CN110004225B - 一种肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒、引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒、引物及方法。本发明针对肿瘤化疗药个体化基因的13个多态性位点设计了特异性引物组，并提供了肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒，本发明的试剂盒和特异性引物组能够快速、准确、一次性检测13个肿瘤化疗药个体化基因多态性位点，并且利用特异性引物进行多重PCR建库的均一性、重复性、建库成功率、文库测序数据利用率、检测准确性均非常理想。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，更具体地涉及一种肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒、引物及方法。
背景技术
药物效应存在个体化差异，其影响因素包括生理性因素，病理性因素、环境因素和遗传因素，其中遗传因素主要取决个体基因多态性，包括单核苷酸多态性和拷贝数多态性，这些多态性会通过药物代谢酶、药物转运蛋白、药物受体、致病基因等方面影响药代动力学和药效动力学，进而导致药物疗效和毒性的个体化差异。传统的医疗模式是根据患者病情，制定治疗方案，治疗的结果可能会出现有效、无效和不良反应三种情况，如果利用个体化的医疗模式，在制定治疗方案前对个体化基因进行检测，从而确定最佳治疗方案，能够大大提高药物的有效率。
化疗是肿瘤治疗的常用手段，但是化疗患者仍会出现化疗效果不佳或毒副作用较大的情况，对于肿瘤治疗后复发或转移的患者，还会存在原有化疗方案无效的情况，如果能对化疗患者进行化疗药个体化基因的检测，从而针对性的提供化疗个体化方案，对于减少患者治疗负担，提高化疗的有效性非常有益。
新一代高通量目标序列捕获测序技术的发展已被广泛的应用于各类生物学研究和医学研究中。相比探针捕获，应用多重PCR捕获目标序列具有操作简单、成本低，短时间大量富集目标DNA序列等显著优势，大大缩短了检测流程和检测时间。然而，一般来说，多重PCR拟捕获目标区域越多，则扩增的特异性、准确性、均一性越低，多重PCR捕获技术的实现难度越大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒、引物及方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供了一种肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒，包括：检测肿瘤化疗药个体化基因的特异性引物组；所述特异性引物组包括针对下述13个多态性位点进行设计的特异性引物：CDA基因的rs2072671、rs60369023，DPYD基因的rs3918290，MTHFR基因的rs1801133，UGT1A1基因的rs8175347，ABCB1基因的rs1045642、rs2032582，GSTP1基因的rs1695，CYP19A1基因的rs4646，XRCC1基因的rs25487、rs1799782，ERCC1基因的rs11615，CYP2D6基因的rs1065852。
作为上述试剂盒优选的，所述特异性引物组包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的特异性引物。
根据建库需求，所述特异性引物组中的每条特异性引物5’端还连接有建库测序所需的通用序列。所述通用序列选自公共引物、接头、特异性标签。其中，公共引物的作用是通过PCR使目标片段与接头和特异性标签连接；特异性标签则用于区分样本，在文库构建时，不同样本用不同的特异性标签的去标记，从而实现高通量。以上建库测序所需的通用序列需要根据平台建库需求选用，例如，可以在特异性引物的5’端只连接公共引物，并且在测序接头的3’连接公共引物，标签接头的3’端连接公共引物，可通过PCR扩增获得“测序接头-公共引物-目的片段-公共引物-标签接头”的扩增子文库；再如，在特异性引物的5’端直接连接标签和接头，可通过PCR扩增直接获得带有特异性标签和接头的扩增子文库，此外，在特异性引物的5’端只连接标签，可通过PCR扩增获得带有特异性标签的扩增子文库，经接头连接后再进行测序；本领域技术人员应当知晓，特异性引物5’端连接建库测序所需的通用序列的方式不限于此。
本发明还提供一种肿瘤化疗药个体化基因检测引物组，如上述试剂盒中的特异性引物组所述。
本发明提供一种肿瘤化疗药个体化基因的建库方法，所述方法用于非疾病诊断目的，包括步骤：根据测序平台建库需求，利用上述试剂盒或上述特异性引物组，对模板DNA进行多重PCR扩增，获得扩增子文库，对扩增子文库进行混合、纯化，获得肿瘤化疗药个体化基因的文库。
根据半导体测序平台，上述建库方法进一步包括步骤：
