CN113637796A - 一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，分子生物检测领域，包括如下步骤：步骤一，提取8种疱疹病毒1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、Epstein‑Barr病毒、水痘带状疱疹病毒、人类疱疹病毒6、人类疱疹病毒7及人类疱疹病毒8的宿主和病毒微生物基因组；步骤二，设计8种疱疹病毒检测靶标位点的特异性引物，进行第一轮多重PCR扩增；步骤三，使用Index接头引物对纯化产物进行第二轮多重PCR扩增；步骤四，将所有样本取相同质量进行pooling，末端修复加A尾，连接测序接头即完成文库构建；步骤五，文库质控合格后，进行纳米孔测序；本发明判断快速准确且高通量，为辅助疱疹的早期发现提供了技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，特别是一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法。
背景技术
疱疹病毒属于疱疹病毒（Herpesviridae）科，是一类有包膜、基因组为双链的DNA病毒。目前发现的能感染人的疱疹病毒有8种，在临床上引起了多种严重的人类疾病，如发热、黄疸、肝脾肿大、脑炎或脑膜炎等。
疱疹病毒感染者因症状和体征无特异性，其早期发现主要依赖于临床经验判断。传统的病毒分离培养、血清学诊断等技术因特异性和灵敏度较低，极易导致误诊和漏诊。实时定量PCR由于本身的技术限制或其它多方面因素，会导致大量“假阴性”出现，而且不能满足大量样本快速检测的需求。因此，临床上急需一种有效利用核酸检测手段来快速高效高通量且准确的辅助判断疱疹病毒感染的方法。
纳米孔测序是将人工合成的一种多聚合物的膜浸在离子溶液中，多聚合物膜上布满了经改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白（纳米孔），也就是Reader蛋白，在膜两侧施加不同的电压产生电压差，DNA链在马达蛋白的牵引下，解螺旋通过纳米孔蛋白，不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号。该膜具有非常高的电阻。通过纳米孔的单分子引起特征性的电流干扰，这被称为Nanopore信号。
纳米孔是对穿过的片段进行测序，而不管DNA片段的长度如何。也不是生成特定长度的序列，这可能是数百个碱基、或者更多个碱基的序列。Nanopore的长序列简化了重复区域的组装和测序，也提高了物种鉴定和宏基因组实验的速度。
多重PCR技术可以在一个反应孔中完成多对引物的扩增，即通过一次PCR可完成多个靶标区域的富集，克服了普通PCR的缺点。但多重PCR技术应用在病毒微生物检测中容易出现假阳性结果。
市场需要一种能够快速准确判断8种疱疹病毒的方法，辅助疱疹的早期发现。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，本发明判断快速准确且高通量，为辅助疱疹的早期发现提供了技术基础。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，包括如下步骤：
步骤一，提取8种疱疹病毒的宿主和病毒微生物基因组；
8种疱疹病毒包括：1型单纯疱疹病毒（HSV-1）、2型单纯疱疹病毒（HSV-2）、巨细胞病毒（CMV） 、Epstein-Barr病毒（EBV）、水痘带状疱疹病毒（VZV）、人类疱疹病毒6（HHV-6）、人类疱疹病毒7（HHV-7）及人类疱疹病毒8（HHV-8）；
步骤二，设计8种疱疹病毒检测靶标位点的特异性引物，在各正向引物的5’端加上接头序列AGGTCTTCACGATACGTCGAG，各反向引物的5’端加上接头序列GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使用含接头序列的特异性引物的混合物进行第一轮多重PCR扩增，对目的片段进行富集、纯化；
8种疱疹病毒检测靶位点分别为HSV1&2的gB基因、CMV的IE基因、EBV的EBNA2基因、VZV的DNA poly基因、HHV-6的UL57基因、HHV-7的UL10基因及HHV-8的ORF26基因；
步骤三，使用Index接头引物对纯化产物进行第二轮多重PCR扩增、纯化、定量，在Index各正向引物3’端加上测序接头AGGTCTTCACGATACGTCGAG，在Index各反向引物3’端加上测序接头GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使每个样本加上不同Index，完成目标片段富集；
步骤四，将带有不同Index的二轮纯化产物质控合格后，所有样本取相同质量进行pooling,末端修复加A尾，连接测序接头即完成文库构建；
步骤五，文库质控合格后，进行纳米孔测序。
进一步的，步骤一中提取8种疱疹病毒的宿主和病毒微生物基因组的具体内容包括：
1）将含有微生物的液体加入到离心管中作为样本；
2）在离心管中加入灭菌后的玻璃珠、蛋白酶K，震荡研磨；
3）吸取研磨后的液体，加入裂解液，放置；
4）在离心管中加入核酸助沉剂，漩涡混匀；
5）在离心管中加入磁珠，漩涡混匀，放置；
6）将离心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液；
7）将第一洗涤液加入离心管中，静置，吸出上清液；
8）将第二洗涤液加入离心管中，静置，完全吸出上清液；
9）向离心管内加入洗脱液，漩涡混匀，放置；
10）将离心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液至另一新的离心管内，即得到纯化的DNA。
进一步的，步骤二中含接头序列的特异性引物包括：
进一步的，第一轮多重PCR扩增的扩增体系为：
扩增程序为： 95℃预变性3分钟，循环内95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，20个循环；循环结束后72℃延伸5分钟；4℃保存。
进一步的，第二轮多重PCR扩增的扩增体系为：
扩增程序为：补充第二轮多重PCR扩增的程序。
进一步的，纯化采用的方法是磁珠纯化。
进一步的，第一轮多重PCR扩增后纯化一次，第二轮多重PCR扩增后纯化二次。
进一步的，步骤五中的纳米孔测序采用Nanopore公司的MinION测序仪测序，测序试剂盒采用SQK-LSK109，测序芯片为R9。
进一步的，步骤五中的纳米孔测序的具体步骤包括：
1） 芯片诱发；
采用的诱发剂为： 15 μl FLT，500 μl FB， 200 μl 的无核酸酶水；
2）上机文库点样：
上机文库的配置：取一个EP管，加入18.8 μl SQB，12.8 μl LB，200 ng DNA文库，然后加入ddH2O补充至47 μl，吹打混匀，加样，加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序，每个样本数据量达到200K即可停止测序；
3）数据下机后，通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，并正确分配到每个Index中，每个样品都有独特的Index序列，每条序列的前一段序列就是Index序列，将这段序列与测序仪提供的Index序列进行比对，将比对分数大于80的序列视为可信的分配；采用NanoFilt软件进行质控，每条序列都有一个平均测序数据质量值Q，若Q值小于7的序列视为不合格序列，将合格的序列与疱疹病毒基因组序列进行比对；通过与数据库中的疱疹病毒相关基因的比对分析，可以得到样本中是否含有上述8种疱疹病毒。
采用上述技术方案后，本发明的有益之处在于：
