CN114196743A - 一种病原微生物快速检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种适配于Nanopore测序平台的病原微生物快速检测方法及其试剂盒，可以在4‑6小时完成病原微生物的检测。本发明通过对检测靶标设计特异性引物，通过两轮PCR扩增实现核酸的富集，在特异性引物5’端加上通用序列，第一轮PCR产物无需纯化直接用于第二轮扩增，通过第二轮扩增时在带通用标签序列的引物末端添加磷酸化，由此产生的扩增产物可以直接进行测序接头的TA连接，极大的简化了建库步骤，缩短了实验时间。本发明解决了病原微生物检测中人源基因组DNA污染的难题，通过使用长读长的Nanopore测序平台，扩增的长片段数据无需拼接，直接就可以测通整个片段，本方法测序的数据平均长度在1.6k，相比二代平台提升10倍以上，可以极大的提高病原微生物判定的准确性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种病原微生物快速检测方法及其试剂盒。
背景技术
对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物，又称病原体，有病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强，往往造成世界性大流行，因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐，检测周期长，而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展，病原学诊断已不再局限于病原体水平，深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特异的，有别于其他种或属，检测其特有的基因片段序列可用来鉴别病原微生物。随着科技的发展，基因检测技术逐渐代替其它检测技术，成为临床检验科和基础实验室对病原体的主流检测技术。
随着基因组学技术的发展，高通量测序技术(NGS)越来越广泛地应用于感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等各个方面，并且朝着快捷、经济的方向飞速发展。宏基因组学测序(mNGS)技术在临床感染中不依赖于特定基因引物的序列扩增，而是将待测样本的所有DNA或RNA混合测序，并通过将测序数据与病原体数据库进行比对，获得病原体的分类信息，因此能在较短的时间内完成对样本的无靶向检测，单次即可检测上千种病原体，检测的病原体种类包含病毒、细菌、真菌和寄生虫等。从接收样本至完成数据分析，基于二代测序的mNGS检测的周转时间根据测序技术、方法和生物信息学分析方法的不同而不同，平均检测时间在48h，而且为了降低测序时间，目前在48h内完成检测的都是测序单端50bp，属于短序列的测序。目前二代测序检测的成本仍显著高于传统实验室检测方法。在国内，完成1次二代测序检测的费用仍较高；在美国，也需花费上千美元。与之相比，完成1次血培养约40元人民币，完成1次16S PCR检测则需约50元人民币。高成本仍是制约二代测序在国内广泛开展的主要因素之一。
纳米孔靶向测序(Nanopore Targeted Sequencing)方法是一种代表性的基因检测技术，该方法不依赖于传统的微生物培养，能够快速、客观地检测出临床样本中的疑似致病微生物(包括细菌、真菌和病毒)。该检测项目基于第三代单分子测序(Nanopore)平台，是新一代单分子实时测序技术，其以单分子DNA(RNA)通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。其主要特点是读长更长，平均读长可达20kb，最长可达到Mb级别；结合高效的基因组核酸提取和建库方式，测序结果经过生物信息学处理分析后与专业医学微生物数据库进行比对分析，可以获得样本中所有微生物的种属信息以及所携带的耐药和毒力基因信息。该方法检测范围广，可高效检测静脉血、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液及其他体液、组织等多种临床样本中的致病微生物，适用于不明原因发热、疑难感染和急危重症的诊断。