(1)在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的特异性引物序列5’端连接公共引物作为特
异性引物组，并加入测序接头、标签接头和扩增缓冲液，对模板DNA进行多重PCR扩
增，获得扩增子文库；其中，不同模板DNA所用的标签接头不同；测序接头和标签接头
3’端连接了公共引物；
(2)将获得的扩增子文库混合，纯化，获得肿瘤化疗药个体化基因的文库。
上述建库方法中，所述25μL多重PCR扩增反应体系为：模板DNA含量≥100ng、特异性引物组8～12pM、测序接头8～12pM，标签接头8～12pM、扩增缓冲液12.5μL，无核酸酶水为余量。
上述建库方法中，所述多重PCR扩增反应条件为：①95℃3～5min；②34～36个循环扩增，每个循环：95℃10～20s，60℃80～100s，72℃30～45s；③72℃1～2min，④8～16℃保持。
本发明还提供利用上述建库方法获得的肿瘤化疗药个体化基因的文库。
本发明的有益效果是：
本发明针对肿瘤化疗药个体化基因的13个多态性位点设计了特异性引物组，并提供了肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒，本发明的试剂盒和特异性引物组能够快速、准确、一次性检测13个肿瘤化疗药个体化基因多态性位点，并且利用特异性引物进行多重PCR建库的均一性、重复性、建库成功率、文库测序数据利用率、检测准确性均非常理想。
附图说明
图1：扩增子深度盒式图，图中，1～13依次为Came_01L/R～Came_13L/R的扩增子；
图2：数据利用率统计图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步解释本发明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例中未特别说明的试剂和仪器均可市售获得，未特别说明的实验操作均按产商说明书或本领域常规技术实施。
实施例1、检测肿瘤化疗药个体化基因的特异性引物组
发明人根据肿瘤化疗药个体化基因的13个多态性位点设计了特异性引物，并经过大量试验筛选、优化、验证，最终优选出扩增效率高，特异性好的13对引物(如表1所示)。
表1、肿瘤化疗药个体化基因的特异性引物
实施例2、肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒
本实施例根据半导体测序平台，示例性地提供一种基于半导体测序法的肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒，值得注意的是，利用本发明的特异性引物组，开发的基于其他测序平台或非基于测序的肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒也应当是本申请的保护范围，在此不一一示例。
肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒，包括：
(1)特异性引物组：在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的每条特异性引物的5’端加上公共引物，所述公共引物序列为：5’-AAATGGGCGGTAGGCTTG-3’(SEQ ID NO::27)；
(2)测序接头：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-公共引物-3’(SEQID NO:28)；
(3)标签接头：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNGAT-公共引物-3’(SEQ ID NO:29)；序列中N表示AGCT任意碱基，NNNNNNNN用于识别不同样品构建的文库；
(4)扩增缓冲液：市售的多重PCR缓冲试剂，如，QIAGEN Multiplex PCR Kit、2GFast Multiplex PCR Kit；
(5)纯化试剂：市售的纯化磁珠，如Ampure XP磁珠。
实施例3、肿瘤化疗药个体化基因的建库和测序
本实施例示例性提供一种肿瘤化疗药个体化基因的建库和测序方法，步骤如下：
1、一步多重PCR
配制25μL多重PCR反应体系，包括：模板DNA 300ng、特异性引物组10pM、测序接头10pM，标签接头10pM、扩增缓冲液12.5μL，无核酸酶水余量；不同模板使用不同的标签接头。
按下述程序进行扩增：①95℃3min；②35个循环扩增，每个循环：95℃10s，60℃90s，72℃30s；③72℃1min，④16℃保持。
2、扩增产物混合与纯化
从每个PCR管中取出10μL的扩增产物，涡旋混匀，得到混合文库；取25μL的混合文库，使用纯化试剂进行纯化。
3、测序
