CN110607381A - 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种结核分枝杆菌检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种结核分枝杆菌检测试剂盒及方法，属于生物技术领域。本结核分枝杆菌检测试剂盒包括独立包装的下述试剂：引物探针预混液、反应预混液、阳性质控品、阴性质控品；用其检测结核分枝杆菌的方法包括以下步骤：制备得到数字PCR混合液、进行PCR扩增反应、对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有结核分枝杆菌DNA模板及其含量为多少。利用该试剂盒检测结核分枝杆菌效率高、准确性好，可以极大的缩短检测时间，无需制作标准曲线，明显提高了检测特异性和覆盖度，并且具有较高的稳定性。

Description

一种结核分枝杆菌检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌检测试剂盒及方法。
背景技术
结核分枝杆菌(M.tubercuLosis)简称为结核杆菌(tuberclebacilli，TB)。作为一种古老的疾病，由结核分枝杆菌感染所致的结核病困扰人类已有数千年。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式，传染源是接触排菌的肺结核患者。结核病的临床表现多样，可累及全身各器官系统，病变往往十分隐匿，给结核病的诊断及治疗带来了很大的障碍。因此，结核病的早期准确诊断及治疗是结核病疫情控制的关键措施之一。目前结核病已有的检查方法包括结核分枝杆菌涂片抗酸染色、结核分枝杆菌培养、组织病理学检查、皮肤结核菌素试验、结核抗体检测和DNA分子检测等。但结核分枝杆菌涂片抗酸染色法的灵敏性和特异性差；结核分枝杆菌培养法检查时间长，易延误有效诊治；组织病理学检查创伤大，适用范围小；而DNA分子检测法假阳性较高。目前筛查结核分枝杆菌感染的方法中应用最广泛的是结核菌素试验，其操作简便易行，成本低廉，但卡介苗(BCG)接种及非结核分枝杆菌感染均可导致其产生假阳性，而处于各种免疫抑制状态时可导致其产生假阴性，使其特异性和灵敏性减低。因此，临床上仍迫切地需要寻找一种用于快速准确诊断结核分枝杆菌感染的方法。
结核分枝杆菌感染的免疫反应主要是细胞介导免疫反应，T淋巴细胞被结核分枝杆菌抗原致敏后，当用相同的抗原再次刺激时，活化的效应T细胞会分泌大量细胞因子或趋化因子，并具有抗原特异性，这些由T细胞分泌的细胞因子或趋化因子具有良好的结核分枝杆菌感染诊断潜力。随着FQ-PCR技术的发展，其在结核病早期诊断领域的应用已越来越广泛，也越来越为人所重视，PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。结核病感染的实验诊断中，当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR(RealTimeCR)基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号，根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
中国专利申请201310009018.3中公开了一种结核分枝杆菌TB检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01-0.5mM/L，氯化钾20-300mM/L，十二烷基磺酸钠0.01-2％和乙醇0.05-1％；所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物、下游引物和用于靶多核苷酸检测的探针。使用本发明试剂盒中的核酸释放剂释放核酸的方法与煮沸法的检测结果没有明显差异，而本发明中提取核酸时采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取；本发明试剂盒检测TB的灵敏度可达400copies/ml(痰液)，定量线性范围为400-4.00E+09copies/ml；应用该试剂盒可以对痰液等未知样本中的TB-DNA进行快速准确的检测，为诊断TB感染提供可靠的实验依据，该申请中公开的检测为荧光定量PCR检测，该检测试剂盒的检测灵敏度比较低。
中国专利申请201710145841.5公开了一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒，包括如下部分：由检测引物、10倍的环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、显色剂和菌体扩培液组成；所述的检测引物是由一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP组成。该试剂盒结果判断不需要使用电泳、眼易观察，非常适用于结核分枝杆菌的快速检测，但是这个方法同样存在很多问题：第一，由于LAMP的引物设计需要在目标序列上选择6个区域(如果为提高效率使用环引物的话则还额外需要一对)所以它对目的序列本身的要求非常高，即不是所有的病原体都有合适的序列来设计引物。第二，由于LAMP技术的扩增效率非常高，所以也很容易出现由于污染导致的假阳性。
