CN105018647A - 一种基于数字pcr精准定量分型检测hpv16/18的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒及其检测方法；试剂盒包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；方法包括如下步骤：1）受检样品处理；2）质控品的处理；3）配制数字PCR反应混合液；4）生成微反应液滴，并进行数字PCR反应扩增；5）读取荧光信号，分析HPV型别并计算拷贝数；本发明不依赖于外来标准物及标准曲线，操作简便，直接对HPV精准绝对定量同时分型；且灵敏度高，能减少背景DNA和基质干扰，定量极少量HPV，检出限低至1个拷贝。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断生物学技术领域，具体涉及一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒及其检测方法。
背景技术
人乳头瘤病毒（human papillomavirus HPV）在人类感染中非常普遍，能侵犯人类上皮细胞，引起皮肤和黏膜组织良性及恶性肿瘤。越来越多的证据表明，人类感染HPV的后果与感染的HPV的分型密切相关，不同亚型具有特定的感染部位和病变，其中40多种亚型与人类生殖道疾病有关。根据其危险度可分为高危型和低危型两类。低危型HPV如HPV-6、11、40、42、43、44、54、61、67等主要引起生殖道、肛周皮肤和阴道外生殖性湿疣类、扁平湿疣类病变，引起恶性病变的概率较小；高危型HPV如HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等主要导致高度鳞状上皮内瘤变和宫颈癌的发生。其中，HPV16/18的感染率和致癌率都明显高于其他高危型别，在我国不同区域的宫颈癌及宫颈高度病变都是以感染HPV16/18为主，因此确定被感染的HPV型别对诊断和治疗由其引发的疾病就显得非常重要。
HPV难以用细胞培养方式进行培养，目前虽然用血清学技术可以检测HPV的特异性抗体，对宫颈癌患者的诊断具有一定的实用价值，但该方法的特异性和灵敏度均不高，且血清学实验并不能区分近期和远期感染；采用放射免疫技术检测抗体可以提高灵敏度和特异性，但操作繁琐，不适用于大样本的常规检测。另外，电镜检查法虽然准确率很高，但费时，需要特殊仪器设备，且阳性检出率低。现有宫颈癌的标准检测方法是宫颈癌脱落细胞学和组织活检，但细胞学检测不能对HPV感染的危险度进行分级。HPV的核酸检测不仅可以直接检出HPV DNA的存在，而且可以对病原体的危险度进行分级；因此诊断HPV感染的主要实验技术是利用分子生物学方法检测HPV的DNA。
目前，HPV核酸检测主要包括核酸杂交方法、基因芯片技术、荧光PCR技术等。其中核酸杂交包括斑点杂交、Southern印迹杂交、原味杂交、杂交捕获方法和分子导流杂交等方法，但是这些方法由于杂交步骤较为繁琐，在大样本研究中耗时较长，易导致交叉杂交反应，存在着一定的缺陷。基因芯片由于其成本较高，制作工艺复杂，而且信号检测需要专门的仪器设备，限制了其在临床上的应用。目前认为实时荧光定量PCR技术是检测HPV DNA以及分型的最好方法，该技术目前被公认为第二代定量PCR技术。但其定量需要参考标品、标准曲线和内标校正，对有限的标本材料以及低拷贝数HPV的准确定量仍存在一定的应用限制。
数字PCR技术是近年兴起的第三代PCR绝对定量技术，采用分析化学领域的微流控或微滴化方法，将含有核酸分子的反应体系分成数万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检测核酸靶标分子，或者只含有一个至数个待检测核酸靶标分子。经过PCR扩增后，对每个微滴的荧光信号进行逐个分析，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布计算出样品的原始浓度。与实时荧光定量PCR技术相比，数字PCR不依赖于扩增曲线的阈值（CT）进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。在现阶段的低丰度因子检测中，实时荧光定量PCR技术都因受到背景DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精准定量的要求，而数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，从而提高检测的灵敏度和精确性。然而，目前并没有基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒及其检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒，其中包括HPV16/18通用引物和各自特异的检测探针。
本发明的另一目的是提供一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的检测方法，利用上述试剂盒中两条不同的探针对HPV DNA模板进行检测，根据荧光类型和荧光微滴数对HPV16/18进行分型和绝对定量检测。
为了达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；
所述DNA提取液包括50 mM pH 8.3的Tris-HCl、0.5 M NaCl、5 mM EDTA、质量浓度为1.5%的CTAB和2 mM的DTT；
所述数字PCR反应缓冲液A包括HPV16型的引物及探针和HPV18型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B包括内标的引物及探针；所述HPV16型、HPV18型和内标的引物及探针如下所示：
HPV16型和HPV18型通用上游引物：
AGATGKCTYTKTGGCKGCCTAGT；
HPV16型和HPV18型通用下游引物：
ACATAWTCATCSGTRYTTACAAC；
HPV16型探针：CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCA；
HPV18型探针：ATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCT；
内标上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG；
