CN112725531A - 一种mcda结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统 - Google Patents

一种mcda结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统 Download PDF

Info

Publication number
CN112725531A
CN112725531A CN202110076850.XA CN202110076850A CN112725531A CN 112725531 A CN112725531 A CN 112725531A CN 202110076850 A CN202110076850 A CN 202110076850A CN 112725531 A CN112725531 A CN 112725531A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mcda
primer
amplification primer
hepatitis
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110076850.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112725531B (zh
Inventor
陈旭
刘正奇
李玉洁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Affiliated Hospital Of Guizhou University Of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Second Affiliated Hospital Of Guizhou University Of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Affiliated Hospital Of Guizhou University Of Traditional Chinese Medicine filed Critical Second Affiliated Hospital Of Guizhou University Of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN202110076850.XA priority Critical patent/CN112725531B/zh
Publication of CN112725531A publication Critical patent/CN112725531A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112725531B publication Critical patent/CN112725531B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物医药检测技术领域，涉及POCT快速核酸检测系统，具体涉及了一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，包括用于扩增乙肝病毒的S基因的MCDA单元和用于检测从MCDA单元获得的MCDA产物的检测单元；所述MCDA单元包括置换引物对、交叉引物对和三对扩增引物对。本方案可以解决现有的检测方法成本高、耗时长、操作复杂和检测灵敏度低等技术问题。本方案将MCDA和LFB技术相结合，用于检测HBV病毒，其操作过程简单、扩增效率高且费用低廉，非常适合POCT检测，以及在经济欠发达地区缺少检测设备的情况下进行快速检测。

Description

一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统
技术领域
本发明涉及生物医药检测技术领域，涉及POCT快速核酸检测系统，具体涉及了一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B，HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，属嗜肝DNA病毒科，HBV感染是全球性的公共卫生问题。特别是，HBV感染经常伴随有丙肝病毒(HCV)和艾滋病毒(HIV)感染，给公共健康和社会经济带来了极大的负担。世界卫生组织统计数据表明，全球越有2.57亿人口患有慢性乙肝，约有15-40％的慢性乙肝会转化成为肝硬化或者肝癌。因此，在HBV发生早期进行相关检测，对HBV的防治具有积极的意义。
酶联免疫吸附(ELISA)是传统的临床HBV检测方法，但是其存在检测时间长和检测灵敏度不理想等问题，不适合于对HBV的早期筛查。随着分子诊断方法的发展，各类聚合酶链式反应被应用到病毒的核酸检测中，例如实时定量PCR，虽然这一类检测方法极大地提高了检测的灵敏度，但是上述方法对设备的要求较高且检测费用较高，不能满足对实时床旁检测(POCT)的要求。因此，亟需开发一种低成本、快速、灵敏度高且准确度高的HBV的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于一种MCDA结合生物传感技术的乙肝病毒核酸快速检测系统，用以解决现有的检测方法成本高、耗时长、操作复杂和检测灵敏度低等技术问题。
一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，包括用于扩增乙肝病毒的S基因的MCDA单元和用于检测从MCDA单元获得的MCDA产物的检测单元；所述MCDA单元包括置换引物对、交叉引物对和三对扩增引物对。
