KR20220127761A - 차세대 염기서열 분석방법을 이용하여 식중독균을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출방법 - Google Patents

차세대 염기서열 분석방법을 이용하여 식중독균을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 차세대 염기서열 분석방법을 이용하여 식중독균을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 조성물은 16종류의 식중독균을 한 번에 빨리 높은 정확도로 검출할 수 있어, 식중독균의 동시검출에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

차세대 염기서열 분석방법을 이용하여 식중독균을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출방법{PRIMER SET OF FOOD POISONING BACTERIA USING NEXT GENERATION SEQUENCING AND DETECTION METHOD USING THEREOF}
본 발명은 차세대 염기서열 분석방법을 이용하여 식중독균을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출방법에 관한 것이다.
식중독은 식품 또는 물의 섭취에 의해 발생하는 감염성 또는 독소형 질환을 말하며, 구토, 설사, 복통, 발열 등과 같은 증상을 유발하고 심각한 경우 사망에까지 이를 수 있다. 단체급식, 외식산업 및 편이식품의 발달로 식중독 발생건수가 지속해서 증가하고, 국제적으로도 식품의 수출입이 증대됨에 따라 식품 안정성에 대한 소비자의 요구 또는 국제 유통 규정을 충족시키기 위해 이를 신속하고 경제적으로 확인할 수 있는 방법이 필요하다.
식중독은 박테리아, 바이러스, 화학물질, 기생충 등에 의해 발생하는데, 이는 식품의 생산부터 재배, 포장, 유통, 소비까지 전 단계에 걸쳐 다양한 경로로 오염될 수 있다. 식중독을 유발하는 식중독균은 일반적으로 선택적 배지에서 시료를 배양하여 균을 분리한 후, 생화학적 또는 면역학적 방법으로 확인된다. 면역학적 방법을 이용한 식중독균 검출 방법은 높은 정확도로 균의 검출이 가능하나, 많은 양의 시료가 필요하고 각각의 균에 대한 항체가 필요해 높은 비용이 발생한다. 또한, 항체는 보관과 이용상의 어려움이 많고, 한 번에 한 종류 또는 제한된 종류의 균만 검출이 가능하며, 검출까지 소요시간이 길다는 문제가 있다.
이에 최근에는 식중독균의 검출에 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)이 사용되기 시작하였으며, 높은 정확성, 간편성 및 신속성때문에 그 수요가 증가하고 있다. 특히, 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭 산물을 실시간으로 관찰할 수 있어 전기영동의 추가 작업이 필요 없고, 정확도 및 민감도가 우수할 뿐 아니라 높은 재현율, 자동화 시스템, 수치화된 결과 수득 등과 같은 장점이 있어 각광받고 있다. 또한, 형광 표지 인자로 표지된 프로브를 사용하여 DNA 칩이나 항원-항체 반응에 사용되는 시료의 양보다 적은 양의 시료로도 결과를 확인할 수 있다.
관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1456646호는 식중독균 검출용 키트 및 이를 이용한 식중독균 검출 방법에 관한 것으로, 여러 종류의 식중독균을 동시에 효율적으로 검출할 수 있는 식중독균 검출용 키트를 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1456646호
본 발명의 목적은 식중독균을 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 상기 프라이머 세트를 이용한 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍, 서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍, 서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍, 서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍, 서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍, 서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍, 서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍, 서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍, 서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍, 서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍, 서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍, 서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍, 서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍, 서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍, 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍, 서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍, 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍, 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍, 서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍, 서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍, 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍, 서열번호 47 또는 48로 기재된 염기서열로 구성되는 제24 프라이머 쌍, 서열번호 49 또는 50으로 기재된 염기서열로 구성되는 제25 프라이머 쌍, 서열번호 51 또는 52로 기재된 염기서열로 구성되는 제26 프라이머 쌍, 서열번호 53 또는 54로 기재된 염기서열로 구성되는 제27 프라이머 쌍, 서열번호 55 또는 56으로 기재된 염기서열로 구성되는 제28 프라이머 쌍, 서열번호 57 또는 58로 기재된 염기서열로 구성되는 제29 프라이머 쌍, 서열번호 59 또는 60으로 기재된 염기서열로 구성되는 제30 프라이머 쌍, 서열번호 61 또는 62로 기재된 염기서열로 구성되는 제31 프라이머 쌍, 서열번호 63 또는 64로 기재된 염기서열로 구성되는 제32 프라이머 쌍, 서열번호 65 또는 66으로 기재된 염기서열로 구성되는 제33 프라이머 쌍, 서열번호 67 또는 68로 기재된 염기서열로 구성되는 제34 프라이머 쌍, 서열번호 69 또는 70으로 기재된 염기서열로 구성되는 제35 프라이머 쌍, 서열번호 71 또는 72로 기재된 염기서열로 구성되는 제36 프라이머 쌍, 서열번호 73 또는 74로 기재된 염기서열로 구성되는 제37 프라이머 쌍, 서열번호 75 또는 76으로 기재된 염기서열로 구성되는 제38 프라이머 쌍, 및 서열번호 77 또는 78로 기재된 염기서열로 구성되는 제39 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 식중독균 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 차세대 염기서열 분석 패널을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 서열을 이용하여 라이브러리를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 라이브러리를 이용하여 차세대 염기서열 분석을 수행하는 단계를 포함하는 차세대 염기서열 분석 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 식중독균 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 16종류의 식중독균을 한 번에 빨리 높은 정확도로 검출할 수 있어, 식중독균의 동시검출에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 제1 프라이머 쌍을 이용하여 바실러스 세레우스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 5: 비브리오 불니피쿠스, 6: 비브리오 콜레라, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 리스테리아 모노사이토제니스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 2는 본 발명에 따른 제2 프라이머 쌍을 이용하여 바실러스 세레우스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 3은 본 발명에 따른 제3 프라이머 쌍을 이용하여 캄필로박터 속 균주를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 5: 비브리오 불니피쿠스, 6: 비브리오 콜레라, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 리스테리아 모노사이토제니스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 4는 본 발명에 따른 제4 프라이머 쌍을 이용하여 캄필로박터 콜라이를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 5는 본 발명에 따른 제5 프라이머 쌍을 이용하여 캄필로박터 콜라이를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 6은 본 발명에 따른 제6 프라이머 쌍을 이용하여 캄필로박터 제주니를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 5: 비브리오 불니피쿠스, 6: 비브리오 콜레라, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 리스테리아 모노사이토제니스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 7은 본 발명에 따른 제7 프라이머 쌍을 이용하여 캄필로박터 제주니를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 리스테리아 모노사이토제니스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 스타필로코커스 아우레우스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 8은 본 발명에 따른 제8 프라이머 쌍을 이용하여 클로스트리디움 퍼프린진스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 리스테리아 모노사이토제니스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 스타필로코커스 아우레우스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 9는 본 발명에 따른 제9 프라이머 쌍을 이용하여 클로스트리디움 퍼프린진스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 5: 비브리오 불니피쿠스, 6: 비브리오 콜레라, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 리스테리아 모노사이토제니스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 10은 본 발명에 따른 제10 프라이머 쌍을 이용하여 클로스트리디움 퍼프린진스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 11은 본 발명에 따른 제11 프라이머 쌍을 이용하여 장응집성 대장균을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 12는 본 발명에 따른 제12 프라이머 쌍을 이용하여 장관출혈성 대장균을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 13은 본 발명에 따른 제13 프라이머 쌍을 이용하여 장관출혈성 대장균을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 14는 본 발명에 따른 제14 프라이머 쌍을 이용하여 장관출혈성 대장균을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 15는 본 발명에 따른 제15 프라이머 쌍을 이용하여 장병원성 대장균을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 16은 본 발명에 따른 제16 프라이머 쌍을 이용하여 장침습성 대장균을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 17은 본 발명에 따른 제17 프라이머 쌍을 이용하여 장침습성 대장균을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 리스테리아 모노사이토제니스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 스타필로코커스 아우레우스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 18은 본 발명에 따른 제18 프라이머 쌍을 이용하여 장독소성 대장균을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 19는 본 발명에 따른 제19 프라이머 쌍을 이용하여 리스테리아 모노사이토제니스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 리스테리아 모노사이토제니스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 스타필로코커스 아우레우스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 20은 본 발명에 따른 제20 프라이머 쌍을 이용하여 리스테리아 모노사이토제니스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 21은 본 발명에 따른 제21 프라이머 쌍을 이용하여 리스테리아 모노사이토제니스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 5: 비브리오 불니피쿠스, 6: 비브리오 콜레라, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 리스테리아 모노사이토제니스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 22는 본 발명에 따른 제22 프라이머 쌍을 이용하여 살모넬라 티피뮤리움을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 5: 비브리오 불니피쿠스, 6: 비브리오 콜레라, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 리스테리아 모노사이토제니스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 23은 본 발명에 따른 제23 프라이머 쌍을 이용하여 살모넬라 티피뮤리움을 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: EAEC, 9: ETEC, 10: EPEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 24는 본 발명에 따른 제24 프라이머 쌍을 이용하여 스타필로코커스 아우레우스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스, 2: 예시니아 엔테로콜리티카, 3: 바실러스 세레우스, 4: 리스테리아 모노사이토제니스, 5: 클로스트리디움 퍼프린진스, 6: EHEC, 7: EIEC, 8: 살모넬라 티피뮤리움, 9: 비브리오 불니피쿠스, 10: 비브리오 콜레라, 11: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 12: 캄필로박터 제주니, 13: 캄필로박터 콜라이).