本发明选择的HSV1&2的gB基因、CMV的IE基因、EBV的EBNA2基因、VZV的DNA poly基因、HHV-6的UL57基因、HHV-7的UL10基因及HHV-8的ORF26既可以覆盖8种疱疹病毒，又在组合引物扩增过程中彼此不受干扰；在特异性上具有协同作用；
本发明通过多重PCR扩增目标区域并一次性完成捕获，结合纳米孔测序技术，多样本同时测序，在大样本量筛查的同时极大地降低了成本。另外，多重PCR与纳米孔技术的整合应用，进一步提高疱疹病毒检测的灵敏度、特异性及可重复性，实现大批量样本疱疹病毒检测及混合感染样品基质中的多种疱疹病毒的有效检测。
此外，相对于其他测序平台，纳米孔测序有简单便携、超长读长、低成本设备及实时数据测序监控等优点。它体积小巧和具有通过笔记本电脑驱动操作的能力, 使得研究人员能够设计完成以往在现场不可能完成的实验，解决在生物材料运输受到物理条件而遇到的困难。以往我们需要收集样本并将其速递到测序中心进行测序，现在可以将测序仪带到现场进行样本的检测以获得更快的结果。
附图说明
图1是本发明的一种实施例的检测原理图；
图2是本发明的检测方法检测已知8种疱疹病毒捕获后片段大小电泳图，M1：100bpmaker；M2：200bp maker；1：HSV-1；2：HSV-2；3：VZNA；4：EBV；5：CMV；6：HHV-6；7：HHV-7；8：HHV-8；
图3是本发明测试EB病毒特异性引物的灵敏度及特异性的电泳结果图（1：EBV-Lmp2A-F/R；2：EBV- EBNA2-F/R；3：EBV- Lmp2A-F/R阴性对照；4：EBV- EBNA2-F/R阴性对照）；
图4是本发明EBV- EBNA2-F/R扩增其他疱疹病毒，检测该引物特异性电泳结果图（1：HSV1临床阳性样本；2：HSV2临床阳性样本；3：VZN临床阳性样本；4：CMV临床阳性样本；5：HHV-6临床阳性样本；6：HHV-7临床阳性样本；7：HHV-7临床阳性样本；8：EBV临床阳性样本；9：阴性对照）；
图5是本发明检测特异性引物CMV-IE-F/R及CMV-gB-F/R的电泳结果（1：CMV-IE-F/R，2 ：CMV-gB-F/R）
图6是本发明纳米孔测序检测结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，包括如下步骤：
步骤一，提取宿主和病毒微生物基因组：
1 .将含有微生物的液体加入到离心管中作为样本；
2 .向步骤 （1）的离心管中加入灭菌后的玻璃珠、蛋白酶K，震荡研磨；
3 .吸取步骤（2）中研磨后的液体，加入裂解液，56℃放置30min；
4.加入核酸助沉剂至步骤（3）的离心管中，漩涡混匀；
5.向步骤（4）的离心管中加入磁珠，漩涡混匀，室温放置25-30min；
6.将步骤（5）的离心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液；
7.将洗涤液1加入步骤（6）的离心管中，静置30s，吸出上清液；
8.将洗涤液2加入步骤（7）的离心管中，静置30s，完全吸出上清液；
9.向步骤（8）的离心管内加入洗脱液，漩涡混匀，室温放置2-20min；
10.将步骤（9）的离心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液至另一新的离心管内，即得到纯化的DNA；
步骤二，设计覆盖HSV1&2的gB基因、CMV的IE基因、EBV的EBNA2基因、VZV的DNApoly基因、HHV-6的UL57基因、HHV-7的UL10基因及HHV-8的ORF26基因的特异性引物，在各正向引物的5’端加上接头序列AGGTCTTCACGATACGTCGAG，各反向引物的5’端加上接头序列GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG。其扩增产物在500-700bp，具体含接头序列的引物见表1。
表1
将以上引物分别稀释至10uM后等比例混合为Primer Pool。
合成二次扩增Index引物，稀释至10uM。目前纳米孔测序常用Index有96种，一般可以满足样本需求，具体纳米孔测序Index序列见表2。
表2
步骤三，目标片段富集：
1、第一轮多重PCR
（1）按照Qubit dsDNA HS Assay Kit 操作手册检测样品核酸浓度，根据Qubit检测的样本浓度，每个样品取相同的量（10ng），利用实施例2中混合好的Primer Pool扩增目的片段。按照理论值的125%配置PCR总体系，具体为：
（2）PCR反应条件为95℃预变性3分钟，循环内95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，20个循环；循环结束后72℃延伸5分钟；4℃保存。
2、PCR产物纯化
（1）PCR反应结束后，打开PCR管盖，每孔加入15uL的纯化磁珠，吹打混匀，室温下孵育5分钟。
（2）将PCR管放上磁力架，等待2分钟，待溶液澄清后，吸弃上清。
（3）每孔加入100uL 80%乙醇，静置1分钟，吸弃上清，重复一遍。
（4）晾干3-5分钟，观察磁珠表面不再潮湿反光，成雾面状，可离开磁力架，每孔加入20uL Nuclease Free H2O，吹打混匀重悬磁珠，室温孵育1分钟。
（5）将PCR管再次放上磁力架，静置2分钟，待溶液澄清后，转移上清至新的PCR管中。
3、第二轮多重PCR
使用实施例2中Index引物对纯化的扩增子进行第二次扩增，在在Index各正向引物3’端加上测序接头AGGTCTTCACGATACGTCGAG，在Index各反向引物3’端加上测序接头GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使每个样本带上不同的Index。按照理论值的125% 配置PCR总体系，具体为：
4、PCR产物纯化
步骤同二，做两次纯化，彻底去除引物二聚体，用20 uL Nuclease Free H2O洗脱。
5、电泳鉴定
每个样本取5uL，进行2% 的琼脂糖电泳，观察是否有条带，以及条带长度是否在500-700bp之间。同时进行Qubit定量，质控合格后方可进行下一步。
附图二为利用本发明检测方法包含的Primer Pool对已知8种疱疹病毒阳性样本鉴定的电泳图。
步骤四，测序文库构建及纯化：
（1） pooling：将第二次扩增后的纯化产物按照每个样本100 ng进行pooling，pooling后总体积不超过50μl，不足50μl的用ddH2O补充至50μl。
（2） 末端修复、加A尾：总体系为65μl，pooling完的DNA溶液50μl，末端修复mix（Vazyme）15μl。反应程序为，20 ℃ 反应15min，65℃终止反应 15min，4 ℃保存。
（3）末端修复纯化，在65μl PCR产物加入52μl AMpure XP Beads，之后纯化方式与实施例2 中的纯化方法相同，最后洗脱DNA时用27μl ddH2O洗脱，取25μl用于接头连接。
（4）接头连接：总体系为50μl，末端修复纯化后产物25μl，5×Ligation Buffer（NEB）10μl，T4 Rapid DNA Ligase（NEB）5μl，Adapter Mix（Nanopore）1μl，ddH2O 9μl。反应程序为，20℃反应15min，4℃保存。
（5） 接头连接产物纯化：在50μl 接头连接产物中加入35μl AMpure XP Beads，吹打混匀后室温静置5min；置于磁力架上，待2-5min液体澄清后弃上清；加入125μl SFB（Nanopore），磁力架上静置30s后弃上清，重复一次；吸干净残留的乙醇，开盖室温晾干约5min，待磁珠干燥即加入15μl ddH2O洗脱DNA；吹打混匀后室温静置3min，吸取13μl 即得到终文库。
步骤五，使用Nanopore公司的MinION测序仪测序（测序试剂盒：SQK-LSK109，测序芯片：R9）
（1） 芯片诱发：
