JP2006158341A - 遺伝子多型検出キット - Google Patents

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JP2006158341A JP2004357457A JP2004357457A JP2006158341A JP 2006158341 A JP2006158341 A JP 2006158341A JP 2004357457 A JP2004357457 A JP 2004357457A JP 2004357457 A JP2004357457 A JP 2004357457A JP 2006158341 A JP2006158341 A JP 2006158341A
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Norinobu Kusaba
宣延 草場
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Abstract

【課題】
ヒトから採取したゲノムDNAにおける多剤耐性(MDR1)遺伝子における遺伝子多型(SNP)をより簡便に検出することが出来るキットの開発が求められている。
【解決手段】
本発明は、ヒトから採取したゲノムDNAにおけるMDR1遺伝子のエクソン12の1236番目、エクソン21の2677番目またはエクソン26の3435番目の遺伝子多型(SNP)の検出を、好ましくは3箇所同時に簡便に検出することが出来るものである。また、検出の結果からステロイド剤の服用の際に将来副作用が起きる可能性について予測することができる遺伝子多型検出キットを提供する。
【選択図】 図1

Description

本発明は、ヒトから採取したゲノムDNAにおける多剤耐性(MDR1)遺伝子のエクソン12の1236番目、エクソン21の2677番目またはエクソン26の3435番目の遺伝子多型(SNP)の検出を簡便に行うことが出来る遺伝子多型検出キットおよび検出方法に関する。
ステロイド剤は、その発見以来、効能の強さゆえに膠原病や皮膚炎など様々な分野で治療薬として使用されている。その反面、骨疾患、糖尿病、白内障および緑内障などの副作用が生じる可能性も高く、服用することを避けられる場合がある。
MDR1遺伝子は有害な物質を細胞外へ輸送する輸送蛋白の一種であるP糖蛋白をコードしている遺伝子であり、その研究が盛んに行われている。このMDR1遺伝子には、ある特定の位置の塩基が個体によって種類が異なることが知られており、遺伝子多型(SNP)と呼ばれている。このSNPが、薬剤の副作用が起こる可能性に影響していると考えられている。
そこで、MDR1遺伝子のSNPを調べることにより、事前に患者のステロイド剤に対する耐性を予測する方法が研究盛んに行われている。
ステロイド剤の耐性に関するMDR1遺伝子のSNPの候補としては、エクソン12の1236番目、エクソン21の2677番目またはエクソン26の3435番目などが挙げられている。例えば、エクソン12の1236番目の塩基は、チミン(T)もしくはシトシン(C)であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、TT、TCおよびCC型の3タイプのSNPが存在し、このSNPがステロイドの副作用に関連していると言われている(非特許文献1、2)。
しかしながら、現在の所はシーケンサーを用いて直接塩基配列を解析するなど、非常に時間と手間のかかる検出方法しか存在しなかった。このことから、MDR1遺伝子のSNPを検出することは、非常に有用であると考えられる。
Tanabe et al., the Journal of pharmacology and experimental therapeutics, 297 (3), 1137 Hoffmeyer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol.97 No.7 3473-3478, March 28 (2000)
したがって、MDR1遺伝子における遺伝子多型をより簡便に検出することが出来るキットおよび検出方法の開発が求められている。
本発明は、
(1) ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムDNAにおける遺伝子多型(SNP)を検出するキットであって、少なくとも下記の(i)、(ii)または(iii)のプローブ群を含んでなる遺伝子多型検出キット;
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群、
(2) プローブ群が坦体表面上に固定化された検出ストリップを含んでなる(1)に記載の遺伝子多型検出キット、
(3) 坦体が、ビニル系ポリマーまたはポリエステルである(2)に記載の遺伝子多型検出キット、
(4) 坦体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである(2)に記載の遺伝子多型検出キット、
(5) 少なくとも下記の(i)、(ii)および(iii)の全てのプローブ群を含んでなる(1)に記載の遺伝子多型検出キット:
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群、
(6) 少なくとも下記の(i)、(ii)および(iii)の全てのプローブ群を含んでなる(1)に記載の遺伝子多型検出キット:
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群、
