CN113584160A - 一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述检测试剂盒用于检测昂司丹琼代谢标志物ABCB1C3435T和ABCB1G2677T/A两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：ABCB1C3435T扩增引物、ABCB1C3435T测序引物、ABCB1G2677T/A扩增引物、ABCB1G2677T/A测序引物和阳性对照。本发明以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对昂丹司琼用药相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)基因多态性，为临床个性化用药给出基因角度的建议。
Description
技术领域
本发明涉及一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。
背景技术
昂丹司琼为一种高度选择性的5-羟色胺(5-HT3)受体拮抗剂，能抑制由化疗和放疗引起的恶心呕吐，有高强度和高度的选择性，能控制小肠及CTZ中受体受刺激而引起的呕吐。适用于治疗由化疗和放疗引起的恶心呕吐，也可用于预防和治疗手术后引起的恶心呕吐。然而，但仍有35％的患者抱怨仍有呕吐，这意味着不同患者对药物的反应不同。
到目前为止，止吐药反应差异的原因尚不清楚。除了归因于这种恶心和呕吐的许多危险因素外，现在已经意识到遗传因素可能是造成这种变异的原因。昂丹司琼被血脑屏障中的腺苷5'-三磷酸结合盒B族亚家族B成员1(ABCB1)药物转运蛋白识别，后者又决定了中枢神经系统(CNS)中的药物浓度。
目前，对于基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法和芯片法，操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；高分辨率熔解曲线法步骤简单，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，其引物设计难以最优化，检测条件要求严格。Taqman荧光探针法其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒的技术方案如下：
本发明的试剂盒针对ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)两个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：扩增反应液、ABCB1(C3435T)测序引物、ABCB1(G2677T/A)测序引物、阳性对照。
优选地，所述设计特异性引物，如下表所示：
优选的，所述ABCB1(C3435T)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:2所示；所述ABCB1(G2677T/A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示。更优选的，所述的扩增引物为生物素标记引物。
优选的，所述的ABCB1(C3435T)测序引物、ABCB1(G2677T/A)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
优选的，所述的试剂1包括：扩增缓冲液，18mM醋酸镁；
优选的，所述的试剂2包括：ABCB1(C3435T)后引物，ABCB1(C3435T)后引物，ABCB1(G2677T/A)前引物，ABCB1(G2677T/A)后引物，dNTPS、链置换DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白，结合单链核酸的重组酶，海藻糖；可在恒温条件下进行ABCB1(C3435T)/ABCB1(G2677T/A)同时扩增。
更优选的，试剂2各组分浓度分别为：ABCB1(C3435T)后引物(0.32uM)，ABCB1(C3435T)后引物(0.32uM)，ABCB1(G2677T/A)前引物(0.32uM)，ABCB1(G2677T/A)后引物(0.32uM)，dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)；
优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677A)杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的昂丹司琼用药相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组DNA，采用多重RPA扩增进行扩增；
b.结合液(含微珠)与扩增产物进行结合。
c.变性液处理得到单链产物。
d.加入洗涤缓冲液漂洗。
e.将单链产物与退火液、测序引物进行退火。
f.向每个测序管中加入测序酶和测序底物。
g.取一个dNTP排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部。
h.焦磷酸测序；
i.确定ABCB1(C3435T)位点、ABCB1(G2677T/A)位点昂丹司琼位点的基因型。
优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：42℃20min。
本发明还公开了一种用于昂丹司琼疗效评估的试剂盒及方法的应用，所述检测试剂盒对ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)进行检测，以从基因层面指导昂丹司琼疗效评估。
重组酶聚合酶扩增(RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在二十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
本发明通过多重RPA一管扩增ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)，快速、有效地在恒定温度下产生大量扩增产物。扩增产物中其中一条引物具有生物素标记。生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合，变性去除无生物素标记单链，加入测序引物与模板DNA退火后，加入测序原料进行焦磷酸测序。