诱发剂的配制：取一个1.5ml EP管，加入15μl FLT，500μl FB，然后加入200μl 的去酶水，吹打混匀。
诱发：将已质检完毕的芯片插入到上机机器中，打开加诱发试剂的孔，用1000μl的移液枪，吸取450μl的诱发剂，加入诱发剂前先调小一点量程，使枪尖带有小液珠，插入孔中，调小量程使液体缓缓进入芯片，直到不能调小量程为止。诱发剂加入完毕后，关闭孔洞静置5min。接着打开孔洞，按照上一步方法继续加入200μl的诱发剂。
（2） 上机文库点样：
上机文库的配置：取一个EP管，加入18.8μl SQB，12.8μl LB，200ng DNA文库，然后加入ddH2O补充至47μl，吹打混匀。
加样：打开加样孔，用100μl的移液枪，吸取47μl的上机文库，加样时，枪尖悬空在加样孔上方，缓慢按动移液枪，确保上机文库一滴一滴地加入。加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序。每个样本数据量达到200K即可停止测序。
（3） 数据下机后，通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，并正确分配到每个Index中。每个样品都有独特的Index序列，每条序列的前一段序列就是Index序列，将这段序列与测序仪提供的Index序列进行比对，将比对分数大于80的序列视为可信的分配。采用NanoFilt软件进行质控，每条序列都有一个平均测序数据质量值Q，Q值小于7的序列视为不合格序列，将合格的序列与疱疹病毒基因组序列进行比对。通过与数据库中的疱疹病毒相关基因的比对分析。
验证实验：以下通过本发明覆盖8种疱疹病毒的特异性引物筛选过程验证本发明选择的HSV1&2的gB基因、CMV的IE基因、EBV的EBNA2基因、VZV的DNA poly基因、HHV-6的UL57基因、HHV-7的UL10基因及HHV-8的ORF26基因在检测结果特异性上具有协同作用。
除本发明筛选出的灵敏度及特异性高的覆盖HSV1&2的gB基因、CMV的IE基因、EBV的EBNA2基因、VZV的DNA poly基因、HHV-6的UL57基因、HHV-7的UL10基因及HHV-8的ORF26的特异性引物外，本发明初期，还同时设计了覆盖HSV1&2的DNA Poly基因、CMV的gB基因、EBV的Lmp2A基因、VZV的ORF26基因以及针对HHV-6的UL57、HHV-7的UL10、HHV-8的ORF26基因的另外一对特异性引物，含接头序列的引物具体见表格3：
表3
使用本发明检测方法检测已知8种疱疹病毒捕获后片段大小电泳图如图2所示，M1：100bp maker；M2：200bp maker；1：HSV-1；2：HSV-2；3：VZNA；4：EBV；5：CMV；6：HHV-6；7：HHV-7；8：HHV-8。对已知EB病毒阳性患者的肺泡灌洗液样本，测试EB病毒特异性引物的灵敏度及特异性，具体检测结果如图3所示；使用EBV- EBNA2-F/R扩增其他疱疹病毒，检测该引物特异性电泳结果如图4所示；结果表明：针对EB病毒的特异性引物EBV- EBNA2-F/R特异性及灵敏度皆符合要求，PCR产物送一代测序所得到的序列在NCBI比对，100%比对到EB病毒EBNA2基因，因此选择特异性引物EBV- EBNA2-F/R与其他引物组合为Primer Pool。
同样的，筛选出特异性引物HSV1＆HSV2-gB-F/R、CMV-IE-F/R、VZN- DNA poly-F/R、HHV-6- UL57-F/R、HHV-7- UL10-F/R及HHV-8- ORF26-F/R。
值得说明的是：特异性引物CMV-IE-F/R及CMV-gB-F/R从电泳结果看灵敏度及特异性基本无差异，一代测序结果比对正确，具体见图5。
于是特异性Primer Pool-1的引物组合为：HSV1＆HSV2-gB-F/R、CMV-IE-F/R、VZN-DNA poly-F/R、HHV-6- UL57-F/R、HHV-7- UL10-F/R及HHV-8- ORF26-F/R；特异性PrimerPool-2的引物组合为：HSV1＆HSV2-gB-F/R、CMV-gB-F/R、VZN- DNA poly-F/R、HHV-6-UL57-F/R、HHV-7- UL10-F/R及HHV-8- ORF26-F/R；
选临床阳性样本进行纳米孔测序结果显示：
纳米孔测序结果显示，特异性Primer Pool-2中CMV-gB-F/R可能在扩增过程中对引物HSV1＆HSV2-gB-F/R有干扰作用，因此选择特异性Primer Pool-1。
2.利用本发明的检测方法，对已知阳性患者的肺泡灌洗液检测结果如下：
将该样本进行10倍梯度稀释后进行提取，稀释液选用EB病毒阴性肺泡灌洗液样本，同时进行纳米孔测序及qPCR检测，由检测结果可见：本发明涉及的检测方法检测灵敏度优于qPCR检测方法。
纳米孔测序检测结果如表４所示：
表4
qPCR检测检测结果如图6所示。
本发明选择的HSV1&2的gB基因、CMV的IE基因、EBV的EBNA2基因、VZV的DNA poly基因、HHV-6的UL57基因、HHV-7的UL10基因及HHV-8的ORF26既可以覆盖8种疱疹病毒，又在组合引物扩增过程中彼此不受干扰；在特异性上具有协同作用；本发明通过多重PCR扩增目标区域并一次性完成捕获，结合纳米孔测序技术，多样本同时测序，在大样本量筛查的同时极大地降低了成本的同时进一步提高疱疹病毒检测的灵敏度、特异性及可重复性，实现大批量样本疱疹病毒检测及混合感染样品基质中的多种疱疹病毒的有效检测。
需要说明的是：本发明并不涉及疾病的诊断方法，本发明是鉴定病毒的方法，无法直接判断疾病，只是对早期发现提供了技术基础，辅助判断的方法。
除上述优选实施例外，本发明还有其他的实施方式，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求书中所定义的范围。
序列表
<110> 杭州圣庭医疗科技有限公司
<120> 一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法
<141> 2021-07-06
<160> 138
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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<210> 2
<211> 41
<212> DNA
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<400> 2
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<400> 3
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<213> Artificial Sequence
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gtccaatcag ttgcagcttc agtgcggtac atgtataggt ca 42
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aggtcttcac gatacgtcga gagtatgacc gctgctatac 40
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gtccaatcag ttgcagcttc agatctgcgc gtgatagtt 39
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
aggtcttcac gatacgtcga ggatagtcga gatgatgtac gca 43
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gtccaatcag ttgcagcttc agcctcagtg caggagaata gt 42
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
aggtcttcac gatacgtcga ggaaagtgga ctagatgtac gca 43
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gtccaatcag ttgcagcttc agcttatcga tgacagatcg cga 43
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
aggtcttcac gatacgtcga gggagaatgc gaccgtatac t 41
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gtccaatcag ttgcagcttc agtcgcagtt tacagattat cac 43
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
aagaaagttg tcggtgtctt tgtg 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tcgattccgt ttgtagtcgt ctgt 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gagtcttgtg tcccagttac cagg 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ttcggattct atcgtgtttc ccta 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
cttgtccagg gtttgtgtaa cctt 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
ttctcgcaaa ggcagaaagt agtc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gtgttaccgt gggaatgaat cctt 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
ttcagggaac aaaccaagtt acgt 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
aactaggcac agcgagtctt ggtt 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
aagcgttgaa acctttgtcc tctc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gtttcatcta tcggagggaa tgga 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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caggtagaaa gaagcagaat cgga 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 27
agaacgactt ccatactcgt gtga 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
aacgagtctc ttgggaccca taga 24
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<213> Artificial Sequence
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aggtctacct cgctaacacc actg 24
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<213> Artificial Sequence
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cgtcaactga cagtggttcg tact 24
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<213> Artificial Sequence
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accctccagg aaagtacctc tgat 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
ccaaacccaa caacctagat aggc 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 33
gttcctcgtg cagtgtcaag agat 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
ttgcgtcctg ttacgagaac tcat 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
gagcctctca ttgtccgttc tcta 24
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<213> Artificial Sequence
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accactgcca tgtatcaaag tacg 24
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<213> Artificial Sequence
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cttactaccc agtgaacctc ctcg 24
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gcatagttct gcatgatggg ttag 24
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gtaagttggg tatgcaacgc aatg 24
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catacagcga ctacgcattc tcat 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 41
cgacggttag attcacctct taca 24
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tgaaacctaa gaaggcaccg tatc 24
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ctagacacct tgggttgaca gacc 24
