CN108085419A - 探针及引物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学及医学检验和体外诊断领域。具体而言，本发明提供了一种探针及引物组合物，及其用于检测人乳头瘤病毒及相关病症的试剂盒。本发明的试剂盒具有显著提高的灵敏度和高度特异性，达到了降低漏检率和排除假阳性的效果，在体外检测及临床领域具有很高的应用价值。

Description

探针及引物组合物
技术领域
本发明涉及分子生物学及医学检验和体外诊断领域。具体而言，本发明涉及一种探针及引物组合物，及其用于检测人乳头状瘤病毒及相关病症的试剂盒。
背景技术
近年来，我国宫颈癌呈高发趋势，成为女性第二大最常见的恶性肿瘤，仅次于乳腺癌。每年新发病例约13.5万，占全球发病数量的1/3，占女性生殖系统恶性肿瘤发病率的73－93％，为发达国家的6倍，并趋于年轻化，年龄在35岁以下的宫颈癌患者占到三分之一，且性活跃的年轻妇女感染率最高，感染的高峰年龄在18-28岁，感染率可达40％以上。在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌，而在全世界每年新增的宫颈癌病例中，也约有三分之一是来自中国。虽然癌早期和癌前病变阶段并没有特别的临床表现，易被忽视，但由于宫颈癌的病因明确，且发展过程中存在较长的、可逆转的癌前病变期，因而也是唯一一种可以通过医学干预降低发病率和死亡率的恶性肿瘤。如果能及时发现宫颈癌前病变，并且在癌前病变阶段进行医学干预，其治愈率可高达98％。但是，一旦发展成为癌症，则只有20％的女性患者能存活五年。因此，筛查仍是目前预防宫颈癌的关键。
研究发现，几乎所有(99.7％)的宫颈癌都是因HPV感染所引起的。诺贝尔医学奖获得者Harald zur Hausen首先发现了HPV导致宫颈癌，并对其机制进行了深入研究，最终证明HPV感染是引起宫颈癌发生的主要病因。人乳头状瘤病毒 (human papillomavirus，HPV)是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。
病毒型别的区分和鉴定主要是依据L1基因序列的同源性比较进行的。如果L1基因的同源性与其他型别相比小于90％，则称其为一个新“型”(type)，如果同源性在90％-98％之间，则称其为“亚型”(subtype)，同源性在98％以上，则称为型内“变异株”(variant)。而HPV感染细胞及低级鳞状上皮内病变细胞中病毒常成游离状态，随着细胞异型程度的加重，高危型病毒基因组常发生断裂，诱发病毒序列整合到宿主基因组中，整合发生时，E1、E2、E5及部分的 L基因序列断裂丢失。因此，本发明对病毒的检测区域选择了L1区的后半段，既避免了整合丢失，又能最大程度地防止引物探针的错配造成的高低危型之间交叉反应或高危型之间的分型错误。随着分子生物学技术的发展，目前已分出 100余种HPV亚型，其中40多种跟宫颈感染和病变相关。
根据导致宫颈癌的能力不同，可将HPV分为高危型和低危型。只有持续的高危型HPV感染才会发生癌前病变或宫颈癌，一般平均8到24月可发生轻度、中度和高度的宫颈癌前病变(CIN1、CIN2、CIN3)，再平均8到10年才可发生浸润癌。全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA的存在，其中HPV16型、18型、45型和31型感染占80％。而低危型HPV 一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌。目前，世界卫生组织已确认了与宫颈癌相关的14种高危型HPV类型，即HPV16、18、31、 33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68，根据来自世界各地的宫颈癌组织标本的研究发现，在这14种高危型中，HPV16/18型的感染率最高，达70％，且中国不同区域的宫颈癌及宫颈高度病变也都是以感染HPV16和18为主，约 85％左右的宫颈癌确诊病例属于这两种类型，且HPV16/18的感染率和致癌率都明显高于其他高危HPV型别，感染HPV16/18的女性，不论是近期还是远期，进展为高度宫颈病变的风险都远远高于其它HPV型别阳性。因而，美国阴道镜和宫颈病理协会ASCCP新版指南中关于宫颈癌的筛查流程里，特别提出要对细胞学阴性、HPV阳性的30岁以上女性进行HPV16/18基因分型检测，这也将有助于更好地对高风险人群进行风险分层管理，及时发现细胞学正常结果中患CIN 的高危人群，以及ASCUS结果中需要更密切随访的人群。而对于其它12种高风险HPV，近期发生CIN2以上病变的风险相对较低，则无需进行基因分型。
人乳头状瘤病毒实验室检测方法主要有：分子杂交法、荧光定量PCR、基因芯片法。由于荧光定量PCR方法具有高特异性和高灵敏度，可以对不同型别的HPV进行精确分型，所以是目前较普遍的检测技术；分子杂交法中的二代杂交捕获法(HCⅡ)以其高灵敏度、操作简便、可以区分高危与低危型病毒的特性成为宫颈癌和癌前病变大规模筛查的优选方法，但由于该方法在高危型别或低危型别之间存在交叉反应，不能进行具体分型，因而无法判断是否为多重感染或由某一型别引起的持续感染，无法满足HPV亚型的流行病学调查；基因芯片技术是一种大规模的固相分子杂交技术，可用于HPV DNA分型和检测，但由于基因芯片法对实验硬件投入要求较高，操作复杂，成本高，所以在使用推广方面有较大障碍。因此，本领域亟需一种操作简便且灵敏度高，特异性强的人乳头状瘤病毒检测手段。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种探针及引物组合物，其包含如下组分：
(1)包含13种探针的第一探针组及包含24种引物的第一引物组，其中所述 13种探针分别具有如SEQ ID No：1-13所示的核苷酸序列，所述24种引物分别具有如SEQ ID No：14-37所示的核苷酸序列；
(2)包含1种探针的第二探针组及包含2种引物的第二引物组，其中所述1 种探针具有如SEQ ID No：38所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID No：39-40所示的核苷酸序列；