内标下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG；
内标探针：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC；
所述HPV16型探针5’端荧光报告基因为FAM，HPV18型探针5’端荧光报告基团为VIC，内标探针5’端荧光报告基团为VIC，所有探针3’端淬灭基团均为BHQ；
所述HPV16病毒基因阳性质控为100 copies/μL的HPV16的标准质粒液；所述HPV18病毒基因阳性质控为100 copies/μL的HPV18的标准质粒液；
所述阴性质控为灭菌生理盐水；
所述内标溶液为100 copies/μL的β-globin的标准质粒液。
一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的检测方法，采用上述基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
（1）受检样品处理：将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100℃恒温处理10分钟，再于12,000 rpm/min离心5分钟，取上清液，获得PCR扩增DNA模板；
（2）质控品的处理：分别取所述试剂盒中的HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控和阴性质控，按照与步骤（1）相同的方法处理，得到相应的DNA模板；
（3）配制数字PCR反应混合液：向步骤（1）和步骤（2）处理后得到的DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别由数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制；
（4）将步骤（3）制备的数字PCR混合液制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10,000~20,000个；然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；其中，数字PCR扩增反应条件为：95℃变性5分钟；95℃变性10秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃变性10分钟，4℃停止反应；
（5）读取荧光信号：步骤（4）PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，分别在FAM和VIC通道中进行HPV16和HPV18分型检测，通过仪器配套Quanta soft软件进行定量分析，计算出HPV16型和HPV18的拷贝数。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明基于数字PCR平台，对HPV进行绝对定量检测，不依赖于扩增曲线的阈值（CT）进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现HPV的绝对精准定量分析。
2、本发明在HPV含量极低的组织样品检测中，对样品溶液采用微滴化处理，数字PCR检测系统通过微滴化处理，可以大大减少背景和基质的干扰，灵敏度可以低至1个拷贝，提高检测的灵敏度和精确性。
3、本发明方法无需设置标准曲线，根据荧光类型、荧光微滴个数的结果，可以直接判读HHV型别和拷贝数，大大简化操作步骤。
4、本发明提供的方法和试剂盒可以在具有数字PCR的实验室完成，检测时间仅需要3小时，结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点。
5、本发明试剂盒可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备产业化推广条件。
附图说明
图1为实施例中阴性样品的荧光检测结果图。
图2为实施例中感染HPV16型样品的荧光检测结果图。
图3为实施例中感染HPV18型样品的荧光检测结果图。
图4为实施例中共感染HPV16/18型样品的荧光检测结果图。
具体实施方式
为更好地理解本发明的内容，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应该理解，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
一、一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；
所述DNA提取液包括50 mM pH 8.3的Tris-HCl，0.5 M NaCl，5 mM EDTA，质量浓度为1.5%的CTAB，2 mM的DTT；
所述数字PCR反应缓冲液A包括HPV16型的引物及探针和HPV18型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B包括内标的引物及探针；所述HPV16型、HPV18型和内标的引物及探针如下所示：
HPV16型和HPV18型通用上游引物：
AGATGKCTYTKTGGCKGCCTAGT；
HPV16型和HPV18型通用下游引物：
ACATAWTCATCSGTRYTTACAAC；
HPV16型探针：CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCA；
HPV18型探针：ATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCT；
内标上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG；
内标下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG；
内标探针：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC；
所述HPV16型探针5’端荧光报告基因为FAM，HPV18型探针5’端荧光报告基团为VIC，内标探针5’端荧光报告基团为VIC，所有探针3’端淬灭基团均为BHQ；
所述HPV16病毒基因阳性质控为100 copies/μL的HPV16的标准质粒液；所述HPV18病毒基因阳性质控为100 copies/μL的HPV18的标准质粒液；