采用上述技术方案，技术原理为：
MCDA单元先对样本中的HBV病毒的S基因进行扩增，扩大目的片段的拷贝数，然后再使用检测单元对MCDA产物进行检测，通过检测S基因是否存在以及其含量，从而推断样本中是否具有目的病原体，进而判断是否存在HBV感染。
MCDA的全称为多交叉置换扩增(multiple cross displacementamplification)，是一种新型的快速的核酸扩增方法，采用本方对乙肝病毒的目的基因进行扩增，对设备的要求低且扩增效率高。较传统PCR技术而言，MCDA技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。MCDA技术能够在恒温条件下实现靶序列扩增，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高等优点。
进一步，所述检测单元包括侧向流生物传感器，侧向流生物传感器包括依次固定在背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上设置有质控线和用于检测S基因的检测线。
采用上述技术方案，采用MCDA结合侧向流生物传感器(LFB)，可实现检测结果的可视化，可以很直观的观察实验结果，且无需昂贵的PCR产物检测仪器。
进一步，所述结合垫上包被有纳米粒子偶联的链霉素亲和素，检测线上固定有羧基荧光素抗体，所述质控线上固定有生物素偶联的牛血清蛋白。
采用上述技术方案，纳米粒子偶联的链霉素亲和素可与样本(MCDA产物)上的生物素结合，实现对目的物质的可视化标记；检测线可捕获含有羧基荧光素的样本(MCDA产物)；质控线上捕获了没有和目的物质结合的纳米粒子偶联的链霉素亲和素。
进一步，所述扩增引物对包括第一扩增引物对、第二扩增引物对和第三扩增引物；第一扩增引物对包括第一反向扩增引物和第一正向扩增引物，第一反向扩增引物的5’端标记有第一标记分子；第二扩增引物对包括第二反向扩增引物和第二正向扩增引物，第二反向扩增引物的5’端标记有第二标记分子。
采用上述技术方案，检测单元可通过检测两种标记分子，来判断目的基因是否存在。
进一步，所述第一标记分子为生物素；第二标记分子为羧基荧光素。
采用上述技术方案，羧基荧光素和生物素为常见标记分子，他们的抗体(或结合分子)也已经实现商业化，易于获取。
进一步，第一反向扩增引物的序列为：5′-FAM-GCAGACACATCCAGCGA-3′；
第一正向扩增引物的序列为：5′-CATGCAAAACCTGCACGAT-3′；
第二反向扩增引物的序列为：5′-Biotin-GCATAGAAGCAGGATGAAGAGGAAT-3′；
第二正向扩增引物的序列为：5′-ACTTCCAGGATCATCAACTACCAGC-3′
第三扩增引物包括第三反向扩增引物和第三正向扩增引物，第三反向扩增引物的序列为：5′-AGACCCAACAAGAAGATGA-3′；
第三正向扩增引物：5′-TGGACTACCAAGGTATGTT-3′；
其中，Biotin代表生物素；FAM代表羧基荧光素。
进一步，所述置换引物对包括正向置换引物和反向置换引物，正向置换引物的序列为：
5′-TCACTCACCAACCTCTTGT-3′；
反向置换引物的序列为：5′-CGAAGGTTTTGTACAGCAAC-3′；
所述交叉引物包括正向交叉引物和反向交叉引物，正向交叉引物的序列为：
5′-GCATAGAAGCAGGATGAAGAGGAATCCTCCAATTTGTCCTGGCTA-3′；
反向交叉引物的序列为：
5′-ACTTCCAGGATCATCAACTACCAGCACATAGAGGTTCCTTGAGCA-3′。
采用上述技术方案，使用上述引物可实现对目的基因的快速、特异且高效的扩增。发明人在研发过程中尝试过多种引物组合，但扩增效果均不理想，只有使用上述引物才能获得满足应用需求的检测系统。
进一步，所述MCDA单元还包括链移位型DNA聚合酶。链移位型DNA聚合酶可有效介导恒温核酸扩增反应。
进一步，所述MCDA单元的工作温度为63℃，工作时长为35min。采用上述温度和扩增时间可实现对目的基因稳定且快速的扩增。并且实验证明，延长工作时间，并不能将检测下限增加。
进一步，系统的检测下限为5IU核酸。本方案的MCDA加上LFB的检测系统具有较高的灵敏度，样品中的核酸的浓度在5IU及其以上即可实现快速检出，其灵敏度高于现有技术中的实时PCR试剂盒。
综上所述，本方案将MCDA和LFB技术相结合，用于检测HBV病毒，其操作过程简单、扩增效率高且费用低廉，非常适合床旁检测(POCT)，以及偏远地区缺少检测设备的情况下的快速检测。其中，检测前的DNA模板准备需要约30min的时间，MCDA扩增需要35min左右的时间，LFB检测需要约2min的时间，完成整套检测仅需约70min的时间。而现有技术中使用常规的实时PCR则需要2-3h，远远长于本方案的检测耗时，大大提高了工作效率和检测速度。除此之外，发明人也估算了本方案的费用情况，DNA模板准备所需试剂和耗材费用约为$1USD，MCDA扩增所需试剂和耗材费用约为$3.5USD，LFB检测所需试剂和耗材费用约为$2USD，整套检测所需费用约为$6.5USD，远远低于常规的实时PCR的费用。本方案不但有费用低廉和操作时间短的特点，更重要的是，它的检测下限比实时PCR更低，灵敏度更高。经过测试，本方案的检测下限值为5IU，而实时PCR的检测下限高于本方案的系统。并且，临床样本检测结果显示，本方案的系统能够检出实时PCR判定为阴性的样本。