(3)包含1种探针的第三探针组及包含2种引物的第三引物组，其中所述1 种探针具有如SEQ ID No：41所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID No：42-43所示的核苷酸序列；及任选的
(4)包含1种探针的第四探针组及包含2种引物的第四引物组，其中所述1 种探针具有如SEQ ID No：44所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID No：45-46所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述组分(1)-(4)中所述探针带有标记物。在进一步的实施方案中，所述标记物为荧光标记物。在更进一步的实施方案中，所述第一、第二、第三和第四探针组的荧光标记物选自最大发射波长为518nm、538-555nm、 574-575nm、602-615nm、640nm、660-667nm、和690nm的荧光标记物。在更进一步的实施方案中，各探针组的荧光标记物分别是不同的。
在一些实施方案中，所述探针及引物组合物用于检测人乳头状瘤病毒。在进一步的实施方案中，所述探针及引物组合物用于对HPV16型和HPV18型人乳头状瘤病毒进行分型检测。在更进一步的实施方案中，所述探针及引物组合物用于对HPV16型和HPV18型人乳头状瘤病毒进行分型检测，且同时还检测 HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、 HPV59、HPV66、及HPV68型人乳头状瘤病毒。
在另一个方面，本发明提供了一种人乳头状瘤病毒(HPV)检测试剂盒，其包含如下组分：
(1)第一检测组，其包含分别针对HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、 HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针分别具有如SEQ ID No：1-13所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：14-37所示的核苷酸序列；
(2)第二检测组，其包含针对HPV16型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：38所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：39-40所示的核苷酸序列；
(3)第三检测组，其包含针对HPV18型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：41所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：42-43所示的核苷酸序列；及任选的
(4)第四检测组，其包含针对β-球蛋白基因的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：44所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No： 45-46所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述组分(1)-(4)中所述探针带有标记物。在进一步的实施方案中，所述标记物为荧光标记物。在更进一步的实施方案中，所述第一、第二、第三和第四探针组的荧光标记物选自最大发射波长为518nm、538-555nm、 574-575nm、602-615nm、640nm、660-667nm、和690nm的荧光标记物。在更进一步的实施方案中，各探针组的荧光标记物分别是不同的。
在一些实施方案中，所述检测包含如下步骤：(1)从受试者获得生物样品； (2)用所述试剂盒测定该生物样品中是否存在人乳头状瘤病毒DNA。在一些实施方案中，所述检测进一步包含步骤(3)若第一、第二和/或第三检测组测定呈阳性，则检测到人乳头状瘤病毒。
在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述生物样品来源于尿道拭子、宫颈拭子、阴道拭子、皮肤拭子、和尿液的一种或多种。在进一步的实施方案中，所述生物样品含有宫颈脱落细胞。
在一些实施方案中，所述试剂盒用于对HPV16型和HPV18型人乳头状瘤病毒进行分型检测。
在又一个方面，本发明提供了一种用于评价受试者罹患宫颈癌的风险的试剂盒，其包含如下组分：
(1)第一检测组，其包含分别针对HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、 HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针分别具有如SEQ ID No：1-13所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：14-37所示的核苷酸序列；
(2)第二检测组，其包含针对HPV16型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：38所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：39-40所示的核苷酸序列；
(3)第三检测组，其包含针对HPV18型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：41所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：42-43所示的核苷酸序列；及任选的
(4)第四检测组，其包含针对β-球蛋白基因的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：44所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No： 45-46所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述组分(1)-(4)中所述探针带有标记物。在进一步的实施方案中，所述标记物为荧光标记物。在更进一步的实施方案中，所述第一、第二、第三和第四探针组的荧光标记物选自最大发射波长为518nm、538-555nm、 574-575nm、602-615nm、640nm、660-667nm、和690nm的荧光标记物。在更进一步的实施方案中，各探针组的荧光标记物分别是不同的。
