CN106191317A - 一种基于数字pcr检测hpv16病毒的引物对及其试剂盒 - Google Patents

一种基于数字pcr检测hpv16病毒的引物对及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于数字PCR检测HPV16病毒的引物对及其试剂盒。所述引物对包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。所述试剂盒包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针。本发明的引物对和探针用于数字PCR中检测HPV16病毒相比传统方法和现有技术具有更好的效果，具有高特异性，能够实现检测限低、精确度高。本发明的试剂盒添加高浓度BSA，极大地提高了反应效率，对于高浓度BSA在数字PCR领域的应用，本发明属于首创。

Description

一种基于数字PCR检测HPV16病毒的引物对及其试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于数字PCR检测HPV16病毒的引物对及其试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对，目前共发现约200多型。该病毒主要感染皮肤和上皮组织，造成上皮组织增生，甚至恶化。其中，HPV病毒感染与90％宫颈癌相关，且HPV16型是最常见的高危型HPV，并与世界上60％的宫颈癌相关。因此，发展对HPV病毒有效的检测方法，将具有重要的临床和社会意义。
目前，HPV病毒尚不能实现体外培养，因此其检测方法主要有以下两类：
(1)免疫学检测方法：免疫学检测方法是利用抗原抗体反应，检测病毒的核蛋白、血凝素、神经丝氨酸酶等抗原反应所产生的抗体。但是在HPV感染的早期，由于感染时间短，HPV还未诱导出抗体的产生，故在血清中很难检测到抗体；只有随着感染时间的延长，病情的逐渐加重，抗HPV抗体才能较易在血清中检测出。另外，HPV感染人体表皮细胞后，在细胞内增殖合成衣壳蛋白而成为HPV抗原成分。免疫酶染色可检测感染组织细胞内的HPV抗原成分，以了解有无HPV感染。无论是抗体或抗原，在感染初期都处于一个较低的浓度，因此针对二者的检测方法都不能实现早期检测。
(2)核酸检测方法：该方法依赖于PCR(聚合酶链式反应)扩增DNA片段的分子生物学检测方法，主要是实时荧光定量PCR(real time PCR)，能较快速分析HPV病毒基因表达的类型，从而指导疾病的诊断、预后、病理分析、治疗等各种研究。传统的PCR扩增需多次打开样品并进行凝胶电泳，容易造成环境污染。另外，凝胶条带的分辨率较低，不能对病毒的含量进行准确的定量。基于Taqman探针的实时荧光定量PCR技术是目前检测流感病毒最快速、最有效和最灵敏的方法。但是该方法的定量依然依赖于内参基因和标准样品的设定，并不能对低浓度的病毒样品进行绝对定量。因此，也很难在病毒感染的早期进行精确的检测。
综上所述，本领域亟需开发检测准确性更高、定量更精确的对HPV16病毒实现检测的产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于数字PCR检测HPV16病毒的引物对及其试剂盒，以期至少解决上述现有技术中存在的问题之一。
本发明的一方面提供一种基于数字PCR检测HPV16病毒的引物对，其包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。
本发明的另一方面提供一种基于数字PCR检测HPV16病毒的试剂盒，其包括前述核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针。
优选地，所述荧光探针5’端的标记基团为FAM(6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素)，所述荧光探针3’端的标记基团为BHQ(Black Hole Quencher，黑洞淬灭剂)。
优选地，所述试剂盒中，前述核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物的浓度分别为10μM。
优选地，所述试剂盒中，前述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针的浓度为5.5μM。
优选地，所述试剂盒还包括牛血清白蛋白溶液。
更优选地，所述牛血清白蛋白溶液的浓度为100g/L。
优选地，所述试剂盒还包括Mg2+、dNTPs、Tris-HCl和DNA聚合酶中的一种或多种。
优选地，当所述试剂盒包括Mg2+、dNTPs、Tris-HCl和DNA聚合酶时，所述Mg2+、dNTPs、Tris-HCl和DNA聚合酶混合在一起作为数字PCR反应预混液包括于所述试剂盒中。
更优选地，所述数字PCR反应预混液包括：4mM Mg2+、300mM dNTPs、50mM Tris-HCl和1U/L rTaq DNA聚合酶。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明具有至少下述有益效果之一：
1、本发明的引物对和探针用于数字PCR中检测HPV16病毒相比传统方法和现有技术具有更好的效果，具有高特异性、低检测限和高精确度的特点。
2、本发明的试剂盒添加高浓度BSA，极大地提高了反应效率，对于高浓度BSA在数字PCR领域的应用，本发明属于首创。
附图说明
图1是对比例8的实验结果图。
图2是对比例9的实验结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述具体实施方式中，部分材料和试剂的来源如下：