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<213> Artificial Sequence
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tcagtgagga tctacttcga ccca 24
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<213> Artificial Sequence
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tgcgtacagc aatcagttac attg 24
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<213> Artificial Sequence
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ccagtagaag tccgacaacg tcat 24
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<213> Artificial Sequence
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cagacttggt acggttgggt aact 24
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<213> Artificial Sequence
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ggacgaagaa ctcaagtcaa aggc 24
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<213> Artificial Sequence
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ctacttacga agctgaggga ctgc 24
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<213> Artificial Sequence
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atgtcccagt tagaggagga aaca 24
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<213> Artificial Sequence
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gcttgcgatt gatgcttagt atca 24
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<213> Artificial Sequence
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accacaggag gacgatacag agaa 24
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ccacagtgtc aactagagcc tctc 24
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<213> Artificial Sequence
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tagtttggat gaccaaggat agcc 24
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<213> Artificial Sequence
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ggagttcgtc cagagaagta cacg 24
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<213> Artificial Sequence
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ctacgtgtaa ggcatacctg ccag 24
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<213> Artificial Sequence
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ctttcgttgt tgactcgacg gtag 24
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<213> Artificial Sequence
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agtagaaagg gttccttccc actc 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 59
gatccaacag agatgccttc agtg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gctgtgttcc acttcattct cctg 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 61
gtgcaacttt cccacaggta gttc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 62
catctggaac gtggtacacc tgta 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 63
actggtgcag ctttgaacat ctag 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 64
atggactttg gtaacttcct gcgt 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gttgaatgag cctactgggt cctc 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 66
tgagagacaa gattgttcgt ggac 24
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<213> Artificial Sequence
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agattcagac cgtctcatgc aaag 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 68
caagagcttt gactaaggag catg 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 69
tggaagatga gaccctgatc tacg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 70
