CN116516075B - 一种用于宫颈癌早筛和辅助诊断的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于宫颈癌早筛和辅助诊断的检测方法及试剂盒，所述引物探针组的反转录扩增片段序列位于(HR)‑HPV E6/E7基因mRNA选择性剪切转录本上从原E6翻译起始位点上游‑40nt至下游+420nt区间。本发明从转录水平及转录后调控着手，提高宫颈癌检出率，简单方便，有较高的敏感性和特异性，可以提示病毒基因的活性状态和癌变的进展程度，是目前筛查宫颈癌变的有效方法。通过本发明的检测方法及试剂盒进行宫颈癌的初筛或自查，实现早发现早治疗，可以使患者的病情得到控制，延长生存期，避免癌症发展。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，尤其是涉及一种用于宫颈癌早筛和辅助诊断的检测方法及试剂盒。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重地危害着女性的健康。人乳头瘤病毒（human papilloma virus, HPV）感染是诱发宫颈癌的根本原因。HPV是一种无包膜的环状、双链、小DNA病毒，主要感染人皮肤和粘膜上皮细胞，诱发疣状增生和良恶性肿瘤。依据外壳蛋白L1的基因同源性，HPV可分为不同的亚型，目前已分离鉴定出亚型高达118种。根据感染部位不同，可分为嗜皮肤组和嗜黏膜组两大类。嗜黏膜组可根据感染后诱发病变的情况不同进行细分，根据 HPV 的致病力及引起疾病的危重程度，分为高危型HPV 和低危型HPV：其中HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59等14种属于诱发上皮组织恶性增生的高危型HPV，与宫颈癌及癌前病变的发生密切相关，也与口咽、肛门、阴道、阴唇及阴茎癌的发生有关。有效快捷的HPV检测手段，及时发现宫颈癌患者的癌前病变，对宫颈癌进行有效预防和及时治疗，是提高宫颈癌患者生存率的关键所在。
近年来，HPV检测技术日益增多，方法层出不穷。临床上采用的HPV产品多采用以下两种技术：针对靶点的PCR扩增和酶切信号放大技术。基于荧光定量PCR技术，有较高的灵敏度和特异度，可对病毒载量进行测定，也可以进行HPV具体分型。基于通用引物PCR技术，虽然对HPV的检出率较高，但不能进行HPV的分型，对于某些HPV型别甚至无法扩增，不适用于HPV的多重感染。导流杂交法是一种针对HPV L1基因进行的PCR扩增，可确定HPV基因型别，可以判断是否多重感染。流氏荧光杂交技术（液相芯片技术），是一种高通量检测技术，针对HPV的L1和L2进行检测，可以查出13种HPV型别，并进行分型，可以判断是否多重感染，速度较快，但对检测设备要求较高，花费较大。酶切放大信号技术是通过放大与HPV-DNA中的L1基因结合的化学信号来检测HPV病毒的DNA或RNA。可进行定性和半定量，但不能区分具体型别，对HPV的检出有较好的敏感性和特异性，可直接检测HPV-DNA序列，具有较好的灵敏度及特异度。
阴道镜检查及宫颈活体组织检查等病理检查结果为宫颈癌诊断的“金标准”。组织病理和免疫组化等形态学可以证实HPV-DNA的表达，直接定位HPV病毒蛋白表达的位置，确认HPV导致的疾病类型，但其灵敏度较低，特异性较差，操作繁琐，且不利于患者的广泛筛查。
目前，临床上宫颈癌的筛查方法，以HPV L1基因为检测靶点，HPV病毒在整合到宿主DNA时，L1壳蛋白容易发生丢失，导致表达减少或缺失，在检测中易造成假阴性。
E6、E7是主要的致癌基因，在感染至宿主的过程中编码致癌蛋白E6、E7。E6和E7蛋白在导致恶性肿瘤过程中发挥着重要的作用。E6和E7蛋白都可通过与转录因子的结合并使其失活，从而导致细胞肿瘤的发生。HPV E6/E7 mRNA的检测，从转录水平及转录后调控着手，提高宫颈癌检出率，简单方便，有较高的敏感性和特异性，可以提示病毒基因的活性状态和癌变的进展程度，是目前筛查宫颈癌变的有效方法。
发明内容
在深入的研究过程中，本发明人意外地发现某些(HR)-HPV E6/E7基因mRNA选择性剪切转录本在宫颈癌癌变组织中特异性存在，通过检测该类转录本，可以评估宫颈癌癌变趋势。
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，并利用意外发现的优势，提出一种用于宫颈癌早筛和辅助诊断的检测方法及试剂盒。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种特异性高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA的引物探针组，所述引物探针组的反转录扩增片段序列位于(HR)-HPV E6/E7基因mRNA选择性剪切转录本上从原E6翻译起始位点上游-40nt至下游+420nt 区间。
优选地，所述引物探针组用于检测的以下14种高危型(HR)-HPV亚型：HPV16型、HPV18型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV66型、HPV68型中的任意一种或多种。
优选地，所述扩增片段的核酸序列如序列表SEQ ID NO:1~15所示或与序列表SEQID NO:1~15具有92%以上同一性的核酸序列。
优选地，所述引物探针组包括如下15个引物探针组：
用于检测HPV16型的引物探针组一由序列表SEQ ID NO:16所示的上游引物16dark-F2、序列表SEQ ID NO:17所示的下游引物16E7R和序列表SEQ ID NO:18所示的探针16P1组成；