引物由上海生工生物技术有限公司公司合成；
荧光探针由上海生工生物技术有限公司公司合成；
牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；
其余试剂材料和仪器，若无特别说明，均为常规市售可得。
本发明提供一种基于数字PCR检测HPV16病毒的引物对，其包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。
本发明还提供一种基于数字PCR检测HPV16病毒的试剂盒，其包括前述核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针。
所述荧光探针的标记基团可为本领域常规，优选地，所述荧光探针5’端的标记基团为FAM(6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素)，所述荧光探针3’端的标记基团为BHQ。
优选地，所述试剂盒中，前述核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物的浓度分别为10μM。在实际操作中，可以将浓度为10μM的核苷酸序列分别如ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物与50mM Tris-HCl混合组成扩增引物对溶液，包括于所述试剂盒中，方便使用。
优选地，所述试剂盒中，前述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针的浓度为5.5μM。在实际操作中，可以将浓度为5.5μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针与50mM Tris-HCl混合组成荧光探针溶液，包括于所述试剂盒中，方便使用。
优选地，所述试剂盒还包括牛血清白蛋白溶液。
更优选地，所述牛血清白蛋白溶液的浓度为100g/L。在实际操作中，可以将浓度为100g/L的牛血清白蛋白溶液与50mM Tris-HCl混合组成牛血清白蛋白溶液，包括于所述试剂盒中，方便使用。
优选地，所述试剂盒还包括Mg2+、dNTPs、Tris-HCl和DNA聚合酶中的一种或多种。所述DNA聚合酶优选rTaq DNA聚合酶。
当所述试剂盒包括Mg2+、dNTPs、Tris-HCl和DNA聚合酶时，这些物质既可以分别单独作为各反应试剂包括于所述试剂盒中，也可以混合在一起作为数字PCR反应预混液包括于所述试剂盒中，本发明优选混合在一起作为数字PCR反应预混液包括于所述试剂盒中。
更优选地，所述数字PCR反应预混液包括：4mM Mg2+、300mM dNTPs、50mM Tris-HCl和1U/L rTaq DNA聚合酶。
利用本发明所述的试剂盒可以按如下方法对HPV16病毒进行检测，包括：
(1)制备数字PCR混合液：将含有待测基因模板的样品、核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针、牛血清白蛋白以及数字PCR反应预混液混合，制备得到数字PCR混合液；
(2)数字PCR混合液制作成微反应的阵列：将数字PCR混合液滴加在含有微孔的微反应阵列芯片的一端，利用硅胶将液体刮进所有的微孔之后，滴加矿物油覆盖芯片的表面；之后将芯片固定在可密闭和可成像的芯片槽里；
(3)PCR扩增：将组装好的芯片放置在普通PCR仪或者自主设计的精密温控模块之上，进行PCR扩增反应；
(4)收集信号和统计计算：使用荧光显微镜对芯片进行荧光信号的采集，并统计进行了PCR反应的微孔数，通过微孔的数量计算病毒模板的初始浓度。
数字PCR的原理是微滴化处理，将每个样品分成20,000个液滴，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器孔中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
另外，本发明检测试剂盒中添加高浓度的牛血清白蛋白(BSA)，一般来讲，在普通PCR扩增领域，BSA有稳定Taq聚合酶的作用，但是通常用量都较少，仅10μg/ml左右，否则就会影响普通PCR的扩增效果。本申请的发明人意外地发现，在数字PCR领域中，使用高浓度的BSA不仅不会影响数字PCR的扩增效果，而且其可吸附在数字PCR芯片的表面，由于芯片表面亲水，制备微反应阵列进液的时候不会在微米尺度的孔里形成气泡，从而影响数字PCR扩增和成像效果。此外，大量的BSA吸附在芯片表面，就降低了聚合酶在芯片表面的吸附，极大的提高了PCR反应的效率。这在本领域之前从未被报道过，因此本发明是首度发现BSA的这一特性，并且首度将高浓度的BSA运用于数字PCR中，并且取得了非常好的应用效果。
实施例1数字PCR试剂盒的制备
所述试剂盒的组成如下表1所示：
表1试剂盒的组成
其中，数字PCR反应预混液包括：4mM MgCl2、300mM dNTP、50mM Tris-HCl和1U/μLrTaq DNA聚合酶。
扩增引物对溶液包括：10μM的核苷酸序列分别如ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物以及50mM Tris-HCl。
荧光探针溶液包括：5.5μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针和50mMTris-HCl。
牛血清白蛋白溶液包括：100g/L牛血清白蛋白和50mM Tris-HCl溶液。
