JP2006158341A - 遺伝子多型検出キット - Google Patents
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Abstract
【課題】
ヒトから採取したゲノムＤＮＡにおける多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子における遺伝子多型（ＳＮＰ）をより簡便に検出することが出来るキットの開発が求められている。
【解決手段】
本発明は、ヒトから採取したゲノムＤＮＡにおけるＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目の遺伝子多型（ＳＮＰ）の検出を、好ましくは３箇所同時に簡便に検出することが出来るものである。また、検出の結果からステロイド剤の服用の際に将来副作用が起きる可能性について予測することができる遺伝子多型検出キットを提供する。
【選択図】 図１
ヒトから採取したゲノムＤＮＡにおける多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子における遺伝子多型（ＳＮＰ）をより簡便に検出することが出来るキットの開発が求められている。
【解決手段】
本発明は、ヒトから採取したゲノムＤＮＡにおけるＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目の遺伝子多型（ＳＮＰ）の検出を、好ましくは３箇所同時に簡便に検出することが出来るものである。また、検出の結果からステロイド剤の服用の際に将来副作用が起きる可能性について予測することができる遺伝子多型検出キットを提供する。
【選択図】 図１
Description
本発明は、ヒトから採取したゲノムＤＮＡにおける多剤耐性（ＭＤＲ１）遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目の遺伝子多型（ＳＮＰ）の検出を簡便に行うことが出来る遺伝子多型検出キットおよび検出方法に関する。
ステロイド剤は、その発見以来、効能の強さゆえに膠原病や皮膚炎など様々な分野で治療薬として使用されている。その反面、骨疾患、糖尿病、白内障および緑内障などの副作用が生じる可能性も高く、服用することを避けられる場合がある。
ＭＤＲ１遺伝子は有害な物質を細胞外へ輸送する輸送蛋白の一種であるＰ糖蛋白をコードしている遺伝子であり、その研究が盛んに行われている。このＭＤＲ１遺伝子には、ある特定の位置の塩基が個体によって種類が異なることが知られており、遺伝子多型（ＳＮＰ）と呼ばれている。このＳＮＰが、薬剤の副作用が起こる可能性に影響していると考えられている。
そこで、ＭＤＲ１遺伝子のＳＮＰを調べることにより、事前に患者のステロイド剤に対する耐性を予測する方法が研究盛んに行われている。
ステロイド剤の耐性に関するＭＤＲ１遺伝子のＳＮＰの候補としては、エクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目などが挙げられている。例えば、エクソン１２の１２３６番目の塩基は、チミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＴＴ、ＴＣおよびＣＣ型の３タイプのＳＮＰが存在し、このＳＮＰがステロイドの副作用に関連していると言われている（非特許文献１、２）。
しかしながら、現在の所はシーケンサーを用いて直接塩基配列を解析するなど、非常に時間と手間のかかる検出方法しか存在しなかった。このことから、ＭＤＲ１遺伝子のＳＮＰを検出することは、非常に有用であると考えられる。
Tanabe et al., the Journal of pharmacology and experimental therapeutics, 297 (3), 1137
Hoffmeyer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol.97 No.7 3473-3478, March 28 (2000)
したがって、ＭＤＲ１遺伝子における遺伝子多型をより簡便に検出することが出来るキットおよび検出方法の開発が求められている。
本発明は、
（１） ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおける遺伝子多型（ＳＮＰ）を検出するキットであって、少なくとも下記の（i）、(ii)または（iii）のプローブ群を含んでなる遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、
（２） プローブ群が坦体表面上に固定化された検出ストリップを含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット、
（３） 坦体が、ビニル系ポリマーまたはポリエステルである（２）に記載の遺伝子多型検出キット、
（４） 坦体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである（２）に記載の遺伝子多型検出キット、
（５） 少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てのプローブ群を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット：
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、
（６） 少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てのプローブ群を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット：
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、
