JP2001029088A - ビタミンｄ受容体遺伝子、アポリポタンパクｅ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型同時検出用試薬および該遺伝子多型同時検出法 - Google Patents
ビタミンｄ受容体遺伝子、アポリポタンパクｅ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型同時検出用試薬および該遺伝子多型同時検出法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ビタミンＤ受容体遺伝子、アポリポタンパクＥ
遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子を同時に増幅し
て検出し、ゲノム遺伝子の遺伝子多型を知り、その組み
合わせから骨粗鬆症薬剤の感受性を予測する方法を提供
することにある。 【解決手段】ビタミンＤ受容体遺伝子、アポリポタンパ
クＥ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子に対して、
それぞれの遺伝子に特異的な増幅プライマーおよび検出
プローブを含む該遺伝子多型同時検出用試薬、およびこ
れらの遺伝子の同時検出方法、ならびに該遺伝子多型よ
り骨疾患治療薬の選択方法に関する。
遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子を同時に増幅し
て検出し、ゲノム遺伝子の遺伝子多型を知り、その組み
合わせから骨粗鬆症薬剤の感受性を予測する方法を提供
することにある。 【解決手段】ビタミンＤ受容体遺伝子、アポリポタンパ
クＥ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子に対して、
それぞれの遺伝子に特異的な増幅プライマーおよび検出
プローブを含む該遺伝子多型同時検出用試薬、およびこ
れらの遺伝子の同時検出方法、ならびに該遺伝子多型よ
り骨疾患治療薬の選択方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はヒト検体中のビタミ
ンＤ受容体（以下、ＶＤＲと略することがある）遺伝
子、アポリポタンパクＥ（以下、ＡｐｏＥと略すること
がある）遺伝子およびエストロゲン受容体（以下、ＥＲ
と略することがある）遺伝子の多型を同時に増幅および
検出する試薬および該遺伝子多型を同時に検出する方法
に関する。さらに該遺伝子多型による骨疾患治療薬の選
択方法に関する。
ンＤ受容体（以下、ＶＤＲと略することがある）遺伝
子、アポリポタンパクＥ（以下、ＡｐｏＥと略すること
がある）遺伝子およびエストロゲン受容体（以下、ＥＲ
と略することがある）遺伝子の多型を同時に増幅および
検出する試薬および該遺伝子多型を同時に検出する方法
に関する。さらに該遺伝子多型による骨疾患治療薬の選
択方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、骨粗鬆症の治療薬としては、
ビタミンＤ、ビタミンＫ、エストロゲンなどの治療薬が
広く用いられている。これらの薬剤は単剤投与が原則と
されているが、現在のところ、どの治療薬がもっとも効
果的であるかを調べる方法は、実際に数年間、１つの薬
剤の投与を行って、その結果を見てから判断するという
非効率的な方法でしかなかった。
ビタミンＤ、ビタミンＫ、エストロゲンなどの治療薬が
広く用いられている。これらの薬剤は単剤投与が原則と
されているが、現在のところ、どの治療薬がもっとも効
果的であるかを調べる方法は、実際に数年間、１つの薬
剤の投与を行って、その結果を見てから判断するという
非効率的な方法でしかなかった。
【０００３】近年の遺伝子研究から、ビタミンＤ、ビタ
ミンＫ、エストロゲンに関係するＶＤＲ遺伝子、Ａｐｏ
Ｅ遺伝子、ＥＲ遺伝子が、これらの薬剤の治療効果と関