在一些实施方案中，所述评价包含如下步骤：
(1)从受试者获得生物样品，
(2)用前述试剂盒测定所述生物样品中是否存在人乳头状瘤病毒DNA，
其中当第一、第二和/或第三检测组检测呈阳性时，则评价所述受试者具有罹患宫颈癌的风险；
在一些实施方案中，所述测定通过多重荧光PCR进行。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述生物样品来源于尿道拭子、宫颈拭子、阴道拭子、皮肤拭子、和尿液的一种或多种。在进一步的实施方案中，所述生物样品含有宫颈脱落细胞。
在又一个方面，本发明提供了一种诊断受试者的人乳头状瘤病毒感染相关病症的方法/试剂盒，其包含前述的探针及引物组合物的任一种。
在又一个方面，本发明提供了前述的探针及引物组合物的任一种在制备用于诊断人乳头状瘤病毒相关病症的试剂中的用途。在一些实施方案中，所述人乳头状瘤病毒相关病症选自宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌和口咽癌。
定义
如本申请中所使用的，如本文所使用的“核苷酸序列”或“多核苷酸”是指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或合成的核苷酸残基的线性聚合体。其可以是单链的或双链的，并且包括RNA、DNA(例如可以是基因组、cDNA 或合成的)、其类似物或其组合。本领域技术人员应该理解，通常核苷酸序列的表示顺序从左到右是5'-3'顺序，并且，除非另外指出，否则“A”是指脱氧腺苷，“C”是指脱氧胞苷，“G”是指脱氧鸟苷，“T”是指脱氧胸苷，而“U”是指核糖核苷，尿苷。通常，核苷酸序列包含四种天然脱氧核苷酸或四种天然核糖核苷酸；然而，它们还可以包含非天然核苷酸类似物。
如本申请中所使用的，术语“引物”是指这样的多核苷酸序列：其与靶核酸模板上的序列杂交并且促进寡核苷酸探针的检测。例如，在本发明的扩增实施方案中，寡核苷酸引物可以充当核酸合成的起始点。引物可以具有多种长度，并且通常是小于50个核苷酸的长度，例如可以是10-25个核苷酸的长度。用于 PCR中的引物的长度和序列可以基于本领域技术人员已知的原则来设计。
如本文所使用的术语“寡核苷酸探针”是指这样的多核苷酸序列：其能够与目标靶核酸杂交或退火并且允许所述靶核酸的特异性检测。
有益效果
本发明基于多重荧光PCR技术提供了可以在同一反应管中检测第一组不分型12种高危型HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)、第二组高危型HPV16、第三组高危型HPV18及第四组细胞内β–球蛋白基因的试剂盒；其中第四组同步检测细胞内保守基因β–球蛋白，用于评估采集样本质量及PCR抑制因素，对检测过程进行质量控制。本发明所有的探针Tm接近相同且高于引物的Tm大约8-10℃，所有引物的Tm接近相同为58-60℃，从而确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。
本发明的试剂盒既可以将高危型HPV检测又能将HPV16、HPV18具体分型，同时还可通过β-球蛋白基因对检测过程进行质量控制。相比于传统检测试剂盒，本发明具有显著提高的灵敏度和高度特异性，从而降低了漏检率，同时排除假阳性。因此本发明满足了筛查要求且能更好地提供临床指导，这样可以最大限度减轻我国HPV基因检测所带来的巨额费用，从而降低病人的经济负担，达到有效利用资源的目的。
附图说明
图1是高危型HPV16模板(SEQ ID No：38所示的探针，和SEQ ID No：39-40 所示的引物)在ABI荧光PCR仪7500型(下文简称ABI7500)上的检测结果的扩增曲线。其中ΔRn表示荧光增幅。
图2是高危型HPV18模板(SEQ ID No：41所示的探针，和SEQ ID No：42-43 所示的引物)在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。
图3是12种高危型HPV中的模板(SEQ ID No：1-13所示的探针，和SEQ ID No：14-37所示的引物)在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。
图4是全部模板(所有引物+探针)在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。
图5-6是对第42号受试者样品进行52型测序(分别比对L1和E7基因)的比对结果。经序列比对确认其为HPV 52型基因片段。
图7-8是对第56号受试者样品进行16型测序(分别比对L1和E6基因)的比对结果。经序列比对确认其为HPV 16型基因片段。
图9-10是对第74号受试者样品进行39型测序(分别比对L1和E7基因)的比对结果。经序列比对确认其为HPV 39型基因片段。
图11-12是对第111号受试者样品进行16型测序(分别比对L1和E6基因) 的比对结果。经序列比对确认其为HPV 16型基因片段。
图13-14是对第111号受试者样品进行52型测序(分别比对L1和E7基因) 的比对结果。经序列比对确认其为HPV52型基因片段。
图15-16是对第113号受试者样品进行16型测序(分别比对L1和E6/E7基因)的比对结果。经序列比对确认其为HPV 16型基因片段。
图17-18是对第142号受试者样品进行16型测序(分别比对L1和E7基因) 的比对结果。经序列比对确认其为HPV 16型基因片段。
图19-20是对第142号受试者样品进行52型测序(分别比对L1和E7基因) 的比对结果。经序列比对确认其为HPV 52型基因片段。
图21-22是对第155号受试者样品进行18型测序(分别比对L1和E7基因) 的比对结果。经序列比对确认其为HPV 18型基因片段。
具体实施方式
实施例1.引物及探针
制备了12+2高危型人乳头状瘤病毒(HPV)检测试剂盒，其包括如下探针及引物：
(1)具有与12种高危型HPV(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、 66、及68型)的DNA互补的核苷酸序列的探针及引物(SEQ ID No：1-37)；