（７） 少なくとも下記の（i）、(ii)または（iii）を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１０のＤＮＡ、または配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対。
（８） 配列番号９〜１５のＤＮＡ、配列番号９、１２および１４のＤＮＡ、または配列番号１０、１１、１３および１５のＤＮＡに、蛍光物質または放射性同位体を修飾した（７）に記載の遺伝子多型検出キット、
（９） 配列番号９〜１５のＤＮＡ、配列番号９、１２および１４のＤＮＡ、または配列番号１０、１１、１３および１５のＤＮＡの５'末端に、ビオチンを修飾した（７）に記載の遺伝子多型検出キット、
（１０） さらに、ストレプトアビジン、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を含む（９）に記載の遺伝子多型検出キット、および
（１１） 少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てをを含んでなる請求項７に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対
に関する。
（１） ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおける遺伝子多型（ＳＮＰ）を検出するキットであって、少なくとも下記の（i）、(ii)または（iii）のプローブ群を含んでなる遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、
（２） プローブ群が坦体表面上に固定化された検出ストリップを含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット、
（３） 坦体が、ビニル系ポリマーまたはポリエステルである（２）に記載の遺伝子多型検出キット、
（４） 坦体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである（２）に記載の遺伝子多型検出キット、
（５） 少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てのプローブ群を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット：
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、
（６） 少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てのプローブ群を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット：
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、
（７） 少なくとも下記の（i）、(ii)または（iii）を含んでなる（１）に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１０のＤＮＡ、または配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対。
（８） 配列番号９〜１５のＤＮＡ、配列番号９、１２および１４のＤＮＡ、または配列番号１０、１１、１３および１５のＤＮＡに、蛍光物質または放射性同位体を修飾した（７）に記載の遺伝子多型検出キット、
（９） 配列番号９〜１５のＤＮＡ、配列番号９、１２および１４のＤＮＡ、または配列番号１０、１１、１３および１５のＤＮＡの５'末端に、ビオチンを修飾した（７）に記載の遺伝子多型検出キット、
（１０） さらに、ストレプトアビジン、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を含む（９）に記載の遺伝子多型検出キット、および
（１１） 少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てをを含んでなる請求項７に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対
に関する。
本発明の遺伝子多型検出キットは、ヒトから採取したゲノムＤＮＡにおけるＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目のＳＮＰの検出を簡便に行うことが出来るものであり、好ましくは上記３箇所のＳＮＰを同時検出することができるものである。そして、この結果よりステロイド剤の服用の際に将来副作用が起きる可能性について予測することができる。
本発明は、ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおけるＳＮＰを検出するキットである。本発明における生体試料とは、血液、唾液または毛髪などが挙げられ、好ましくは、血球細胞、表皮細胞および粘膜細胞などの各種ヒト細胞である。これらの生体試料からＤＮＡを抽出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えばフェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法等が公知である。
本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも下記の（i）、（ii）または（iii）からなるプローブ群を含んでなる。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群。
上記の（i）、(ii)および（iii）における配列番号１〜８のＤＮＡはＭＤＲ１遺伝子のＳＮＰを検出するためプローブである。これらのＤＮＡは、市販されているＤＮＡ／ＲＮＡ合成機などによって合成することができ、その合成方法は限定されるものではない。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群。