도 25는 본 발명에 따른 제25 프라이머 쌍을 이용하여 스타필로코커스 아우레우스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 리스테리아 모노사이토제니스, 10: 바실러스 세레우스, 11: 예시니아 엔테로콜리티카, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 26은 본 발명에 따른 제26 프라이머 쌍을 이용하여 스타필로코커스 아우레우스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 리스테리아 모노사이토제니스, 10: 바실러스 세레우스, 11: 예시니아 엔테로콜리티카, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 27은 본 발명에 따른 제27 프라이머 쌍을 이용하여 스타필로코커스 아우레우스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 리스테리아 모노사이토제니스, 10: 바실러스 세레우스, 11: 예시니아 엔테로콜리티카, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 28은 본 발명에 따른 제28 프라이머 쌍을 이용하여 스타필로코커스 아우레우스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 리스테리아 모노사이토제니스, 10: 바실러스 세레우스, 11: 예시니아 엔테로콜리티카, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 29는 본 발명에 따른 제29 프라이머 쌍을 이용하여 비브리오 콜레라를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC25923), 2: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC23235), 3: 스타필로코커스 아우레우스(CCARM), 4: 스타필로코커스 아우레우스(NewMan), 5: 예시니아 엔테로콜리티카, 6: 바실러스 세레우스, 7: 리스테리아 모노사이토제니스, 8: 클로스트리디움 퍼프린진스, 9: EHEC, 10: EIEC, 11: EAEC, 12: ETEC, 13: EPEC, 14: 살모넬라 티피뮤리움, 15: 비브리오 불니피쿠스, 16: 비브리오 콜레라, 17: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 18: 캄필로박터 제주니, 19: 캄필로박터 콜라이).
도 30은 본 발명에 따른 제30 프라이머 쌍을 이용하여 비브리오 콜레라를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC25923), 2: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC23235), 3: 스타필로코커스 아우레우스(CCARM), 4: 스타필로코커스 아우레우스(NewMan), 5: 예시니아 엔테로콜리티카, 6: 바실러스 세레우스, 7: 리스테리아 모노사이토제니스, 8: 클로스트리디움 퍼프린진스, 9: EHEC, 10: EIEC, 11: EAEC, 12: ETEC, 13: EPEC, 14: 살모넬라 티피뮤리움, 15: 비브리오 불니피쿠스, 16: 비브리오 콜레라, 17: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 18: 캄필로박터 제주니, 19: 캄필로박터 콜라이).
도 31은 본 발명에 따른 제31 프라이머 쌍을 이용하여 비브리오 콜레라를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 5: 비브리오 불니피쿠스, 6: 비브리오 콜레라, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 리스테리아 모노사이토제니스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 32는 본 발명에 따른 제32 프라이머 쌍을 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스(CCARM), 2: 스타필로코커스 아우레우스(NewMan), 3: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC25923), 4: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC23235), 5: 예시니아 엔테로콜리티카, 6: 바실러스 세레우스, 7: 리스테리아 모노사이토제니스, 8: 클로스트리디움 퍼프린진스, 9: EHEC, 10: EIEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 33은 본 발명에 따른 제33 프라이머 쌍을 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 리스테리아 모노사이토제니스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 스타필로코커스 아우레우스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 34는 본 발명에 따른 제34 프라이머 쌍을 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 5: 비브리오 불니피쿠스, 6: 비브리오 콜레라, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 리스테리아 모노사이토제니스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 35는 본 발명에 따른 제35 프라이머 쌍을 이용하여 비브리오 파라헤몰리티쿠스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 5: 비브리오 불니피쿠스, 6: 비브리오 콜레라, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 스타필로코커스 아우레우스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 리스테리아 모노사이토제니스, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 36은 본 발명에 따른 제36 프라이머 쌍을 이용하여 비브리오 불니피쿠스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스(CCARM), 2: 스타필로코커스 아우레우스(NewMan), 3: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC25923), 4: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC23235), 5: 예시니아 엔테로콜리티카, 6: 바실러스 세레우스, 7: 리스테리아 모노사이토제니스, 8: 클로스트리디움 퍼프린진스, 9: EHEC, 10: EIEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 37은 본 발명에 따른 제37 프라이머 쌍을 이용하여 비브리오 불니피쿠스를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 스타필로코커스 아우레우스(CCARM), 2: 스타필로코커스 아우레우스(NewMan), 3: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC25923), 4: 스타필로코커스 아우레우스(ATCC23235), 5: 예시니아 엔테로콜리티카, 6: 바실러스 세레우스, 7: 리스테리아 모노사이토제니스, 8: 클로스트리디움 퍼프린진스, 9: EHEC, 10: EIEC, 11: 살모넬라 티피뮤리움, 12: 비브리오 불니피쿠스, 13: 비브리오 콜레라, 14: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 15: 캄필로박터 제주니, 16: 캄필로박터 콜라이).
도 38은 본 발명에 따른 제38 프라이머 쌍을 이용하여 예시니아 엔테로콜리티카를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 리스테리아 모노사이토제니스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 예시니아 엔테로콜리티카, 11: 스타필로코커스 아우레우스, 12: EHEC, 13: EAEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: ETEC, N: 주형없음).
도 39는 본 발명에 따른 제39 프라이머 쌍을 이용하여 예시니아 엔테로콜리티카를 검출한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 분석 사진이다(M: DNA 마커, 1: 캄필로박터 제주니, 2: 캄필로박터 콜라이, 3: 클로스트리디움 퍼프린진스, 4: 비브리오 콜레라, 5: 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 6: 비브리오 불니피쿠스, 7: 살모넬라 티피뮤리움, 8: 리스테리아 모노사이토제니스, 9: 바실러스 세레우스, 10: 스타필로코커스 아우레우스, 11: 예시니아 엔테로콜리티카, 12: EHEC, 13: ETEC, 14: EPEC, 15: EIEC, 16: EAEC, N: 주형없음).
도 40은 본 발명의 일 실시예에서 NGS를 수행하기 위해 본 발명에 따른 모든 프라이머 쌍과 식중독균 유전자를 혼합하여 PCR을 수행한 결과 도면이다.
도 41은 본 발명의 일 실시예에서 NGS를 수행하고 수득된 결과 데이터의 일부를 나타내는 도면이다.
도 42는 본 발명의 일 실시예에서 NGS를 수행하여 검출된 표적 부위의 개수를 종합한 결과를 나타내는 도면이다.