MCDA虽然具有上述优点，但是MCDA的引物设计是非常具有难度的，只有设计合理的引物才能使得MCDA单元具备特异且高效的扩增效果。如果设计的引物组合不适合，则检测效果不佳，不能实现上述检测效果。MCDA包括了5对共10条引物，而S基因本身长度较短，供选择的空间不多，针对该基因设计合适的MCDA引物组合具有较大的难度。发明人通过大量的对比和测试，选取了本方案的引物组合，可实现高效且准确的目的基因的扩增，进而获得理想的检测下限值。实验证明，只有本方案选取的引物组合才具有理想的扩增效率(对比例1)，本方案的引物组合的浊度可以达0.4以上，而选用其他的候选引物组合均不能获得本方案的检测效果(即扩增效率较低，最大浊度值均在0.4以下)。除此之外，发明人将对比例1的候选引物组合用于灵敏度测试的实验中，发现最大浊度值的微小差异会导致系统的灵敏度产生较大的区别，本方案的LoD可以到达5IU(每个反应)，而候选引物组合和本方案引物组合在最大浊度值上有一定差异，上述浊度差异造成了较大的在MCDA系统的灵敏度上的差异，候选引物组合的灵敏度只能到达50IU(每个反应)。
附图说明
图1为本发明实施例1中S基因引物位点示意图。
图2为本发明实施例1中MCDA产物的比色指示仪检测结果以及LFB检测结果。
图3为本发明实施例2中MCDA扩增实时浊度数据(60℃、61℃、64℃、65℃)。
图4为本发明实施例2中MCDA扩增实时浊度数据(62℃、63℃、66℃、67℃)。
图5为本发明实施例3中MCDA-LFB灵敏度测试结果。
图6为本发明实施例4中MCDA-LFB的扩增时间测试结果(25min)。
图7为本发明实施例4中MCDA-LFB的扩增时间测试结果(35min)。
图8为本发明实施例4中MCDA-LFB的扩增时间测试结果(45min)。
图9为本发明实施例4中MCDA-LFB的扩增时间测试结果(55min)。
图10为本发明实施例5中MCDA-LFB的特异性测试结果。
图11为本发明对比例1中表1所展示的引物组的MCDA扩增以及浊度测试结果。
图12为本发明对比例1中对比引物组1的MCDA扩增以及浊度测试结果。
图13为本发明对比例1中对比引物组2的MCDA扩增以及浊度测试结果。
图14为本发明对比例1中对比引物组3的MCDA扩增以及浊度测试结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1：
1.材料和设备
基因组DNA以及RNA提取试剂盒购自西安天隆科技，比色指示仪(Colorimetricindicator)购自Malachite Green公司，通用恒温扩增试剂盒购自北京海泰正元，生物素标记的BSA(bovine serum albumin)购自Abcam公司。LFB材料包括背板、样品垫、吸收垫、结合垫和NC膜，上述材料均购自Jie-Yi Biotechnology.Co.Ltd.。纳米粒子偶联的链霉素亲和素(深红色，Dye streptavidin-coated polymer nanoparticles)购自BangsLaboratories公司。HBV实时PCR检测试剂盒购自DaAn Gene公司。核酸纯度和浓度由Nano-Drop ND-2000进行分析(A260/280)。
2.MCDA引物设计
根据乙肝病毒的S基因(S基因的序列见Genbank Accession No.AB809557.1)设计引物，引物序列详见表1和图1。在图1中，右箭头和左箭头分别表示同正义链一致的引物和同正义链反向互补的引物。引物中，Biotin表示生物素修饰，FAM表示羧基荧光素修饰。引物包括：置换引物对包括F1(正向置换引物)和F2(反向置换引物)、第一扩增引物对包括D1*(第一反向扩增引物，图1中的标记为D1)和D2(第一正向扩增引物)、第二扩增引物对包括C1*(第二反向扩增引物，图1中的标记为C1)和C2(第二正向扩增引物)、第三扩增引物对包括R1(第三反向扩增引物)和R2(第三正向扩增引物)、交叉引物对包括CP1(正向交叉引物，图1中的标记为P1)和CP2(反向交叉引物，图1中的标记为P2)。
表1：引物列表
Figure BDA0002907915660000061
3.基于纳米粒子的侧向流生物传感器的制备
本方案的高分子纳米侧向流生物传感器(Lateral Flow Biosensor，LFB)的制备采用现有技术中的方法，委托天津汇德鑫生物科技发展有限公司制备该高分子纳米侧向流生物传感器。LFB(又称免疫层析试纸条)包括四个部分，即在背板上依次设置的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)及吸水垫。在结合垫上包被有纳米粒子偶联的链霉素亲和素(Dye streptavidin-coated polymer nanoparticles)。在硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线。检测线(TL)上固定有羧基荧光素抗体anti-FAM，质控线(CL)上固定有生物素偶联的牛血清蛋白(biotin-BSA)。
4.MCDA反应
MCDA反应采用25μl反应体系(一步反应获得)：F1和F2各0.4μM、D1*和D2各1.2μM、R1和R2各1.2μM、C1*和C2各0.8μM、CP1和CP2各1.2μM，12.5μl 2×反应混合液(含dNTP)、1.25μl Bst DNA聚合酶(链移位型DNA聚合酶或链置换型DNA聚合酶，10U)，以及500IU 1μl核酸模板(上述浓度均是指在25μl反应体系中的终浓度，核酸模板中含有500IU核酸)。将25μl反应体系置于63℃反应环境中1h。其中，核酸模板包括HBV病毒基因组、HCV(丙型肝炎病毒)基因组和HIV(艾滋病毒)RNA，上述病毒均为购自中国计量科学研究院的标准品。同时使用蒸馏水作为空白对照。经过MCDA反应后，获得对应的MCDA产物。
5.MCDA产物检测