上記の（i）、(ii)および（iii）における配列番号１〜８のＤＮＡはＭＤＲ１遺伝子のＳＮＰを検出するためプローブである。これらのＤＮＡは、市販されているＤＮＡ／ＲＮＡ合成機などによって合成することができ、その合成方法は限定されるものではない。
gttcaggccc ttcaag （配列番号１）
gttcagaccc ttcaag （配列番号２）
tagaaggtgc tgggaa （配列番号３）
agaaggttct gggaag （配列番号４）
agaaggtact gggaag （配列番号５）
aagagatcgt gagggc （配列番号６）
aagagattgt gagggc （配列番号７）
agagattgtg agggc （配列番号８）
gttcagaccc ttcaag （配列番号２）
tagaaggtgc tgggaa （配列番号３）
agaaggttct gggaag （配列番号４）
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aagagatcgt gagggc （配列番号６）
aagagattgt gagggc （配列番号７）
agagattgtg agggc （配列番号８）
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群は、エクソン１２の１２３６番目のＳＮＰを検出することができる。エクソン１２の１２３６番目の塩基は、チミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＴＴ型、ＴＣ型およびＣＣ型の３タイプのＳＮＰが存在する。配列番号１のＤＮＡプローブは、エクソン１２の１２３６番目の塩基がシトシン（Ｃ）の場合に検出することができ、配列番号２のＤＮＡプローブは、エクソン１２の１２３６番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができる。したがって、配列番号１のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＣＣ型、配列番号２のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＴＴ型、配列番号１および２のＤＮＡプローブの両方で検出される場合はＣＴ型であると容易に検知することができる。
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群は、エクソン２１の２６７７番目のＳＮＰを検出することができる。エクソン２１の２６７７番目の塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）もしくはチミン（Ｔ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＧＧ型、ＡＡ型、ＴＴ型、ＧＡ型、ＧＴ型およびＡＴ型の６タイプのＳＮＰが存在する。配列番号３のＤＮＡプローブは、エクソン２１の２６７７番目の塩基がグアニン（Ｇ）の場合に検出することができ、配列番号４のＤＮＡプローブは、エクソン２１の２６７７番目の塩基がアデニン（Ａ）の場合に検出することができ、配列番号５のＤＮＡプローブは、エクソン２１の２６７７番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができる。したがって、配列番号３のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＧＧ型、配列番号４のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＡＡ型、配列番号５のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＴＴ型、配列番号３および４のＤＮＡプローブで検出される場合はＧＡ型、配列番号３および５のＤＮＡプローブで検出される場合はＧＴ型、配列番号４および５のＤＮＡプローブで検出される場合はＡＴ型であると容易に検知することができる。
配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群は、エクソン２６の３４３５番目のＳＮＰを検出することができる。エクソン２６の３４３５番目の塩基は、チミン（Ｔ）もしくはシトシン（Ｃ）であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、ＴＴ型、ＴＣ型およびＣＣ型の３タイプのＳＮＰが存在する。配列番号６のＤＮＡプローブは、エクソン２６の３４３５番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができ、配列番号７および８のＤＮＡプローブは、エクソン２６の３４３５番目の塩基がシトシン（Ｃ）の場合に検出することができる。上記配列番号７および８は、どちらかを選択することができる。したがって、配列番号６のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＣＣ型、配列番号７または８のＤＮＡプローブのみで検出される場合はＴＴ型、配列番号６および７のＤＮＡプローブ、または配列番号６および８のＤＮＡプローブで検出される場合はＣＴ型であると容易に検知することができる。
本発明は、上記のＤＮＡプローブ群を、坦体表面上に物理的または化学的に固定されることで検出ストリップを含む。
