡旋振荡2-3sec，尽量避免产生气泡，此步骤中请确保移液器加量准确；
(4)将所有检测PCR管置于室温环境下避光孵育2min；
(5)按照Qubit 4.0荧光定量仪(Q33238，Thermo)的操作说明，选择dsDNA高敏检测程序测定浓度；
(6)记录Qubit浓度。
S4、核酸标准品准备(模版准备)
本实验共准备10种核酸，包括4种细菌，2种真菌，1种RNA病毒，2种DNA病毒，1种耐药基因；分别将细菌、病毒、耐药基因核酸稀释到≈1ng/uL，真菌稀释到≈2ng/uL用作后续PCR扩增实验，本实验所用核酸及浓度见下表：
S5、PCR扩增：
(1)按照下列体系将各组分加入八连管中进行PCR扩增：
Reagent Volume(μL)
酶预混液 12.5
Primer F 1.0
Primer R 1.0
模板 10.0
Nuclease-Free Water 0.5
Total 25.0
(2)在PCR仪上设置如下程序进行PCR扩增：
S6、PCR产物Qubit浓度测定：
(1)使用前，将试剂盒中各组分平衡至室温。
(2)配制检测标准品：取190μL试剂盒中Equalbit 1×dsDNA HS WorkingSolution至标准品PCR管中，再分别加入10μL Equalbit 1×dsDNA HS Standard#1和Standard#2至相应的标准品PCR管中，轻轻涡旋振荡2-3sec，尽量避免产生气泡。此步骤中请确保移液器加量准确。
(3)配制检测样本：取199μL Equalbit 1×dsDNA HS Working Solution至样本PCR管中，分别加入1μL待测dsDNA样本，使得每个检测样本PCR管中终体积为200μL，轻轻涡旋振荡2-3sec，尽量避免产生气泡。此步骤中请确保移液器加量准确。
(4)将所有检测PCR管置于室温环境下避光孵育2min。
(5)按照Qubit 4.0荧光定量仪(Q33238，Thermo)的操作说明，选择dsDNA高敏检测程序测定浓度。
(6)记录Qubit浓度，本实验各核酸PCR产物浓度见下表：
S7、琼脂糖凝胶电泳和基于灰度的引物筛选
基于实施例2确立的体系进行电泳和灰度评价，具体步骤如下：
1.电泳液的配制：
1xTAE电泳液的配制：准确量取20mL 50xTAE缓冲液(Solarbio，NO.T1060)，加ddH2O至1000mL，上下混匀，保存备用；
1xTBE电泳液的配制：准确量取20mL 50xTBE缓冲液(Solarbio，NO.T1050)，加ddH2O至1000mL，上下混匀，保存备用；
2.琼脂糖凝胶配制：
(1)用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；
(2)选用不同凝胶缓冲液(1xTAE&1xTBE)配制不同浓度的琼脂糖凝胶(1.0x、1.5x、2.0x)。以1.5x凝胶为例：准确称量琼脂糖干粉1.5g，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液100mL；
(3)放入到微波炉内加热熔化，每30sec拿出轻轻摇晃混匀。冷却片刻，加入10uLGelRed核酸凝胶染料(10000x水溶液，擎科，TSJ002#TS)，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；
(4)凝胶完全凝结后，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
(5)向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去。
3.电泳
(1)取PCR产物10uL，加入2uL 6×Loading buffer(TSJ010，擎科)，混匀后，用移液枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
(2)接通琼脂糖水平电泳仪电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，110V电压，电泳40-45min即可；
(3)根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；
(4)电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪(WD-9413B)上观察电泳带及其位置，拍照并与核酸分子量标准Marker(TSJ100#100bp DNA Ladder)比较被扩增产物的大小，拍照并记录，本实验胶图结果如图5所示。通过电泳结果可以直观看到四类扩增结果：(1)是否有目标扩增条带；(2)是否有引物二聚体；(3)是否有非特异扩增；(4)是否有无扩增等现象。优选目标条带扩增清晰，条带位置准确、无明显非特异扩增或者引物二聚体的引物对。