使用第3步制备的LFB对四种MCDA产物进行检测，在LFB的样品垫上滴加MCDA产物，观察TL和CL的显色情况。并同时使用比色指示仪(MG试剂)检测RT-LAM产物的显色情况(阳性的MCDA产物呈不同深浅的亮绿色)、以及使用实时浊度仪(LA-500)检测MCDA产物。比色指示仪检测结果显示样品颜色由无色转变成为浅绿色，说明样品中含有HBV，未发生颜色转变则说明样品中不含有HBV。使用实时浊度仪监测结果显示浊度大于0.1，说明样品中含有HBV。而使用LFB检测时，TL和CL同时显色，则说明样品为HBV阳性，在HBV阴性的样品中，只有CL显色。检测结果参见图2，A为使用MG试剂的检测结果，B为使用LFB的检测结果。管1和LFB1为阳性结果，MCDA反应的模板来自HBV；管2和LFB2为阴性结果，MCDA反应的模板来自HCV；管3和LFB3为阴性结果，MCDA反应的模板来自HIV；管4和LFB4为阴性结果，MCDA反应的模板来自蒸馏水。上述实验结果说明，本方案的MCDA结合LFB的方法可以有效检测样本中的HBV，特异性强，不会将其他类型的病毒检出。
实施例2：MCDA最佳反应温度测试
在本实施例基本同实施例1，不同点在于温度的设置，本实验例对MCDA最佳反应温度进行了检测和确认，扩增温度设置为60-67℃(每1℃为一个梯度)，使用实时浊度仪(LA-500)检测体系中的扩增子(浊度大于0.1被认为是阳性结果)。实验结果如图3和图4所示(浊度检测仪使用judgment模式，主要考察扩增时间)，63℃为最佳反应时间。
实施例3：MCDA-LFB的灵敏度测试
将HBV模板稀释至核酸含量为5.0×103IU,5.0×102IU,5.0×101IU,5IU,5IU,0.5IU,0.05IU，获得7种稀释模板，然后以上述模板来分别进行MCDA扩增(同实施例1)，并对MCDA扩增产物进行比色指示仪检测以及LFB检测。实验结果如图5所示，本方案的检测灵敏度为每个反应中HBV的量为5IU(即LoD，limited of detection)。
实施例4：最佳反应时间的确定
在本实验例中对MCDA的最适反应时间进行了研究，本实验例的MCDA扩增以及LFB检测同实施例1，不同点在于，将MCDA的反应时间调整成了20,30,40或50min，并采用了实施例3的模板浓度梯度，实验结果如图6、图7、图8和图9所示，35min为最佳的MCDA反应时间。
实施例5：MCDA-LFB检测的特异性测试
本实验例对多个病毒株进行了MCDA-LFB检测，包括18个HBV阳性样本和20种非HBV样本、1个HBV标准样品和1个阴性对照(双蒸水，图10中的编号为40)(详见表2)。实验过程参见实施例1，结果参见图10，只有HBV阳性样本才被成功检出，其他样本的检测结果均为阴性，说明本方案对目标物质HBV的特异性强，符合应用要求。
表2：实验用病原体信息(表中缩写含义为：ATCC：美国典型培养物保藏中心；2ndGZUTCM：贵州中医大学第二附属医院；GZCDC：贵州省疾控中心)
Figure BDA0002907915660000081
实验例3：使用MCDA-LFB检测临床样本
为了进一步测试本法的实用性，本实验例对136位疑似乙肝患者进行了MCDA-LFB检测和传统的实时PCR检测。上述乙肝疑似患者的血清样本均采集自杭州市妇产科医院。MCDA-LFB检测方法参见实施例1，实时PCR检测使用商业化的TaqMan PCR试剂盒(DaAngene)。实时PCR检测结果显示89份阳性样本(检测限大于30IU)，这些HBV阳性样本在本方案的MCDA-LFB检测中也被测定为阳性。但是，4个被实时PCR检测定性为阴性的样本(核酸含量约为20IU)，在MCDA-LFB检测中被测定为阳性。这说明了本方案的MCDA-LFB检测方法比实时PCR更为灵敏，实验结果参见表3。
表3：临床样本检测结果
Figure BDA0002907915660000091
对比例1
为找到能够获得较好测试灵敏度和准确度的检测系统，发明人针对S基因的不同检测靶片段(用于MCDA扩增的片段)设计了大量引物组合进行测试，现将部分实验过程中用到的引物组合的情况列举在表4中。使用表1和表4的引物组合分别进行MCDA扩增实验，并采用实施例1的扩增方法，扩增同时进行实时的浊度检测，MCDA扩增结果参见图11、图12、图13和图14(浊度检测仪使用amplificatior模式，主要考察扩增效率)。MCDA扩增过程中会产生沉淀，例如，焦磷酸镁(dNTP参与反应，失去焦磷酸根，焦磷酸根与扩增体系中的镁离子结合产生沉淀，而镁离子是DNA聚合酶活性所必须的物质)，故可以用浊度来表征MCDA扩增进行的程度，此为本技术领域的惯用手段。针对图11-14的实验结果，以及最大浊度值来判断引物组合的扩增效率，可见本方案的系统使用的引物组合的最大浊度值可达0.4以上，而表4中的引物组合均不能达到上述扩增效率。发明人进而使用表4的引物组合进行了的灵敏度测试(实施例3的MCDA扩增和LFB检测)，对比引物组1、对比引物组2和对比引物组3检测的LoD分别为500IU、50IU和50IU，不能如本系统的引物组合一样检出5IU的样品，这说明了引物的选用对系统的高检测灵敏度的实现非常重要。
表4：本对比例涉及的引物组合列表(S基因)
Figure BDA0002907915660000101
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Figure BDA0002907915660000102
Figure BDA0002907915660000111
Figure BDA0002907915660000121
Figure BDA0002907915660000131
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州中医药大学第二附属医院
<120> 一种MCDA结合生物传感技术的乙肝病毒核酸快速检测系统
<130> 2021-1-19