(7) 少なくとも下記の(i)、(ii)または(iii)を含んでなる(1)に記載の遺伝子多型検出キット;
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群、ならびに配列番号9のDNAおよび配列番号10のDNA、または配列番号9のDNAおよび配列番号11のDNAからなる第1のプライマー対:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群、ならびに配列番号12のDNAおよび配列番号13のDNAからなる第2のプライマー対:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群、ならびに配列番号14のDNAおよび配列番号15のDNAからなる第3のプライマー対。
(8) 配列番号9〜15のDNA、配列番号9、12および14のDNA、または配列番号10、11、13および15のDNAに、蛍光物質または放射性同位体を修飾した(7)に記載の遺伝子多型検出キット、
(9) 配列番号9〜15のDNA、配列番号9、12および14のDNA、または配列番号10、11、13および15のDNAの5'末端に、ビオチンを修飾した(7)に記載の遺伝子多型検出キット、
(10) さらに、ストレプトアビジン、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスファターゼ p−トルイジニル塩(BCIP)を含む(9)に記載の遺伝子多型検出キット、および
(11) 少なくとも下記の(i)、(ii)および(iii)の全てをを含んでなる請求項7に記載の遺伝子多型検出キット;
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群、ならびに配列番号9のDNAおよび配列番号11のDNAからなる第1のプライマー対:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群、ならびに配列番号12のDNAおよび配列番号13のDNAからなる第2のプライマー対:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNAからなる第3のプローブ群、ならびに配列番号14のDNAおよび配列番号15のDNAからなる第3のプライマー対
に関する。
本発明の遺伝子多型検出キットは、ヒトから採取したゲノムDNAにおけるMDR1遺伝子のエクソン12の1236番目、エクソン21の2677番目またはエクソン26の3435番目のSNPの検出を簡便に行うことが出来るものであり、好ましくは上記3箇所のSNPを同時検出することができるものである。そして、この結果よりステロイド剤の服用の際に将来副作用が起きる可能性について予測することができる。
本発明は、ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムDNAにおけるSNPを検出するキットである。本発明における生体試料とは、血液、唾液または毛髪などが挙げられ、好ましくは、血球細胞、表皮細胞および粘膜細胞などの各種ヒト細胞である。これらの生体試料からDNAを抽出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えばフェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法等が公知である。
本発明の遺伝子多型検出キットは、少なくとも下記の(i)、(ii)または(iii)からなるプローブ群を含んでなる。
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群。
上記の(i)、(ii)および(iii)における配列番号1〜8のDNAはMDR1遺伝子のSNPを検出するためプローブである。これらのDNAは、市販されているDNA/RNA合成機などによって合成することができ、その合成方法は限定されるものではない。
gttcaggccc ttcaag (配列番号1)
gttcagaccc ttcaag (配列番号2)
tagaaggtgc tgggaa (配列番号3)
agaaggttct gggaag (配列番号4)
agaaggtact gggaag (配列番号5)
aagagatcgt gagggc (配列番号6)
aagagattgt gagggc (配列番号7)
agagattgtg agggc (配列番号8)
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群は、エクソン12の1236番目のSNPを検出することができる。エクソン12の1236番目の塩基は、チミン(T)もしくはシトシン(C)であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、TT型、TC型およびCC型の3タイプのSNPが存在する。配列番号1のDNAプローブは、エクソン12の1236番目の塩基がシトシン(C)の場合に検出することができ、配列番号2のDNAプローブは、エクソン12の1236番目の塩基がチミン(T)の場合に検出することができる。したがって、配列番号1のDNAプローブのみで検出される場合はCC型、配列番号2のDNAプローブのみで検出される場合はTT型、配列番号1および2のDNAプローブの両方で検出される場合はCT型であると容易に検知することができる。