在初步判定引物是否可用的基础上，对有靶标基因扩增的引物对的扩增产物进行灰度值计算。下表所示为不同引物对目标扩增产物灰度值与基准灰度值的统计结果。当目标/基准值越大时，说明此引物对的扩增效率越高。
通过上表结果，本申请最终筛选到了一系列具体的引物序列，如SEQ ID NO.1-40所示，具体可参加附图6。
具体引物序列如下表：
另外，针对上述制备的样本，本申请还比较了未采用本申请方法所筛选的引物组去进行感染宏基因组的多重靶向扩增。两者比较结果如图7和图8所示：未采用本申请方法的图7扩增效率低，而且部分物种在体系下无法扩增；而本申请方法引物的扩增效率显著优于图7，同时能够实现多物种的同时有效扩增。
S8基于筛选引物的扩增、文库构建、测序和生信分析完成整个实验。
(1)将所筛选到的引物按照等摩尔比进行混合，记为多重PCR扩增引物组；
(2)根据PCR扩增试剂盒要求，进行多物种多重PCR扩增体系反应；
(3)纯化PCR产物后进行MGI高通量测序；
(4)运用生物信息学方法对所测得数据进行分析，确定多重PCR引物扩增效率和特异性等参数。
结果表明，通过该方法设计和筛选到的引物组合均能特异性的扩增到目标物种序列，有效特异性扩增占比可达94.52-98.76％。基于该方法的引物体系非常适用于感染性病原的鉴定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种适用于感染宏基因组靶向测序的超多重PCR引物的简易设计方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）超多重PCR引物的初步设计；
2）基于生信分析的引物复筛；
3）湿实验筛选高扩增效率引物；
4）基于电泳图像灰度评价确定最终引物组合；
所述步骤4）中，所述评价为基于电泳结果中目标扩增产物灰度值/基准灰度值进行引物评价；所述电泳的条件为:针对步骤3）筛选过程中的PCR扩增结果，采用1.25-1.75%TAE的琼脂糖凝胶电泳体系进行电泳，通过100-110V电压条件，电泳40-45min；所述最终引物组合的序列如SEQ ID NO.1-40所示；
所述步骤1）中，所述超多重PCR引物的初步设计为针对所有靶基因采用引物设计软件或引物设计网站设计初步引物；所述引物的设计克服感染宏基因组中人源核酸非特异扩增问题，具体的，所述设计为：引物扩增子长度为150-300bp；引物序列GC含量为57-60%；引物长度为18-21bp；彼此引物间不超过5个碱基严格互补，ΔG值>-9000 cal/mol；引物序列中没有连续超过5个碱基的多聚序列。
2.根据权利要求1所述的简易设计方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述复筛包括：特异性、二聚体和覆盖度的复筛；
所述复筛具体包括：使用PrimerSuite对引物序列的二聚体和特异性进行检验，得到高特异性和低二聚体的复筛引物；使用Primer-BLAST进行覆盖度检验。
3.根据权利要求1所述的简易设计方法，其特征在于，所述步骤3）具体包括如下步骤：
a、核酸样本制备：包括病原物培养，DNA和RNA核酸提取，cDNA制备，核酸浓度测定和参考品拷贝数配置；
b、根据PCR扩增试剂盒要求，进行单物种PCR扩增体系反应；
c、对PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，肉眼评价引物扩增效率并筛选。
4.根据权利要求1所述的简易设计方法，其特征在于，所述步骤4）中，所述图像灰度的获得使用Image J软件，具体包括如下步骤：电泳结果图片校正后，使用Image J获得要分析的电泳条带影像强度，区分图形中有条带区域和没有条带区域，点选要分析区域，结果对话视窗出现分析数据，通过依序点选获得每个条带分析数据值，包括灰度值；以电泳点样Marker为基准对照，对每一条带进行亮度矫正，对所测试引物组按照定量灰度值进行排名，保留单物种排名靠前引物组进行混池。
5.权利要求1-4任一所述的简易设计方法在感染宏基因组靶向测序中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
6.一种感染宏基因组的靶向测序方法，其特征在于，包含权利要求1-4任一所述的简易设计方法，并进一步包括基于设计的引物进行感染样本的靶向扩增和建库，和基于NGS进行建库的步骤；所述靶向测序方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。
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