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcactcacca acctcttgt 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgaaggtttt gtacagcaac 20
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcatagaagc aggatgaaga ggaatcctcc aatttgtcct ggcta 45
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acttccagga tcatcaacta ccagcacata gaggttcctt gagca 45
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcatagaagc aggatgaaga ggaat 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acttccagga tcatcaacta ccagc 25
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcagacacat ccagcga 17
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
catgcaaaac ctgcacgat 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agacccaaca agaagatga 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tggactacca aggtatgtt 19

Claims (10)

1.一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：包括用于扩增乙肝病毒的S基因的MCDA单元和用于检测从MCDA单元获得的MCDA产物的检测单元；所述MCDA单元包括置换引物对、交叉引物对和三对扩增引物对。
2.根据权利要求1所述的一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：所述检测单元包括侧向流生物传感器，侧向流生物传感器包括依次固定在背板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上设置有质控线和用于检测S基因的检测线。
3.根据权利要求2所述的一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：所述结合垫上包被有纳米粒子偶联的链霉素亲和素，检测线上固定有羧基荧光素抗体，所述质控线上固定有生物素偶联的牛血清蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：所述扩增引物对包括第一扩增引物对、第二扩增引物对和第三扩增引物；第一扩增引物对包括第一反向扩增引物和第一正向扩增引物，第一反向扩增引物的5’端标记有第一标记分子；第二扩增引物对包括第二反向扩增引物和第二正向扩增引物，第二反向扩增引物的5’端标记有第二标记分子。
5.根据权利要求4所述的一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：所述第一标记分子为生物素；第二标记分子为羧基荧光素。
6.根据权利要求5所述的一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：
第一反向扩增引物的序列为：5′-FAM-GCAGACACATCCAGCGA-3′；
第一正向扩增引物的序列为：5′-CATGCAAAACCTGCACGAT-3′；
第二反向扩增引物的序列为：5′-Biotin-GCATAGAAGCAGGATGAAGAGGAAT-3′；
第二正向扩增引物的序列为：5′-ACTTCCAGGATCATCAACTACCAGC-3′
第三扩增引物包括第三反向扩增引物和第三正向扩增引物，第三反向扩增引物的序列为：5′-AGACCCAACAAGAAGATGA-3′；
第三正向扩增引物：5′-TGGACTACCAAGGTATGTT-3′；
其中，Biotin代表生物素；FAM代表羧基荧光素。
7.根据权利要求6所述的一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：所述置换引物对包括正向置换引物和反向置换引物，正向置换引物的序列为：
5′-TCACTCACCAACCTCTTGT-3′；
反向置换引物的序列为：5′-CGAAGGTTTTGTACAGCAAC-3′；
所述交叉引物包括正向交叉引物和反向交叉引物，正向交叉引物的序列为：
5′-GCATAGAAGCAGGATGAAGAGGAATCCTCCAATTTGTCCTGGCTA-3′；
反向交叉引物的序列为：
5′-ACTTCCAGGATCATCAACTACCAGCACATAGAGGTTCCTTGAGCA-3′。
8.根据权利要求7所述的一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：所述MCDA单元还包括链移位型DNA聚合酶。
9.根据权利要求8所述的一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：所述MCDA单元的工作温度为63℃，工作时长为35min。