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群は、エクソン21の2677番目のSNPを検出することができる。エクソン21の2677番目の塩基は、グアニン(G)、アデニン(A)もしくはチミン(T)であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、GG型、AA型、TT型、GA型、GT型およびAT型の6タイプのSNPが存在する。配列番号3のDNAプローブは、エクソン21の2677番目の塩基がグアニン(G)の場合に検出することができ、配列番号4のDNAプローブは、エクソン21の2677番目の塩基がアデニン(A)の場合に検出することができ、配列番号5のDNAプローブは、エクソン21の2677番目の塩基がチミン(T)の場合に検出することができる。したがって、配列番号3のDNAプローブのみで検出される場合はGG型、配列番号4のDNAプローブのみで検出される場合はAA型、配列番号5のDNAプローブのみで検出される場合はTT型、配列番号3および4のDNAプローブで検出される場合はGA型、配列番号3および5のDNAプローブで検出される場合はGT型、配列番号4および5のDNAプローブで検出される場合はAT型であると容易に検知することができる。
配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群は、エクソン26の3435番目のSNPを検出することができる。エクソン26の3435番目の塩基は、チミン(T)もしくはシトシン(C)であることが知られている。ヒトの染色体は二量体であることから、TT型、TC型およびCC型の3タイプのSNPが存在する。配列番号6のDNAプローブは、エクソン26の3435番目の塩基がチミン(T)の場合に検出することができ、配列番号7および8のDNAプローブは、エクソン26の3435番目の塩基がシトシン(C)の場合に検出することができる。上記配列番号7および8は、どちらかを選択することができる。したがって、配列番号6のDNAプローブのみで検出される場合はCC型、配列番号7または8のDNAプローブのみで検出される場合はTT型、配列番号6および7のDNAプローブ、または配列番号6および8のDNAプローブで検出される場合はCT型であると容易に検知することができる。
本発明は、上記のDNAプローブ群を、坦体表面上に物理的または化学的に固定されることで検出ストリップを含む。
坦体は、ビニル系ポリマーまたはポリエステル、より詳しくは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートもしくはニトロセルロースなどの有機材料、ガラスもしくはシリカなどの無機材料、金もしくは銀などの金属材料などが挙げられ、特に限定されるものではないが、成型加工性が容易である有機材料が好ましく、さらに好ましくは、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類である。これらの坦体は、発色法での検知において、その発色を見やすくするために白色であることが好ましい。
これらの坦体表面にDNAプローブを物理的に固定化する方法として、例えば、ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を坦体表面に被覆することで、ポリアニオンであるDNAプローブとの静電相互作用により、固定化の効率を上げることができる、また、プローブDNAに無関係な塩基配列(ポリチミン鎖など)を付加し、DNAの分子量を増大させることにより固定化の効率をあげることもできる。さらに、担体表面がガラスなどの場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤など、担体表面が金などの場合、2−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールもしくはジスルフィド化合物などで坦体表面を処理することで、ポリアニオンであるDNAプローブとの静電相互作用により、固定化の効率が良くなることが知られている。
一方で、プローブDNAに官能基を導入して化学的に固定化する方法としては、例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料の場合には、核酸検出用プローブの末端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基を修飾し、その溶液に24〜48時間浸漬し、取り出した後、洗浄することによることもできる。または、ガラス、シリコンなどの無機材料坦体上に、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することで、坦体の表面をアミノ化し、末端にカルボン酸を導入したプローブDNAとアミノカップリング反応させることで、固定化する方法などがある。さらに、担体の材料が金、銀などの金属材料の場合、核酸検出用プローブの末端にチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基を修飾し、その溶液に24〜48時間浸漬し、取り出した後、洗浄し、固定化することができる。
また、合成されたDNAプローブを固定するのでなく、リソグラフィー技術を利用して、望む配列を固定表面上で直接DNAプローブを合成する方法も知られており、本発明においてもこの方法も含む。
本発明の遺伝子多型検出キットは、エクソン12の1236番目、エクソン21の2677番目またはエクソン26の3435番目のSNPのいずれかを検出するものであるが、好ましくは上記から選ばれる2箇所のSNPを同時に検出するキットであり、さらに好ましくは上記3箇所のSNPを同時に検出するキットである。したがって、本発明の遺伝子多型検出キットのさらに好ましい形態は、少なくとも下記の(i)、(ii)および(iii)の全てのプローブ群を含むものである。