与现有技术相比，本发明以多重RPA扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对昂丹司琼用药相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)基因多态性，为临床个性化用药给出基因角度的建议。
附图说明
图1是本发明提供的ABCB1(C3435T)TT型测序结果示例图；
图2是本发明提供的ABCB1(C3435T)CT型测序结果示例图；
图3是本发明提供的ABCB1(C3435T)CC型测序结果示例图；
图4是本发明提供的ABCB1(G2677T/A)AA型测序结果示例图；
图5是本发明提供的ABCB1(G2677T/A)TT型测序结果示例图；
图6是本发明提供的ABCB1(G2677T/A)GG型测序结果示例图；
图7是本发明提供的ABCB1(G2677T/A)AG型测序结果示例图；
图8是本发明提供的ABCB1(G2677T/A)TG型测序结果示例图；
图9是本发明提供的ABCB1(G2677T/A)AT型测序结果示例图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1、试剂盒的制备
本发明的试剂盒针对ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677T/A)设计了特异性扩增引物和测序引物，用于恒温扩增和焦磷酸测序检测。基于重组酶聚合酶扩增技术设计引物是本发明的关键之一，该技术的引物设计无法辅助软件进行，只能依靠人工设计。为保证扩增速度及检测灵敏度，引物长度应控制在30～35bp，引物设计过短易增加非特异性扩增导致假阳性，若设计过长易导致无法进行扩增。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准。
ABCB1 C3435T(rs1045642)序列如下：
ABCB1 G2677T/A(rs2032582)序列如下：
(一)本实施例的引物序列如下：
(二)本实施例的检测试剂盒包括如下组分：
(三)本实施例的检测试剂盒试剂1单人份配置体系如下：
| 成分 | 体积(ul) |
| 扩增缓冲液 | 18.8 |
| 300mM醋酸镁 | 1.2 |
(四)本实施例的检测试剂盒试剂2单人份配置体系如下：
试剂2各组分浓度分别为：ABCB1(C3435T)后引物(0.32uM)，ABCB1(C3435T)后引物(0.32uM)，ABCB1(G2677T/A)前引物(0.32uM)，ABCB1(G2677T/A)后引物(0.32uM)，dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)；
| 成分 | 体积(ul) |
| 结合单链核酸的重组酶(100ng/μL) | 1.2 |
| 单链DNA结合蛋白(100ng/μL) | 0.8 |
| 链置换DNA聚合酶(100ng/μL) | 0.3 |
| dNTPs(2.5mM) | 3 |
| ABCB1(C3435T)前引物(20μM) | 0.4 |
| ABCB1(C3435T)后引物(20μM) | 0.4 |
| ABCB1(G2677T/A)前引物(20μM) | 0.4 |
| ABCB1(G2677T/A)后引物(20μM) | 0.4 |
| 海藻糖(20％) | 0.25 |
配置完成后158ul/管进行分装、冻干。
实施例2、焦磷酸检测
本发明中采用的仪器如下：恒温仪；
焦磷酸测序仪：武汉菲思特生物科技有限公司。
(1)试剂准备(试剂准备室)
提前将试剂取出，并将试剂1涡旋振荡15秒，低速离心待用。直接向试剂2(冻干)中加入440ul试剂1，涡旋振荡15秒充分混匀。确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次PCR实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按20μL/管分装至PCR反应管中。
(2)加样检测(样本制备间)
将样本DNA、阳性对照和空白对照按5μL加样量加入到PCR反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。
(3)PCR扩增(扩增间)
采用PCR仪进行扩增，反应体系为25μL，扩增条件：
| 扩增温度 | 时间 | 循环数 |
| 42℃ | 20min | 1 |
(4)焦磷酸测序
1)在PCR反应管中加入结合液40μL和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入PCR产物10μL，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和PCR产物充分结合；
2)7,000×g离心1min，弃上清；
3)加入22uL稀释后的变性液工作液，静置5min，7,000×g离心1min，EP管收集得到单链产物。
4)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液，7,000×g离心1min。(重复3次)
5)向EP管中加入退火缓冲液6μL，再加入测序引物1uL。
6)将EP管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入3uL测序酶和3uL测序底物。
7)取一个dNTP排管，自圆滑一端向平端依次加入20μldATP、20μl dTTP、20μldGTP、20μl dCTP。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部。
8)根据仪器使用说明进行测序，仪器分配指令如下。
(5)结果判读
1)有效性判定：
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为ABCB1(C3435T)、ABCB1(G2677A)型。
2)结果判定标准
a.ABCB1(C3435T)的DNA测序峰值图中，
T的频率≧90％，C的频率≦10％，即为TT型；
40％≦T的频率≦60％，40％≦C的频率≦60％，即为CT型；
C的频率≧90％，T的频率≦10％，即为CC型；
b.ABCB1(G2677T/A)的DNA测序峰值图中，
A的频率≧90％，G/T的频率≦10％，即为AA型；
T的频率≧90％，G/A的频率≦10％，即为TT型；
G的频率≧90％，A/T的频率≦10％，即为GG型；