所述阴性质控为灭菌生理盐水；
所述内标溶液为100 copies/μL的β-globin特异扩增区的标准质粒液。
上述数字PCR反应缓冲液A包括：4 mM MgCl2、50 mM Tris-HCl、300 mM dNTP、900 nM HPV16型和HPV18型通用上游引物、900 nM HPV16型和HPV18型通用下游引物、250 nM HPV16探针和250 nM HPV18探针；
所述数字PCR反应缓冲液B包括：4 mM MgCl2、50 mM Tris-HCl、300 mM dNTP、900 nM内标上游引物、900 nM内标下游引物和250 nM内标探针。
上述数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B中还均含有热启动Taq酶和UDG酶，其中Taq酶和UNG酶的浓度均为1U/μL。
二、一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的检测方法，采用上述基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
（1）受检样品处理：将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100℃恒温处理10分钟，再于12,000 rpm/min离心5分钟，取上清液，获得PCR扩增DNA模板；
（2）质控品的处理：分别取所述试剂盒中的HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控和阴性质控，按照与步骤（1）相同的方法处理，得到相应的DNA模板；
（3）配制数字PCR反应混合液：向步骤（1）和步骤（2）处理后得到的DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别由数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制；
（4）将步骤（3）制备的数字PCR混合液制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10,000~20,000个；然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；其中，数字PCR扩增反应条件为：95℃变性5分钟；95℃变性10秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃变性10分钟，4℃停止反应；
（5）读取荧光信号：步骤（4）PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，分别在FAM和VIC通道中进行HPV16和HPV18分型检测，通过仪器配套Quanta soft软件进行定量分析，计算出HPV16型和HPV18的拷贝数。
三、利用上述试剂盒，对确定的无任何HPV感染的阴性样品、感染HPV16样品、感染HPV18样品、HPV16/18共感染样品进行绝对定量分型检测，检测操作如下：
1、样本处理与DNA提取（在样本制备区）
1）向样品收集管中加入2 mL无菌生理盐水，使沾有样品的棉拭子头完全侵入液体中，充分震荡混匀，将全部液体转移至相应样品编码的离心管中；
2）将相应样品溶液的离心管于10,000 rpm/min离心3分钟，弃上清；
3）向步骤2）弃上清后的离心管中重新加入1 mL无菌生理盐水，充分震荡洗涤，于10,000rpm/min离心3分钟，弃上清；
4）向步骤3）离心弃上清后的离心管中加入500 μL灭菌水，充分震荡混匀；
5）取200 μL步骤4）震荡均匀后的溶液，加入500 μL DNA提取液（50 mM Tris-HCl（pH8.3），0.5 M NaCl，5 mM EDTA，1.5%的CTAB，2 mM的DTT）和5 μL的内标溶液（100 copies/ul的β-globin特异扩增区的标准质粒），剧烈震荡混匀15秒；
6）将上述混合并震荡均匀的溶液，于100℃恒温处理10分钟，再于12,000 rpm离心5分钟，取上清液，得到PCR扩增DNA模板，备用。
2、质控品处理（样本制备区）
取分别装有HPV16/18阳性质控（浓度分别为100 copies/ul 的HPV16/18特异扩增区的标准质粒混合液）、阴性质控离心管（灭菌生理盐水），按照上述“1、样品处理与DNA提取”相同的步骤进行操作，得到相应的DNA模板。
3、数字PCR试剂准备（试剂准备区）
取PCR反应管，依次按照以下配比分别配制阳性质控、阴性质控、样品的数字PCR反应混合液，具体配比如下表1所示；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别由数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制。
表1 数字PCR反应混合液的配比
| 组分 | 体积（μL） |
| 相应数字PCR反应缓冲液（内含Taq酶、dNTP、相应引物探针组合） | 10 |
| DNA模板 | 5 |
| 灭菌水 | 5 |
| 总体积 | 20 |
采用上述配比配制完相应的数字PCR反应混合液后，盖紧PCR反应管管盖，于8,000 rpm/min离心数秒后转移至扩增区。
4、微反应液滴生成（扩增和产物分析区）
将步骤3配制好的相应数字PCR反应混合液置于液滴生成器内，按照仪器使用说明进行操作，实现对反应体系的分液处理，将制备好的相应PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10,000 ~20,000个。
5、数字PCR扩增
将步骤4装有相应PCR微反应液滴的96孔PCR板放入PCR仪，按照下面条件进行PCR扩增反应；进行数字PCR扩增反应条件为：95℃变性5分钟；95℃变性10秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃变性10分钟，4℃停止反应。
6、信号读取
PCR扩增反应后，将PCR反应板放置PCR微反应液滴信号读取仪中进行信号收集，分别在FAM和VIC检测FAM和VIC荧光信号。FAM通道检测HPV16，VIC通道检测HPV18，根据荧光微滴数量，通过Quanta soft软件对各自通道样品进行定量。