数字PCR(DPCR)技术是近几年兴起的第三代PCR技术，数字PCR一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于实时荧光定量核酸扩增检测系统(QPCR)对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量，该方法极大的提高了检测目标DNA的灵敏度，因此，有必要开发一种依赖于数字PCR技术，准确、快速、检测灵敏度高的结核分枝杆菌的检测试剂盒。
发明内容
本发明提供了一种结核分枝杆菌检测方法及试剂盒，该试剂盒能够高效、快速、准确、灵敏的检测结核分枝杆菌，并且检测结果灵敏度高，特异性强。
本发明的目的之一是提供一种用于结核分枝杆菌检测的试剂盒。
一种用于结核分枝杆菌检测的试剂盒，其特征在于：包括独立包装的下述试剂：引物探针预混液、反应预混液、阳性质控品、阴性质控品；
所述的引物探针预混液中包括：
检测结核分枝杆菌DNA的上游引物TB-DNA-F、
检测结核分枝杆菌DNA的下游引物TB-DNA-R、
检测结核分枝杆菌DNA的荧光探针TB-DNA-P、
检测人actb基因的上游引物actb-F、
检测人actb基因的下游引物actb-R、
检测人actb基因的荧光探针actb-P；
所述的上游引物TB-DNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的下游引物TB-DNA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的荧光探针TB-DNA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，且的5’端连接有荧光报告基团FAM、3’端连接有淬灭基团BHQ-1；
所述的上游引物actb-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的下游引物actb-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的荧光探针actb-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，且的5’端连接有荧光报告基团CY3、3’端连接有淬灭基团BHQ-2；
SEQ ID NO:1(TB-DNA-F):5’---CACATCGATCCGGTTCAGCG---3’；
SEQ ID NO:2(TB-DNA-R):5’---GTCATAGGAGCTTCCGACCG---3’；
SEQ ID NO:3(TB-DNA-P):5’---CTCGCCGAGGCAGGCATCCA---3’
SEQ ID NO:4(actb-F):5’---GAGGGCATACCCCTCGTAGA---3’；
SEQ ID NO:5(actb-R):5’---GTGCTATCCCTGTACGCCTC---3’；
SEQ ID NO:6(actb-P):5’---CACTGGCATCGTGATGGACT---3’。
所述的引物探针预混液中各引物和探针的浓度范围为：
上游引物TB-DNA-F：0.4-2μM；优选为2μM；
下游引物TB-DNA-R：0.4-2μM；优选为2μM；
荧光探针TB-DNA-P：0.2-1μM；优选为1μM；
上游引物actb-F：0.4-2μM；优选为2μM；
下游引物actb-R：0.4-2μM；优选为2μM；
荧光探针actb-P：0.2-1μM；优选为1μM。
用于结核分枝杆菌检测的试剂盒的反应预混液包括dNTPs0.2-0.6mM(each)、MgCl22-8mM、BSA2-20μg/μL、热启动taq酶0.05-0.2U/μL、ROX50-200nM、尿嘧啶-DNA-糖基酶0.05-0.2U/μL，优选的，包括dNTPs0.4mM(each)、MgCl24mM、BSA10μg/μL、热启动taq酶0.1U/μL、ROX100nM、尿嘧啶-DNA-糖基酶0.1U/μL。
所述的反应预混液还包括单分子扩增增强剂。
所述的单分子扩增增强剂为TritonX-100 0.05-0.4％和/或热稳定焦磷酸酶0.01-0.04/μL。
优选的，所述的单分子扩增增强剂为TritonX-100 0.2％和/或热稳定焦磷酸酶0.02U/μL。
所述的阳性质控品为为含结核分枝杆菌基因组序列的标准质粒溶液。
所述的阴性质控品‘为含人正常T淋巴细胞系H9细胞系DNA。
另一方面，本发明还提供了一种利用上述结核分枝杆菌检测的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)制备得到数字PCR混合液：将待测的DNA模板、引物探针预混液、反应预混液和无菌去离子水混合制成反应体系，即得到数字PCR混合液；