도 43은 본 발명의 일 실시예에 따른 식중독균 검출 방법을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍, 서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍, 서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍, 서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍, 서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍, 서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍, 서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍, 서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍, 서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍, 서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍, 서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍, 서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍, 서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍, 서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍, 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍, 서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍, 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍, 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍, 서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍, 서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍, 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍, 서열번호 47 또는 48로 기재된 염기서열로 구성되는 제24 프라이머 쌍, 서열번호 49 또는 50으로 기재된 염기서열로 구성되는 제25 프라이머 쌍, 서열번호 51 또는 52로 기재된 염기서열로 구성되는 제26 프라이머 쌍, 서열번호 53 또는 54로 기재된 염기서열로 구성되는 제27 프라이머 쌍, 서열번호 55 또는 56으로 기재된 염기서열로 구성되는 제28 프라이머 쌍, 서열번호 57 또는 58로 기재된 염기서열로 구성되는 제29 프라이머 쌍, 서열번호 59 또는 60으로 기재된 염기서열로 구성되는 제30 프라이머 쌍, 서열번호 61 또는 62로 기재된 염기서열로 구성되는 제31 프라이머 쌍, 서열번호 63 또는 64로 기재된 염기서열로 구성되는 제32 프라이머 쌍, 서열번호 65 또는 66으로 기재된 염기서열로 구성되는 제33 프라이머 쌍, 서열번호 67 또는 68로 기재된 염기서열로 구성되는 제34 프라이머 쌍, 서열번호 69 또는 70으로 기재된 염기서열로 구성되는 제35 프라이머 쌍, 서열번호 71 또는 72로 기재된 염기서열로 구성되는 제36 프라이머 쌍, 서열번호 73 또는 74로 기재된 염기서열로 구성되는 제37 프라이머 쌍, 서열번호 75 또는 76으로 기재된 염기서열로 구성되는 제38 프라이머 쌍, 및 서열번호 77 또는 78로 기재된 염기서열로 구성되는 제39 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 식중독균 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 프라이머 세트는 a) 서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍, 및 서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
b) 서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍;
c) 서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
d) 서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍, 및 서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
e) 서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍, 및 서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
f) 서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍;
g) 서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍, 서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍, 및 서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
h) 서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍;
i) 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍, 및 서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
j) 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍;
k) 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍, 서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍, 및 서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
l) 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 및 서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
m) 서열번호 47 또는 48로 기재된 염기서열로 구성되는 제24 프라이머 쌍, 서열번호 49 또는 50으로 기재된 염기서열로 구성되는 제25 프라이머 쌍, 서열번호 51 또는 52로 기재된 염기서열로 구성되는 제26 프라이머 쌍, 서열번호 53 또는 54로 기재된 염기서열로 구성되는 제27 프라이머 쌍, 및 서열번호 55 또는 56으로 기재된 염기서열로 구성되는 제28 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
n) 서열번호 57 또는 58로 기재된 염기서열로 구성되는 제29 프라이머 쌍, 서열번호 59 또는 60으로 기재된 염기서열로 구성되는 제30 프라이머 쌍, 및 서열번호 61 또는 62로 기재된 염기서열로 구성되는 제31 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
o) 서열번호 63 또는 64로 기재된 염기서열로 구성되는 제32 프라이머 쌍, 서열번호 65 또는 66으로 기재된 염기서열로 구성되는 제33 프라이머 쌍, 서열번호 67 또는 68로 기재된 염기서열로 구성되는 제34 프라이머 쌍, 및 서열번호 69 또는 70으로 기재된 염기서열로 구성되는 제35 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
p) 서열번호 71 또는 72로 기재된 염기서열로 구성되는 제36 프라이머 쌍, 및 서열번호 73 또는 74로 기재된 염기서열로 구성되는 제37 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍; 및
q) 서열번호 75 또는 76으로 기재된 염기서열로 구성되는 제38 프라이머 쌍, 및 서열번호 77 또는 78로 기재된 염기서열로 구성되는 제39 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍, 서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍, 서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍, 서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍, 서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍, 서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍, 서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍, 서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍, 서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍, 서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍, 서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍, 서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍, 서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍, 서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍, 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍, 서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍, 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍, 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍, 서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍, 서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍, 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍, 서열번호 47 또는 48로 기재된 염기서열로 구성되는 제24 프라이머 쌍, 서열번호 49 또는 50으로 기재된 염기서열로 구성되는 제25 프라이머 쌍, 서열번호 51 또는 52로 기재된 염기서열로 구성되는 제26 프라이머 쌍, 서열번호 53 또는 54로 기재된 염기서열로 구성되는 제27 프라이머 쌍, 서열번호 55 또는 56으로 기재된 염기서열로 구성되는 제28 프라이머 쌍, 서열번호 57 또는 58로 기재된 염기서열로 구성되는 제29 프라이머 쌍, 서열번호 59 또는 60으로 기재된 염기서열로 구성되는 제30 프라이머 쌍, 서열번호 61 또는 62로 기재된 염기서열로 구성되는 제31 프라이머 쌍, 서열번호 63 또는 64로 기재된 염기서열로 구성되는 제32 프라이머 쌍, 서열번호 65 또는 66으로 기재된 염기서열로 구성되는 제33 프라이머 쌍, 서열번호 67 또는 68로 기재된 염기서열로 구성되는 제34 프라이머 쌍, 서열번호 69 또는 70으로 기재된 염기서열로 구성되는 제35 프라이머 쌍, 서열번호 71 또는 72로 기재된 염기서열로 구성되는 제36 프라이머 쌍, 서열번호 73 또는 74로 기재된 염기서열로 구성되는 제37 프라이머 쌍, 서열번호 75 또는 76으로 기재된 염기서열로 구성되는 제38 프라이머 쌍, 및 서열번호 77 또는 78로 기재된 염기서열로 구성되는 제39 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 구성하는 프라이머는 표적 위치에 특이적으로 결합을 유지하는 한, 서열번호 1 내지 78로 각각 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 갖거나, 변이된 변이체를 모두 포함할 수 있다. 상기 변이체는 프라이머를 구성하는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 제거된 것을 모두 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '식중독균'은 식품이나 물을 매개로 하여 급성 위장염 및 신경장애 등의 중독증상을 나타낼 수 있는 박테리아를 의미한다. 상기 식중독균은 식품 안에서 증식하며 독소를 생성하여 식중독을 유발하는 독소형 식중독균 및 생균 자체의 섭취에 의해 식중독을 유발하는 감염형 식중독균을 모두 포함할 수 있다.
상기 식중독균은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 식중독균을 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 식중독균은 바실러스 속, 캄필로박터 속, 클로스트리디움 속, 에세리키아 속, 리스테리아 속, 살모넬라 속, 스타필로코커스 속, 비브리오 속 및 예시니아 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 일례로, 상기 식중독균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens), 장응집성 대장균(enteroaggregative Escherichia coli, EAEC), 장관출혈성 대장균(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC), 장병원성 대장균(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC), 장침습성 대장균(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC), 장독소성 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 티피뮤리움(Salmolella typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 및 예시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 프라이머 세트에서 a) 서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍, 및 서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 바실러스 세레우스를 검출하고;
b) 서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍은 캄필로박터 속 균주를 검출하며;
c) 서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 캄필로박터 콜라이를 검출하고;
d) 서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍, 및 서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 캄필로박터 제주니를 검출하며;
e) 서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍, 서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍, 및 서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 클로스트리디움 퍼프린진스를 검출하고;
f) 서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍은 장응집성 대장균을 검출하며;
g) 서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍, 서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍, 및 서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 장관출혈성 대장균을 검출하고;
h) 서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍은 장병원성 대장균을 검출하며;
i) 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍, 및 서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍은 장침습성 대장균을 검출하고;
j) 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍은 장독소성 대장균을 검출하며;
k) 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍, 서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍, 및 서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 리스테리아 모노사이토제니스를 검출하고;
l) 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 및 서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 살모넬라 티피뮤리움을 검출하며;
m) 서열번호 47 또는 48로 기재된 염기서열로 구성되는 제24 프라이머 쌍, 서열번호 49 또는 50으로 기재된 염기서열로 구성되는 제25 프라이머 쌍, 서열번호 51 또는 52로 기재된 염기서열로 구성되는 제26 프라이머 쌍, 서열번호 53 또는 54로 기재된 염기서열로 구성되는 제27 프라이머 쌍, 및 서열번호 55 또는 56으로 기재된 염기서열로 구성되는 제28 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 스타필로코커스 아우레우스를 검출하고;
n) 서열번호 57 또는 58로 기재된 염기서열로 구성되는 제29 프라이머 쌍, 서열번호 59 또는 60으로 기재된 염기서열로 구성되는 제30 프라이머 쌍, 및 서열번호 61 또는 62로 기재된 염기서열로 구성되는 제31 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 비브리오 콜레라를 검출하며;
o) 서열번호 63 또는 64로 기재된 염기서열로 구성되는 제32 프라이머 쌍, 서열번호 65 또는 66으로 기재된 염기서열로 구성되는 제33 프라이머 쌍, 서열번호 67 또는 68로 기재된 염기서열로 구성되는 제34 프라이머 쌍, 및 서열번호 69 또는 70으로 기재된 염기서열로 구성되는 제35 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 비브리오 파라헤몰리티쿠스를 검출하고;
p) 서열번호 71 또는 72로 기재된 염기서열로 구성되는 제36 프라이머 쌍, 및 서열번호 73 또는 74로 기재된 염기서열로 구성되는 제37 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 비브리오 불니피쿠스를 검출하며; 및
q) 서열번호 75 또는 76으로 기재된 염기서열로 구성되는 제38 프라이머 쌍, 및 서열번호 77 또는 78로 기재된 염기서열로 구성되는 제39 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 예시니아 엔테로콜리티카를 검출할 수 있다.