坦体は、ビニル系ポリマーまたはポリエステル、より詳しくは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートもしくはニトロセルロースなどの有機材料、ガラスもしくはシリカなどの無機材料、金もしくは銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されるものではないが、成型加工性が容易である有機材料が好ましく、さらに好ましくは、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類である。これらの坦体は、発色法での検知において、その発色を見やすくするために白色であることが好ましい。
坦体は、ビニル系ポリマーまたはポリエステル、より詳しくは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートもしくはニトロセルロースなどの有機材料、ガラスもしくはシリカなどの無機材料、金もしくは銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されるものではないが、成型加工性が容易である有機材料が好ましく、さらに好ましくは、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類である。これらの坦体は、発色法での検知において、その発色を見やすくするために白色であることが好ましい。
これらの坦体表面にＤＮＡプローブを物理的に固定化する方法として、例えば、ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を坦体表面に被覆することで、ポリアニオンであるＤＮＡプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる、また、プローブＤＮＡに無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、ＤＮＡの分子量を増大させることにより固定化の効率をあげることもできる。さらに、担体表面がガラスなどの場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤など、担体表面が金などの場合、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで坦体表面を処理することで、ポリアニオンであるＤＮＡプローブとの静電相互作用により、固定化の効率が良くなることが知られている。
一方で、プローブＤＮＡに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、その溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄することによることもできる。または、ガラス、シリコンなどの無機材料坦体上に、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することで、坦体の表面をアミノ化し、末端にカルボン酸を導入したプローブＤＮＡとアミノカップリング反応させることで、固定化する方法などがある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合、核酸検出用プローブの末端にチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基を修飾し、その溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄し、固定化することができる。
また、合成されたＤＮＡプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、望む配列を固定表面上で直接ＤＮＡプローブを合成する方法も知られており、本発明においてもこの方法も含む。
本発明の遺伝子多型検出キットは、エクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目のＳＮＰのいずれかを検出するものであるが、好ましくは上記から選ばれる２箇所のＳＮＰを同時に検出するキットであり、さらに好ましくは上記３箇所のＳＮＰを同時に検出するキットである。したがって、本発明の遺伝子多型検出キットのさらに好ましい形態は、少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てのプローブ群を含むものである。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群。
gttcaggccc ttcaag （配列番号１）
gttcagaccc ttcaag （配列番号２）
tagaaggtgc tgggaa （配列番号３）
agaaggttct gggaag （配列番号４）
agaaggtact gggaag （配列番号５）
aagagatcgt gagggc （配列番号６）
aagagattgt gagggc （配列番号７）
agagattgtg agggc （配列番号８）
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また、２箇所以上の同時検出の場合、エクソン２６の３４３５番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができるプローブは、配列番号７および８のＤＮＡプローブのうち、非特異吸着を抑えることができる配列番号８のＤＮＡプローブを選択することが好ましい。したがって、本発明の遺伝子多型検出キットの特に好ましい形態は、少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てのプローブ群を含むものである。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群。
gttcaggccc ttcaag （配列番号１）
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tagaaggtgc tgggaa （配列番号３）
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agaaggtact gggaag （配列番号５）