tcactactca acaggtggca tgaa 24
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<213> Artificial Sequence
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gctaggtcaa tctccttcgg aagt 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 72
caggttactc ctccgtgagt ctga 24
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<213> Artificial Sequence
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tcaatcaaga agggaaagca aggt 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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catgttcaac caaggcttct atgg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 75
agagggtact atgtgcctca gcac 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 76
cacccacact tacttcagga cgta 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 77
ttctgaagtt cctgggtctt gaac 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gacagacacc gttcatcgac tttc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ttctcagtct tcctccagac aagg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 80
ccgatccttg tggcttctaa cttc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 81
gtttgtcata ctcgtgtgct cacc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 82
gaatctaagc aaacacgaag gtgg 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 83
tacagtccga gcctcatgtg atct 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 84
accgagatcc tacgaatgga gtgt 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 85
cctgggagca tcaggtagta acag 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tagctgactg tcttccatac cgac 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 87
aagaaacagg atgacagaac cctc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 88
tacaagcatc ccaacacttc cact 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaccattgtg atgaaccctg ttgt 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atgcttgtta catcaaccct ggac 24
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<213> Artificial Sequence
<400> 91
cgacctgttt ctcagggata caac 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 92
aacaaccgaa cctttgaatc agaa 24
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<213> Artificial Sequence
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tctcggagat agttctcact gctg 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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cggatgaaca taggatagcg attc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cctcatcttg tgaagttgtt tcgg 24
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<213> Artificial Sequence
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acggtatgtc gagttccagg acta 24
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<213> Artificial Sequence
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tggcttgatc taggtaaggt cgaa 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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gtagtggacc tagaacctgt gcca 24
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<213> Artificial Sequence
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aacggaggag ttagttggat gatc 24
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<213> Artificial Sequence