其中，待测的DNA模板的浓度为0.25-2ng/μL；优选为0.5-1ng/μL；更优选为1ng/μL；引物探针预混液用量为4μL，反应预混液用量为10μL，无菌去离子水用量为4μL，共制成20μL混合液。
(2)进行PCR扩增反应：将步骤(1)中配置好的不同比例的反应体系上样到芯片上，形成微反应单元，再进行PCR扩增反应得到PCR扩增反应后的产物；
其中，所述的PCR扩增条件为：93-97℃预变性3-15min；93-97℃变性5-50s，60-70℃退火5-50s，55-65℃延伸10-65s，共进行20-60个循环，至2-10℃终止反应；
优选地，所述的PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，60℃延伸30s，共进行40个循环，10℃终止反应。
(3)将步骤(2)中得到的PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有结核分枝杆菌DNA模板及其含量为多少。
此结核分枝杆菌检测方法的检测样本为血液、血清、痰液或呼吸道灌洗液。
与现有技术相比本发明的有益效果为：
(1)本发明开发了一种应用于芯片式数字PCR平台的结核分枝杆菌DNA检测试剂盒，该试剂盒的检测效率高、准确性好，可以缩短检测时间，无需制作标准曲线，可以实现绝对定量；
(2)本试剂盒使用本发明中公开的引物探针组合，明显提高了检测特异性和覆盖度；
(3)本发明公开的试剂盒使用本发明的反应体系，在保证反应高效准确的前提下极大提高了芯片进孔效率，检测过程中使用热启动的DNA聚合酶和UDG酶，降低反应假阳性；
(4)本发明提供的试剂盒稳定性好；
(5)本发明提供的试剂盒能够有效检测DNA终浓度仅为1ng/μL的样本，并且能够有效分辨终浓度低至10copie/μL的标准品，能够满足临床上早期筛查的技术需求，该试剂盒可以广泛应用于临床对于TB活性的动态监测，以及对于抗菌药物疗效的评估。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种用于结核分枝杆菌检测的试剂盒
试剂盒包括以下部分：独立包装的下述试剂：引物探针预混液、反应预混液、阳性质控品、阴性质控品、无菌水。
1、引物探针预混液：
检测结核分枝杆菌DNA的上游引物TB-DNA-F，序列为SEQ ID NO:1(TB-DNA-F):5’---CACATCGATCCGGTTCAGCG---3’，浓度为400nM；
检测结核分枝杆菌DNA的下游引物TB-DNA-R，序列为SEQ ID NO:2(TB-DNA-R):5’---GTCATAGGAGCTTCCGACCG---3’，浓度为400nM；
检测结核分枝杆菌DNA的荧光探针TB-DNA-P，序列为SEQ ID NO:3(TB-DNA-P):5’---CTCGCCGAGGCAGGCATCCA---3’，且的5’端连接有荧光报告基团FAM、3’端连接有淬灭基团BHQ-1，浓度为200nM；
检测人atb基因的上游引物actb-F，序列为SEQ ID NO:4(actb-F):5’
---GAGGGCATACCCCTCGTAGA---3’，浓度为400nM；
检测人actb基因的下游引物actb-R，序列为SEQ ID NO:5(actb-R):5’
---GTGCTATCCCTGTACGCCTC---3’，浓度为400nM；
检测人actb基因的荧光探针actb-P，序列为SEQ ID NO:6(actb-P):5’
---CACTGGCATCGTGATGGACT’---3’，浓度为200nM。
2、反应预混液：
dNTPs(购自Diamond公司)0.4mM(each)、MgCl2(购自Promega公司)4mM、BSA(购自Sigma公司)10μg/μL、热启动taq酶(购自Promega公司)0.1U/μL、ROX(购自上海生工有限公司)100nM、尿嘧啶-DNA-糖基酶(购自NEB公司)0.1U/μL、TritonX-100(购自sigma公司)0.2％和热稳定焦磷酸酶(购自NEB公司)0.02U/μL。
3、阳性质控品：含结核分枝杆菌基因组序列的标准质粒溶液；阳性质控品的制备方法为400bpTB基因组序列(包含扩增片段)连接进puc57质粒中，定量至1000copies/μL，然后加入等体积10ng/μL的人正常T淋巴细胞系H9细胞系DNA，即得到含结核分枝杆菌基因组序列的标准质粒溶液。
4、阴性质控品：5ng/μL的人正常T淋巴细胞系H9细胞系DNA。
5、无菌水。
dNTPs 0.4mM(each)包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
本发明中设置检测人actb基因的引物和荧光探针的目的是：为了验证样本提取过程和反应循环过程没有问题，如果检测结核分枝杆菌荧光探针检测为阴性，可能存在三种情况：1、可能是样本中检测结核分枝杆菌真的是阴性，2、可能是样本DNA在提取过程中出现了问题，导致没有提取到符合试验标准的DNA，3、可能是反应过程中仪器的生降温出了问题导致反应没有正常进行。这时可以再看看另一个通道的actb基因的检测情况，如果为阳性，则能排除后面两种情况，确定样本结核分枝杆菌为阴性。