(2)具有与高危型HPV16的DNA互补的核苷酸序列的探针(SEQ ID No：38) 及引物(SEQ ID No：39-40)；
(3)具有与高危型HPV18的DNA互补的核苷酸序列的探针(SEQ ID No：41) 及引物(SEQ ID No：52-43)；
(4)具有与细胞内β-球蛋白基因的DNA互补的核苷酸序列的探针(SEQ ID No：44)及引物(SEQ ID No：45-46)；
其中，第一组探针标记最大发射波长为522nm的荧光标记物、第二组探针标记最大发射波长为554nm的荧光标记物、第三组探针标记最大发射波长为 602nm的荧光标记物、第四组探针标记最大发射波长为664nm的荧光标记物。
具体探针和引物的核苷酸序列如下：
注：“引物F”意指正向引物，“引物R”为反向引物
实施例2
检测本发明试剂盒诊断HPV感染的准确性和有效性，用二种现有的市售同类试剂盒(下文分别称试剂盒A和试剂盒B)和本发明试剂盒同时对200例临床样品做对比实验，评价试验系统和对照系统的一致性。
具体实验步骤如下：
1.试剂准备(在试剂准备区进行)
1.1取出扩增试剂，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀备用；
1.2按照下表配制试剂：
注：测试数N＝n+2，其中n表示待测样品数量，另2份分别为阴性质控品、阳性质控品。应根据实验室情况，适当考虑试剂分装过程中的损耗。
1.3将上述准备好的试剂转移至样品处理区，混匀备用。
2.样品处理(在样品处理区进行)
2.1从样品提取核酸
样品来源可以包括尿道拭子、宫颈拭子、阴道拭子、皮肤拭子、尿液等，最优选的样品为宫颈脱落细胞或含有宫颈脱落细胞的体液、组织等。提取样品核酸步骤如下，其中阴性质控品应参与核酸的平行提取步骤。
(1)吸取10μL预处理液，置于1.5mL EP管，加入400μL临床样品，混合均匀。再加入400μL裂解缓冲液及8μL磁珠，混合均匀，静置10分钟，瞬时离心。
(2)将EP管置于磁力架2分钟，吸弃上清。
(3)加入750μL洗涤缓冲液I及50μL洗涤缓冲液II，混合均匀，瞬时离心。
(4)将EP管置于磁力架2分钟，吸弃上清，瞬时离心。
(5)将EP管置于磁力架2分钟，吸弃残留液体，晾干2分钟。
(6)加入35μL洗脱缓冲液，混合均匀，瞬时离心。
(7)将EP管置于60℃金属浴，孵育10分钟。
(8)将EP管置于磁力架2分钟，吸取上清液，将含磁珠的EP管丢弃。
2.2取PCR反应管N支，分别加入15μL步骤1配制的试剂后，再加入阳性质控品、步骤2.1处理得到的阴性质控品及待测样品上清液各5μL，盖上管盖，瞬时离心后转移至扩增区。
3.PCR扩增(在扩增区进行)
3.1将各反应管放入荧光PCR检测仪内，设置样品名称。
3.2PCR反应条件设置参照下表：
3.3设置反应体积为20μL。
3.4仪器检测通道选择：选择FAM、VIC、ROX、CY5通道。各通道代表的HPV型别如下表：
3.5设置完毕，保存文件，运行反应程序。PCR程序完成后，保存结果，将反应管及其它废弃物按PCR实验室管理规则处理。
3.6质量控制：阴性质控品的全部通道Ct值均无数值，否则提示有污染发生。阳性质控品的FAM、VIC和ROX通道均应Ct≤35，否则提示阳性质控品降解或扩增试剂失效。
4.判断标准
4.1阳性判断值
阳性判断值及有效性认定参考下表：
4.2检验结果的解释
4.2.1质控标准
阈值(threshold)：仪器的自动设置是3～15个循环荧光信号的标准偏差的 10倍。手动设置的原则以阈值线刚好超过阴性质控品曲线(无规则的噪音线) 和样品的荧光背景值的最高点为准。尽量选择进入指数期的最初阶段。
基线(baseline)：基线的起点要避免选择开始的几个循环(由于高温导致的信号增高)，一般在3至6个循环之间，终点要避免选择信号已经开始有明显增长的区域，一般选择比本组最小的Ct值减去3～4个循环处。起点和终点之间建议间隔8个循环以上，然后分析结果。
扩增曲线只有呈典型S型的才可认为是扩增阳性，否则认为是扩增阴性。如果反应结果处于有效区(有效认定参照检验方法和阳性判断值)，可进一步分析结果，否则试验无效。
4.2.2结果报告标准
若检测样品FAM信号Ct值≤39，则报告为HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68中一种或一种以上阳性。
若检测样品VIC信号Ct值≤39，则报告为HPV16阳性。
若检测样品ROX信号Ct值≤39，则报告为HPV18阳性。
FAM、VIC及ROX的Ct值均为无数值，则报告为阴性；如果检测样品Ct 值＞39时，为灰区，需重新检测，若重新检测的Ct值为无数值或＞39，则报告为阴性；若重新检测的Ct值≤39时，则报告为阳性。
5.检测结果
三种方法学的检测结果如下：
16型 本发明 试剂盒A 试剂盒B
阳性例数 35 28 28
18型 本发明 试剂盒A 试剂盒B
阳性例数 8 7 5
12种高危型 本发明 试剂盒A 试剂盒B
阳性例数 134 126 118
其中，本发明的试剂盒与对比试剂的检测结果阳性符合率高度一致。可见，本发明的试剂盒在HPV的检测灵敏度方面具有显著的优势。
实施例3：阳性结果验证
为了进一步验证本发明试剂盒检测的阳性结果，针对本发明与A和B两种对比试剂结果均不符合(即本发明检测为阳性且而A、B检测为阴性)的样品(第 42、56、74、111、113、142、155号临床样品)，采用与L1区单重引物探针及与E6、E7区单重引物探针同时扩增并将PCR产物用sanger法经特异引物进行测序验证。
实验步骤：
1.配用于42号样品(12个型的通道有阳性信号)的扩增反应混合物
2.配用于56号样品(16型的通道有阳性信号)的扩增反应混合物
组分名称 16型 18型 31型 33型 35型 39型 45型
Ex Taq HS 0.1μL —— —— —— —— —— ——
10×Ex Taq缓冲液 2μL —— —— —— —— —— ——
dNTP混合剂 1.6μL —— —— —— —— —— ——
ddH2O 14.3μL —— —— —— —— —— ——
相应型别引物F(10uM) 0.4μL —— —— —— —— —— ——
相应型别引物R(10uM) 0.4μL —— —— —— —— —— ——
相应型别探针P(10uM) 0.2μL —— —— —— —— —— ——
DNA 1μL —— —— —— —— —— ——
组分名称 51型 52型 56型 58型 59型 66型 68型