按表1的参数，将各试剂独立包装即得到HPV16数字PCR荧光检测试剂盒。
探针和引物对的序列如表2所示：
表2探针和引物对的序列
实施例2试剂盒的使用方法
(1)制备数字PCR混合液：将含有待测基因模板的样品、核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针、牛血清白蛋白以及数字PCR反应预混液混合，制备得到数字PCR混合液；
得到的数字PCR混合液总体积为20μL，其中包括1.2μL核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物、0.4μL核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针、1.0μLBSA、10.0μL 2×数字PCR反应预混液，和50mM Tris-HCl，以及待检测的HPV16样本1.0μL，其余为ddH2O补齐；
(2)数字PCR混合液制作成微反应的阵列：将数字PCR混合液滴加在含有微孔的微反应阵列芯片的一端，利用硅胶将液体刮进所有的微孔之后，滴加矿物油覆盖芯片的表面；之后将芯片微孔面朝上夹在导热金属和透明玻璃片组成的三明治式的密闭芯片槽里；
(3)PCR扩增：将组装好的芯片放置在普通PCR仪(也可以是自主设计的精密温控模块)之上，进行PCR扩增反应；
反应程序为：95℃、5min；95℃、15s，60℃、45s，50个循环；60℃、5min；4℃保存或分析；
(4)收集信号和统计计算：使用荧光显微镜对芯片进行荧光信号的采集，并统计进行了PCR反应的微孔数，通过图像处理软件Image J读取20000个微孔中的荧光亮点数，计算HPV16病毒模板的初始DNA浓度。
实施例3试剂盒的性能考察
取不同浓度拷贝数的包含HPV16E6基因的质粒(购自addgene公司，美国麻萨诸塞州)，采用实施例1制备的试剂盒按照实施例2的方法进行检测，HPV16质粒的浓度分别为1、5、10和25拷贝/μl；每个浓度样本重复测定三次取平均值，具体结果如表3所示：
表3HPV16病毒拷贝数检测结果
实际HPV16浓度 检测结果
1copies/μl 1.104copies/μl
5copies/μl 4.92copies/μl
10copies/μl 10.13copies/μl
25copies/μl 25.19copies/μl
对比例1～4
另外，本发明还进行了一系列对比试验，具体的实验条件基本同实施例3，不同之处仅在于各对比例试剂盒采用的荧光探针与实施例1中所述荧光探针不同，各对比例的荧光探针序列如下：
对比例1的荧光探针序列为：5’FAM–AGGAGCGACCCGGAAAGTT ACCACA-3’；
对比例2的荧光探针序列为：5’FAM–AGCGACCCGGAAAGTTACC ACAGTT-3’；
对比例3的荧光探针序列为：5’FAM–CACAGGAGCGACCCGGAAA GTTACCACA-3’
对比例4的荧光探针序列为：5’FAM–AGCGACCCGGAAAGTTACC ACAGTTATG-3’。
各对比例的实验结果如表4所示：
表4不同荧光探针的实验结果对比
通过表3和表4的结果可以看出，本发明的试剂盒在用于数字PCR中检测HPV16病毒时，由于反应体积的降低以及引物探针的特异性强，可与模板高度互补，使得检测限降低至1个拷贝。各对比例探针对于目的片段的特异性差，在PCR反应过程中不能完全与模板互补配对，导致结合不稳定。未与模板结合的探针，在PCR过程中将不会被聚合酶切断而发光，直接造成检测限的升高和检测值的偏小。
对比例5～7BSA对试剂盒的性能影响
按照实施例1和2的检测方案，通过对试剂盒PCR扩增体系中的BSA浓度进行调整，进行对比例5～7的实验。具体的实验条件基本同实施例2，不同之处仅在于各对比例PCR扩增体系中的BSA浓度不同，各对比例中的BSA浓度如下：
对比例5的反应体系中不添加BSA，其他均同实施例2；
对比例6的反应体系中BSA的浓度为140g/L，其他均同实施例2；
对比例7的反应体系中BSA的浓度为60g/L，其他均同实施例2。
各对比例检测5和25copies/μl的包含HPV16E6基因的质粒，重复测定三次取平均值，统计并对比检测结果，具体如表5所示：
表5不同浓度BSA的实验结果
实际HPV16浓度 对比例5 对比例6 对比例7
5copies/μl 0.41copies/μl 3.76copies/μl 1.76copies/μl
25copies/μl 5.72copies/μl 20.52copies/μl 11.38copies/μl
通过表5的结果可以看出，本发明的试剂盒在用于数字PCR中检测HPV16病毒时，高浓度的BSA极大地提高了PCR的效率，其有益效果在于：1)BSA封闭的芯片表面亲水，在PCR混合液进入微孔阵列时不会形成气泡。气泡会在PCR的高温反应中不断变大，破坏反应界面并影响成像；2)BSA在微孔阵列表面的吸附，极大的降低了聚合酶在表面的吸附，有效保存了酶的活力，提高了PCR反应效率。
对比例8试剂盒的检测准确性和特异性验证
对比例8的反应体系中同时加入HPV16样本1.0μL和相同浓度的干扰项质粒样本1.0μL，其他均同实施例2；结果如图1所示。图1中，左侧图片显示单一样品的结果(即实施例2结果)，右侧图片显示混合样品结果(即对比例8结果)，图中，每一个亮点代表一个PCR反应(密微孔阵列)。从图1的结果可以看出，在有大量干扰样品加入时，荧光图像的亮点并没有出现显著增加，证明本发明的试剂盒对HPV16检测的准确性和特异性均很高。
对比例9试剂盒相较于RealTimePCR的优越性
对比例9是使用Realtime PCR仪检测某一未知浓度的样本，因此反应体系无需高浓度BSA，其他同实施例2，结果如图2所示。