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aggtgatccc aacaagcgta agta 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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tacatgctcc tgttgttagg gagg 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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tcttctacta ccgatccgaa gcag 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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acagcatcaa tgtttggcta gttg 24
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<213> Artificial Sequence
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gatgtagagg gtacggtttg aggc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ggctccatag gaactcacgc tact 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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ttgtgagtgg aaagatacag gacc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 107
agtttccatc acttcagact tggg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 108
gattgtcctc aaactgccac ctac 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 109
cctgtctgga agaagaatgg actt 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 110
ctgaacggtc atagagtcca ccat 24
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aggtcttcac gatacgtcga gccatcgcta atccgagtat a 41
<210> 112
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 112
gtccaatcag ttgcagcttc agacgatcac gtccacgtcc t 41
<210> 113
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 113
aggtcttcac gatacgtcga gtaactgtac gttcagacaa cc 42
<210> 114
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 114
gtccaatcag ttgcagcttc agctctggcc tatgtcccac ac 42
<210> 115
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 115
aggtcttcac gatacgtcga gctaagagaa taaggttcga gtgg 44
<210> 116
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 116
gtccaatcag ttgcagcttc agcatattct gatcacgaga gca 43
<210> 117
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 117
aggtcttcac gatacgtcga gggcatcatg gtattctaca a 41
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 118
gtccaatcag ttgcagcttc agtagtaggt tgggcttcta tc 42
<210> 119
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 119
aggtcttcac gatacgtcga gctgatcata gcancgcaaa t 41
<210> 120
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 120
gtccaatcag ttgcagcttc agtgcggtac atgtataggt ca 42
<210> 121
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 121
aggtcttcac gatacgtcga ggcttggctc tctcacttat a 41
<210> 122
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 122
gtccaatcag ttgcagcttc agtcctgttc atgtatcgat ga 42
<210> 123
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 123
aggtcttcac gatacgtcga gagtatgacc gctgctatac 40
<210> 124
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 124
gtccaatcag ttgcagcttc agatctgcgc gtgatagtt 39
<210> 125
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 125
aggtcttcac gatacgtcga ggtcttcgac actcgatgct c 41
<210> 126
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtccaatcag ttgcagcttc agcgagtatc atcggtatca ga 42
<210> 127
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aggtcttcac gatacgtcga ggatagtcga gatgatgtac gca 43
<210> 128
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtccaatcag ttgcagcttc agcctcagtg caggagaata gt 42
<210> 129
<211> 43
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<213> Artificial Sequence
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aggtcttcac gatacgtcga ggatagtcga gatgatgtac gca 43
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
<400> 130
gtccaatcag ttgcagcttc agtgctgttg acgttggaga t 41
<210> 131