Ex Taq HS —— —— —— —— —— —— ——
10×Ex Taq缓冲液 —— —— —— —— —— —— ——
dNTP混合剂 —— —— —— —— —— —— ——
ddH2O —— —— —— —— —— —— ——
相应型别引物F(10uM) —— —— —— —— —— —— ——
相应型别引物R(10uM) —— —— —— —— —— —— ——
相应型别探针P(10uM) —— —— —— —— —— —— ——
DNA —— —— —— —— —— —— ——
3.配用于74号样品(12个型的通道有阳性信号)的扩增反应混合物
4.配用于111号样品(16型及12个型的通道有阳性信号)的扩增反应混合物
组分名称 16型 18型 31型 33型 35型 39型 45型
Ex Taq HS 0.1μL —— 0.1μL 0.1μL 0.1μL 0.1μL 0.1μL
10×Ex Taq缓冲液 2μL —— 2μL 2μL 2μL 2μL 2μL
dNTP混合剂 1.6μL —— 1.6μL 1.6μL 1.6μL 1.6μL 1.6μL
ddH2O 14.3μL —— 14.3μL 14.3μL 14.3μL 14.3μL 14.3μL
相应型别引物F(10uM) 0.4μL —— 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL
相应型别引物R(10uM) 0.4μL —— 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL
相应型别探针P(10uM) 0.2μL —— 0.2μL 0.2μL 0.2μL 0.2μL 0.2μL
DNA 1μL —— 1μL 1μL 1μL 1μL 1μL
组分名称 51型 52型 56型 58型 59型 66型 68型
Ex Taq HS 0.1μL 0.1μL 0.1μL 0.1μL 0.1μL 0.1μL 0.1μL
10×Ex Taq缓冲液 2μL 2μL 2μL 2μL 2μL 2μL 2μL
dNTP混合剂 1.6μL 1.6μL 1.6μL 1.6μL 1.6μL 1.6μL 1.6μL
ddH2O 14.3μL 14.3μL 14.3μL 14.3μL 14.3μL 14.3μL 14.3μL
相应型别引物F(10uM) 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL
相应型别引物R(10uM) 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL 0.4μL
相应型别探针P(10uM) 0.2μL 0.2μL 0.2μL 0.2μL 0.2μL 0.2μL 0.2μL
DNA 1μL 1μL 1μL 1μL 1μL 1μL 1μL
5.配用于113号样品(16型的通道有阳性信号)的扩增反应混合物
组分名称 16型 18型 31型 33型 35型 39型 45型
Ex Taq HS 0.1μL —— —— —— —— —— ——
10×Ex Taq缓冲液 2μL —— —— —— —— —— ——
dNTP混合剂 1.6μL —— —— —— —— —— ——
ddH2O 14.3μL —— —— —— —— —— ——
相应型别引物F(10uM) 0.4μL —— —— —— —— —— ——
相应型别引物R(10uM) 0.4μL —— —— —— —— —— ——
相应型别探针P(10uM) 0.2μL —— —— —— —— —— ——
DNA 1μL —— —— —— —— —— ——
组分名称 51型 52型 56型 58型 59型 66型 68型
Ex Taq HS —— —— —— —— —— —— ——
10×Ex Taq缓冲液 —— —— —— —— —— —— ——
dNTP混合剂 —— —— —— —— —— —— ——
ddH2O —— —— —— —— —— —— ——
相应型别引物F(10uM) —— —— —— —— —— —— ——
相应型别引物R(10uM) —— —— —— —— —— —— ——
相应型别探针P(10uM) —— —— —— —— —— —— ——
DNA —— —— —— —— —— —— ——
6.配用于142号样品(16型及12个型的通道有阳性信号)的扩增反应混合物
7.配用于155号样品(18型的通道有阳性信号)的扩增反应混合物
组分名称 16型 18型 31型 33型 35型 39型 45型
Ex Taq HS —— 0.1μL —— —— —— —— ——
10×Ex Taq缓冲液 —— 2μL —— —— —— —— ——
dNTP混合剂 —— 1.6μL —— —— —— —— ——
ddH2O —— 14.3μL —— —— —— —— ——
相应型别引物F(10uM) —— 0.4μL —— —— —— —— ——
相应型别引物R(10uM) —— 0.4μL —— —— —— —— ——
相应型别探针P(10uM) —— 0.2μL —— —— —— —— ——
DNA —— 1μL —— —— —— —— ——
组分名称 51型 52型 56型 58型 59型 66型 68型
Ex Taq HS —— —— —— —— —— —— ——
10×Ex Taq缓冲液 —— —— —— —— —— —— ——
dNTP混合剂 —— —— —— —— —— —— ——
ddH2O —— —— —— —— —— —— ——
相应型别引物F(10uM) —— —— —— —— —— —— ——
相应型别引物R(10uM) —— —— —— —— —— —— ——
相应型别探针P(10uM) —— —— —— —— —— —— ——
DNA —— —— —— —— —— —— ——
上机扩增步骤
PCR扩增实验结果：采用L1区引物和E6/E7区引物的PCR扩增实验结果一致如下：第42号临床样本出现52型阳性信号、第56号出现16型阳性信号、第74号出现39型阳性信号、第111号出现16型和52型阳性信号、第113号出现16型阳性信号、第142号出现16型和52型阳性信号、155号出现18型阳性信号)。将以上获得阳性信号的PCR产物交由第三方测序公司进行Sanger法测序。