用于检测HPV16型的引物探针组二由序列表SEQ ID NO:19所示的上游引物16F2、序列表SEQ ID NO:20所示的下游引物16R2和序列表SEQ ID NO:21所示的探针16P-2组成；
用于检测HPV18型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:22所示的上游引物18F、序列表SEQ ID NO:23所示的下游引物18QR-darkR3和序列表SEQ ID NO:24所示的探针18P1组成；
用于检测HPV31型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:25所示的上游引物31F19724、序列表SEQ ID NO:26所示的下游引物31R35423和序列表SEQ ID NO:27所示的探针31PP28229组成；
用于检测HPV33型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:28所示的上游引物33F21724、序列表SEQ ID NO:29所示的下游引物33R36921和序列表SEQ ID NO:30所示的探针33P24530组成；
用于检测HPV35型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:31所示的上游引物35F21824、序列表SEQ ID NO:32所示的下游引物35R37022和序列表SEQ ID NO:33所示的探针35P24626组成；
用于检测HPV39型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:34所示的上游引物39F23120、序列表SEQ ID NO:35所示的下游引物39R37018和序列表SEQ ID NO:36所示的探针39P25223组成；
用于检测HPV45型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:37所示的上游引物45F225、序列表SEQ ID NO:38所示的下游引物45R313和序列表SEQ ID NO:39所示的探针45P254组成；
用于检测HPV51型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:40所示的上游引物51F16829、序列表SEQ ID NO:41所示的下游引物5H1QR-2和序列表SEQ ID NO:42所示的探针5H1QP20625组成；
用于检测HPV52型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:43所示的上游引物52F20226、序列表SEQ ID NO:44所示的下游引物52R35020和序列表SEQ ID NO:45所示的探针52P22828组成；
用于检测HPV56型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:46所示的上游引物56F21923、序列表SEQ ID NO:47所示的下游引物56R31328和序列表SEQ ID NO:48所示的探针56P20组成；
用于检测HPV58型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:49所示的上游引物58F21723、序列表SEQ ID NO:50所示的下游引物58R32818和序列表SEQ ID NO:51所示的探针58P24626组成；
用于检测HPV59型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:52所示的上游引物5H9Fa、序列表SEQ ID NO:53所示的下游引物59R35925和序列表SEQ ID NO:54所示的探针59P21925组成；
用于检测HPV66型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:55所示的上游引物66F21226、序列表SEQ ID NO:56所示的下游引物66R30526和序列表SEQ ID NO:57所示的探针66P24824组成；
用于检测HPV68型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:58所示的上游引物68F11222、序列表SEQ ID NO:59所示的下游引物68R27819和序列表SEQ ID NO:60所示的探针68P15827组成。
优选地，所述探针包括TaqMan探针和/或杂交探针。
优选地，所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团，更优选为所述探针的5’端标记有荧光基团、3’端标记有淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括Cyan500、FAM、VIC、Cy3、JOE、TAMRA、Texas Red、ROX、Cy5、Cy5.5、TET、HEX、NED中的任意一种。
优选地，所述淬灭基团包括MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、NFQ、DABCYL、Eclipse中的任意一种。
第二方面，本发明还提供了上述引物探针组在确定HPV E6/E7癌基因表达情况、检测HPV致癌活动产物或预测宫颈癌病变趋势中应用。
第三方面，本发明还提供了一种基于上述引物探针组的宫颈癌筛查试剂盒，所述试剂盒中包括上述引物探针组。所述试剂盒基于实时荧光定量PCR检测常见高危型(HR)-HPV亚型E6/E7 mRNA。
优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
优选地，所述阳性质控品含有特异性高危型(HR)-HPV亚型E6/E7 RNA和/或DNA。
第四方面，本发明还提供了一种应用上述引物探针组进行宫颈癌早筛和癌变风险评估的检测方法。
优选地，所述检测方法为基于核酸扩增的检测手段和/或核酸分子杂交原理的检测方法。
优选地，所述检测方法为PCR、数字PCR、交叉引物扩增技术、荧光定量PCR技术、熔解曲线、重复序列标记物的定量荧光多聚酶链反应技术、多重连接依赖性探针扩增、侧向层析试纸条、极限PCR、光PCR、Cast PCR、脉冲PCR、巢式PCR、PCR芯片、分子信标核酸检测技术、等温扩增技术中的至少一种。
优选地，所述检测方法为应用上述试剂盒对提取的RNA样本进行荧光定量PCR来检测分析HPV RNA的水平。
优选地，所述检测方法用于HPV分型定量检测和/或HPV的单重以及多重感染检测。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
（1）本发明提供一种常见高危型(HR)-HPV亚型（包括16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型）HPV E6/E7 mRNA的单重以及多重RT-PCR 检测方法及试剂盒，实现对常见高危型(HR)-HPV亚型的快速准确定量。
（2）本发明通过大量的数据分析最终确定了常见高危型(HR)-HPV亚型E6/E7 mRNA选择性剪切转录本序列以及相应的引物探针，确定了一种宫颈癌检测的新方法。
（3）本发明所提供的选择性剪切转录本序列以及相应的引物探针及基于荧光定量PCR技术的诊断方法，克服了现有技术检测手段诊断敏感性较低，假阳性率较高，不能分型等的缺陷。
（4）本发明从转录水平及转录后调控着手，提高宫颈癌检出率，简单方便，有较高的敏感性和特异性，可以提示病毒基因的活性状态和癌变的进展程度，是目前筛查宫颈癌变的有效方法。通过本发明的检测方法及试剂盒进行宫颈癌的初筛或自查，实现早发现早治疗，可以使患者的病情得到控制，延长生存期，避免癌症发展。
附图说明
图1为RT-qPCR检测临床样本HPV 16 E6/E7 mRNA的扩增曲线；
图2为RT-qPCR检测临床样本HPV 18 E6/E7 mRNA的扩增曲线；
图3为RT-qPCR检测多重阳性对照品HPV 16/18/58/66 E6/E7 mRNA的扩增曲线；
图4为RT-qPCR检测多重阳性对照品HPV 35/52/68E6/E7 mRNA的扩增曲线；
图5为RT-qPCR检测多重阳性对照品HPV 33/39/56 E6/E7 mRNA的扩增曲线；
图6为RT-qPCR检测HPV 16 E6/E7 mRNA的阳性对照品（一）扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图7为RT-qPCR检测HPV 16 E6/E7 mRNA的阳性对照品（二）扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图8为RT-qPCR检测HPV 18 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图9为RT-qPCR检测HPV 31 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图10为RT-qPCR检测HPV 33 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图11为RT-qPCR检测HPV 45 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图12为RT-qPCR检测HPV 35 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图13为RT-qPCR检测HPV 39 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图14为RT-qPCR检测HPV 51 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图15为RT-qPCR检测HPV 52 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图16为RT-qPCR检测HPV 56 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图17为RT-qPCR检测HPV 58 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图18为RT-qPCR检测HPV 66 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图19为RT-qPCR检测HPV 68 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图20为RT-qPCR检测HPV 59 E6/E7 mRNA的阳性对照品扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5）；
图21为HPV16型不同浓度的引物量的结果图；（图中由上至下曲线浓度依次为1.2μM、1.6 μM、0.8 μM、0.4 μM、0.1 μM）；
图22为HPV18型不同浓度的引物量的结果图；（图中由上至下曲线浓度依次为1.6μM、1.2 μM、0.8 μM、0.4 μM、0.1 μM）；
图23为目标基因检测子宫颈癌的ROC曲线；
图24为实施例6的扩增曲线（图中由左至右曲线浓度依次为1.5×108copies/mL、1.5×107copies/mL、1.5×106copies/mL、1.5×105copies/mL、1.5×104copies/mL、1.5×103copies/mL）。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
本发明的实施例提供的是一种单重以及多重早期筛查宫颈癌常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA RT-qPCR检测方法，该检测方法指利用本发明所述的常见高危型(HR)-HPVE6/E7 mRNA的正向引物、反向引物、Taqman探针（5’-3’），及所述的酶系、RT-qPCR反应体系、阳性对照和阴性对照，使用RT-qPCR技术对常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA进行检测，对宫颈癌进行早期诊断。
需要说明的是，检测方法还可选择PCR、数字PCR、交叉引物扩增技术、荧光定量PCR技术、熔解曲线、重复序列标记物的定量荧光多聚酶链反应技术、多重连接依赖性探针扩增、侧向层析试纸条、极限PCR、光PCR、Cast PCR、脉冲PCR、巢式PCR、PCR芯片、分子信标核酸检测技术、等温扩增技术中的任一种。上述技术均为现有技术中的常规技术，为了进一步解释具体的实验方法，以下为实验方法的具体操作方式的举例，但是本发明的操作方法并不局限于此。
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荧光定量PCR技术：徐婷婷.荧光定量PCR技术应用综述[J].畜禽业,2010(10):48-50.
高分辨率熔解曲线（HRM）分析技术：Yin Xiaomao et al. High-resolutionmelting curve analysis for rapid detection of rifampin resistance inMycobacterium tuberculosis: a meta-analysis.[J]. Journal of clinicalmicrobiology, 2013, 51(10) : 3294-9.
重复序列标记物的定量荧光多聚酶链反应技术：易翠兴,李东至,袁思敏,李发涛,李伟,廖灿.QF-PCR技术联合染色体核型分析在羊水产前诊断中的应用[J].海南医学,2020,31(20):2617-2619.
多重连接依赖性探针扩增：吴慧,孟祥吉,周长胜.MLPA技术应用于SMA产前诊断的临床价值[J].智慧健康,2020,6(22):76-77.
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实施例1检测方法的操作步骤
1.1 标本来源
HPV16、HPV18临床样本。
1.2宫颈脱落细胞中RNA的提取
1.2.1 样本处理
（1）取100 μL待检样本至1.5 mL干净的离心管中，加入10 μL 5 M NaCl溶液，用涡旋振荡器充分震荡10 s；
（2）加入10 μL蛋白酶K，在涡旋振荡器上充分震荡10 s；
（3）配制新鲜的裂解液，其组成为：130 μL裂解液/100 μL样本，9 μL肝糖原/100 μL样本，0.2 μL tRNA/100 μL样本，充分混匀以制成新鲜配制的裂解液；
（4）将139 μL新鲜配制的裂解液加入到样本管中，然后用涡旋振荡器充分震荡10s，取出短暂快速离心5 s，然后放置在56℃孵育30 min；
1.2.2 DNA捕获
（1）将磁珠充分涡旋振荡以完全重悬；
（2）将样本管从孵育器中取出，然后加入完全重悬的磁珠60 μL和230 μL结合液，在涡旋振荡器上充分震荡10 s（注意：需经常振荡重悬磁珠，以保证吸取时磁珠的均匀性，建议每加3-4组样本后，重悬磁珠后再进行后续样本的添加）；
（3）将震荡后的样本管，置于旋转混匀器上旋转5-10 min以进行磁珠捕获；
（4）将样本管从旋转混匀器上取下，在10 000 g的条件下离心30 s使磁珠充分聚集；
（5）将离心后的样本管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，用枪头小心移去上清（注：避免枪头搅动磁珠，使得磁珠同上清一起被除去从而影响得率）；
1.2.3 洗涤
（1）样本管移去上清后，不必将样本管从磁力架上取下，直接加入400 μL洗涤液；
（2）待溶液完全澄清后，磁珠完全分离，用枪头小心移去上清；
（3）保持样本管在磁力架上，加入400 μL洗涤液，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清；
（4）将样本管从磁力架上取下，于10 000 g的条件下离心30 s，使得残留的洗涤液完全聚集到管底；
（5）将样本管置于磁力架上，待磁珠完全分离后，用10 μL枪头小心移除残留的液体；
（6）将样本管从磁力架上取下，置于56℃金属浴中，放置1-2 min，除去残留的乙醇（注：干燥时间不可过长，残留的乙醇会影响后续的定量检测反应）；
1.2.4 RNA洗脱
（1）沿着样本管的管壁加入30-100 μL洗脱液，用100 μL的枪头反复吹吸，以完全重悬磁珠；
（2）将样本管置于70℃孵育器孵育7-10 min；
（3）将样本管从孵育器中取出，于20 000 g离心2 min，然后置于磁力架上，待磁珠完全分离后，用10 μL枪头小心将上清液转移至新的干净的离心管中；
（4）为了避免吸入磁珠，在离心管中还剩余少量液体时，将其于20 000 g离心2min，然后置于磁力架上以吸出剩余的液体。
1.3 RT-qPCR
取宫颈脱落细胞提取的RNA 10μl作为模板，按照反转录试剂盒的常规操作步骤，运用设计的特异正向引物、反向引物和Taqman探针检测待测RNA，正向引物、反向引物和Taqman探针的序列见SEQ ID NO:16-18和SEQ ID NO:22-24，扩增曲线见附图1、图2。
（1）在冰上操作，在PCR管中按表1比例加入各试剂，涡旋混匀。
表1 RT-qPCR体系
（2）标准扩增程序见表2。
表2 标准扩增程序
实施例2 基于实时荧光定量PCR检测常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA早期筛查宫颈癌多重检测试剂盒。
利用实施例1所提供的常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA序列及基于所述常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA特异性序列得到的引物、探针等，进行宫颈癌的早期筛查。
2.1 提取RNA
具体操作方法如1.2。
2.2 RT-qPCR扩增检测
使用2.1中提取的RNA作为模板，加入酶系、RT-qPCR反应体系，正反向引物和荧光探针组，配制扩增反应体系；设置反应条件进行RT-qPCR反应得到扩增曲线，对扩增曲线进行结果分析。作为优选，对每一个样本每次检测时同时扩增三个重复孔，另以阴性标准品代替扩增反应体系中的样本RNA模板，加入RNase free H2O，加入酶系、RT-qPCR反应体系，正反向引物和荧光探针组，配制扩增反应体系，作为阴性对照孔。
作为本发明一种多重早期筛查宫颈癌常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA的鉴定检测试剂盒的一种优选方案，其中：所述引物设计优选包括以下步骤：获取常见高危型(HR)-HPV E6/E7选择性转录本产量最高的mRNA相关基因序列（见SEQ ID NO:1-15）；按照其引物设计原则，分别针对其特异性目标片段设计特异性引物和荧光探针（见SEQ ID NO:16-60）。
所述荧光探针组的所有探针均含有5’端荧光报告基团和3’端荧光淬灭基团，所述荧光探针组中第一探针5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为MGB；所述荧光探针组中第二探针5’端荧光报告基团为VIC，3’端荧光淬灭基团为MGB；所述荧光探针组中内参质控探针5’端荧光报告基团为ROX，3’端荧光淬灭基团为MGB，所述荧光报告基团可选自FAM、Cy5、VIC、ROX中的一种；所述荧光淬灭基团优选为BHQ1、MGB中的一种；所述荧光报告基团优选为FAM、Cy5、VIC和ROX，分别标记不同的探针以区别不同亚型的荧光信号。实施例2中，对本发明常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA的鉴定检测试剂盒中常见亚型及内参进行配组，得到能够使常见亚型的检测同时准确且干扰小的报告基因组合，表3所示为其中一种优选的HPV亚型荧光信号组合，多重检测结果见图3-图5。
表3 荧光基团的携带基团
作为本发明所述多重宫颈癌早期筛查荧光定量RT-qPCR检测试剂盒的一种优选方案，其中：所述引物探针包括，常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA和RPP30（内参）正向引物、反向引物、Taqman探针（5’-3’）。
本发明提供了如下技术方案：一种多重早期筛查结宫颈癌常见高危型(HR)-HPVE6/E7 mRNA RT-qPCR检测试剂盒，包括，RT-qPCR反应液、酶反应液、引物探针混合物、无菌无核酸酶水、阳性对照和阴性对照。
所述RT-qPCR反应液，包括dNTP、Mg2+、PCR缓冲液；所述酶反应液，包括反转录酶和Taq酶；所述引物探针混合物，成分为常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA的特异性引物和探针。
试剂盒中还可包括阳性质控品，其中阳性对照品用于定性检测，为常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA序列片段，包括16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型的RNA片段；内质控包含内参基因RPP30序列片段的RNA序列片段；阴性质控品：RNase free H2O；RT-Taq mix试剂。
图6-图20所示，为常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA扩增曲线图。其中各mRNA的标准曲线为：
16型（引物探针组一）：Y=-3.684X+17.537，R2=0.998；
16型（引物探针组二）：Y=-3.943X+17.465，R2=0.993；
18型：Y=-3.966X+17.768，R2=0.998；
31型：Y=-3.178X+13.972，R2=0.996；
33型：Y=-3.28X+13.426，R2=0.999；
35型：Y=-3.343X+13.486，R2=0.997；
39型：Y=-3.314X+14.503，R2=0.999；
45型：Y=-3.362X+13.666，R2=0.999；
51型：Y=-3.322X+14.208，R2=0.999；
52型：Y=-3.161X+15.104，R2=0.991；
56型：Y=-3.341X+13.243，R2=0.999；
58型：Y=-3.276X+14.141，R2=1；
59型：Y=-3.493X+12.893，R2=0.998；
66型：Y=-3.323X+15.412，R2=1；
68型：Y=-3.395X+13.136，R2=0.998；
X分别为常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA序列片段的相对浓度，人为设定为以10倍为梯度进行的梯度稀释的浓度；Y为Ct值。
实施例3
实施例3与实施例2相似，不同的是，引物探针序列如表4所示，引物备选。
表4 备选引物序列
标准曲线为：
16型：Y=-4.716X+19.324，R2=0.998；
18型：Y=-4.271X+17.818，R2=0.998；
结果证明实施例2的引物探针组的效果优于实施例3。
实施例4 引物浓度优化
引物待优化浓度分别为0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 μM。PCR反应体系：2×Hifair VNMP Buffer 12.5 μL、Hifair VN Enzyme Mix (UDG plus)1.5 μL、模板RNA 2 μL、Probe(10 uM) 1 μL、Primer Mix，加水补足至25 μL，PCR反应条件不变。
结果如图21和图22所示，当引物浓度为0.4 μM时，曲线呈S形，所以本实验采用0.4μM的引物进行后续实验。
实施例5
选取868例阴道宫颈脱落细胞标本（359例子宫颈癌标本，509例正常子宫颈标本，均经病理确认），按实施例1的检测方法进行操作。
捕获及RT-PCR反应以RPP30作为内参基因，最后根据CT值判断目标基因CT值≦38判断为阳性，CT值>38判断为阴性。
根据这868例阴道宫颈脱落细胞标本结果，使用IBM SPSS statistics 20软件绘制该目标基因检测子宫颈癌的ROC曲线，如图23所示。
结果显示，在特异性为95.28％时，对子宫颈癌敏感性高达91.36％，检测子宫颈癌的ROC曲线下面积为0.979，95％CI为0.970～0.988。
实施例6 检测方法的检出限
使用试剂盒阳性质控品中的阳性标准品用于定量检测，阳性标准品为常见高危型(HR)-HPV E6/E7 mRNA序列对应的DNA片段，包括16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型、68型的序列片段。
以HPV 16亚型为例：所述阳性标准品原始浓度为1.5×109 copies/mL，10倍梯度稀释，制备标准品ST1：浓度为1.5×108copies/mL；标准品ST2：浓度为1.5×107copies/mL；标准品ST3：浓度为1.5×106copies/mL；标准品ST4：浓度为1.5×105copies/mL；标准品ST5：浓度为1.5×104copies/mL；标准品ST6：浓度为1.5×103copies/mL。
实验结果如图24及表5所示，标准曲线至ST5仍保持良好的线性度，对应反应体系内样本浓度为3×103copies/m，所以ST5为本试剂盒作为精确定量的最低定量限。ST6点虽然不能维持良好的线性，但仍可有效地检出，区别于作为阴性对照的NTC，ST6点对应的浓度为3×102copies/mL，所以本试剂盒的检出限为3×102copies/mL。
表5 检出限结果
使用相同方法制备其他亚型的标准品，验证其他亚型的最低定量限和检测下限，所得结果与HPV16型结果一致。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种针对特异性高危型HPV E6/E7 mRNA的引物探针组，其特征在于：
所述引物探针组包括如下13个引物探针组中的一种或多种：
用于检测HPV16型的引物探针组一由序列表SEQ ID NO:16所示的上游引物16dark-F2、序列表SEQ ID NO:17所示的下游引物16E7R和序列表SEQ ID NO:18所示的探针16P1组成；
用于检测HPV16型的引物探针组二由序列表SEQ ID NO:19所示的上游引物16F2、序列表SEQ ID NO:20所示的下游引物16R2和序列表SEQ ID NO:21所示的探针16P-2组成；
用于检测HPV31型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:25所示的上游引物31F19724、序列表SEQ ID NO:26所示的下游引物31R35423和序列表SEQ ID NO:27所示的探针31PP28229组成；
用于检测HPV33型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:28所示的上游引物33F21724、序列表SEQ ID NO:29所示的下游引物33R36921和序列表SEQ ID NO:30所示的探针33P24530组成；
用于检测HPV35型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:31所示的上游引物35F21824、序列表SEQ ID NO:32所示的下游引物35R37022和序列表SEQ ID NO:33所示的探针35P24626组成；
用于检测HPV39型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:34所示的上游引物39F23120、序列表SEQ ID NO:35所示的下游引物39R37018和序列表SEQ ID NO:36所示的探针39P25223组成；
用于检测HPV45型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:37所示的上游引物45F225、序列表SEQ ID NO:38所示的下游引物45R313和序列表SEQ ID NO:39所示的探针45P254组成；
用于检测HPV51型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:40所示的上游引物51F16829、序列表SEQ ID NO:41所示的下游引物5H1QR-2和序列表SEQ ID NO:42所示的探针5H1QP20625组成；
用于检测HPV52型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:43所示的上游引物52F20226、序列表SEQ ID NO:44所示的下游引物52R35020和序列表SEQ ID NO:45所示的探针52P22828组成；
用于检测HPV56型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:46所示的上游引物56F21923、序列表SEQ ID NO:47所示的下游引物56R31328和序列表SEQ ID NO:48所示的探针56P20组成；
用于检测HPV58型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:49所示的上游引物58F21723、序列表SEQ ID NO:50所示的下游引物58R32818和序列表SEQ ID NO:51所示的探针58P24626组成；
用于检测HPV66型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:55所示的上游引物66F21226、序列表SEQ ID NO:56所示的下游引物66R30526和序列表SEQ ID NO:57所示的探针66P24824组成；
用于检测HPV68型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:58所示的上游引物68F11222、序列表SEQ ID NO:59所示的下游引物68R27819和序列表SEQ ID NO:60所示的探针68P15827组成。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：还包括如下引物探针组：
用于检测HPV18型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:22所示的上游引物18F、序列表SEQ ID NO:23所示的下游引物18QR-darkR3和序列表SEQ ID NO:24所示的探针18P1组成。
3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：还包括如下引物探针组：
用于检测HPV59型的引物探针组由序列表SEQ ID NO:52所示的上游引物5H9Fa、序列表SEQ ID NO:53所示的下游引物59R35925和序列表SEQ ID NO:54所示的探针59P21925组成。
4.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：所述探针包括TaqMan探针。
5.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：
所述探针的5’端标记有荧光基团、3’端标记有淬灭基团；所述荧光基团包括Cyan500、FAM、VIC、Cy3、JOE、TAMRA、Texas Red、ROX、Cy5、Cy5.5、TET、HEX、NED中的任意一种；所述淬灭基团包括MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、NFQ、DABCYL、Eclipse中的任意一种。
6.一种权利要求1-5任一所述的引物探针组在制备宫颈癌筛查或宫颈癌癌变风险评估的试剂或试剂盒的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；所述阳性质控品含有特异性高危型HPV亚型E6/E7 RNA和/或DNA，所述特异性高危型HPV亚型E6/E7 RNA的核酸序列如序列表SEQ ID NO:1-15所示。
8.根据权利要求 6所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒基于核酸扩增原理。
9.根据权利要求 6所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒基于核酸分子杂交原理。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒基于PCR技术。
11.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒用于HPV分型检测。
12.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒用于HPV定量检测。
13.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒用于HPV的单重以及多重感染检测。
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