10.根据权利要求9所述的一种MCDA结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统，其特征在于：系统的检测下限为5IU核酸。
CN202110076850.XA 2021-01-20 2021-01-20 一种mcda结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统 Active CN112725531B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110076850.XA CN112725531B (zh) 2021-01-20 2021-01-20 一种mcda结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110076850.XA CN112725531B (zh) 2021-01-20 2021-01-20 一种mcda结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112725531A true CN112725531A (zh) 2021-04-30
CN112725531B CN112725531B (zh) 2023-03-21

Family

ID=75593666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110076850.XA Active CN112725531B (zh) 2021-01-20 2021-01-20 一种mcda结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112725531B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113684317A (zh) * 2021-09-09 2021-11-23 贵州中医药大学第二附属医院 一种基于CRISPR-Cas12b对乙肝病毒B型和C型的超灵敏快速检测及鉴别系统
CN114540548A (zh) * 2022-02-28 2022-05-27 贵州安康医学检验中心有限公司 一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器
CN114592037A (zh) * 2022-04-25 2022-06-07 成都百思赛弗生物科技有限公司 一种等温扩增靶核酸序列的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1454082A (zh) * 2000-09-08 2003-11-05 艾普免疫公司 使用肽和核酸组合物诱导针对乙型肝炎病毒的细胞免疫应答
CN109996888A (zh) * 2016-09-23 2019-07-09 阿尔韦奥科技公司 用于检测分析物的方法和组合物
CN110669823A (zh) * 2018-07-03 2020-01-10 中国医学科学院肿瘤医院 一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法
CA3123825A1 (en) * 2018-12-20 2020-06-25 Alveo Technologies, Inc. Isothermal amplification with electrical detection

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1454082A (zh) * 2000-09-08 2003-11-05 艾普免疫公司 使用肽和核酸组合物诱导针对乙型肝炎病毒的细胞免疫应答
CN109996888A (zh) * 2016-09-23 2019-07-09 阿尔韦奥科技公司 用于检测分析物的方法和组合物
CN110669823A (zh) * 2018-07-03 2020-01-10 中国医学科学院肿瘤医院 一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法
CA3123825A1 (en) * 2018-12-20 2020-06-25 Alveo Technologies, Inc. Isothermal amplification with electrical detection

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIN LIN等: "Rapid Detection of Hepatitis B Virus in Blood Samples Using a Combination of Polymerase Spiral Reaction With Nanoparticles Lateral-Flow Biosensor", 《FRONTIERS IN MOLECULAR BIOSCIENCES》 *
XU CHEN等: "Multiple Cross Displacement Amplification Linked with Nanoparticles-Based Lateral Flow Biosensor in Screening of Hepatitis B Virus in Clinical Application", 《INFECTION AND DRUG RESISTANCE》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113684317A (zh) * 2021-09-09 2021-11-23 贵州中医药大学第二附属医院 一种基于CRISPR-Cas12b对乙肝病毒B型和C型的超灵敏快速检测及鉴别系统