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群。
gttcaggccc ttcaag (配列番号1)
gttcagaccc ttcaag (配列番号2)
tagaaggtgc tgggaa (配列番号3)
agaaggttct gggaag (配列番号4)
agaaggtact gggaag (配列番号5)
aagagatcgt gagggc (配列番号6)
aagagattgt gagggc (配列番号7)
agagattgtg agggc (配列番号8)
また、2箇所以上の同時検出の場合、エクソン26の3435番目の塩基がチミン(T)の場合に検出することができるプローブは、配列番号7および8のDNAプローブのうち、非特異吸着を抑えることができる配列番号8のDNAプローブを選択することが好ましい。したがって、本発明の遺伝子多型検出キットの特に好ましい形態は、少なくとも下記の(i)、(ii)および(iii)の全てのプローブ群を含むものである。
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群。
gttcaggccc ttcaag (配列番号1)
gttcagaccc ttcaag (配列番号2)
tagaaggtgc tgggaa (配列番号3)
agaaggttct gggaag (配列番号4)
agaaggtact gggaag (配列番号5)
aagagatcgt gagggc (配列番号6)
agagattgtg agggc (配列番号8)
上記核酸の検知に用いるためには予め検出すべき遺伝子多型の箇所を含むDNAを増幅する必要がある。核酸の増幅は、ヒトの生体試料から抽出されたDNAを公知の方法、例えばPCR法、NASBA法、LAMP法またはICAN法等により行うことができ、好適にはPCR法により行うことができる。
したがって、本発明の遺伝多型検出キットは、PCR法に用いるプライマーを含むことは好ましい。該プライマーは、エクソン12の1236番目、エクソン21の2677番目またはエクソン26の3435番目の塩基を含むDNAを増幅することができれば特に限定されるものではないが、増幅すべき核酸の塩基数が100〜400塩基対、好ましくは150〜300塩基対である。
上記プライマーとしてより好ましいのは、エクソン12の1236番目を含むDNAの増幅には配列番号9および10のDNA、または配列番号9および11のDNAからなる第1のプライマー対、エクソン21の2677番目を含むDNAの増幅には配列番号12および13のDNAからなる第2のプライマー対、エクソン26の3435番目を含むDNAの増幅には配列番号14および15のDNAからなる第3のプライマー対である。
actgttgtgc tcttcccaca (配列番号9)
cacttcagtt acccatctcg (配列番号10)
cctgtgtctg tgaattgcct (配列番号11)
cccatcattg caatagcagg (配列番号12)
ccaagaactg gctttgctac (配列番号13)
ttcagctgct tgatggcaaa (配列番号14)
aggcagtgac tcgatgaagg (配列番号15)
したがって、本発明における遺伝子多型検出キットは少なくとも下記の(i)、(ii)または(iii)を含む。
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群、ならびに配列番号9のDNAおよび配列番号10のDNA、または配列番号9のDNAおよび配列番号11のDNAからなる第1のプライマー対:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群、ならびに配列番号12のDNAおよび配列番号13のDNAからなる第2のプライマー対:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群、ならびに配列番号14のDNAおよび配列番号15のDNAからなる第3のプライマー対。
ここで配列番号1〜8のDNAはDNAプローブであり、配列番号9、12および14のプライマーはフォワードプライマー、配列番号10、11、13および15のプライマーはリバースプライマーに相当する。
上記PCR法は公知の手法により核酸を増幅することができる。例えば、(1)2本鎖ゲノムDNAを約92〜95℃、約30秒〜1分間の反応条件で熱処理することにより1本鎖にする変性工程、該1本鎖DNAのそれぞれに約50〜65℃を約20秒〜1分間の反応条件で、(2)少なくとも2種類の増幅プライマーを結合させることによりPCRの反応開始点となる2本鎖部分を作製するアニール工程、(3)約70〜75℃を約20秒〜5分間の反応条件でDNAポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の(1)〜(3)の工程を通常の方法により20〜40回繰り返すことで核酸を増幅することができる。
上記の方法によって増幅した核酸は、DNAプローブを固定化した坦体表面に接触させ、DNAハイブリダイゼーションにより反応させる。このハイブリダイゼーション反応によって目的のDNAを検知する。検知の方法としては、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などを用いて検出することができ、これらの検出を容易に行うためには、リバースプライマーに標識したものを用いる。