纳米孔靶向测序的测序速度快，在2个小时的测序及可以得到满足病原微生物分析的数据，同时通过靶向扩增的方式，可以无需进行人源基因组DNA的去除，就可以达到对病原微生物的富集。同时如果适配本发明开发快速建库技术，即可以在4-6个小时获得检测结果，非常适用于急危重症的诊断。
发明内容
对于病原微生物的检测，目前通用的方法是采用二代测序平台进行宏基因组的测序，该平台存在测序时间长、测序读长短，测序结果存在大量人源基因组DNA污染、测序数据量高且测序结果较难解读的问题。
针对目前的技术瓶颈，本发明的目的在于开发一套适配于Nanopore测序平台的病原微生物快速检测解决方案及其试剂盒，本发明方法在提取时可以直接使用通用的自动化提取仪器进行提取，无需进行人源基因组DNA的去除，在进行靶向扩增富集时，选择具有代表性的细菌、真菌目标区域，并针对病毒与耐药基因设计了特异性检测引物，可以同时进行细菌、真菌、病毒与耐药基因的检测，并且可以在4-6小时完成病原微生物的检测。
为达到上述技术目的，本发明靶向富集时设计了两段式的扩增方式，如图1本发明的两轮PCR扩增原理图所示，第一轮扩增时采用带有通用序列的特异性引物，并对多重扩增反应体系进行了优化，可以同时进行细菌、真菌、病毒、耐药基因的多重扩增，在第一轮扩增完成后，无需纯化直接加入带通用标签序列的Barcode引物，该Barcode引物在5’端进行了磷酸化修饰，在扩增完成后直接就形成了具有A突出的粘性末端结构，在将不同样本混合后就可以直接进行测序接头的快速连接，而无需进行额外的末端修复、加A与纯化，可以极大的简化实验流程，缩短检测的实验时间，同时配套自研的病原微生物分析软件，可以即时的出具检测报告。具体技术方案如下：
一种病原微生物快速检测方法，包括以下步骤：
1)对病原微生物感染的样本中的DNA和RNA分别进行提取，混合所得DNA和RNA得到总核酸，作为待测样本；
或者，直接提取微生物感染的样本中的总核酸作为待测样本；
本步骤的原理是靶向富集，可以特异性的提高测序数据中病原微生物的比例，所以在提取时无需进行人源基因组DNA的去除。提取方法可以是同时进行DNA和RNA提取的方法，优选使用明德自动化提取仪的磁珠法进行核酸的提取。提取方法参照试剂盒说明书和仪器使用说明书，提取时间约0.5h。
2)第一轮特异性引物的多重PCR扩增：以总核酸为模板，用带通用序列的特异性引物组，进行PCR扩增；
第一轮特异性引物包括两部分，一是位于5’端的通用序列序列，该序列的引入是因为在第二轮扩增时，是以通用序列为引物结合位点的，可以避免扩增循环数过高造成的扩增偏好；第二部分是位于3’端的特异性引物，该引物特异性的与病原微生物的靶标区域结合，可以特异性富集这部分待测序的靶标区域。
第一轮扩增反应的通用配制体系如下表1：
表1第一轮特异性引物的多重PCR扩增的体系
将配制好的反应体系混匀后，瞬时离心，在PCR仪上进行扩增反应：
第一轮扩增需消耗约0.5h。
所述带通用序列的特异性引物组如下表2：
表2带通用序列的特异性引物组
其中，对应的F端引物和R端引物为一对特异性的靶标引物，用于特异性的扩增富集细菌、真菌、病毒、耐药基因的靶标区域。在具体实验时可以根据实验目的选择一种或多种组合一起进行多重扩增使用。
3)第二轮带标签序列PCR扩增：用步骤2)获得的第一轮PCR反应产物为模板，加入带标签序列的引物组，进行PCR扩增；所述带标签序列的引物组含有步骤2)中的通用序列为引物结合位点，所述带标签序列的引物组在5’端均进行了磷酸化修饰；
第二轮扩增反应的通用配制体系如下表3：
表3第二轮带标签序列PCR扩增的体系
| 试剂 | 体积 |
| 第一轮扩增产物 | 10ul |
| 快速扩增酶混合液(2X) | 15ul |
| 带标签序列的引物组(10uM) | 2ul |
| 无菌超纯水 | 13ul |
将配制好的反应体系混匀后，瞬时离心，在PCR仪上进行扩增反应：
第二轮扩增需消耗约1h。
所述带标签引物在5’端均进行了磷酸化修饰，具体序列如下表4：
表4带标签序列的引物组
带标签的引物序列F端与R端组成一对，每个样本使用一对带标签引物扩增，不同样本使用不同的标签引物，在测序时可以直接基于标签引物进行不同样本的拆分。
4)测序接头的连接：用磁珠纯化步骤3)中的PCR产物，纯化完成后进行Qubit浓度测定，将准备同批进行测序的样本等量混合，连接反应后得到测序文库；
所述混合后的核酸总量在50～500ng，即可进行连接反应。
连接体系的配制如下表5：
表5测序接头连接反应的体系
| 试剂 | 体积 |
| 待测序样本(50～500ng) | 18ul |
| 快速连接酶混合液(2X) | 20ul |
| 测序接头 | 2ul |
| 总体积 | 40ul |
将配制好的反应体系混匀后，瞬时离心，20℃连接反应10min，反应结束后即连接上测序接头。连接产物按照Nanopore官方的测序流程进行上机反应。连接与上机反应耗时约0.5h。
5)测序与数据分析：使用长读长的Nanopore测序平台，测序时间达到1～2h即可以检出主要的病原微生物，测序产生的数据在病原微生物分析软件上进行同步分析，具体分析流程参考明德病原微生物分析软件使用说明书。
上述样本为血液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、口腔拭子、脓液。
上述样本使用常规的磁珠法等自动化仪器提取核酸即可，提取核酸总量不少于50pg，总核酸无需去除人源基因组。
优选的，所述步骤3)中直接加入通用的Barcode引物与普通的快速扩增酶扩增。
进一步的，所述步骤3)中Barcode 5’末端额外的添加了磷酸化修饰。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
1)本发明开发了一种病原微生物快速检测的方法及其配套试剂盒，在4-6小时即可完成病原微生物的检测，相比常规的mNGS检测技术的24h，将检测时间缩短至20％，可以在病原微生物的检测应用中实现快速即时检测；
2)本发明适用于常规的血液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、口腔拭子、脓液等多种临床样本类型，样本在提取时无需进行人源基因组DNA的去除，使用常规的磁珠法等自动化仪器提取的DNA即可以满足后续建库测序的要求。特别适配于血液等病原微生物含量极低的样本类型，在提取DNA总量在50pg以上即可完成检测，与Nanopore官方16S测序流程对比，可以极显著的提升微量样本的建库成功率，同时在使用标准样品进行测试时，在反应体系中的拷贝数低至4个拷贝时仍可以实现正常的检出；
3)本发明通过对检测靶标设计特异性引物，并在引物5’端加上通用序列，可以实现同时对细菌、真菌、寄生虫、病毒和耐药基因的检测，覆盖从DNA至RNA的所有类型的核酸的检测。在扩增时通过第一轮的低浓度特异性引物的多重扩增，将通用序列添加至扩增的靶标条带上，在直接加入通用的Barcode引物与普通的快速扩增酶扩增，即可以避免不同引物由于扩增效率差异而导致出现严重的扩增偏好，使样本的测序Reads更加符合实际分布水平。同时本发明在使用的Barcode的5‘末端额外的添加了磷酸化修饰，在扩增时使用的快速扩增酶会额外的在延伸末端添加A碱基，由此产生的扩增产物可以直接进行测序接头的TA连接，极大的简化了建库步骤，缩短了实验时间；
4)本发明对多重扩增体系条件进行多伦的优化，经优化后的扩增引物在不进行人源基因组DNA去除的情况下，测序数据中微生物的占比就可以达到95％以上，解决了病原微生物检测中人源基因组DNA污染的难题；
5)本发明通过使用长读长的Nanopore测序平台，扩增的长片段数据无需拼接，直接就可以测通整个片段，用于进行后续的病原微生物数据分析，本方法测序的数据平均长度在1.6k，相比二代平台提升10倍以上，可以极大的提高病原微生物判的准确性和稳定性。同时通过使用配套的自主开发的病原微生物分析软件，测序数据在开始产生时就可以直接进行分析，使实验测序与数据分析同步进行，实时监控测序产生的病原微生物数据，在测序完成的同时分析报告也同步完成。
附图说明
图1为本发明两轮PCR扩增原理图；
图2为本发明的方法与Nanopore官方流程进行扩增产物片段大小检测的对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1本发明与Nanopore官方流程对比测试
对于建库技术，Nanopore官方也提供了部分实验流程，为比较本发明检测方法与Nanopore官方流程的实验结果差异，使用标准品进行了对比的测试，主要对比测试条件如下：
表6本发明方法与Nanopore官方流程的测试条件对比
| 实验项 | 官方流程 | 本发明 |
| 核酸量 | 30ng | 50pg～100ng |
| 扩增流程 | 一管直扩 | 两段式扩增 |
| 连接方式 | 非连接酶依赖连接 | 连接酶连接 |
在使用单一的培养微生物提取的DNA，按照要求的30ng的进行测试，均可以成功构建文库并可以正常检出。当将样本替换为临床细菌(100拷贝/mL)和质粒标准品(100拷贝/mL)时，使用官方流程均无法进行检出，使用本发明的方法可以正常检出标准品的微生物，具体检测结果如下：
表7本发明与Nanopore官方流程的检测结果对比
| 样品 | 官方流程 | 发明流程 |
| 微生物标准品(100拷贝/mL) | 无法检出 | 正常检测 |
| 质粒标准品(100拷贝/mL) | 无法检出 | 正常检测 |
微生物标准品是稀释至100拷贝/mL的微生物菌液，包括白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、光滑念珠菌、EBV病毒和CMV病毒；质粒标准品是基于靶标区域合成的标准质粒，包括白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、EBV病毒和CMV病毒。
由对比测试可以表明本发明的方法相比官方流程可以在极低浓度的条件下检出病源微生物，而Nanopore官方流程无法正常检测，本发明与Nanopore官方流程扩增产物对比检测如图2所示，其中图2A为本发明方法扩增的靶标片段检测的峰图，可以在0.7～1.8kb之间观察到明显的细菌、真菌、病毒特异性富集的条带，而图2B官方流程无目标条带，仅在140bp左右出现了明显的引物二聚体，说明并没有靶向富集的效果。
实施例2本发明方法标准品检测限试验
对于临床应用，检测限是判定实验效果的关键指标，目前已知的方法在检出限上需要提取时微生物的数目达到20个拷贝以上才能正常检出，对于标准的微生物菌株，进行以下的20、10、4个拷贝数的检测测试，具体检测结果如下：
表8标准品检测限实验结果
微生物标准品是稀释至100拷贝/mL的微生物菌液，包括白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、光滑念珠菌、EBV病毒和CMV病毒，在进行核酸提取时分别取200uL、100uL、40uL的标准菌液进行提取，提取后按照本发明的方法进行病原微生物的检测，均可正常构建文库并测序。测试结果表明，在20个拷贝下进行提取检测，100％可以正常检出，当低至4个拷贝时，也有78％的微生物可以正常检出，表明本发明提供的病原微生物快速检测的方法具有极低的检出性能。
实施例3临床血液样品检测
取10例临床血培有明确病原微生物的全血样本，取200uL全血提取核酸后，按照本发明的方法进行建库测序，10例样本均正常建库且获得测序数据，具体的检测结果如下：
表9不同临床血液样品的检测结果
| 样品 | 血培结果 | 是否一致 |
| 血液1 | 大肠杆菌 | 一致 |
| 血液2 | 表皮葡萄球菌 | 未检出 |
| 血液3 | 肺炎克雷伯 | 一致 |
| 血液4 | 溶血葡萄球菌 | 一致 |
| 血液5 | 金黄色葡萄球菌 | 一致 |
| 血液6 | 屎肠球菌 | 一致 |
| 血液7 | 铜绿假单胞菌 | 一致 |
| 血液8 | 肺炎链球菌 | 一致 |
| 血液9 | 大肠杆菌 | 一致 |
| 血液10 | 表皮葡萄球菌 | 一致 |
在检测的10例血液样品中，除有1例样本未检出病原微生物外，其余样本均能正常检测出血培的结果，说明本方法与临床的血培结果具有很高的一致性，通过测序方法检测出的病原微生物可靠的。
实施例4临床肺泡灌洗液样本检测
取29例临床培养有明确病原微生物的肺泡灌洗液样本，取200uL提取核酸后，按照本发明的方法进行建库测序，29例样本均正常建库且获得测序数据，具体的检测结果如下：
表10不同临床肺泡灌洗液样品的检测结果
所有的29例肺泡灌洗液样品均检出了病原微生物，与临床培养结果相比，有23份样本的检出结果与临床培养一致，有6份样本的检出结果与临床不一致，其中有一份样本虽检出临床培养的微生物，但测序数据的占比仅有1.5％，另有两份样本检测为粘质沙雷菌，这三份样本通过耐药基因的检测也表明测序检测的主要病原菌是更符合实际样本情况。根据批测试结果确定测序结果与肺泡培养结果具有79％的一致性，同时测序可以检出更多类型的病原微生物，与实际样本中的病原微生物分布吻合性更高。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对病原微生物感染的样本中的DNA和RNA分别进行提取，混合所得DNA和RNA得到总核酸，作为待测样本；
或者，直接提取微生物感染的样本中的总核酸作为待测样本；
2)第一轮特异性引物的多重PCR扩增：以总核酸为模板，用带通用序列的特异性引物组，进行PCR扩增；
3)第二轮带标签序列PCR扩增：用步骤2)获得的第一轮PCR反应产物为模板，加入带标签序列的引物组，进行PCR扩增；所述带标签序列的引物组含有步骤2)中的通用序列为引物结合位点，所述带标签序列的引物组在5’端均进行了磷酸化修饰；
4)测序接头的连接：用磁珠纯化步骤3)中的PCR产物，纯化完成后进行Qubit浓度测定，将准备同批进行测序的样本混合，连接反应后得到测序文库；
5)测序与数据分析：使用长读长的Nanopore测序平台，测序时间达到1～2h即可以检出主要的病原微生物，测序产生的数据在病原微生物分析软件上进行同步分析。
2.根据权利要求1所述病原微生物快速检测方法，其特征在于：所述样本为血液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、口腔拭子、脓液。
3.根据权利要求1所述病原微生物快速检测方法，其特征在于：所述样本提取核酸总量不少于50pg。
4.根据权利要求1所述病原微生物快速检测方法，其特征在于：所述步骤1)使用常规的磁珠法等自动化仪器提取核酸即可。
5.根据权利要求1所述病原微生物快速检测方法，其特征在于：所述步骤1)中的总核酸无需去除人源基因组。
6.根据权利要求1所述病原微生物快速检测方法，其特征在于：所述步骤2)中第一轮特异性引物的多重PCR扩增的配置体系为：提取核酸(50pg～100ng)4μl，加入多重扩增酶混合液(2X)5μl，以及10μl带通用序列的特异性引物组(100nM)进行扩增；PCR扩增条件：94℃1min，10个循环(94℃15s，60℃2min)，4℃暂存。
7.根据权利要求1所述病原微生物快速检测方法，其特征在于：所述步骤3)中第一轮异性引物的多重PCR扩增的配置体系为：第一轮扩增产物10μl，加入快速扩增酶混合液(2X)15μl，以及2μl带标签序列的引物组(10uM)，加13μl ddH2O进行扩增；PCR扩增条件：94℃1min，30个循环(94℃15s，62℃15s，72℃1min)，72℃2min，4℃暂存。
8.根据权利要求1所述病原微生物快速检测方法，其特征在于：所述步骤3)中直接加入通用的Barcode引物与普通的快速扩增酶扩增。
9.根据权利要求8所述病原微生物快速检测方法，其特征在于：所述步骤3)中Barcode5’末端额外的添加了磷酸化修饰。
10.一种利用如权利要求1～9任一项所述的方法快速检测病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
第一轮特异性引物的多重PCR扩增试剂，包括多重扩增酶混合液和带通用序列的特异性引物组，
第二轮带标签序列PCR扩增，包括快速扩增酶混合液、带标签序列的引物组。
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