测序前使用QubitTM dsDNA Hs Assay Kit对纯化后的混合文库进行定量，根据定量的浓度进行上机测序。本实施例采用半导体测序仪进行测序，测序模板制备和富集详见Ion PITM Hi QTMOT2 200Kit(A26434)操作使用说明书，将带有模板分子的微珠加载到IonProtonTM测序仪的半导体芯片上进行测序，详细步骤参见Ion PITM Hi QTMSequence 200Kit操作使用说明书。
实施例4、指标评价
1、检测结果Sanger一致性评价
根据实施例3的方法对5例样本进行建库测序，获得二代测序检测结果(简称NGS)，同时进行sanger验证，结果如表2所示，NGS结果与sanger结果一致，表明肿瘤化疗药个体化基因检测准确性高。
表2、检测限参考品和阴性参考品的检测结果符合情况
2、扩增均一性评价
利用特异性引物组进行多重PCR建库后的均一性进行评价，建库方法参考实施例3，对一个run内的样本获得的扩增深度进行统计，结果如图1所示，扩增子深度均一性好，说明特异性引物组的引物特异性高，相互干扰小。
3、重复性评价
对同一样本的DNA按实施例3的方法建库，获得肿瘤化疗药个体化基因的文库，对文库进行测序和分析，结果如表3所示。结果显示：利用特异性引物组构建的肿瘤化疗药个体化基因的文库检测结果重复性好。
表3、同一样本5次重复检测结果
4、建库成功率及数据利用率评价
收集51例样本按实施例3的方法建库，获得肿瘤化疗药个体化基因的文库，统计建库成功率，并对文库进行测序和分析，输出数据利用率。
实验结果显示，一次性建库成功率为99.33％，二次建库成功率为100％，数据利用率集中在60％-80％，如图2所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞博奥木华基因科技有限公司
<120> 一种肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒、引物及方法
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)
1.一种肿瘤化疗药个体化基因检测试剂盒，包括：检测肿瘤化疗药个体化基因的特异性引物组；所述特异性引物组包括针对下述13个多态性位点进行设计的特异性引物：CDA基因的rs2072671、rs60369023，DPYD基因的rs3918290，MTHFR基因的rs1801133，UGT1A1基因的rs8175347，ABCB1基因的rs1045642、rs2032582，GSTP1基因的rs1695，CYP19A1基因的rs4646，XRCC1基因的rs25487、rs1799782，ERCC1基因的rs11615，CYP2D6基因的rs1065852。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物组包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的特异性引物。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物组中的每条特异性引物5’端还连接有建库测序所需的通用序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述通用序列选自公共引物、接头、特异性标签。
5.一种肿瘤化疗药个体化基因检测引物组，其特征在于：所述引物组为权利要求1～4任一项所述试剂盒中的特异性引物组。
6.一种肿瘤化疗药个体化基因的建库方法，所述方法用于非疾病诊断目的，包括步骤：根据测序平台建库需求，利用权利要求1～4任一项所述的试剂盒或权利要求5所述的特异性引物组，对模板DNA进行多重PCR扩增，获得扩增子文库，对扩增子文库进行混合、纯化，获得肿瘤化疗药个体化基因的文库。
7.根据权利要求6所述的建库方法，其特征在于：所述方法进一步包括步骤：
（1）在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:26所示的特异性引物序列5’端连接公共引物作为特异性引物组，并加入测序接头、标签接头和扩增缓冲液，对模板DNA进行多重PCR扩增，获得扩增子文库；其中，不同模板DNA所用的标签接头不同；测序接头和标签接头3’端连接了公共引物；
（2）将获得的扩增子文库混合，纯化，获得肿瘤化疗药个体化基因的文库。
8.根据权利要求7所述的建库方法，其特征在于：所述25μL多重PCR扩增反应体系为：模板DNA含量100～300ng、特异性引物组8～12pM、测序接头8～12pM，标签接头8～12pM、扩增缓冲液12.5μL，无核酸酶水为余量。
9.根据权利要求7所述的建库方法，其特征在于：所述多重PCR扩增反应条件为：①95℃3～5min；②34～36个循环扩增，每个循环： 95℃ 10～20s，60℃ 80～100s，72℃ 30～45s；③72℃ 1～2min，④8～16℃保持。
10.利用权利要求6～9任一项所述建库方法获得的肿瘤化疗药个体化基因的文库。
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