aagagatcgt gagggc （配列番号６）
agagattgtg agggc （配列番号８）
上記核酸の検知に用いるためには予め検出すべき遺伝子多型の箇所を含むＤＮＡを増幅する必要がある。核酸の増幅は、ヒトの生体試料から抽出されたＤＮＡを公知の方法、例えばＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法またはＩＣＡＮ法等により行うことができ、好適にはＰＣＲ法により行うことができる。
したがって、本発明の遺伝多型検出キットは、ＰＣＲ法に用いるプライマーを含むことは好ましい。該プライマーは、エクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目の塩基を含むＤＮＡを増幅することができれば特に限定されるものではないが、増幅すべき核酸の塩基数が１００〜４００塩基対、好ましくは１５０〜３００塩基対である。
上記プライマーとしてより好ましいのは、エクソン１２の１２３６番目を含むＤＮＡの増幅には配列番号９および１０のＤＮＡ、または配列番号９および１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対、エクソン２１の２６７７番目を含むＤＮＡの増幅には配列番号１２および１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対、エクソン２６の３４３５番目を含むＤＮＡの増幅には配列番号１４および１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対である。
actgttgtgc tcttcccaca （配列番号９）
cacttcagtt acccatctcg （配列番号１０）
cctgtgtctg tgaattgcct （配列番号１１）
cccatcattg caatagcagg （配列番号１２）
ccaagaactg gctttgctac （配列番号１３）
ttcagctgct tgatggcaaa （配列番号１４）
aggcagtgac tcgatgaagg （配列番号１５）
cacttcagtt acccatctcg （配列番号１０）
cctgtgtctg tgaattgcct （配列番号１１）
cccatcattg caatagcagg （配列番号１２）
ccaagaactg gctttgctac （配列番号１３）
ttcagctgct tgatggcaaa （配列番号１４）
aggcagtgac tcgatgaagg （配列番号１５）
したがって、本発明における遺伝子多型検出キットは少なくとも下記の（i）、(ii)または（iii）を含む。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１０のＤＮＡ、または配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対。
ここで配列番号１〜８のＤＮＡはＤＮＡプローブであり、配列番号９、１２および１４のプライマーはフォワードプライマー、配列番号１０、１１、１３および１５のプライマーはリバースプライマーに相当する。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１０のＤＮＡ、または配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対。
ここで配列番号１〜８のＤＮＡはＤＮＡプローブであり、配列番号９、１２および１４のプライマーはフォワードプライマー、配列番号１０、１１、１３および１５のプライマーはリバースプライマーに相当する。
上記ＰＣＲ法は公知の手法により核酸を増幅することができる。例えば、（１）２本鎖ゲノムＤＮＡを約９２〜９５℃、約３０秒〜１分間の反応条件で熱処理することにより１本鎖にする変性工程、該１本鎖ＤＮＡのそれぞれに約５０〜６５℃を約２０秒〜１分間の反応条件で、（２）少なくとも２種類の増幅プライマーを結合させることによりＰＣＲの反応開始点となる２本鎖部分を作製するアニール工程、（３）約７０〜７５℃を約２０秒〜５分間の反応条件でＤＮＡポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の（１）〜（３）の工程を通常の方法により２０〜４０回繰り返すことで核酸を増幅することができる。
上記の方法によって増幅した核酸は、ＤＮＡプローブを固定化した坦体表面に接触させ、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより反応させる。このハイブリダイゼーション反応によって目的のＤＮＡを検知する。検知の方法としては、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などを用いて検出することができ、これらの検出を容易に行うためには、リバースプライマーに標識したものを用いる。
上記検知方法の中で特に好ましいのは、比較的安価で容易に実施できるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法である。具体的には、上記プライマーの３’または５’末端にアビジンを修飾したものを用いて、核酸を増幅する。５’にアビジンを有する増幅された核酸は、ＤＮＡハイブリダイゼーション後、ストレプイトアビジンに接触させることができ、次いでＮＢＴ、ＢＣＩＰと反応させることにより発光させることができる。
したがって、本発明は、配列番号９〜１５の全てのプライマー、配列番号９、１２および１４のフォワードプライマー、または配列番号１０、１１、１３および１５のリバースプライマーに蛍光もしくはＲＩ標識を行う、または上記リバースプライマーの５末端にビオチンを修飾したプライマーを用いることが好ましい。