CN113684317B (zh) * 2021-09-09 2023-09-26 贵州中医药大学第二附属医院 一种基于CRISPR-Cas12b对乙肝病毒B型和C型的超灵敏快速检测及鉴别系统
CN114540548A (zh) * 2022-02-28 2022-05-27 贵州安康医学检验中心有限公司 一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器
CN114592037A (zh) * 2022-04-25 2022-06-07 成都百思赛弗生物科技有限公司 一种等温扩增靶核酸序列的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112725531B (zh) 2023-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112725531B (zh) 一种mcda结合生物传感器的乙肝病毒快速检测系统
CN111235316B (zh) 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用
WO2010102460A1 (zh) 定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒
US20220195542A1 (en) Use of primer probe combination and kit thereof in hbv detection
CN111778359B (zh) 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的系统及其使用方法
Kumvongpin et al. Detection assay for HPV16 and HPV18 by loop‑mediated isothermal amplification with lateral flow dipstick tests
WO2021179469A1 (zh) 检测病原体的组合物、试剂盒及方法
CN106636454B (zh) 一种同时检测人冠状病毒229e，oc43，nl63和hku1的实时荧光多重rt-pcr方法
Wang et al. Graphene oxide and self-avoiding molecular recognition systems-assisted recombinase polymerase amplification coupled with lateral flow bioassay for nucleic acid detection
Zeng et al. Rapid quantitative detection of Human immunodeficiency virus type 1 by a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay
Fan et al. Visual detection of high-risk HPV16 and HPV18 based on loop-mediated isothermal amplification
Zheng et al. Rapid detection of HPV16/18 based on a CRISPR-Cas13a/Cas12a dual-channel system
Fan et al. Rapid detection of high-risk HPV16 and HPV18 based on microchip electrophoresis
US9994922B2 (en) Methods and compositions for assessing copy number of target polynecleotides
CN114250325A (zh) 快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法
CN106048080B (zh) 一种快速筛查hpv亚型的引物和方法
Zhang et al. A one-step dipstick assay for the on-site detection of nucleic acid
Hibbitts et al. Human papilloma virus genotyping by surface-enhanced Raman scattering
CN101619364A (zh) 检测HPV的方法及Phi29DNA聚合酶在检测HPV中的应用
Liu et al. Laboratory detection of SARS-CoV-2: A review of the current literature and future perspectives
Chen et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for the rapid detection of six common respiratory viruses
CN110592269A (zh) 草鱼出血病2型病毒（gcrv-2）的raa恒温荧光检测方法及试剂
KR102076343B1 (ko) 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도
CN113957177A (zh) Cva16检测引物及检测方法
CN111206117A (zh) 一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant