CN110724761A - 检测人类乳头瘤病毒的试剂、方法及应用 - Google Patents

检测人类乳头瘤病毒的试剂、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及疾病筛查技术领域，具体涉及用于检测人类乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的试剂、方法及应用。该方法包括：在同一PCR反应管中，使用两条简并引物和多个探针进行荧光定量PCR；其中，所述两条简并引物可用于扩增至少24个亚型HPV；所述多个探针包括用于检测低危亚型HPV的探针、用于检测高危亚型HPV的探针、用于检测中度高危亚型HPV的探针；所述用于检测低危亚型HPV的探针、所述用于检测高危亚型HPV的探针、所述用于检测中度高危亚型HPV的探针分别对应不同的荧光通道。

Description

检测人类乳头瘤病毒的试剂、方法及应用
技术领域
本发明涉及疾病筛查技术领域，具体涉及用于检测人类乳头瘤病毒 (humanpapilloma virus,HPV)的试剂、方法及应用。
背景技术
现有子宫颈癌的筛查技术可分两类，基于形态学的方法是在细胞或组织水平检查以识别不正常，基于分子生物学的方法是检查子宫颈上皮瘤的子宫颈癌的标志物。进一步区分这些方法可根据他们释放借助于显微镜或物理和电光学的特性。
Pap细胞学：Pap检测是最早的癌症检测方法之一，毫无疑问，它同时也是现代医学中最有成效的一种方法。Pap检测主要是检查子宫颈癌先兆，通过重复检测，可以密切监测可疑的或低度异常，或提议病人立即进行阴道镜、细胞切片检查，并对高度或严重的损害进行治疗。通过Pap检测预防侵入性子宫颈癌，可在它还只是上皮组织时就阻止其恶性发展。
薄层液相为基础的细胞学：ThinPrepTM和Autocyte Prep系统是两种基于液体的用于代替传统Pap涂片的制片方法。从子宫颈取得的样本被溶于细胞保存液而不是直接涂在玻璃片上。通过这种方法几乎所有的细胞都可给予检测。在传统Pap涂片法中，约20％从子宫颈收集的细胞会被置于玻璃片上，而在薄层样本中，多余的血细胞和炎症细胞会被裂解，而含有约50000细胞的随机样本会由自动细胞处理机转移到玻璃片，并形成一薄层涂片，这涂片经染色后由细胞技术员进行检查。这种自动的薄层技术可以使涂片更清晰、均一，并且没有血细胞、炎症细胞碎片和细胞集落这些影响显微镜检测的因子，从而提高对非典型细胞、癌症先兆和癌症的检出率。
自动化细胞学：自动化的系统正处于测试和市场推广的阶段。这些系统包括一种能自动把子宫颈癌细胞悬浮液制成标准薄层玻璃片的装置，及通过计算机辅助扫描来首先发现不正常细胞，并把这些涂片分离处理以便作进一步的人工细胞学检测。这些方法最关键的优点是可减轻因缺乏合格的细胞学家而引起的人员紧张。现在在北美和欧洲，有许多私人公司赞助的比较性实验正在验证这些自动化机器的筛查效率和经济效益。
醋酸法目视筛查(VIA)：在低收入国家，目查法已成为一种技术要求低、能代替细胞学筛查的方法。这些目查法包括直接检查子宫颈，借助醋酸的目查法(也称为直接目查DVI,子宫镜和辅助目查)，低倍镜醋酸目查 (VIAM)，Lugol’s碘酒目查法(VILI)和子宫颈图像。
筛查中检查HPV：目前研究人员正在比较HPV检测与Pap检测作为子宫颈癌筛查方法的优缺点。由于HPV难以进行体外培养，而且不是所有的感染者都有可检测的抗体反应。因此，HPV DNA的检测是非介入式检测HPV 感染最好方法。目前HPV检测的方法主要有三类：
第一类是直接探针结合，如southern印迹和点印迹，原位杂交过滤法等。这些方法普遍存在灵敏度低，操作繁琐等缺点。
第二类是信号放大法，大多数的研究所采用的是唯一经FDA批准的 Digene的第一和第二代Hybrid Capture(HC)系统。另一些用不同的PCR 方法来检测HPV。相比于HC法，PCR的检测灵敏度更高，但第二代HC2的检测灵敏度已大大提高，接近于PCR的水平。HC2检查是通过微孔板化学发光信号扩增的核酸杂交技术，定性检查子宫颈样本中高危HPV病毒，这些病毒通常与子宫颈癌有联系，它们是：16、18、33、35、39、45、51、 52、56、58、59、68。
第三类是基于PCR的把序列片段扩增，PCR方法是用型别特异或通用引物扩增目标片段并与特异性探针杂交。实时定量PCR(real-time quantitative，PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增。
定量PCR技术所使用的探针有多种，包括：水解探针或Taqman探针、分子信标、scorpions等。相比较于Taqman探针，后期发明的Taqman-MGB 探针、分子信标、scorpions等具有分析灵敏度高等优点，缺点在于价格昂贵。
发明内容
本发明提供一种检测人类乳头瘤病毒的试剂、方法及应用，可以在Taqman探针的基础上，通过优化引物、探针序列和PCR反应体系，使用 Taqman探针同样达到准确检测的目的。
第一方面，提供了一种用于检测人类乳头瘤病毒HPV的方法，包括：在同一PCR反应管中，使用两条简并引物和多个探针进行荧光定量PCR；其中，所述两条简并引物可用于扩增至少24个亚型HPV；
所述多个探针包括用于检测低危亚型HPV的探针、用于检测高危亚型 HPV的探针、用于检测中度高危亚型HPV的探针；
所述用于检测低危亚型HPV的探针、所述用于检测高危亚型HPV的探针、所述用于检测中度高危亚型HPV的探针分别对应不同的荧光通道；
所述用于检测低危亚型HPV的探针包括用于检测HPV6的探针、用于检测HPV11的探针、用于检测HPV42的探针、用于检测HPV43的探针、用于检测HPV44的探针中的任一种或任意多种的组合或全部；
所述用于检测高危亚型HPV的探针包括用于检测HPV16的探针、用于检测HPV18的探针、用于检测HPV31的探针、用于检测HPV33的探针、用于检测HPV35的探针、用于检测HPV39的探针、用于检测HPV45的探针、用于检测HPV51的探针、用于检测HPV52的探针、用于检测HPV56的探针、用于检测HPV58的探针、用于检测HPV59的探针、用于检测HPV68的探针中的任一种或任意多种的组合或全部；
所述用于检测中度高危亚型HPV的探针包括用于检测HPV53的探针、用于检测HPV66的探针、用于检测HPV73的探针、用于检测HPV81的探针、用于检测HPV82的探针、用于检测HPV83的探针中的任一种或任意多种的组合或全部。
在一个实施例中，所述两条简并引物由SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列组成。
在一个实施例中，用于检测HPV6的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，所述用于检测HPV11的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，用于检测HPV42的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，用于检测HPV43的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，用于检测HPV44的探针核苷酸序列如 SEQ ID NO.13所示；
用于检测HPV16的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，用于检测HPV18 的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，用于检测HPV31的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，用于检测HPV33的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.8 所示，用于检测HPV35的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，用于检测 HPV39的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，用于检测HPV45的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，用于检测HPV51的探针核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示，用于检测HPV52的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，用于检测HPV56的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，用于检测HPV58 的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，用于检测HPV59的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，用于检测HPV68的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.22 所示；
用于检测HPV53的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，用于检测HPV66 的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，用于检测HPV73的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，用于检测HPV81的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.24 所示，用于检测HPV82的探针如SEQ IDNO.26所示，用于检测HPV83的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
在一个实施例中，所述荧光定量PCR的反应包含特异性靶标序列和引物探针序列以及UNG的防污染体。
第二方面，提供了一种用于检测人类乳头瘤病毒HPV的成套DNA分子，包括两条简并引物和多个探针；其中，
所述两条简并引物可用于扩增至少24个亚型HPV；
所述多个探针包括用于检测低危亚型HPV的探针、用于检测高危亚型 HPV的探针、用于检测中度高危亚型HPV的探针；
所述用于检测低危亚型HPV的探针、所述用于检测高危亚型HPV的探针、所述用于检测中度高危亚型HPV的探针分别对应不同的荧光通道；
所述用于检测低危亚型HPV的探针包括用于检测HPV6的探针、用于检测HPV11的探针、用于检测HPV42的探针、用于检测HPV43的探针、用于检测HPV44的探针中的任一种或任意多种的组合或全部；
所述用于检测高危亚型HPV的探针包括用于检测HPV16的探针、用于检测HPV18的探针、用于检测HPV31的探针、用于检测HPV33的探针、用于检测HPV35的探针、用于检测HPV39的探针、用于检测HPV45的探针、用于检测HPV51的探针、用于检测HPV52的探针、用于检测HPV56的探针、用于检测HPV58的探针、用于检测HPV59的探针、用于检测HPV68的探针中的任一种或任意多种的组合或全部；
所述用于检测中度高危亚型HPV的探针包括用于检测HPV53的探针、用于检测HPV66的探针、用于检测HPV73的探针、用于检测HPV81的探针、用于检测HPV82的探针、用于检测HPV83的探针中的任一种或任意多种的组合或全部。
在一个实施例中，所述两条简并引物由SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列组成。
在一个实施例中，用于检测HPV6的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，所述用于检测HPV11的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，用于检测HPV42的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，用于检测HPV43的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，用于检测HPV44的探针核苷酸序列如 SEQ ID NO.13所示；
用于检测HPV16的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，用于检测HPV18 的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，用于检测HPV31的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，用于检测HPV33的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.8 所示，用于检测HPV35的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，用于检测 HPV39的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，用于检测HPV45的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，用于检测HPV51的探针核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示，用于检测HPV52的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，用于检测HPV56的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，用于检测HPV58 的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，用于检测HPV59的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，用于检测HPV68的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.22 所示；
用于检测HPV53的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，用于检测HPV66 的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，用于检测HPV73的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，用于检测HPV81的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.24 所示，用于检测HPV82的探针如SEQ IDNO.26所示，用于检测HPV83的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
第三方面，一种用于检测人类乳头瘤病毒HPV的PCR试剂，包括第二方面所述的成套DNA分子。
第四方面，一种用于检测人类乳头瘤病毒HPV的试剂盒，包括第二方面所述的成套DNA分子。
第五方面，提供了第二方面所述的成套DNA分子或第三方面所述的PCR 试剂或第四方面所述的试剂盒在制备用于筛查子宫颈癌的产品中的用途。
本发明提供的检测人类乳头瘤病毒的试剂、方法，可以一管检测24种 HPV型别并做相应分组，解决了以往定量PCR试剂通量小的问题，缩短大批量样本检测时间，且操作简便，成本低。
附图说明
图1A示出了本发明实施例提供的一种指数扩增图；其中，1表示扩增曲线，2表示阈值线，3表示Ct值；
图1B示出了本发明实施例提供的一种线性扩增图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
目前HPV的检测方法主要有细胞学检测和核酸DNA检测(NAT)。其中细胞学检测是目前临床检测和筛查常用的技术。随着分子生物学尤其是荧光定量PCR检测技术的发展，HPV DNA荧光定量检测试剂已越多越多的应用于临床检测和血液筛查。该方法操作简便，灵敏度高，定性检测的同时又可大幅度提高低病毒载量的检出率，降低细胞学检测由于窗口期、病毒变异、低病毒载量等引起的漏检率。可对样本进行高效可靠的筛查，以及对临床病情和用药效果进行监测，指导合理用药。
目前市场上已有国内外的同类试剂，以Roche公司的Amplicor试剂为金标准，但国内取得国家药监部门注册证书的同类试剂只有达安公司等在内的少数几家公司，且国产试剂不论是试剂灵敏度和特异性，均与进口试剂有差距。但进口试剂价格昂贵，不适用于大规模的宫颈癌预防筛查等，对国内医院临床检测应用来说成本也相对较高，增加了患者负担。另外，市场上的产品只有亚能、艾康、博晖创新等8家有和默乐类似的一次定性检测23-25种HPV型别，但多数基于操作复杂、成本更高的其他技术(PCR-反向点杂交法、表面等离子谐振法和基因芯片法等)，而且由于使用新型探针造成的成本增加使得难以进行应用于临床诊断。本发明实施例提供的方案可以一管检测24 种HPV型别并做相应分组，解决了以往定量PCR试剂通量小的问题，缩短大批量样本检测时间，且操作简便，成本低。
本发明实施例提供的方案还利用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)+dUTP系统防止实验室的假阳性结果，提高检测结果的可靠性。
接下来，在各实施例中对本发明实施例提供的方案进行具体介绍。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates； theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe， CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker， ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1，引物、探针设计
研究表明，HPV各型基因组的L1区既有一定的同源性又有一定的特异性，可以根据同源性序列设计简并引物。并设计低危亚型组别(HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44)、高危亚型组别(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、 HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68)和中度高危亚型(HPV53、HPV66、HPV73、HPV83、HPV82和HPV81)组别这三个组别共24 个型别HPV的探针，以对这24个型别HPV相应分类。
24个型别的HPV DNA的引物探针设计原理是：HPV各型基因组的L1区选择同源性高的序列设计正向和反向引物，在特异性高的序列设计探针序列，具体如下表1所示。
表1
Figure RE-GDA0002310756430000081
Figure RE-GDA0002310756430000091
如表1所示，不同组别的HPV探针连接有不同的荧光素，以在不同的荧光通道进行检测，实现对HPV的分组。属于同一组别的HPV探针可以连接有相同的荧光素。
实施例2，试剂盒
本实施例提供了一种试剂盒，该试剂盒可以包括表2所示的试剂。
表2
Figure RE-GDA0002310756430000092
其中，强阳性质控品中的HPV6、33、66型L1区基因的浓度高于弱阳性质控品中的HPV6、33、66型L1区基因的浓度。
实施例3，荧光定量PCR
在本实施例中介绍采用实施例2进行荧光定量CPR。包括如下步骤。
3.1，按照表3比例配制裂解工作液，上下颠倒充分混匀。
表3
样本数 内标 裂解液
n 2μL×(n+3) 50μL×(n+3)
注：“3”是指弱阳性质控品、强阳性质控品以及用户自行设置1管含无菌生理盐水的空白质控品。试验时必须添加内标。
3.2，样本处理(样本处理期)
3.2.1，如果离心机有制冷功能，请将温度设置到25℃。
3.2.2，取n个1.5mL离心管(n＝样本数)，做好标记后分别用带滤芯的吸头加入200μL已经混匀的样本(如样本保存于-20℃或-70℃则须取出置室温解冻)，10000g/min离心10min，弃上清，保留底部的细胞沉淀。另取3 个1.5mL离心管，分别加入50μL强阳性质控品、弱阳性质控品和无菌生理盐水。
3.2.3，分别用带滤芯的吸头加入52μL裂解工作液，漩涡混合器上振荡混匀，100℃静置10min，冷却至室温，10000g/min离心10min，取上清后应立即进行下一步实验。
3.3，扩增试剂准备(PCR前准备期)
3.3.1，从试剂盒中取出PCR buffer、引物探针和Taq酶，在室温下融化后进行混合，各试剂比例如表4所示。
表4
样本数 PCR buffer 引物探针 Taq酶
n 19.8μL×(n+3) 3μL×(n+3) 0.2μL×(n+3)
并振荡混匀简短离心，向设定的n+3个(3＝2管阳性质控+1管空白质控) 荧光定量PCR反应管中分别加入23.0μL，转移至样本处理区。
3.4，加样(样本处理期)
在装有PCR反应液的PCR反应管中分别加入制备好的模板2.0μL，同时做空白质控、阳性质控。
3.5，PCR反应(检测期)
将反应管放入荧光PCR检测仪中，循环参数设定如表5所示。
表5
Figure RE-GDA0002310756430000111
荧光信号的收集定为FAM(低危亚型组别)、HEX(中度高危亚型)、ROX (高危亚型组别)、CY5(内标)，数据的采集定在58℃。
检测结果分析如下。
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节基线(Baseline)的 Start值、End值和荧光阈值(Threshold值)(可自行调节，Start值可以在3-15之间，End值位于5-20之间，调整空白质控品的扩增曲线，使其平直或低于阈值线，具体可以图1A和图1B所示)。空白质控品Ct值应为阴性；强阳性质控品的FAM(HPV6型)、HEX(HPV66型)和ROX(HPV16型)的Ct值均位于20-25之间；弱阳性质控品的FAM(HPV6型)、HEX(HPV66型)和 ROX(HPV16型)的Ct值均位于23-28之间；CY5(内标)的Ct值应≤35。以上条件需要在同一次试验中同时满足，否则认为PCR反应无效，需要重新进行检测。具体如下：
1、待检样本显示阴性或待检样品FAM荧光(低危亚型组别)Ct＞37.10、 HEX荧光(中度高危亚型)Ct＞36.14、ROX荧光(高危亚型组别)Ct＞37.21 或无典型S型扩增曲线时，为阴性样本；
2、待检样本Ct值具备如表6所示条件，且呈典型S型扩增曲线时，判为阳性样本。
表6
Figure RE-GDA0002310756430000121
3、对具有典型S扩增曲线但浓度过高而导致内标没有扩增时，可直接报告为阳性样本，也可将样本进行十倍梯度稀释重新测定。
4、采用本试剂盒进行检验得到的结果仅供临床参考，不作为治疗或其它临床管理的唯一依据；最适样本类型及感染后的最高病毒滴度时间未经验证，因此，在同一患者分次、多部位采集样本可能会避免假阴性结果；不合理的样本采集、运输和处理、样本中病毒滴度过低均有可能导致假阴性结果；检测的病毒靶序列的变异会导致假阴性结果；可能会导致假阴性结果的未经验证的其它干扰因素包括：患者同时患有其它疾病时，其它疾病的病理代谢产物及针对其的治疗药物等因素。
本实施例具有如下优点：
单一管中进行24个型别HPV检测并进行低危亚型、高危亚型和中度高危亚型分类；解决了以往定量PCR试剂通量小的问题，缩短大批量样本检测时间，节约人力物力；
2、针对HPV病毒特异性的核酸片段设计扩增效率最好的引物探针序列，在经过优化后的缓冲液和Hotstart Taq酶的作用下，保证试剂盒的准确度和灵敏度；并且，高危型、中度高危型和低危型病毒感染临床处理过程不同。本发明在结果中直接报告病毒所属类别，可以快速进行治疗，减少病人致病风险；
3、还利用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)+dUTP系统防止实验室的假阳性结果，提高该检测的可靠性；
4、本发明HPV检测时，采样过程要求较高，本发明设计内标来监控采样，有效避免采样可能造成的假阴性问题。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江默乐生物科技有限公司
江苏默乐生物科技股份有限公司
<120> 检测人类乳头瘤病毒的方法、试剂及应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagggwcata ayaatggyat t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaaaatawa ctgmaaatca ty 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catcttccac atacaccaat tc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catctgtgtc taaatctgct ac 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccatatctac ttcagaaact acat 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acacagtctc ctgtacctgg gcaat 25
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctgtgtgtg ctgcaattgc aa 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cacacaagta actagtgaca g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcttctagtg acagtacata 20
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcttccatac cttctacata tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actaacatga ctttgtgtgc 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctactgaccc tactgtgc 18
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<212> DNA