图2中，左侧为未知浓度的样本的原始浓度、稀释100倍和10000倍后Realtime PCR的结果图，图中的有效信息为反应Ct数，此数据还需配合一个Ct数和浓度的标准曲线才能计算出该未知浓度。右侧为稀释10000倍后利用本发明试剂盒进行数字PCR的结果，每一个亮点是一个拷贝的分子，根据该图和分子量即可计算得出原始浓度为27.2ng/ml。因此，本发明的试剂盒及以数字PCR检测HPV16病毒的方法相比传统的Realtime PCR，其得出结果的实验周期大为缩短、实验成本更低、程序更为简化，优越性明显。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于数字PCR检测HPV16病毒的引物对，其特征在于，其包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物。
2.一种基于数字PCR检测HPV16病毒的试剂盒，其特征在于，其包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的荧光探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针5’端的标记基团为FAM，所述荧光探针3’端的标记基团为BHQ。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，所述核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物的浓度分别为10μM。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，所述核苷酸序列如SEQID NO.3所示的荧光探针的浓度为5.5μM。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括牛血清白蛋白溶液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液的浓度为100g/L。
8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Mg2+、dNTPs、Tris-HCl和DNA聚合酶中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒包括Mg2+、dNTPs、Tris-HCl和DNA聚合酶时，所述Mg2+、dNTPs、Tris-HCl和DNA聚合酶混合在一起作为数字PCR反应预混液包括于所述试剂盒中。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应预混液包括：4mM Mg2 +、300mM dNTPs、50mM Tris-HCl和1U/L rTaq DNA聚合酶。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112592967A (zh) * 2021-01-08 2021-04-02 中国科学院半导体研究所 一种基于液滴pcr快速检测单细胞的方法
CN113817808A (zh) * 2021-11-24 2021-12-21 南京求臻基因科技有限公司 评价数字pcr引物和探针扩增特异性和扩增效率的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENG XU等: ""Integration of the full-length HPV16 genome in cervical cancer and Caski and Siha cell lines and the possible ways of HPV integration"", 《VIRUS GENES》 *
MINA KALANTARI等: ""Effects of cellular differentiation, chromosomal integration and 5-aza-2′-deoxycytidine treatment on human papillomavirus-16 DNA methylation in cultured cell lines"", 《VIROLOGY》 *
OLGA KALININA等: ""Nanoliter scale PCR with TaqMan detection"", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
VINCENT L. BIRON等: ""Detection of Human Papillomavirus Type 16 in Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Using Droplet Digital Polymerase Chain Reaction"", 《CANCER》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112592967A (zh) * 2021-01-08 2021-04-02 中国科学院半导体研究所 一种基于液滴pcr快速检测单细胞的方法
CN113817808A (zh) * 2021-11-24 2021-12-21 南京求臻基因科技有限公司 评价数字pcr引物和探针扩增特异性和扩增效率的方法

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