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 131
aggtcttcac gatacgtcga ggaaagtgga ctagatgtac gca 43
<210> 132
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 132
gtccaatcag ttgcagcttc agcttatcga tgacagatcg cga 43
<210> 133
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 133
aggtcttcac gatacgtcga gacacacggt gtgctattca gga 43
<210> 134
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 134
gtccaatcag ttgcagcttc agggtctacg tgacctattc gggt 44
<210> 135
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 135
aggtcttcac gatacgtcga gggagaatgc gaccgtatac t 41
<210> 136
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 136
gtccaatcag ttgcagcttc agtcgcagtt tacagattat cac 43
<210> 137
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 137
aggtcttcac gatacgtcga ggagggagaa tgcgaccgta tact 44
<210> 138
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 138
gtccaatcag ttgcagcttc aggggcagtt tacagaaaat cgc 43
Claims (9)
1.一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，提取8种疱疹病毒的宿主和病毒微生物基因组；
8种疱疹病毒包括：1型单纯疱疹病毒（HSV-1）、2型单纯疱疹病毒（HSV-2）、巨细胞病毒（CMV） 、 Epstein-Barr病毒（EBV）、水痘带状疱疹病毒（VZV）、人类疱疹病毒6（HHV-6）、人类疱疹病毒7（HHV-7）及人类疱疹病毒8（HHV-8）；
步骤二，设计8种疱疹病毒检测靶标位点的特异性引物，在各正向引物的5’端加上接头序列AGGTCTTCACGATACGTCGAG，各反向引物的5’端加上接头序列GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使用含接头序列的特异性引物的混合物进行第一轮多重PCR扩增，对目的片段进行富集、纯化；
所述8种疱疹病毒检测靶位点分别为HSV1&2的gB基因、CMV的IE基因、EBV的EBNA2基因、VZV的DNA poly基因、HHV-6的UL57基因、HHV-7的UL10基因及HHV-8的ORF26基因；
步骤三，使用Index接头引物对纯化产物进行第二轮多重PCR扩增、纯化、定量，在Index各正向引物3’端加上测序接头AGGTCTTCACGATACGTCGAG，在Index各反向引物3’端加上测序接头GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使每个样本加上不同Index，完成目标片段富集；
步骤四，将带有不同Index的二轮纯化产物质控合格后，所有样本取相同质量进行pooling,末端修复加A尾，连接测序接头即完成文库构建；
步骤五，文库质控合格后，进行纳米孔测序。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，其特征在于，步骤一中提取8种疱疹病毒的宿主和病毒微生物基因组的具体内容包括：
1）将含有微生物的液体加入到离心管中作为样本；
2）在离心管中加入灭菌后的玻璃珠、蛋白酶K，震荡研磨；
3）吸取研磨后的液体，加入裂解液，放置；
4）在离心管中加入核酸助沉剂，漩涡混匀；
5）在离心管中加入磁珠，漩涡混匀，放置；
6）将离心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液；
7）将第一洗涤液加入离心管中，静置，吸出上清液；
8）将第二洗涤液加入离心管中，静置，完全吸出上清液；
9）向离心管内加入洗脱液，漩涡混匀，放置；
10）将离心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液至另一新的离心管内，即得到纯化的DNA。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，其特征在于，步骤二中含接头序列的特异性引物包括：
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，其特征在于，所述第一轮多重PCR扩增的扩增体系为：
扩增程序为： 95℃预变性3分钟，循环内95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，20个循环；循环结束后72℃延伸5分钟；4℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，其特征在于，所述第二轮多重PCR扩增的扩增体系为：
扩增程序为：补充第二轮多重PCR扩增的程序。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，其特征在于，所述纯化采用的方法是磁珠纯化。
7.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，其特征在于，第一轮多重PCR扩增后纯化一次，第二轮多重PCR扩增后纯化二次。
8.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤五中的纳米孔测序采用Nanopore公司的MinION测序仪测序，测序试剂盒采用SQK-LSK109，测序芯片为R9。
9.根据权利要求8所述的一种基于纳米孔测序仪的8种疱疹病毒快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤五中的纳米孔测序的具体步骤包括：
1） 芯片诱发；
采用的诱发剂为： 15μl FLT，500μl FB， 200μl 的无核酸酶水；
2）上机文库点样：
上机文库的配置：取一个EP管，加入18.8μl SQB，12.8μl LB，200 ng DNA文库，然后加入ddH2O补充至47μl，吹打混匀，加样，加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序，每个样本数据量达到200K即可停止测序；
3）数据下机后，通过Guppy软件将由测序仪产生的fast5格式文件转换成fastq格式，并正确分配到每个Index中，每个样品都有独特的Index序列，每条序列的前一段序列就是Index序列，将这段序列与测序仪提供的Index序列进行比对，将比对分数大于80的序列视为可信的分配；采用NanoFilt软件进行质控，每条序列都有一个平均测序数据质量值Q，若Q值小于7的序列视为不合格序列，将合格的序列与疱疹病毒基因组序列进行比对；通过与数据库中的疱疹病毒相关基因的比对分析。
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