PCR产物测序结果：测序所得序列进行NCBI Blast比对，证实A和B试剂检出为阴性，而本发明检出为阳性的样品全部为真阳性，且分型正确。各临床样本的Blast比对结果如图5-图22所示。
可见，本发明不仅显著提高了检测灵敏度，极大改善了现有HPV检测试剂盒对样品的漏检状况，并且验证排除了假阳性，证明其具有极强的检测特异性。
结合上述实验结果，本发明试剂盒与对比试剂的检测结果阳性符合率高度一致，而且在灵敏度方面具有显著的优势，表明了本发明的试剂盒不仅完全满足临床应用的要求，而且可以很大程度上防止同类产品因灵敏度不够而产生的漏检。
应该理解到，本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可在不悖离本发明主旨的情况下变化。还应理解本文所述的实施例仅仅是出于描述具体实施方案的目的，而非意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求限定。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 迈克生物股份有限公司
<120> 探针及引物组合物
<130> MB20161018
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> HPV33探针
<400> 1
caattgcaaa cagtgatac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> HPV35探针
<400> 2
tgcacacaag taactagtg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> HPV39探针
<400> 3
ctagtgacag tacatataaa a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> HPV45探针
<400> 4
ctatagagtc ttccatacct tc 22
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> HPV51探针
<400> 5
cctctacaca aaatc 15
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> HPV52探针
<400> 6
actgccactg ctgc 14
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> HPV56探针
<400> 7
caatcagttg tttgtcacag tt 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> HPV58探针
<400> 8
ctgctacaga acagttaag 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> HPV59探针
<400> 9
acttcagtgc ataatgtc 18
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> HPV66探针
<400> 10
cacacctacc agtttta 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> HPV68探针1
<400> 11
cagctaaaag cacattaa 18
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> HPV68探针2
<400> 12
ctactactga atcagctgta cc 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> HPV31引物F
<400> 13
cagactctac tgtaccagc 19
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> HPV31引物R
<400> 14
gtgctcaggg acacaataat gg 22
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> HPV33引物F
<400> 15
tgtaaatcaa attcctcacc atgtc 25
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> HPV33引物R
<400> 16
cgtgcacaag gtcataataa tgg 23
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> HPV35引物F
<400> 17
aaactgtaaa tcatattctt caacatgtc 29
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> HPV35引物R
<400> 18
gtgcacaagg ccataataat gg 22
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> HPV39引物F
<400> 19
tgtaaatcat attcttcacc atgcc 25
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> HPV39引物R
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ccagggccac aacaatgg 18
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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aaatcatact cctccacgtg cc 22
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
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<220>
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<222> (1)..(19)
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cccagggcca taacaatgg 19
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<220>
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actgtaaatc atattcctcc acatgtc 27
<210> 24
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gcgcagggtc acaataatgg 20
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<211> 22
<212> DNA
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<222> (1)..(22)
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aattcatact cttccccatg cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> HPV52引物R
<400> 26
gcagggccac aataatgg 18
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> HPV56引物F
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atcgaattcc tcgccatgac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> HPV56引物R
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gcccaaggcc ataataatgg 20
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
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ttgtaattca tattcctcca catgtc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
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gtgcacaagg tcataacaat gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
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aaactgtaag tcatattctt caacatgac 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
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ggctcagggt ttaaacaatg g 21
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<221> misc_feature
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caaatcaaat tcctccacat gtc 23
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
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tgcacagggc cataataatg g 21
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<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> HPV68引物F
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
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gcacagggac acaacaatgg 20
<210> 37
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<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> HPV16引物F
<400> 38
tgctgccata tctacttc 18
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> HPV16引物R
<400> 39
gcacagggcc acaataatgg 20
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> HPV18探针
<400> 40
tgtaaatcat attcctcccc atgtc 25
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> HPV18引物F
<400> 41
tgcttctaca cagtctcctg tacctgggct agaagca 37
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> HPV18引物R
<400> 42
ggcacagggt cataacaatg g 21
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> β-球蛋白探针
<400> 43
tgcaaatcat attcctcaac atgtc 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> β-球蛋白引物F