40％≦A的频率≦60％，40％≦G的频率≦60％,T的频率≦5％，即为AG型；
40％≦T的频率≦60％，40％≦G的频率≦60％,A的频率≦5％，即为TG型；
40％≦A的频率≦60％，40％≦T的频率≦60％,G的频率≦5％，即为AT型；
各基因型检测结果如图1～9所示。
实施例3、基因检测结果与代谢活性的相关性
基因检测结果与药物疗效的相关性总结：
关于ABCB1 G2677T/A rs2032582：
与其他基因型的患者相比，基因型AA(TT)的患者在接受昂丹司琼治疗后不久恶心和呕吐的可能性较低。
与基因型为AA的患者相比，基因型为AC(GT)的患者在接受昂丹司琼治疗后不久恶心和呕吐的可能性可能会增加。
与基因型为AA的患者相比，基因型为AT(AT)的患者在接受恩丹司琼治疗后不久恶心和呕吐的可能性增加。
与基因型为AA的患者相比，基因型为CC(GG)的患者在接受恩丹司琼治疗后不久恶心和呕吐的可能性可能会增加。
与AA基因型患者相比，基因型TT(AA)患者在接受恩丹司琼治疗后不久恶心和呕吐的可能性可能增加。
关于rs1045642(ABCB1)C3435T：
与TT基因型相比，CT基因型在接受昂丹司琼治疗后，恶心和呕吐的可能性可能会增加。
与CT或CC基因型相比，TT基因型在接受昂丹司琼治疗后，恶心呕吐的可能性较低。
与TT基因型相比，CC基因型在接受昂丹司琼治疗后，恶心和呕吐的可能性可能会增加。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南菲思特精准医疗科技有限公司
<120> 一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(32)
<400> 1
tgcagcattg ctgagaacat tgcctatgga ga 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(32)
<400> 2
taggcagtga ctcgatgaag gcatgtatgt tg 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(32)
<400> 3
attgcaatag caggagttgt tgaaatgaaa at 32
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 4
tttttgagtc caagaactgg ctttgctact 30
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 5
ctttgctgcc ctcac 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 6
tgactcacct tccca 15
Claims (10)
1.一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测昂司丹琼代谢标志物ABCB1 C3435T和ABCB1 G2677T/A两个基因的基因多态性，试剂盒包括如下组分：ABCB1 C3435T扩增引物、ABCB1 C3435T测序引物、ABCB1 G2677T/A扩增引物、ABCB1G2677T/A测序引物和阳性对照。
2.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1C3435T扩增引物如序列表SEQ ID NO:1～2所示。
3.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1G2677T/A扩增引物如序列表SEQ ID NO:3～4所示。
4.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述ABCB1C3435T测序引物如序列表SEQ ID NO:5所示，ABCB1 G2677T/A测序引物如序列表SEQ IDNO:6所示。
5.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物为生物素标记引物。
6.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述所述试剂盒还包括扩增缓冲液、18mM醋酸镁、dNTPS、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、结合单链核酸的重组酶和海藻糖。
7.根据权利要求6所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分浓度为：ABCB1 C3435T扩增前后引物各0.32uM，ABCB1 G2677T/A扩增前后引物各0.32uM，dNTPS 0.3mM，链置换DNA聚合酶1.2ng/μL，单链DNA结合蛋白3.2ng/μL，结合单链核酸的重组酶4.8ng/μL，海藻糖0.2％。
8.根据权利要求1所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照，包括浓度为20ng/ul的ABCB1 C3435T、ABCB1 G2677T/A杂合型基因组DNA。
9.一种采用权利要求1～8任一项所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
a.将所述扩增反应液与5ul待测基因组DNA，采用多重RPA扩增进行扩增；
b.将含微珠的结合液与扩增产物进行结合；
c.变性液处理得到单链产物；
d.加入洗涤缓冲液漂洗；
e.将单链产物与退火液、测序引物进行退火；
f.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
g.取一个dNTP排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
h.焦磷酸测序；
i.确定ABCB1 C3435T位点、ABCB1 G2677T/A位点的基因型。
10.一种根据权利要求1～8任一项所述的昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试剂盒用于体外检测待测样本中的ABCB1 C3435T和ABCB1 G2677T/A基因多态性。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20211102 |