上記検知方法の中で特に好ましいのは、比較的安価で容易に実施できるニトロブルーテトラゾリウム(NBT)/5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスファターゼ p−トルイジニル塩(BCIP)発色法である。具体的には、上記プライマーの3’または5’末端にアビジンを修飾したものを用いて、核酸を増幅する。5’にアビジンを有する増幅された核酸は、DNAハイブリダイゼーション後、ストレプイトアビジンに接触させることができ、次いでNBT、BCIPと反応させることにより発光させることができる。
したがって、本発明は、配列番号9〜15の全てのプライマー、配列番号9、12および14のフォワードプライマー、または配列番号10、11、13および15のリバースプライマーに蛍光もしくはRI標識を行う、または上記リバースプライマーの5末端にビオチンを修飾したプライマーを用いることが好ましい。
さらに本発明は、上記したように2箇所好ましくは3箇所同時に検出することができるキットを含む。上記同時検出することができるキットにおいて、エクソン12の1236番目の塩基を含むDNAを増幅するためのリバースプライマーは、配列番号10および11のうち、増幅されたDNAの非特異吸着を抑えられる点から、配列番号11のリバースプライマーを選択することが好ましい。さらに、同時検出においては、エクソン26の3435番目の塩基がチミン(T)の場合に検出することができるプローブは、配列番号8のDNAが好ましいことを上記に開示した。
したがって、本発明の最も好ましい形態は、少なくとも下記の(i)、(ii)および(iii)の全てを含んでなる請求項1に記載の遺伝子多型検出キットである。
(i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群、ならびに配列番号9のDNAおよび配列番号11のDNAからなる第1のプライマー対:
(ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群、ならびに配列番号12のDNAおよび配列番号13のDNAからなる第2のプライマー対:
(iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNAからなる第3のプローブ群、ならびに配列番号14のDNAおよび配列番号15のDNAからなる第3のプライマー対。
gttcaggccc ttcaag (配列番号1)
gttcagaccc ttcaag (配列番号2)
tagaaggtgc tgggaa (配列番号3)
agaaggttct gggaag (配列番号4)
agaaggtact gggaag (配列番号5)
aagagatcgt gagggc (配列番号6)
agagattgtg agggc (配列番号8)
actgttgtgc tcttcccaca (配列番号9)
cacttcagtt acccatctcg (配列番号10)
cctgtgtctg tgaattgcct (配列番号11)
cccatcattg caatagcagg (配列番号12)
ccaagaactg gctttgctac (配列番号13)
ttcagctgct tgatggcaaa (配列番号14)
aggcagtgac tcgatgaagg (配列番号15)
本発明の遺伝子多型キットを用いて検知された遺伝子多型から、ステロイド剤の副作用が起こる可能性を予想することができる。一般的に、
(a) エクソン12の1236番目のSNPが、CTおよびTT型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、CC型のヒトはCTおよびTT型に比べて副作用が生じやすい。
(b) エクソン21の2677番目のSNPが、GT、GA、TT、TAおよびAA型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、GG型のヒトは他のSNPに比べて副作用が生じやすい。
(c) エクソン26の3435番目のSNPが、TT型のヒトはステロイド剤の副作用が生じにくく、CC型およびCT型のヒトはTT型に比べて副作用が生じやすい。
と言われている。
以下に本発明を参考例および実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
(実施例1:エクソン12の1236番目のSNPの検出)
配列番号1、および2に示されるDNAプローブ(シグマジェノシスジャパン社提供)の5’末端をターミナルトランスフェラーゼ(New England Biolab社製)を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナル・トランスフェラーゼ(20unit/μl)を4μl、チミジン三リン酸(10pmol/μl)を10μl、配列番号1もしくは2のDNAプローブ(50mM)を4μl、製品添付のNEBuffer4を5μl、および製品添付のカコジル酸緩衝液を5μl含んだ精製水50μlを調製した後、37℃で4時間反応させ、製品添付の20*SSC緩衝液50μlを加えることで、ポリチミン付加された核酸プローブ2pmol/μlを得た。
その後、ポリチミン付加された配列番号1および2の核酸プローブは1.0pmol/μlとなるように、製品添付の10*SSC緩衝液で希釈し、ポリエステル膜(4×0.4cm)上の別々の場所にそれぞれ0.5μLずつ塗布し、312nmの紫外線を2分間照射して固定化することで、検出ストリップを作成した。