상기 프라이머 세트를 이용한 식중독균의 검출은 분자진단 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 용어, '분자진단(molecular detection)'은 세포 내에서 일어나는 다양한 분자 수준의 변화를 수치나 영상을 통해 검출해내는 방법을 의미한다. 상기 분자진단은 일반적으로 DNA나 RNA 등의 핵산 분석을 말하나, 넓은 범위에서 단백질 분석 및 세포 내 대사체(metabolome) 분석을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물은 DNA 분석을 통해 식중독균을 검출할 수 있다.
상기 검출은 식중독균 유전자 내에 존재하는 표적 위치를 증폭하여 수행될 수 있다. 이때, 유전자의 증폭은 통상의 기술분야에 알려진 모든 방법으로 수행될 수 있다. 일례로, 상기 유전자 증폭은 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR), 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR) 등을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 검출은 차세대 염기서열 분석 방법으로 수행될 수 있다.
상기 프라이머 세트를 구성하는 프라이머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 검출용 조성물에 포함되는 프라이머나 이를 이용하여 검출할 수 있는 식중독균은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 구성하는 프라이머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체가 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 차세대 염기서열 분석 패널을 제공한다.
본 발명에 따른 분석 패널에 포함되는 프라이머나 이를 이용하여 검출할 수 있는 식중독균은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)'은 유전자 염기서열을 고속으로 분석할 수 있는 방법으로, 하나의 유전자를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 수득된 데이터를 생물정보학적 기법을 이용하여 조합함으로써 유전자 정보를 빠르게 해독할 수 있다. 일례로, 상기 차세대 염기서열 분석은 단일분자 실시간 염기서열 분석, 이온 반도체/이온 토런트 염기서열 분석, 파이로시퀀싱, 염기서열 합성분석, 염기서열 묶음 분석, 나노포어 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트에 포함되는 프라이머나 이를 이용하여 검출할 수 있는 식중독균은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 키트는 이에 포함되는 프라이머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
상기 키트를 이용하여 검출할 수 있는 식중독균의 종류는 상기 서술한 바와 같다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 키트를 이용하여 식중독균을 검출하기 위해 차세대 염기서열 분석 방법이 사용될 수 있다. 이때, 차세대 염기서열 분석 방법으로 식중독균을 검출하기 위해서는 차세대 염기서열 분석에 일반적으로 사용되는 추가 시약이 더 포함될 수 있다. 일례로, 상기 키트는 중합효소, dNTP 등과 같이 표적 부위를 증폭하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 키트는 증폭된 산물을 정제하고, 이를 이용하여 차세대 염기서열 분석용 라이브러리 제작을 위한 A-테일, 어댑터(adapter), 비드, 완충액 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들 추가 시약은 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 서열을 이용하여 라이브러리를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 라이브러리를 이용하여 차세대 염기서열 분석을 수행하는 단계를 포함하는 차세대 염기서열 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 분석 방법에 사용되는 프라이머나 이를 이용하여 검출할 수 있는 식중독균은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
한편, 상기 차세대 염기서열 분석 또한 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있으며, 이는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 방법은 필요에 따라 통상의 기술자에 의해 적절히 변형될 수 있다.
상기 시료는 식중독균을 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 채소, 육류, 어류, 해산물 등과 같이 음식의 재료가 될 수 있는 식자재나, 이들을 이용하여 조리된 음식을 모두 포함할 수 있다. 한편, 상기 시료는 식중독에 걸린 개체를 진단하기 위해서도 사용될 수 있다. 이때, 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 검출방법에 적용되기 전에 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 식중독균 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 검출방법에 사용되는 프라이머나 이를 이용하여 검출할 수 있는 식중독균은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 한편, 상기 증폭 또한 상술한 바와 같은 방법으로 수행될 수 있다. 상기 증폭은 통상적인 방법으로 제조된 반응물을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, 차세대 염기서열 분석 방법이 사용될 수 있고, 이때, 상기 분석 방법은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 이는 필요에 따라 통상의 기술자가 적절히 변형하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 검출방법에 사용되는 시료는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 상기 시료는 상기 서술한 바와 같이 전처리될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 프라이머 세트 제작
차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)을 이용하여 16종류의 식중독균을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트를 제작하였다.
먼저, 16종류 식중독균의 유전자 서열을 나열하여 동종에서 가장 상동성이 높으면서도, 이종의 식중독균 사이에서는 상동성이 없는 부위를 선정하여 이에 대한 프라이머를 제작하였다. 이때, 프라이머는 20 내지 23개의 염기로 구성되고, PCR 증폭을 통해 수득되는 PCR 산물의 크기는 150 내지 250 bp이며, 40 내지 60%의 GC 함량을 포함하고, 53 내지 60℃의 Tm 값을 갖도록 제작하였다. 또한, 자기 결합(self compatibility)은 4 이상이 되도록 하였다. 그 결과, 제작된 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타내었다.
균주 프라이머 서열 서열번호
Bacillus
cereus 		1-F GCG CTC TTC TAA AGT CTC AC 서열번호 1
1-R CGA AAT TAG CCC AGT AGC AC 서열번호 2
2-F GAA CTG CTG GTA CAA CAC CTG 서열번호 3
2-R TCT GCA CTA ATG AAC TGA CCG 서열번호 4
Campylobacter spp. 3-F CCG CTT TTG GAC CTC AAT CTC GC 서열번호 5
3-R GCC TTG TGC GCG TTC TTT ATT GCC 서열번호 6
Campylobacter coli 4-F GCA AGA ATT ACC TTT GGT TGA 서열번호 7
4-R CCT CCA TTT GCT TGT ATT CAT 서열번호 8
5-F CCT ACG ACT TGT TTG ATT TGG 서열번호 9
5-R CCA CAG AAT GAC CTC CAT TAG 서열번호 10
Campylobacter jejuni 6-F TGG AGT TGT TGT GGG GCT TC 서열번호 11
6-R TGA TGC GTT CTT TTG CAC CC 서열번호 12
7-F TTA TGG CGA GGG ACT TGG AGC 서열번호 13
7-R AGA ATA ATG CGC CGT TGG ACG 서열번호 14
Clostridium perfringens 8-F ATG TTA CTG CCG TTG ATA GCG 서열번호 15
8-R GCT GCA TAA TCC CAA TCA TCC C 서열번호 16
9-F GGC GTT CTT CTA ACT CAT ACC C 서열번호 17
9-R CTC CAT CAC CTA AGG ACT GTT C 서열번호 18
10-F GCC TTA TTG TCT TAT TGG TCT 서열번호 19
10-R GAA AAA TGG AAT AGC ACC TAA 서열번호 20
EAEC 11-F GAT GCT GAC GAT TCT GTA TTA 서열번호 21
11-R ATA AGT CCT TCT CGA TTG TGT 서열번호 22
EHEC 12-F GAT AGA TCC AGA GGA AGG GCG 서열번호 23
12-R TAC GAC TGA TCC CTG CAA CAC 서열번호 24