さらに本発明は、上記したように２箇所好ましくは３箇所同時に検出することができるキットを含む。上記同時検出することができるキットにおいて、エクソン１２の１２３６番目の塩基を含むＤＮＡを増幅するためのリバースプライマーは、配列番号１０および１１のうち、増幅されたＤＮＡの非特異吸着を抑えられる点から、配列番号１１のリバースプライマーを選択することが好ましい。さらに、同時検出においては、エクソン２６の３４３５番目の塩基がチミン（Ｔ）の場合に検出することができるプローブは、配列番号８のDNAが好ましいことを上記に開示した。
したがって、本発明の最も好ましい形態は、少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てを含んでなる請求項１に記載の遺伝子多型検出キットである。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対。
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対。
gttcaggccc ttcaag （配列番号１）
gttcagaccc ttcaag （配列番号２）
tagaaggtgc tgggaa （配列番号３）
agaaggttct gggaag （配列番号４）
agaaggtact gggaag （配列番号５）
aagagatcgt gagggc （配列番号６）
agagattgtg agggc （配列番号８）
actgttgtgc tcttcccaca （配列番号９）
cacttcagtt acccatctcg （配列番号１０）
cctgtgtctg tgaattgcct （配列番号１１）
cccatcattg caatagcagg （配列番号１２）
ccaagaactg gctttgctac （配列番号１３）
ttcagctgct tgatggcaaa （配列番号１４）
aggcagtgac tcgatgaagg （配列番号１５）
gttcagaccc ttcaag （配列番号２）
tagaaggtgc tgggaa （配列番号３）
agaaggttct gggaag （配列番号４）
agaaggtact gggaag （配列番号５）
aagagatcgt gagggc （配列番号６）
agagattgtg agggc （配列番号８）
actgttgtgc tcttcccaca （配列番号９）
cacttcagtt acccatctcg （配列番号１０）
cctgtgtctg tgaattgcct （配列番号１１）
cccatcattg caatagcagg （配列番号１２）
ccaagaactg gctttgctac （配列番号１３）
ttcagctgct tgatggcaaa （配列番号１４）
aggcagtgac tcgatgaagg （配列番号１５）
本発明の遺伝子多型キットを用いて検知された遺伝子多型から、ステロイド剤の副作用が起こる可能性を予想することができる。一般的に、
(a) エクソン１２の１２３６番目のＳＮＰが、ＣＴおよびＴＴ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＣＣ型のヒトはＣＴおよびＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
(b) エクソン２１の２６７７番目のＳＮＰが、GＴ、ＧＡ、ＴＴ、ＴＡおよびＡＡ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、GG型のヒトは他のＳＮＰに比べて副作用が生じやすい。
(c) エクソン２６の３４３５番目のＳＮＰが、ＴＴ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＣＣ型およびＣＴ型のヒトはＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
と言われている。
(a) エクソン１２の１２３６番目のＳＮＰが、ＣＴおよびＴＴ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＣＣ型のヒトはＣＴおよびＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
(b) エクソン２１の２６７７番目のＳＮＰが、GＴ、ＧＡ、ＴＴ、ＴＡおよびＡＡ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、GG型のヒトは他のＳＮＰに比べて副作用が生じやすい。
(c) エクソン２６の３４３５番目のＳＮＰが、ＴＴ型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、ＣＣ型およびＣＴ型のヒトはＴＴ型に比べて副作用が生じやすい。
と言われている。
以下に本発明を参考例および実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１：エクソン１２の１２３６番目のＳＮＰの検出）
配列番号１、および２に示されるＤＮＡプローブ（シグマジェノシスジャパン社提供）の５’末端をターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナル・トランスフェラーゼ（２０ｕｎｉｔ／μｌ）を４μｌ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１０μｌ、配列番号１もしくは２のＤＮＡプローブ（５０ｍＭ）を４μｌ、製品添付のＮＥＢｕｆｆｅｒ４を５μｌ、および製品添付のカコジル酸緩衝液を５μｌ含んだ精製水５０μｌを調製した後、３７℃で４時間反応させ、製品添付の２０＊ＳＳＣ緩衝液５０μｌを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ２ｐｍｏｌ／μｌを得た。