無作為に選んだ健常な日本人12人から血液を採取し、血球細胞を分画して、フェノール抽出法によりゲノムDNAを抽出精製した。配列番号9に示された塩基配列を有するフォワードプライマーおよび10に示された塩基配列を有し、かつ5’末端にビオチンを結合させたリバースプライマー、およびTaq DNAポリメラーゼ(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)を用いたPCR法によりMDR1遺伝子の塩基配列の1236番目を含む塩基配列の増幅を行った。PCRの反応条件は、変性過程を94℃、30秒、アニール過程を55℃、20秒、鎖伸長過程を72℃、20秒とし、この工程を30サイクルおこない増幅を行った。
増幅したDNA溶液20μLに、水酸化ナトリウム(5M)、エチレンジアミン四酢酸(0.05M)の溶液(20μL)を加えてよく攪拌し、5分間放置して、増幅したDNAを1本鎖に変性した。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム(0.01w/v%)、塩化ナトリウム(1.8w/v%)、クエン酸ナトリウム(1.0w/v%)の溶液(1mL)および上記検出ストリップ1枚を加え、反応温度45℃のもとで30分間振とうして反応させた。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにニトロブルーテトラゾリウム(NBT)および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスファターゼ p−トルイジニル塩(BCIP)を加えて、検出ストリップ上の各プローブと結合した試料に結合したアルカリホスファターゼを発色させた(図1)。また、図1における結果の判定の基準となる模式図を表1に示す。
Figure 2006158341
1:発色の確認マーカー
2:C型検出部位
3:T型検出部位
●:発色
図1の結果から試料No.1〜12は、それぞれ表2に示す遺伝子多型(SNP)を有すると判定した。
Figure 2006158341
また、試料No.1〜12を別途でシーケンサーによるMDR1遺伝子のエクソン26の3435番目の塩基多型を測定した結果は、表2の結果と一致することから、本発明の遺伝子多型検出キットおよび方法は非常に有用であることが示された。
(実施例2:エクソン21の2677番目のSNPの検出)
次に、配列番号3、4および5のDNAプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。無作為に選んだ健常な日本人12人の血液から、実施例1と同様の方法で、SNPの検知を行った(図2)。PCR法におけるプライマーは、配列番号12および13を用いた。図2における結果の判定の基準となる模式図を表3に示す。
Figure 2006158341
1:発色の確認マーカー
2:G型検出部位
3:A型検出部位
4:T型検出部位
●:発色
また、図2の結果から試料No.1〜10は、それぞれ表5に示すSNPを有すると判定した。
Figure 2006158341
一方、別途でシーケンサーによるMDR1遺伝子のエクソン21の2677番目のSNPを測定した結果は、表4の結果と一致した。
(実施例3:エクソン26の3435番目のSNPの検出)
次に、配列番号6および7のDNAプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。無作為に選んだ健常な日本人10人の血液から、実施例1と同様の方法で、SNPの検知を行った(図3)。PCR法におけるプライマーは、配列番号14および15を用いた。図3における結果の判定の基準となる模式図を表5に示す。
Figure 2006158341
1:発色の確認マーカー
2:C型検出部位
3:T型検出部位
●:発色
また、図2の結果から試料No.1〜10は、それぞれ表6に示すSNPを有すると判定した。
Figure 2006158341
一方、別途でシーケンサーによるMDR1遺伝子のエクソン26の3435番目のSNPを測定した結果は、表6の結果と一致した。
(実施例4:3箇所のSNPの同時検出)
次に、配列番号1〜6および8のDNAプローブを固定化した検出ストリップ上を作成した。無作為に選んだ健常な日本人9人の血液から、3箇所のSNPの同時検知を行った(図4)。PCR法におけるプライマーは、配列番号9および11〜15の6本、3組を用い、実施例1同様の条件で、3箇所のPCRを同時に行った。検出は上記PCR溶液20μLを用いた。その結果を図4に示す。また、図4おける結果の判定の基準となる模式図を表7に示す。
Figure 2006158341
1:発色の確認マーカー
2:3435番目のC型検出部位
3:3435番目のT型検出部位
4:2677番目のG型検出部位
5:2677番目のT型検出部位
6:2677番目のA型検出部位
7:1236番目のC型検出部位
8:1236番目のT型検出部位
●:発色
また、図4の結果から試料No.1〜9は、それぞれ表8に示すSNPを有すると判定した。
Figure 2006158341
一方、各SNPを検知する検出ストリップを用いて、同9検体の各SNPを、実施例1〜3に従ってそれぞれ検出した。その結果は、表8の結果と一致し、同時検出が可能であることを確認した(図5〜7)。
本発明の遺伝子多型検出キットは、ヒトから採取したゲノムDNAにおけるMDR1遺伝子のエクソン12の1236番目、エクソン21の2677番目またはエクソン26の3435番目のSNPの検出を簡便に行うことが出来るものであり、ステロイド剤の服用の際に将来副作用が起きる可能性について予測することができる。