13-F ACT GTC TGA AAC TGC TCC TGT 서열번호 25
13-R GGT TGA CTC TCT TCA TTC ACG 서열번호 26
14-F CTC AGG ATG CTA AAC CAG TAG AG 서열번호 27
14-R CCG GTA CAA GCA GGA TTA CAA C 서열번호 28
EPEC 15-F TAG TGG ATT GGA CTC AAC GAT 서열번호 29
15-R TAT TAA CAC CGT AGC CTT TCG 서열번호 30
EIEC 16-F ACG AGT CAA CTT TTA GCG AAG GG 서열번호 31
16-R CTC TAT TTC CAA TCG CGT CAG AAC 서열번호 32
17-F TCC TGC TTA GAT GAT GGA GG 서열번호 33
17-R CCA AAA GGA AGT GTC TGC TC 서열번호 34
ETEC 18-F TGA CGG ATA TGT TTC CAC TTC 서열번호 35
18-R GTA TTC CAC CTA ACG CAG AAA 서열번호 36
Listeria monocytogenes 19-F CTG GTG ATA CTC TTT GGG GTA 서열번호 37
19-R AGC CGT TAG ATT CGG TTG TTT C 서열번호 38
20-F GTG ACG AAG TAG AAG TTA TCG 서열번호 39
20-R AGT TAG TGT GTG GAG TAA TCG 서열번호 40
21-F TTG ATG GTG CTG TTG CGG TTC 서열번호 41
21-R TGG GAG TTG GAT TGG GTG C 서열번호 42
Salmonella typhimurium 22-F CGC ACT GAA TAT CGT ACT GG 서열번호 43
22-R CGA TAA TTT CAC CGG CAT CG 서열번호 44
23-F GCT GAG TAA CCA ACA AGA TAA 서열번호 45
23-R AGT AAA CGC TGT TCA TAG GTC 서열번호 46
Staphylococcus aureus 24-F GCA GCT TGC TTA CTT ACT GCT 서열번호 47
24-R TAC CTG TAA TCT CGC CAT CAT 서열번호 48
25-F ATT CAT TGC CCT AAC GTG GAC 서열번호 49
25-R GCT GTA AAA ATT GAT CGT GAC TCT C 서열번호 50
26-F GTA TGG TGG TGT AAC TGA GC 서열번호 51
26-R CCG TTT CAT AAG GCG AGT TG 서열번호 52
27-F CTG CTA TTT TTC ATC CAA AGA 서열번호 53
27-R TTC TTA TCA GTT TGC ACT TCA 서열번호 54
28-F TGT CAC TCC ACA CGA AGG TA 서열번호 55
28-R TGC AAA TAG CGC CTT GCT TG 서열번호 56
Vibrio cholerae 29-F GCC AAG AGG ACA GAG TGA GTA 서열번호 57
29-R ATG AGG ACT GTA TGC CCC TA 서열번호 58
30-F TAA GAC CAA CAG CAA CCG CCC 서열번호 59
30-R ACT CGA CTG GCG TAA CCA AAA GG 서열번호 60
31-F GTT TGT ATG TGC GAG CGG GTG 서열번호 61
31-R GTG AAT GTC AGC GCC ACC AAC 서열번호 62
Vibrio parahaemolyticus 32-F GCA CTG TCT CAT TTC CCA GAG 서열번호 63
32-R CGC TTC TTG GTC AGA AAC CAG 서열번호 64
33-F ACC TGT GGC TTC TGC TGT G 서열번호 65
33-R CCA GTT GTT GAT TTG CGG GTG 서열번호 66
34-F TCC ATC TGT CCC TTT TCC TGC C 서열번호 67
34-R CAG CCA TTT AGT ACC TGA CGT TGT G 서열번호 68
35-F GCG AGC GAT CCT TGT TTG GAC 서열번호 69
35-R GCG GTG AGT TGC TGT TGT TGG 서열번호 70
Vibrio vulnificus 36-F CTC TGC CTA GAT GTT TAT GG 서열번호 71
36-R CAA TAC CAT TTC TGT GCT AAG 서열번호 72
37-F AGC ACA TCT CTA TTC CTT CTC 서열번호 73
37-R TAG CGT TGC TTC TTC AGT AA 서열번호 74
Yersinia enterocolitica 38-F TGG GGC CAT CTT TCC GCA TTA 서열번호 75
38-R TAC CCT GCA CCA AGC ATC CAA 서열번호 76
39-F AAC GGG GCA TCT GGT TCT CTC 서열번호 77
39-R TGG TGG TGT CAG GAA AGG GAC 서열번호 78
실시예 2. 프라이머의 검출능 확인
상기 제작된 프라이머가 각각의 표적 균주를 특이적으로 검출하는지 확인하기 위해 PCR을 다음과 같이 수행하였다.
구체적으로, 16종류의 식중독균 각각의 유전자를 주형으로, 1번부터 39번 프라이머 세트를 각각 사용하여 각각의 프라이머가 원하는 균주만을 특이적으로 검출하는지 확인하였다. 이때, 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, 세니젠, 한국), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli, 세니젠, 한국), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni, 세니젠, 한국), 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens, FORC_25), 장응집성 대장균(enteroaggregative Escherichia coli, EAEC, NCCP14039), 장관출혈성 대장균(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC, 세니젠, 한국), 장병원성 대장균(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC, 세니젠, 한국), 장침습성 대장균(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC, 세니젠, 한국), 장독소성 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC, 세니젠, 한국), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes, 세니젠, 한국), 살모넬라 티피뮤리움(Salmolella typhimurium, 세니젠, 한국), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, ATCC25929, ATCC23235, CCARM3089, Newman), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae, 세니젠, 한국), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus, 세니젠, 한국), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus, 세니젠, 한국) 및 예시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica, 세니젠, 한국)를 사용하였다. 유전자 주형은 뉴클레오스핀® 마이크로바이알 DNA 키트(Nucleospin® Microbial DNA kit, Macherey-Nagel)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 준비하였다. PCR 반응을 위해 1 ㎕의 주형 DNA, 0.1 ㎕의 정방향 프라이머, 0.1 ㎕의 역방향 프라이머, 10 ㎕의 마스터 믹스(master mix, Biofact) 및 8.8 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 PCR 반응물을 이용하여 하기 표 2에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하고, 수득된 PCR 산물을 아가로즈 겔을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 아가로즈 겔 전기영동의 결과를 도 1 내지 39에 나타내었다.
단계 온도 시간 사이클
초기 전-반응 95℃ 4분 1회
변성 95℃ 30초 35회
어닐링 60℃ 30초
연신 72℃ 30초
후-연신 72℃ 5분 1회
도 1 내지 39에 나타난 바와 같이, 1 내지 39번 프라이머 세트 각각은 표적하는 식중독균만을 특이적으로 검출하였다.
실시예 3. NGS를 이용한 식중독균 검출
3-1. 표적 서열 증폭
상기 표 1에 기재된 프라이머와 16종류 식중독균의 유전자를 모두 혼합하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭시켰다. 먼저, 상기 나열된 16종 균주의 DNA를 3 ng이 되도록 혼합하여 주형 DNA 혼합물을, 상기 표 1에 기재된 프라이머를 10 pmol이 되도록 혼합하여 정방향 또는 역방향 프라이머 혼합물을 각각 준비하였다. 이후, PCR 반응물은 2.5 ㎕의 주형 DNA 혼합물, 5 ㎕의 정방향 프라이머 혼합물, 5 ㎕의 역방향 프라이머 혼합물, 및 12.5 ㎕의 HIFI KAPA 하이퍼플러스 마스터 믹스(HIFI KAPA hyperplus master mix, Roche)를 혼합하여 준비하였다. 준비된 PCR 반응물을 이용하여 상기 표 2에 기재된 바와 같은 조건을 PCR을 수행하고, 아가로즈 겔을 이용하여 PCR 산물을 확인한 결과를 도 40에 나타내었다.
도 40에 나타난 바와 같이, 표 1에 기재된 39개 프라이머 세트에 의해 각각 증폭된 150 내지 250 bp의 크기를 갖는 PCR 산물을 확인하였다.
3-2. 라이브러리 제작
상기에서 수득된 PCR 산물을 이용하여 다음과 같이 라이브러리를 제작하였다.