その後、ポリチミン付加された配列番号１および２の核酸プローブは１．０ｐｍｏｌ／μｌとなるように、製品添付の１０＊ＳＳＣ緩衝液で希釈し、ポリエステル膜（４×０．４ｃｍ）上の別々の場所にそれぞれ０．５μＬずつ塗布し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化することで、検出ストリップを作成した。
配列番号１、および２に示されるＤＮＡプローブ（シグマジェノシスジャパン社提供）の５’末端をターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナル・トランスフェラーゼ（２０ｕｎｉｔ／μｌ）を４μｌ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μｌ）を１０μｌ、配列番号１もしくは２のＤＮＡプローブ（５０ｍＭ）を４μｌ、製品添付のＮＥＢｕｆｆｅｒ４を５μｌ、および製品添付のカコジル酸緩衝液を５μｌ含んだ精製水５０μｌを調製した後、３７℃で４時間反応させ、製品添付の２０＊ＳＳＣ緩衝液５０μｌを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ２ｐｍｏｌ／μｌを得た。
その後、ポリチミン付加された配列番号１および２の核酸プローブは１．０ｐｍｏｌ／μｌとなるように、製品添付の１０＊ＳＳＣ緩衝液で希釈し、ポリエステル膜（４×０．４ｃｍ）上の別々の場所にそれぞれ０．５μＬずつ塗布し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化することで、検出ストリップを作成した。
無作為に選んだ健常な日本人１２人から血液を採取し、血球細胞を分画して、フェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出精製した。配列番号９に示された塩基配列を有するフォワードプライマーおよび１０に示された塩基配列を有し、かつ５’末端にビオチンを結合させたリバースプライマー、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いたＰＣＲ法によりＭＤＲ１遺伝子の塩基配列の１２３６番目を含む塩基配列の増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、変性過程を９４℃、３０秒、アニール過程を５５℃、２０秒、鎖伸長過程を７２℃、２０秒とし、この工程を３０サイクルおこない増幅を行った。
増幅したＤＮＡ溶液２０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液（２０μＬ）を加えてよく攪拌し、５分間放置して、増幅したＤＮＡを1本鎖に変性した。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液（１ｍＬ）および上記検出ストリップ１枚を加え、反応温度４５℃のもとで３０分間振とうして反応させた。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を加えて、検出ストリップ上の各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼを発色させた（図１）。また、図１における結果の判定の基準となる模式図を表１に示す。
２：Ｃ型検出部位
３：Ｔ型検出部位
●：発色
図１の結果から試料Ｎｏ．１〜１２は、それぞれ表２に示す遺伝子多型（ＳＮＰ）を有すると判定した。
また、試料Ｎｏ．１〜１２を別途でシーケンサーによるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目の塩基多型を測定した結果は、表２の結果と一致することから、本発明の遺伝子多型検出キットおよび方法は非常に有用であることが示された。
（実施例２：エクソン２１の２６７７番目のＳＮＰの検出）
次に、配列番号３、４および５のＤＮＡプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。無作為に選んだ健常な日本人１２人の血液から、実施例１と同様の方法で、ＳＮＰの検知を行った（図２）。ＰＣＲ法におけるプライマーは、配列番号１２および１３を用いた。図２における結果の判定の基準となる模式図を表３に示す。
次に、配列番号３、４および５のＤＮＡプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。無作為に選んだ健常な日本人１２人の血液から、実施例１と同様の方法で、ＳＮＰの検知を行った（図２）。ＰＣＲ法におけるプライマーは、配列番号１２および１３を用いた。図２における結果の判定の基準となる模式図を表３に示す。
２：Ｇ型検出部位
３：Ａ型検出部位
４：Ｔ型検出部位
●：発色
また、図２の結果から試料Ｎｏ．１〜１０は、それぞれ表５に示すＳＮＰを有すると判定した。
一方、別途でシーケンサーによるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２１の２６７７番目のＳＮＰを測定した結果は、表４の結果と一致した。
（実施例３：エクソン２６の３４３５番目のＳＮＰの検出）
次に、配列番号６および７のＤＮＡプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。無作為に選んだ健常な日本人１０人の血液から、実施例１と同様の方法で、ＳＮＰの検知を行った（図３）。ＰＣＲ法におけるプライマーは、配列番号１４および１５を用いた。図３における結果の判定の基準となる模式図を表５に示す。
次に、配列番号６および７のＤＮＡプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。無作為に選んだ健常な日本人１０人の血液から、実施例１と同様の方法で、ＳＮＰの検知を行った（図３）。ＰＣＲ法におけるプライマーは、配列番号１４および１５を用いた。図３における結果の判定の基準となる模式図を表５に示す。
２：Ｃ型検出部位
３：Ｔ型検出部位
●：発色