MDR1遺伝子のエクソン12の1236番目のSNPの検出の結果である。 MDR1遺伝子のエクソン21の2677番目のSNPの検出の結果である。 MDR1遺伝子のエクソン26の3435番目のSNPの検出の結果である。 上記3種類のSNPの同時検出の結果である。 図4におけるMDR1遺伝子のエクソン12の1236番目のSNPの単独検出の結果である。 図4におけるMDR1遺伝子のエクソン21の2677番目のSNPの単独検出の結果である。 図4におけるMDR1遺伝子のエクソン26の3435番目のSNPの単独検出の結果である。

Claims (11)

  1. ヒトから採取した生体試料中に含むゲノムDNAにおける遺伝子多型(SNP)を検出するキットであって、少なくとも下記の(i)、(ii)または(iii)のプローブ群を含んでなる遺伝子多型検出キット;
    (i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群:
    (ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群:
    (iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群。
  2. プローブ群が坦体表面上に固定化された検出ストリップを含んでなる請求項1に記載の遺伝子多型検出キット。
  3. 坦体が、ビニル系ポリマーまたはポリエステルである請求項2に記載の遺伝子多型検出キット。
  4. 坦体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリエチレンテレフタレートである請求項2に記載の遺伝子多型検出キット。
  5. 少なくとも下記の(i)、(ii)および(iii)の全てのプローブ群を含んでなる請求項1に記載の遺伝子多型検出キット:
    (i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群:
    (ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群:
    (iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群。
  6. 少なくとも下記の(i)、(ii)および(iii)の全てのプローブ群を含んでなる請求項1に記載の遺伝子多型検出キット:
    (i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群:
    (ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群:
    (iii)配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群。
  7. 少なくとも下記の(i)、(ii)または(iii)を含んでなる請求項1に記載の遺伝子多型検出キット;
    (i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群、ならびに配列番号9のDNAおよび配列番号10のDNA、または配列番号9のDNAおよび配列番号11のDNAからなる第1のプライマー対:
    (ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群、ならびに配列番号12のDNAおよび配列番号13のDNAからなる第2のプライマー対:
    (iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNA、または配列番号6のDNAおよび配列番号8のDNAからなる第3のプローブ群、ならびに配列番号14のDNAおよび配列番号15のDNAからなる第3のプライマー対。
  8. 配列番号9〜15のDNA、配列番号9、12および14のDNA、または配列番号10、11、13および15のDNAに、蛍光物質または放射性同位体を修飾した請求項7に記載の遺伝子多型検出キット。
  9. 配列番号9〜15のDNA、配列番号9、12および14のDNA、または配列番号10、11、13および15のDNAの5’末端に、ビオチンを修飾した請求項7に記載の遺伝子多型検出キット。
  10. さらに、ストレプトアビジン、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスファターゼ p−トルイジニル塩(BCIP)を含む請求項9に記載の遺伝子多型検出キット。
  11. 少なくとも下記の(i)、(ii)および(iii)の全てをを含んでなる請求項7に記載の遺伝子多型検出キット;
    (i)配列番号1のDNAおよび配列番号2のDNAからなる第1のプローブ群、ならびに配列番号9のDNAおよび配列番号11のDNAからなる第1のプライマー対:
    (ii)配列番号3のDNA、配列番号4のDNAおよび配列番号5のDNAからなる第2のプローブ群、ならびに配列番号12のDNAおよび配列番号13のDNAからなる第2のプライマー対:
    (iii)配列番号6のDNAおよび配列番号7のDNAからなる第3のプローブ群、ならびに配列番号14のDNAおよび配列番号15のDNAからなる第3のプライマー対。
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CN113584160A (zh) * 2021-06-15 2021-11-02 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种昂司丹琼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法和应用

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