阳性对照在FAM通道和VIC通道中都检测到，即FAM通道检测到HPV16阳性质粒，VIC通道检测到HPV18阳性质粒，根据荧光微滴数，通过配套软件Quanta soft计算，可以计算出HPV16/18的拷贝数。
本实施例中，各种样品共40份。无任何HPV感染的阴性样品，通过FAM通道和VIC通道检测，都无信号，反应微滴数为0，计算出来的拷贝数为0，则阴性样品定量结果为0 copies/ul，图1为一阴性样品分析结果。仅被HPV16型感染的样品，在FAM通道中被检测到，VIC通道中无反应，通过软件对FAM通道微滴数计算，HPV16的拷贝数为34 ~ 1270 copies/μL，图2为一仅HPV16感染样品分析结果。仅被HPV18型感染的样品，在FAM通道中检测不到信号，而在VIC通道中能够检测到，软件计算拷贝数为23 ~ 700 copies/μL，图3为一仅HPV18型感染的分析结果。HPV16/HPV18混合感染样品，两个通道中都能检测到，HPV16和HPV18型的拷贝数分别为15 ~ 344 copies/μL和35 ~ 679 copies/μL，图4为一混合感染的分析结果。
对单一亚型HPV DNA浓度大于100 IU/mL的样品，数字PCR方法与荧光定量PCR方法结果一致性为98%；对于HPV DNA浓度小于100 IU/mL的样品，荧光定量PCR方法CT值介于32 - 40之间，判定样品可疑，而数字PCR方法可以精确计算出样品中的HPV DNA浓度，并且对样本中HPV感染亚型进行分析，具有良好的分型检测效果。
本发明提供的方法和试剂盒可以在具有数字PCR的实验室完成，检测时间仅需要3小时，结果判读直观可靠，具有可以稳定实施的特点；本发明试剂盒可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备产业化推广条件。
在说明书中，本发明已参照特定的实施例做了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离发明的精神和范围。因此，说明书被认为是说明性的而非限制性的。
<110> 吉权；
<120> 一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒及其检测方法；
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> 23
<223> HPV16型和HPV18型通用上游引物
<400> 1
AGATGKCTYT KTGGCKGCCT AGT 23
<210> 2
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> 23
<223> HPV16型和HPV18型通用下游引物
<400> 2
ACATAWTCAT CSGTRYTTAC AAC 23
<210> 3
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> 26
<223> HPV16型探针
<400> 3
CCACTGTCTA CTTGCCTCCT GTCCCA 26
<210> 4
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> 26
<223> HPV18型探针
<400> 4
ATACCGTATA TCTTCCACCT CCTTCT 26
<210> 5
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> 19
<223> 内标上游引物
<400> 5
CTGCCGTTAC TGCCCTGTG 19
<210> 6
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> 23
<223> 内标下游引物
<400> 6
TTGGTCTCCT TAAACCTGTC TTG 23
<210> 7
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> 25
<223> 内标探针
<400> 7
ACCACCAACT TCATCCACGT TCACC 25
Claims (5)
1.一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒，其特征在于：包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；
所述DNA提取液包括50 mM pH 8.3的Tris-HCl、0.5 M NaCl、5 mM EDTA、质量浓度为1.5%的CTAB和2 mM的DTT；
所述数字PCR反应缓冲液A包括HPV16型的引物及探针和HPV18型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B包括内标的引物及探针；所述HPV16型、HPV18型和内标的引物及探针如下所示：
HPV16型和HPV18型通用上游引物：
AGATGKCTYTKTGGCKGCCTAGT；
HPV16型和HPV18型通用下游引物：
ACATAWTCATCSGTRYTTACAAC；
HPV16型探针：CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCA；
HPV18型探针：ATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCT；
内标上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG；
内标下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG；
内标探针：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC；
所述HPV16型探针5’端荧光报告基因为FAM，HPV18型探针5’端荧光报告基团为VIC，内标探针5’端荧光报告基团为VIC，所有探针3’端淬灭基团均为BHQ；
所述HPV16病毒基因阳性质控为100 copies/μL的HPV16的标准质粒液；所述HPV18病毒基因阳性质控为100 copies/μL的HPV18的标准质粒液；
所述阴性质控为灭菌生理盐水；
所述内标溶液为100 copies/μL的β-globin的标准质粒液。