먼저, 25 ㎕의 PCR 산물에 50 ㎕의 샘플 정제 비드(sample purification bead, illumina)를 넣고 잘 혼합하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 반응 후, 상기 혼합물을 마그네틱 스탠드로 옮겨 3분 동안 더 반응시킨 후, 상층액을 제거하였다. 비드에 200 ㎕의 80% 에탄올을 첨가하여 비드를 세척하고, 30초 동안 마그네틱 스탠드에서 반응시켜 상층액인 에탄올을 제거하였다. 이를 2회 반복하여 비드를 세척하고 에탄올을 완전히 제거하였다. 세척된 비드에 62.5 ㎕의 재현탁 완충액(Resuspension buffer, illumina)을 첨가하고 혼합한 뒤, 2분 동안 반응시켰다. 이를 다시 마그네틱 스탠드로 옮겨 3분 동안 더 반응시킨 후, 60 ㎕의 상층액을 취하여 새로운 튜브로 옮겼다. 여기에 40 ㎕의 말단 수리 믹스2(end repair mix2, illumina)를 첨가하고 30℃에서 30분 동안 반응시켜 불완전한 말단을 수리하였다. 반응이 끝난 후, 반응물에 160 ㎕의 샘플 정제 비드를 넣고 잘 혼합하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 혼합물을 마그네틱 스탠드로 옮겨 5분 동안 더 반응시킨 후, 상층액을 제거하였다. 이후, 상기 서술한 바와 같이 샘플 정제 비드를 에탄올로 세척하고, 세척된 비드에 다시 재현탁 완충액을 첨가하여 17.5 ㎕의 상층액을 취하였다. 수득된 17.5 ㎕의 상층액에 12.5 ㎕의 A-테일링 믹스(A-tailing mix, illumina)를 넣고, 97℃에서 30분 및 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 수득된 반응물 30 ㎕에 2.5 ㎕의 라이게이션 믹스(ligation mix, illumina), TruSeq DNA CD 인덱시스(TruSeq DNA CD indexes, illumina) 및 2.5 ㎕의 재현탁 완충액을 첨가하였다. 이를 30℃에서 10분 동안 반응시키고, 5 ㎕의 스톱 라이게이션 완충액(stop ligation buffer, illumina)을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 42.5 ㎕의 산물에 46 ㎕의 샘플 정제 비드 및 46 ㎕의 탈이온수(deionized water)를 첨가하고 잘 혼합하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 상층액만 취하여 새로운 튜브에 넣고, 105 ㎕의 샘플 정제 비드를 다시 넣고 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 이후, 상기 서술한 바와 같이 비드를 에탄올로 세척하고, 세척된 비드에 재현탁 완충액을 첨가하고 반응시키는 과정을 2회 반복하여 25 ㎕의 라이브러리를 수득하였다.
3-3. 라이브러리 증폭
상기에서 제조된 라이브러리를 다음과 같이 증폭하였다.
구체적으로, 25 ㎕의 라이브러리, 20 ㎕의 엔헨스드 PCR 믹스(enhanced PCR mix, illumina) 및 상기 실시예 3-1에서 준비된 5 ㎕의 프라이머 혼합물을 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 PCR 반응물을 하기 표 3에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
단계 온도 시간 사이클
초기 전-반응 98℃ 3분 1회
변성 98℃ 20초 12회
어닐링 60℃ 15초
연신 72℃ 30초
후-연신 72℃ 5분 1회
수득된 PCR 산물에 50 ㎕의 샘플 정제 비드를 첨가하고 상기 서술한 바와 같이 반응 및 세척한 후, 재현탁 완충액을 첨가하여 30 ㎕의 PCR 산물을 수득하였다.
3-4. 최종 산물의 농도 측정 및 NGS 수행
바이오어날라이저를 사용하여 상기에서 수득된 PCR 산물의 농도를 측정하고, PCR 산물의 농도를 4 nM이 되도록 조절하였다. 4 nM의 PCR 산물을 7 pM의 농도가 되도록 희석하고 phiX 용액(illumina)과 7:3의 부피비로 혼합하였다. 상기 혼합물을 Miseq NGS 장비를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 NGS를 수행하였다. NGS 수행을 통해 수득된 데이터를 트리모마틱(trimmomatic), 판다seq(pandaseq) 및 BLAST를 사용하여 분석하였다. 구체적으로, Miseq NGS 장비를 통해 얻은 리드(read) 값을 품질점수(phred score) 15를 기준으로 필터링하고, 리드 단위로 그 값을 합하였다. 한편, 프라이머에 의해 증폭되는 표적 부위의 염기서열에 대한 BLAST 분석을 수행하여 95%의 상동성을 기준으로 필터링하였다. 이 과정에서 일치하는 리드의 개수를 세어 최종 결과를 도출하였다. 그 결과, 분석 결과 데이터의 일부를 도 41에, 검출된 표적 부위의 개수를 종합한 결과를 도 42에 나타내었고, 각각의 균주에 따른 결과 데이터를 종합한 결과를 표 4에 나타내었다.
균주 표적 위치 앰플리콘 크기(bp) 3.E+00 3.E-01 3.E-02 3.E-03
Bacillus
cereus 		1 175 857 361 490 296
2 229 6426 3881 2373 2177
Campylobacter spp. 3 191 608 194 290 173
Campylobacter coli 4 203 6179 6389 11298 13502
5 208 8514 7689 7722 9281
Campylobacter jejuni 6 184 2390 265 129 38
7 163 8682 7046 11693 8354
Clostridium
perfringens 		8 247 10990 9645 8051 14150
9 168 3820 2427 11369 9258
10 178 2890 3322 9173 13574
EAEC 11 187 21964 21054 24069 38173
EHEC 12 209 26 17 7 2
13 255 10858 7945 10576 8052
14 154 1967 832 673 413
EPEC 15 233 12399 6306 5858 3006
EIEC 16 234 8703 4226 1938 3196
17 173 635 201 84 36
ETEC 18 191 2640 3691 8497 8303
Listeria
monocytogenes 		19 264 5269 1296 1055 743
20 198 2488 683 105 50
21 200 26 1 0 1
Salmonella typhimurium 22 176 1620 1092 2272 714
23 186 4893 2172 549 336
Staphylococcus
ureus 		24 214 914 2172 3478 518
25 191 14317 12622 22756 54297
26 212 1480 1539 838 818
27 180 1203 2015 831 893
28 162 2054 768 10 278
Vibrio cholerae 29 253 5067 3656 5803 5795
30 209 2955 987 325 223
31 175 319 90 21 3
Vibrio parahaemolyticus 32 219 3832 2287 9705 7423
33 178 2814 837 312 79
34 190 1499 126 4 13
35 144 65 18 23 31
Vibrio vulnificus 36 218 4557 851 52 103
37 170 11946 13190 31663 42789
Yersinia enterocolitica 38 202 20 8 1 2
39 190 4348 3257 3187 1204
표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 NGS 방법으로 16개 식중독균을 한번에 검출하였다.