<400> 44
aagaattcac cccaccagtg caggc 25
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> β-球蛋白引物R
<400> 45
gctggcccat cactttgg 18
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<400> 46
ttgtgggcca gggcatt 17

Claims (12)

1.一种探针及引物组合物，其包含如下组分：
(1)包含13种探针的第一探针组及包含24种引物的第一引物组，其中所述13种探针分别具有如SEQ ID No：1-13所示的核苷酸序列，所述24种引物分别具有如SEQ ID No：14-37所示的核苷酸序列；
(2)包含1种探针的第二探针组及包含2种引物的第二引物组，其中所述1种探针具有如SEQ ID No：38所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID No：39-40所示的核苷酸序列；
(3)包含1种探针的第三探针组及包含2种引物的第三引物组，其中所述1种探针具有如SEQ ID No：41所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID No：42-43所示的核苷酸序列；及任选的
(4)包含1种探针的第四探针组及包含2种引物的第四引物组，其中所述1种探针具有如SEQ ID No：44所示的核苷酸序列，所述2种引物分别具有如SEQ ID No：45-46所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的探针及引物组合物，其中所述组分(1)-(4)中所述探针带有标记物；更优选地，所述标记物为荧光标记物。
3.如权利要求2所述的探针及引物组合物，其中所述第一、第二、第三和第四探针组的荧光标记物分别是不同的。
4.如权利要求1-3任一项所述的探针及引物组合物，其中所述探针及引物组合物用于检测人乳头状瘤病毒。
5.一种人乳头状瘤病毒(HPV)检测试剂盒，其包含如下组分：
(1)第一检测组，其包含分别针对HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针分别具有如SEQ ID No：1-13所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：14-37所示的核苷酸序列；
(2)第二检测组，其包含针对HPV16型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：38所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：39-40所示的核苷酸序列；
(3)第三检测组，其包含针对HPV18型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：41所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：42-43所示的核苷酸序列；及任选的
(4)第四检测组，其包含针对β-球蛋白基因的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ IDNo：44所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：45-46所示的核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其中所述组分(1)-(4)中所述探针带有标记物。
7.如权利要求5或6所述的检测试剂盒，其中所述检测包含如下步骤：
(1)从受试者获得生物样品，
(2)用权利要求5或6所述的试剂盒测定所述生物样品中是否存在人乳头状瘤病毒DNA。
8.一种用于评价受试者罹患宫颈癌的风险的试剂盒，其包含如下组分：
(1)第一检测组，其包含分别针对HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针分别具有如SEQ ID No：1-13所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：14-37所示的核苷酸序列；
(2)第二检测组，其包含针对HPV16型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：38所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：39-40所示的核苷酸序列；
(3)第三检测组，其包含针对HPV18型人乳头状瘤病毒的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ ID No：41所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：42-43所示的核苷酸序列；及任选的
(4)第四检测组，其包含针对β-球蛋白基因的探针及引物，其中所述探针具有如SEQ IDNo：44所示的核苷酸序列，所述引物分别具有如SEQ ID No：45-46所示的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述组分(1)-(4)中所述探针带有标记物。
10.如权利要求8或9所述的试剂盒，其中所述评价包括如下步骤：
(1)从受试者获得生物样品，
(2)用权利要求3所述的试剂盒测定所述生物样品中是否存在人乳头状瘤病毒DNA，
其中当第一、第二和/或第三检测组检测呈阳性时，则评价所述受试者具有罹患宫颈癌的风险。
11.权利要求1所述的探针及引物组合物在制备用于诊断人乳头状瘤病毒相关病症的试剂中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述人乳头状瘤病毒相关病症选自宫颈癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌和口咽癌。
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