所述的引物和探针的合成均由上海生工公司进行合成，使用HPLC级纯化，使用时引物用TE缓冲液稀释至2uM，探针用TE缓冲液稀释至1uM。
实施例2利用本发明提供的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法
检测样本：人工合成的含有TB目的片段的标准品；
样本来源：上海生工公司。
包括以下步骤：
1、不同浓度DNA模板制备：
由上海生工公司人工合成含有结核分枝杆菌DNA目的片段长度为300bp的DNA片段，并将其连接进载体质粒中，转入E.coli筛选阳性菌进行克隆，提取纯化质粒，限制性内切酶将质粒切成线性，以Qubit3.0进行双链DNA定量；
另培养人正常T淋巴细胞系H9，提取其DNA，使用Qubit3.0进行定量，之后稀释至10ng/μL的浓度。
配制结核分枝杆菌DNA拷贝数体系终浓度为1、101、102、103、104、105和106拷贝的DNA模板溶液，等体积加入人正常T淋巴细胞系H9细胞系DNA作为背景，制成阳性质控品。另取浓度为5ng/μL的H9细胞系DNA作为阴性质控品，以展示本发明检测下限。
2、反应体系的制备
根据表1建立反应体系，根据反应数量计算总反应体积，具体如下：计算总反应各组分试剂用量，本次实验中，共有两组引物探针，7个不同浓度的DNA模板，阴性质控品，无模板对照，因此总量为9+1＝10个管，即反应预混液＝100μL，引物探针预混液＝40μL，无菌去离子水＝40μL。加样顺序依次为无菌去离子水、反应预混液、引物和探针加入1.5mL离心管中，使用轻柔涡旋将混合体系混匀15s，并通过短时离心将溶液收集到试管底部；
将试剂分装至9支0.2mLEP管中，每管18μL。然后将之前配制好的不同比例的模板DNA加入管中，每管加2μLDNA样本。然后在管盖上写上编号，混匀15s，瞬时离心。
表1.反应体系
3、上机操作
将配置好的不同比例的反应体系上样到芯片上，形成微反应单元。按照表2所示的PCR反应条件进行PCR反应，选择FAM和CY3作为检测荧光的检测通道。
表2.PCR反应条件
4、检测结果
通过数字PCR配套软件，对两个通道的有效荧光阳性点进行判读，使用软件自带的分析工具，对进行结果分析，实验结果如表3所述，表3是种拷贝数浓度的标准品(编号0-6对应终浓度1、101、102、103、104、105和106copies/μL)，以及阴性质控品和无模板样本对照进行3次平行实验的结果统计表。
其中，稳定性检测结果以3次试验结果的标准差除以平均值得到，意在展示多次重复实验结果数据的重复性。稳定性的百分数越小则稳定性越好，小于5％视作稳定性很好，相反，百分数越大，表明重复性越差。但是，对于不同浓度梯度，不能盲目说数值越大重复性越差，因为高浓度检测结果本身拷贝数就大，可以波动的空间也比较大，所以高浓度检测结果百分数也可能大于低浓度检测结果。
表3.拷贝数浓度检测结果
由上表3可知，对于1copy/μL浓度的标准品，由于FAM通道阳性点数量太少，无法稳定检出；对于105-106copies/μL浓度的标准品，由于FAM通道阳性点数量过多，已经超过总孔数的三分之二，已经大大超过了基于泊松分布的计算模型，仅可以作定性检测，无法准确定量，如需准确定量需要将样本进一步稀释。因此，本发明的检测范围为10-104copies/μL。另外，各样本CY3通道阳性微滴数量均为200左右，虽然在标准品检测上意义不大，但在真实临床样本检测上，可以作为样本DNA提取质量符合要求的证明。
综上可知，在本次实验中，基于数字PCR系统，该试剂盒能够有效检测DNA终浓度仅为1ng/μL的样本，并且，能够有效分辨终浓度低至10copie/μL的标准品，能够满足临床上早期筛查的技术需求，还可以广泛应用于临床对于TB活性的动态监测，以及对于抗菌药物疗效的评估。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司
<120> 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及方法
<130> 201909
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacatcgatc cggttcagcg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcataggag cttccgaccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcgccgagg caggcatcca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagggcatac ccctcgtaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgctatccc tgtacgcctc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cactggcatc gtgatggact 20

Claims (10)