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atgtgctgcc actacacag 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacacaaaa tcctgtgcca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttccccaaca tttactccaa g 21
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<212> DNA
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actttatgtg ctgaggtgaa 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccacacagtc tatgtccac 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacagaaca gttaagtaaa tatg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cattatgcac tgaagtaact aa 22
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<211> 25
<212> DNA
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actacttctt ctattcctaa tgtac 25
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actattaatg cagctaaaag cac 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctactacta ctgaatcagc tg 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acacaggcta gtagctctac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catctgctgc tgcagaa 17
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcagctgct gctacacagg ct 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
accattagca ctgctgttac tcc 23

Claims (10)

1.一种用于检测人类乳头瘤病毒HPV的方法，包括：在同一PCR反应管中，使用两条简并 引物和多个探针进行荧光定量PCR；其中，所述两条简并引物可用于扩增至少24个亚型HPV；
所述多个探针包括用于检测低危亚型HPV的探针、用于检测高危亚型HPV的探针、用于检测中度高危亚型HPV的探针；
所述用于检测低危亚型HPV的探针、所述用于检测高危亚型HPV的探针、所述用于检测中度高危亚型HPV的探针分别对应不同的荧光通道；
所述用于检测低危亚型HPV的探针包括用于检测HPV6的探针、用于检测HPV11的探针、用于检测HPV42的探针、用于检测HPV43的探针、用于检测HPV44的探针中的任一种或任意多种的组合或全部；
所述用于检测高危亚型HPV的探针包括用于检测HPV16的探针、用于检测HPV18的探针、用于检测HPV31的探针、用于检测HPV33的探针、用于检测HPV35的探针、用于检测HPV39的探针、用于检测HPV45的探针、用于检测HPV51的探针、用于检测HPV52的探针、用于检测HPV56的探针、用于检测HPV58的探针、用于检测HPV59的探针、用于检测HPV68的探针中的任一种或任意多种的组合或全部；
所述用于检测中度高危亚型HPV的探针包括用于检测HPV53的探针、用于检测HPV66的探针、用于检测HPV73的探针、用于检测HPV81的探针、用于检测HPV82的探针、用于检测HPV83的探针中的任一种或任意多种的组合或全部。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两条简并引物由SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于检测HPV6的探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述用于检测HPV11的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，用于检测HPV42的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，用于检测HPV43的探针核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，用于检测HPV44的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
用于检测HPV16的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，用于检测HPV18的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，用于检测HPV31的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，用于检测HPV33的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，用于检测HPV35的探针核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，用于检测HPV39的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，用于检测HPV45的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，用于检测HPV51的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，用于检测HPV52的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，用于检测HPV56的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，用于检测HPV58的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，用于检测HPV59的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，用于检测HPV68的探针核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示；