<110> Sanigen Co.,Ltd. KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION <120> PRIMER SET OF FOOD POISONING BACTERIA USING NEXT GENERATION SEQUENCING AND DETECTION METHOD USING THEREOF <130> DP21-0106-2 <150> KR 10-2021-0032317 <151> 2021-03-11 <160> 78 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-F primer <400> 1 gcgctcttct aaagtctcac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-R primer <400> 2 cgaaattagc ccagtagcac 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-F primer <400> 3 gaactgctgg tacaacacct g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-R primer <400> 4 tctgcactaa tgaactgacc g 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-F primer <400> 5 ccgcttttgg acctcaatct cgc 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-R primer <400> 6 gccttgtgcg cgttctttat tgcc 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-F primer <400> 7 gcaagaatta cctttggttg a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-R primer <400> 8 cctccatttg cttgtattca t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-F primer <400> 9 cctacgactt gtttgatttg g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-R primer <400> 10 ccacagaatg acctccatta g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6-F primer <400> 11 tggagttgtt gtggggcttc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6-R primer <400> 12 tgatgcgttc ttttgcaccc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7-F primer <400> 13 ttatggcgag ggacttggag c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7-R primer <400> 14 agaataatgc gccgttggac g 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-F primer <400> 15 atgttactgc cgttgatagc g 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-R primer <400> 16 gctgcataat cccaatcatc cc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-F primer <400> 17 ggcgttcttc taactcatac cc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9-R primer <400> 18 ctccatcacc taaggactgt tc 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-F primer <400> 19 gccttattgt cttattggtc t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10-R primer <400> 20 gaaaaatgga atagcaccta a 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-F primer <400> 21 gatgctgacg attctgtatt a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11-R primer <400> 22 ataagtcctt ctcgattgtg t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-F primer <400> 23 gatagatcca gaggaagggc g 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12-R primer <400> 24 tacgactgat ccctgcaaca c 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-F primer <400> 25 actgtctgaa actgctcctg t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-R primer <400> 26 ggttgactct cttcattcac g 21 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-F primer <400> 27 ctcaggatgc taaaccagta gag 23 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-R primer <400> 28 ccggtacaag caggattaca ac 22 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15-F primer <400> 29 tagtggattg gactcaacga t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15-R primer <400> 30 tattaacacc gtagcctttc g 21 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16-F primer <400> 31 acgagtcaac ttttagcgaa ggg 23 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16-R primer <400> 32 ctctatttcc aatcgcgtca gaac 24 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 17-F primer <400> 33 tcctgcttag atgatggagg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 17-R primer <400> 34 ccaaaaggaa gtgtctgctc 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18-F primer <400> 35 tgacggatat gtttccactt c 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18-R primer <400> 36 gtattccacc taacgcagaa a 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 19-F primer <400> 37 ctggtgatac tctttggggt a 21 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 19-R primer <400> 38 agccgttaga ttcggttgtt tc 22 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20-F primer <400> 39 gtgacgaagt agaagttatc g 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20-R primer <400> 40 agttagtgtg tggagtaatc g 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 21-F primer <400> 41 ttgatggtgc tgttgcggtt c 21 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 21-R primer <400> 42 tgggagttgg attgggtgc 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22-F primer <400> 43 cgcactgaat atcgtactgg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22-R primer <400> 44 cgataatttc accggcatcg 20 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 23-F primer <400> 45 gctgagtaac caacaagata a 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 23-R primer <400> 46 agtaaacgct gttcataggt c 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24-F primer <400> 47 gcagcttgct tacttactgc t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24-R primer <400> 48 tacctgtaat ctcgccatca t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 25-F primer <400> 49 attcattgcc ctaacgtgga c 21 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 25-R primer <400> 50 gctgtaaaaa ttgatcgtga ctctc 25 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26-F primer <400> 51 gtatggtggt gtaactgagc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 26-R primer <400> 52 ccgtttcata aggcgagttg 20 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27-F primer <400> 53 ctgctatttt tcatccaaag a 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27-R primer <400> 54 ttcttatcag tttgcacttc a 21 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28-F primer <400> 55 tgtcactcca cacgaaggta 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28-R primer <400> 56 tgcaaatagc gccttgcttg 20 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 29-F primer <400> 57 gccaagagga cagagtgagt a 21 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 29-R primer <400> 58 atgaggactg tatgccccta 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30-F primer <400> 59 taagaccaac agcaaccgcc c 21 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30-R primer <400> 60 actcgactgg cgtaaccaaa agg 23 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 31-F primer <400> 61 gtttgtatgt gcgagcgggt g 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 31-R primer <400> 62 gtgaatgtca gcgccaccaa c 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32-F primer <400> 63 gcactgtctc atttcccaga g 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32-R primer <400> 64 cgcttcttgg tcagaaacca g 21 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 33-F primer <400> 65 acctgtggct tctgctgtg 19 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 33-R primer <400> 66 ccagttgttg atttgcgggt g 21 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 34-F primer <400> 67 tccatctgtc ccttttcctg cc 22 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 34-R primer <400> 68 cagccattta gtacctgacg ttgtg 25 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35-F primer <400> 69 gcgagcgatc cttgtttgga c 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35-R primer <400> 70 gcggtgagtt gctgttgttg g 21 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 36-F primer <400> 71 ctctgcctag atgtttatgg 20 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 36-R primer <400> 72 caataccatt tctgtgctaa g 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 37-F primer <400> 73 agcacatctc tattccttct c 21 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 37-R primer <400> 74 tagcgttgct tcttcagtaa 20 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 38-F primer <400> 75 tggggccatc tttccgcatt a 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 38-R primer <400> 76 taccctgcac caagcatcca a 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 39-F primer <400> 77 aacggggcat ctggttctct c 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 39-R primer <400> 78 tggtggtgtc aggaaaggga c 21

Claims (12)

  1. 서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍,
    서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍,
    서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍,
    서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍,
    서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍,
    서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍,
    서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍,
    서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍,
    서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍,
    서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍,
    서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍,
    서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍,
    서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍,
    서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍,
    서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍,
    서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍,
    서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍,
    서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍,
    서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍,
    서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍,
    서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍,
    서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍,
    서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍,
    서열번호 47 또는 48로 기재된 염기서열로 구성되는 제24 프라이머 쌍,
    서열번호 49 또는 50으로 기재된 염기서열로 구성되는 제25 프라이머 쌍,
    서열번호 51 또는 52로 기재된 염기서열로 구성되는 제26 프라이머 쌍,
    서열번호 53 또는 54로 기재된 염기서열로 구성되는 제27 프라이머 쌍,
    서열번호 55 또는 56으로 기재된 염기서열로 구성되는 제28 프라이머 쌍,
    서열번호 57 또는 58로 기재된 염기서열로 구성되는 제29 프라이머 쌍,