1.一种用于结核分枝杆菌检测的试剂盒，其特征在于：包括独立包装的下述试剂：引物探针预混液、反应预混液、阳性质控品、阴性质控品；
所述的引物探针预混液中包括：
检测结核分枝杆菌DNA的上游引物TB-DNA-F、
检测结核分枝杆菌DNA的下游引物TB-DNA-R、
检测结核分枝杆菌DNA的荧光探针TB-DNA-P、
检测人actb基因的上游引物actb-F、
检测人actb基因的下游引物actb-R、
检测人actb基因的荧光探针actb-P；
所述的上游引物TB-DNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的下游引物TB-DNA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的荧光探针TB-DNA-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，且5’端连接有荧光报告基团FAM、3’端连接有淬灭基团BHQ-1；
所述的上游引物actb-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的下游引物actb-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的荧光探针actb-P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，且5’端连接有荧光报告基团CY3、3’端连接有淬灭基团BHQ-2；
SEQ ID NO:1(TB-DNA-F):5’---CACATCGATCCGGTTCAGCG---3’；
SEQ ID NO:2(TB-DNA-R):5’---GTCATAGGAGCTTCCGACCG---3’；
SEQ ID NO:3(TB-DNA-P):5’---CTCGCCGAGGCAGGCATCCA---3’
SEQ ID NO:4(actb-F):5’---GAGGGCATACCCCTCGTAGA---3’；
SEQ ID NO:5(actb-R):5’---GTGCTATCCCTGTACGCCTC---3’；
SEQ ID NO:6(actb-P):5’---CACTGGCATCGTGATGGACT’---3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的引物探针预混液中各引物和探针的浓度范围为：
上游引物TB-DNA-F：1.5-2.5μM；
下游引物TB-DNA-R：1.5-2.5μM；
荧光探针TB-DNA-P：0.5-1.5μM；
上游引物actb-F：1.5-2.5μM；
下游引物actb-R：1.5-2.5μM；
荧光探针actb-P：0.5-1.5μM。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的引物探针预混液中各引物和探针的浓度范围为：
上游引物TB-DNA-F：2μM；
下游引物TB-DNA-R：2μM；
荧光探针TB-DNA-P：1μM；
上游引物actb-F：2μM；
下游引物actb-R：2μM；
荧光探针actb-P：1μM。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的反应预混液包括dNTPs 0.4mM(each)、MgCl2 4mM、BSA 10μg/μL、热启动taq酶0.1U/μL、ROX 100nM、尿嘧啶-DNA-糖基酶0.1U/μL。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：反应预混液还包括单分子扩增增强剂，所述的单分子扩增增强剂为TritonX-100 0.2％或热稳定焦磷酸酶0.02U/μL。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的阳性质控品为含结核分枝杆菌基因组序列的标准质粒溶液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述的阴性质控品为含人正常T淋巴细胞系H9细胞系DNA。
8.一种用权利要求1所述的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于：包括用权利要求1所述的试剂盒制备数字PCR混合液的步骤，所述PCR混合液由浓度为0.25-2ng/μL的DNA模板、引物探针预混液4μL、反应预混液10μL和无菌去离子水4μL混合制成20μL反应体系。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括进行PCR扩增反应的步骤，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，60℃延伸30s，共进行40个循环；10℃终止反应。
10.根据权利要求8-9任一项所述的方法，其特征在于：检测样本的类型可以为血液、血清、痰液或呼吸道灌洗液。
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