また、図２の結果から試料Ｎｏ．１〜１０は、それぞれ表６に示すＳＮＰを有すると判定した。
一方、別途でシーケンサーによるＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６の３４３５番目のＳＮＰを測定した結果は、表６の結果と一致した。
（実施例４：３箇所のＳＮＰの同時検出）
次に、配列番号１〜６および８のＤＮＡプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。無作為に選んだ健常な日本人９人の血液から、３箇所のＳＮＰの同時検知を行った（図４）。ＰＣＲ法におけるプライマーは、配列番号９および１１〜１５の６本、３組を用い、実施例１同様の条件で、３箇所のＰＣＲを同時に行った。検出は上記ＰＣＲ溶液２０μＬを用いた。その結果を図４に示す。また、図４おける結果の判定の基準となる模式図を表７に示す。
次に、配列番号１〜６および８のＤＮＡプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。無作為に選んだ健常な日本人９人の血液から、３箇所のＳＮＰの同時検知を行った（図４）。ＰＣＲ法におけるプライマーは、配列番号９および１１〜１５の６本、３組を用い、実施例１同様の条件で、３箇所のＰＣＲを同時に行った。検出は上記ＰＣＲ溶液２０μＬを用いた。その結果を図４に示す。また、図４おける結果の判定の基準となる模式図を表７に示す。
２：３４３５番目のＣ型検出部位
３：３４３５番目のＴ型検出部位
４：２６７７番目のＧ型検出部位
５：２６７７番目のＴ型検出部位
６：２６７７番目のＡ型検出部位
７：１２３６番目のＣ型検出部位
８：１２３６番目のＴ型検出部位
●：発色
また、図４の結果から試料Ｎｏ．１〜９は、それぞれ表８に示すＳＮＰを有すると判定した。
一方、各ＳＮＰを検知する検出ストリップを用いて、同９検体の各ＳＮＰを、実施例１〜３に従ってそれぞれ検出した。その結果は、表８の結果と一致し、同時検出が可能であることを確認した（図５〜７）。
本発明の遺伝子多型検出キットは、ヒトから採取したゲノムＤＮＡにおけるＭＤＲ１遺伝子のエクソン１２の１２３６番目、エクソン２１の２６７７番目またはエクソン２６の３４３５番目のＳＮＰの検出を簡便に行うことが出来るものであり、ステロイド剤の服用の際に将来副作用が起きる可能性について予測することができる。
Claims (11)
- ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムＤＮＡにおける遺伝子多型（ＳＮＰ）を検出するキットであって、少なくとも下記の（i）、(ii)または（iii）のプローブ群を含んでなる遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群。 - プローブ群が坦体表面上に固定化された検出ストリップを含んでなる請求項１に記載の遺伝子多型検出キット。
- 坦体が、ビニル系ポリマーまたはポリエステルである請求項２に記載の遺伝子多型検出キット。
- 坦体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである請求項２に記載の遺伝子多型検出キット。
- 少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てのプローブ群を含んでなる請求項１に記載の遺伝子多型検出キット：
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群。 - 少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てのプローブ群を含んでなる請求項１に記載の遺伝子多型検出キット：
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群。 - 少なくとも下記の（i）、(ii)または（iii）を含んでなる請求項１に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１０のＤＮＡ、または配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡ、または配列番号６のＤＮＡおよび配列番号８のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対。 - 配列番号９〜１５のＤＮＡ、配列番号９、１２および１４のＤＮＡ、または配列番号１０、１１、１３および１５のＤＮＡに、蛍光物質または放射性同位体を修飾した請求項７に記載の遺伝子多型検出キット。
- 配列番号９〜１５のＤＮＡ、配列番号９、１２および１４のＤＮＡ、または配列番号１０、１１、１３および１５のＤＮＡの５’末端に、ビオチンを修飾した請求項７に記載の遺伝子多型検出キット。
- さらに、ストレプトアビジン、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ ｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を含む請求項９に記載の遺伝子多型検出キット。
- 少なくとも下記の（i）、(ii)および（iii）の全てをを含んでなる請求項７に記載の遺伝子多型検出キット；
（i）配列番号１のＤＮＡおよび配列番号２のＤＮＡからなる第１のプローブ群、ならびに配列番号９のＤＮＡおよび配列番号１１のＤＮＡからなる第１のプライマー対：
（ii）配列番号３のＤＮＡ、配列番号４のＤＮＡおよび配列番号５のＤＮＡからなる第２のプローブ群、ならびに配列番号１２のＤＮＡおよび配列番号１３のＤＮＡからなる第２のプライマー対：
（iii）配列番号６のＤＮＡおよび配列番号７のＤＮＡからなる第３のプローブ群、ならびに配列番号１４のＤＮＡおよび配列番号１５のＤＮＡからなる第３のプライマー対。
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