用于检测HPV53的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，用于检测HPV66的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，用于检测HPV73的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，用于检测HPV81的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，用于检测HPV82的探针如SEQ ID NO.26所示，用于检测HPV83的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应包含特异性靶标序列和引物探针序列以及UNG的防污染体。
5.一种用于检测人类乳头瘤病毒HPV的成套DNA分子，包括两条简并引物和多个探针；其中，
所述两条简并引物可用于扩增至少24个亚型HPV；
所述多个探针包括用于检测低危亚型HPV的探针、用于检测高危亚型HPV的探针、用于检测中度高危亚型HPV的探针；
所述用于检测低危亚型HPV的探针、所述用于检测高危亚型HPV的探针、所述用于检测中度高危亚型HPV的探针分别对应不同的荧光通道；
所述用于检测低危亚型HPV的探针包括用于检测HPV6的探针、用于检测HPV11的探针、用于检测HPV42的探针、用于检测HPV43的探针、用于检测HPV44的探针中的任一种或任意多种的组合或全部；
所述用于检测高危亚型HPV的探针包括用于检测HPV16的探针、用于检测HPV18的探针、用于检测HPV31的探针、用于检测HPV33的探针、用于检测HPV35的探针、用于检测HPV39的探针、用于检测HPV45的探针、用于检测HPV51的探针、用于检测HPV52的探针、用于检测HPV56的探针、用于检测HPV58的探针、用于检测HPV59的探针、用于检测HPV68的探针中的任一种或任意多种的组合或全部；
所述用于检测中度高危亚型HPV的探针包括用于检测HPV53的探针、用于检测HPV66的探针、用于检测HPV73的探针、用于检测HPV81的探针、用于检测HPV82的探针、用于检测HPV83的探针中的任一种或任意多种的组合或全部。
6.根据权利要求5所述的成套DNA分子，其特征在于，所述两条简并引物由SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列组成。
7.根据权利要求5所述的成套DNA分子，其特征在于，用于检测HPV6的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述用于检测HPV11的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，用于检测HPV42的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，用于检测HPV43的探针核苷酸序列如SEQID NO.12所示，用于检测HPV44的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
用于检测HPV16的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，用于检测HPV18的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，用于检测HPV31的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，用于检测HPV33的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，用于检测HPV35的探针核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，用于检测HPV39的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，用于检测HPV45的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，用于检测HPV51的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，用于检测HPV52的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，用于检测HPV56的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，用于检测HPV58的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，用于检测HPV59的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，用于检测HPV68的探针核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示；
用于检测HPV53的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，用于检测HPV66的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，用于检测HPV73的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，用于检测HPV81的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，用于检测HPV82的探针如SEQ ID NO.26所示，用于检测HPV83的探针核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
8.一种用于检测人类乳头瘤病毒HPV的PCR试剂，包括权利要求5-7任一项所述的成套DNA分子。
9.一种用于检测人类乳头瘤病毒HPV的试剂盒，包括权利要求5-7任一项所述的成套DNA分子。
10.权利要求5-7任一项所述的成套DNA分子或权利要求8所述的PCR试剂或权利要求9所述的试剂盒在制备用于筛查子宫颈癌的产品中的用途。
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