    서열번호 59 또는 60으로 기재된 염기서열로 구성되는 제30 프라이머 쌍,
    서열번호 61 또는 62로 기재된 염기서열로 구성되는 제31 프라이머 쌍,
    서열번호 63 또는 64로 기재된 염기서열로 구성되는 제32 프라이머 쌍,
    서열번호 65 또는 66으로 기재된 염기서열로 구성되는 제33 프라이머 쌍,
    서열번호 67 또는 68로 기재된 염기서열로 구성되는 제34 프라이머 쌍,
    서열번호 69 또는 70으로 기재된 염기서열로 구성되는 제35 프라이머 쌍,
    서열번호 71 또는 72로 기재된 염기서열로 구성되는 제36 프라이머 쌍,
    서열번호 73 또는 74로 기재된 염기서열로 구성되는 제37 프라이머 쌍,
    서열번호 75 또는 76으로 기재된 염기서열로 구성되는 제38 프라이머 쌍, 및
    서열번호 77 또는 78로 기재된 염기서열로 구성되는 제39 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 식중독균 검출용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    a) 서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍, 및
    서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    b) 서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍;
    c) 서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍, 및
    서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    d) 서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍, 및
    서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    e) 서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍,
    서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍, 및
    서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    f) 서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍;
    g) 서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍,
    서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍,
    서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    h) 서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍;
    i) 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍, 및
    서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    j) 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍;
    k) 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍, 및
    서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍,
    서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    l) 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 및
    서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    m) 서열번호 47 또는 48로 기재된 염기서열로 구성되는 제24 프라이머 쌍,
    서열번호 49 또는 50으로 기재된 염기서열로 구성되는 제25 프라이머 쌍,
    서열번호 51 또는 52로 기재된 염기서열로 구성되는 제26 프라이머 쌍,
    서열번호 53 또는 54로 기재된 염기서열로 구성되는 제27 프라이머 쌍, 및
    서열번호 55 또는 56으로 기재된 염기서열로 구성되는 제28 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    n) 서열번호 57 또는 58로 기재된 염기서열로 구성되는 제29 프라이머 쌍,
    서열번호 59 또는 60으로 기재된 염기서열로 구성되는 제30 프라이머 쌍, 및
    서열번호 61 또는 62로 기재된 염기서열로 구성되는 제31 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    o) 서열번호 63 또는 64로 기재된 염기서열로 구성되는 제32 프라이머 쌍,
    서열번호 65 또는 66으로 기재된 염기서열로 구성되는 제33 프라이머 쌍,
    서열번호 67 또는 68로 기재된 염기서열로 구성되는 제34 프라이머 쌍, 및
    서열번호 69 또는 70으로 기재된 염기서열로 구성되는 제35 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍;
    p) 서열번호 71 또는 72로 기재된 염기서열로 구성되는 제36 프라이머 쌍, 및
    서열번호 73 또는 74로 기재된 염기서열로 구성되는 제37 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍; 및
    q) 서열번호 75 또는 76으로 기재된 염기서열로 구성되는 제38 프라이머 쌍, 및
    서열번호 77 또는 78로 기재된 염기서열로 구성되는 제39 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 식중독균 검출용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍,
    서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍,
    서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍,
    서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍,
    서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍,
    서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍,
    서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍,
    서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍,
    서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍,
    서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍,
    서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍,
    서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍,
    서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍,
    서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍,
    서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍,
    서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍,
    서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍,
    서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍,
    서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍,
    서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍,
    서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍,
    서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍,
    서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍,
    서열번호 47 또는 48로 기재된 염기서열로 구성되는 제24 프라이머 쌍,
    서열번호 49 또는 50으로 기재된 염기서열로 구성되는 제25 프라이머 쌍,
    서열번호 51 또는 52로 기재된 염기서열로 구성되는 제26 프라이머 쌍,
    서열번호 53 또는 54로 기재된 염기서열로 구성되는 제27 프라이머 쌍,
    서열번호 55 또는 56으로 기재된 염기서열로 구성되는 제28 프라이머 쌍,
    서열번호 57 또는 58로 기재된 염기서열로 구성되는 제29 프라이머 쌍,
    서열번호 59 또는 60으로 기재된 염기서열로 구성되는 제30 프라이머 쌍,
    서열번호 61 또는 62로 기재된 염기서열로 구성되는 제31 프라이머 쌍,
    서열번호 63 또는 64로 기재된 염기서열로 구성되는 제32 프라이머 쌍,
    서열번호 65 또는 66으로 기재된 염기서열로 구성되는 제33 프라이머 쌍,
    서열번호 67 또는 68로 기재된 염기서열로 구성되는 제34 프라이머 쌍,
    서열번호 69 또는 70으로 기재된 염기서열로 구성되는 제35 프라이머 쌍,
    서열번호 71 또는 72로 기재된 염기서열로 구성되는 제36 프라이머 쌍,
    서열번호 73 또는 74로 기재된 염기서열로 구성되는 제37 프라이머 쌍,
    서열번호 75 또는 76으로 기재된 염기서열로 구성되는 제38 프라이머 쌍, 및
    서열번호 77 또는 78로 기재된 염기서열로 구성되는 제39 프라이머 쌍을 포함하는, 식중독균 검출용 프라이머 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 검출은 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)으로 수행되는, 식중독균 검출용 프라이머 세트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 식중독균은 바실러스 속, 캄필로박터 속, 클로스트리디움 속, 에세리키아 속, 리스테리아 속, 살모넬라 속, 스타필로코커스 속, 비브리오 속 및 예시니아 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 식중독균 검출용 프라이머 세트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 식중독균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리디움 퍼프린진스(Clostridium perfringens), 장응집성 대장균(enteroaggregative Escherichia coli, EAEC), 장관출혈성 대장균(enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC), 장병원성 대장균(enteropathogenic Escherichia coli, EPEC), 장침습성 대장균(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC), 장독소성 대장균(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 티피뮤리움(Salmolella typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 및 예시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 식중독균 검출용 프라이머 세트.
  7. 제1항에 있어서,
    a) 서열번호 1 또는 2로 기재된 염기서열로 구성되는 제1 프라이머 쌍, 및
    서열번호 3 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 제2 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 바실러스 세레우스를 검출하고;
    b) 서열번호 5 또는 6으로 기재된 염기서열로 구성되는 제3 프라이머 쌍은 캄필로박터 속 균주를 검출하며;
    c) 서열번호 7 또는 8로 기재된 염기서열로 구성되는 제4 프라이머 쌍, 및
    서열번호 9 또는 10으로 기재된 염기서열로 구성되는 제5 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 캄필로박터 콜라이를 검출하고;
    d) 서열번호 11 또는 12로 기재된 염기서열로 구성되는 제6 프라이머 쌍, 및
    서열번호 13 또는 14로 기재된 염기서열로 구성되는 제7 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 캄필로박터 제주니를 검출하며;
    e) 서열번호 15 또는 16으로 기재된 염기서열로 구성되는 제8 프라이머 쌍,
    서열번호 17 또는 18로 기재된 염기서열로 구성되는 제9 프라이머 쌍, 및
    서열번호 19 또는 20으로 기재된 염기서열로 구성되는 제10 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 클로스트리디움 퍼프린진스를 검출하고;
    f) 서열번호 21 또는 22로 기재된 염기서열로 구성되는 제11 프라이머 쌍은 장응집성 대장균을 검출하며;
    g) 서열번호 23 또는 24로 기재된 염기서열로 구성되는 제12 프라이머 쌍,
    서열번호 25 또는 26으로 기재된 염기서열로 구성되는 제13 프라이머 쌍, 및
    서열번호 27 또는 28로 기재된 염기서열로 구성되는 제14 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 장관출혈성 대장균을 검출하고;
    h) 서열번호 29 또는 30으로 기재된 염기서열로 구성되는 제15 프라이머 쌍은 장병원성 대장균을 검출하며;
    i) 서열번호 31 또는 32로 기재된 염기서열로 구성되는 제16 프라이머 쌍, 및
    서열번호 33 또는 34로 기재된 염기서열로 구성되는 제17 프라이머 쌍은 장침습성 대장균을 검출하고;
    j) 서열번호 35 또는 36으로 기재된 염기서열로 구성되는 제18 프라이머 쌍은 장독소성 대장균을 검출하며;
    k) 서열번호 37 또는 38로 기재된 염기서열로 구성되는 제19 프라이머 쌍,
    서열번호 39 또는 40으로 기재된 염기서열로 구성되는 제20 프라이머 쌍, 및
    서열번호 41 또는 42로 기재된 염기서열로 구성되는 제21 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 리스테리아 모노사이토제니스를 검출하고;
    l) 서열번호 43 또는 44로 기재된 염기서열로 구성되는 제22 프라이머 쌍, 및
    서열번호 45 또는 46으로 기재된 염기서열로 구성되는 제23 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 살모넬라 티피뮤리움을 검출하며;
    m) 서열번호 47 또는 48로 기재된 염기서열로 구성되는 제24 프라이머 쌍,
    서열번호 49 또는 50으로 기재된 염기서열로 구성되는 제25 프라이머 쌍,
    서열번호 51 또는 52로 기재된 염기서열로 구성되는 제26 프라이머 쌍,
    서열번호 53 또는 54로 기재된 염기서열로 구성되는 제27 프라이머 쌍, 및
    서열번호 55 또는 56으로 기재된 염기서열로 구성되는 제28 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 스타필로코커스 아우레우스를 검출하고;
    n) 서열번호 57 또는 58로 기재된 염기서열로 구성되는 제29 프라이머 쌍,
    서열번호 59 또는 60으로 기재된 염기서열로 구성되는 제30 프라이머 쌍, 및
    서열번호 61 또는 62로 기재된 염기서열로 구성되는 제31 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 비브리오 콜레라를 검출하며;
    o) 서열번호 63 또는 64로 기재된 염기서열로 구성되는 제32 프라이머 쌍,
    서열번호 65 또는 66으로 기재된 염기서열로 구성되는 제33 프라이머 쌍,
    서열번호 67 또는 68로 기재된 염기서열로 구성되는 제34 프라이머 쌍, 및
    서열번호 69 또는 70으로 기재된 염기서열로 구성되는 제35 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 비브리오 파라헤몰리티쿠스를 검출하고;
    p) 서열번호 71 또는 72로 기재된 염기서열로 구성되는 제36 프라이머 쌍, 및
    서열번호 73 또는 74로 기재된 염기서열로 구성되는 제37 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 비브리오 불니피쿠스를 검출하며; 및
    q) 서열번호 75 또는 76으로 기재된 염기서열로 구성되는 제38 프라이머 쌍, 및
    서열번호 77 또는 78로 기재된 염기서열로 구성되는 제39 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍은 예시니아 엔테로콜리티카를 검출하는, 식중독균 검출용 프라이머 세트.
  8. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 조성물.
  9. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 차세대 염기서열 분석 패널.
  10. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 식중독균 검출용 키트.
  11. 제1항의 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 표적 서열을 증폭시키는 단계;
    상기 증폭된 서열을 이용하여 라이브러리를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 라이브러리를 이용하여 차세대 염기서열 분석을 수행하는 단계를 포함하는 차세대 염기서열 분석 방법.
  12. 제1항의 프라이머 세트 및 시료를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 식중독균 검출방법.
KR1020220029865A 2021-03-11 2022-03-10 차세대 염기서열 분석방법을 이용하여 식중독균을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 식중독균 검출방법 KR20220127761A (ko)

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