2.根据权利要求1所述基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应缓冲液A包括：4 mM MgCl2、50 mM pH8.3的Tris-HCl、300 mM dNTP、900 nM HPV16型和HPV18型通用上游引物、900 nM HPV16型和HPV18型通用下游引物、250 nM HPV16探针和250 nM HPV18探针。
3.根据权利要求1所述基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应缓冲液B包括：4 mM MgCl2、50 mM pH8.3的Tris-HCl、300 mM dNTP、900 nM内标上游引物、900 nM内标下游引物和250 nM内标探针。
4.根据权利要求1所述基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂
盒，其特征在于，所述数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B中还均含有热启动Taq酶和UDG酶，其中Taq酶和UNG酶的浓度均为1U/μL。
5.一种基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的检测方法，其特征在于，采用权利要求1~4任一所述基于数字PCR精准定量分型检测HPV16/18的试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：
（1）受检样品处理：将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混匀，并于100℃恒温处理10分钟，再于12,000 rpm/min离心5分钟，取上清液，获得PCR扩增DNA模板；
（2）质控品的处理：分别取所述试剂盒中的HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控和阴性质控，按照与步骤（1）相同的方法处理，得到相应的DNA模板；
（3）配制数字PCR反应混合液：向步骤（1）和步骤（2）处理后得到的DNA模板中分别加入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、HPV16病毒基因阳性质控、HPV18病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液；其中，阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为两种，分别由数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制；
（4）将步骤（3）制备的数字PCR混合液制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为10,000~20,000个；然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应；其中，数字PCR扩增反应条件为：95℃变性5分钟；95℃变性10秒，60℃延伸60秒，共进行30个循环；98℃变性10分钟，4℃停止反应；
（5）读取荧光信号：步骤（4）PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，分别在FAM和VIC通道中进行HPV16和HPV18分型检测，通过仪器配套Quanta soft软件进行定量分析，计算出HPV16型和HPV18的拷贝数。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200813 Address after: 400069 1st-4th floor, building 30, No.6 Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing Patentee after: CHONGQING ZHONGYUAN HUIJI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: Jiulongpo Branch Park four street 400041 Chongqing city 70-1, 70-2, J block 3 layer Patentee before: Ji Quan |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 400069 floors 1-4, building 30, No. 6, Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing Patentee after: Zhongyuan Huiji Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 400069 floors 1-4, building 30, No. 6, Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing Patentee before: CHONGQING ZHONGYUAN HUIJI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No. 45 Shilin Avenue, Tiaodeng Town, Dadukou District, Chongqing 400082 Patentee after: Zhongyuan Huiji Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 400069 floors 1-4, building 30, No. 6, Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing Patentee before: Zhongyuan Huiji Biotechnology Co.,Ltd. Country or region before: China |
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| CP03 | Change of name, title or address |