係あることが発表されている（1997年骨代謝学会要旨集
第52頁、白木正孝ら）。すなわち、ＶＤＲgenotypeのＡ
ＡＢＢはａａｂｂに比べ、ビタミンＤ３に対する反応が
有意に低く、またＥＲgenotypeのＰｐＸｘは他の群に比
べ、エストロゲンに対する反応が有意に高く、さらに、
ＡｐｏＥ４（＋）群はＡｐｏＥ４（−）群に比べて、ビ
タミンＫ２の反応が有意に低かったと記載される。ま
た、ビタミンＤ結合タンパク（ＤＢＰ）の多型につい
て、それと薬剤に対する反応性、治療効果とを結びつけ
ることは、特開平8-201373号公報から公知であり、ビタ
ミンＤ結合タンパク遺伝子型のＧＣ２−２をビタミン類
に対して高い感受性と分類すると記載される。しかし、
１つの遺伝子多型から１つの薬剤の感受性が予測されて
も、複数の薬剤から感受性の高いものを予測あるいは選
択することについては何ら記載されていない。
ミンＫ、エストロゲンに関係するＶＤＲ遺伝子、Ａｐｏ
Ｅ遺伝子、ＥＲ遺伝子が、これらの薬剤の治療効果と関
係あることが発表されている（1997年骨代謝学会要旨集
第52頁、白木正孝ら）。すなわち、ＶＤＲgenotypeのＡ
ＡＢＢはａａｂｂに比べ、ビタミンＤ３に対する反応が
有意に低く、またＥＲgenotypeのＰｐＸｘは他の群に比
べ、エストロゲンに対する反応が有意に高く、さらに、
ＡｐｏＥ４（＋）群はＡｐｏＥ４（−）群に比べて、ビ
タミンＫ２の反応が有意に低かったと記載される。ま
た、ビタミンＤ結合タンパク（ＤＢＰ）の多型につい
て、それと薬剤に対する反応性、治療効果とを結びつけ
ることは、特開平8-201373号公報から公知であり、ビタ
ミンＤ結合タンパク遺伝子型のＧＣ２−２をビタミン類
に対して高い感受性と分類すると記載される。しかし、
１つの遺伝子多型から１つの薬剤の感受性が予測されて
も、複数の薬剤から感受性の高いものを予測あるいは選
択することについては何ら記載されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとしている課題】これらの３種のタ
ンパク（ＶＤＲ、ＡｐｏＥ、ＥＲ）の遺伝子多型が、そ
れぞれの薬剤（ビタミンＤ３、ビタミンＫ２、エストロ
ゲン）に対する感受性を有する、あるいは有さないこと
が知られていても、ビタミンＤ３に対して高感受性を有
するＶＤＲ遺伝子多型およびビタミンＫ２に対して有意
に高い反応性を有するＡｐｏＥ４遺伝子多型の双方を有
するヒト検体において、ビタミンＤ３およびビタミンＫ
２のいずれが、優先的に感受性が高いかを予測すること
は困難であった。これらの遺伝子多型の組み合わせか
ら、異なる薬剤のいずれがより感受性が高いかを知るこ
とは、実際に、ヒト検体に投与してみて、数年が経過し
てからでないとその結果が判明しないという問題があっ
た。そこで、本発明の目的は、各遺伝子の遺伝子多型を
知り、その組み合わせから骨粗鬆症薬剤の感受性を予測
する方法を提供することにある。しかしながら、これら
の遺伝子を別個に検出することは、その作業が複雑化
し、手間や時間がかかるという問題点が存在する。
ンパク（ＶＤＲ、ＡｐｏＥ、ＥＲ）の遺伝子多型が、そ
れぞれの薬剤（ビタミンＤ３、ビタミンＫ２、エストロ
ゲン）に対する感受性を有する、あるいは有さないこと
が知られていても、ビタミンＤ３に対して高感受性を有
するＶＤＲ遺伝子多型およびビタミンＫ２に対して有意
に高い反応性を有するＡｐｏＥ４遺伝子多型の双方を有
するヒト検体において、ビタミンＤ３およびビタミンＫ
２のいずれが、優先的に感受性が高いかを予測すること
は困難であった。これらの遺伝子多型の組み合わせか
ら、異なる薬剤のいずれがより感受性が高いかを知るこ
とは、実際に、ヒト検体に投与してみて、数年が経過し
てからでないとその結果が判明しないという問題があっ
た。そこで、本発明の目的は、各遺伝子の遺伝子多型を
知り、その組み合わせから骨粗鬆症薬剤の感受性を予測
する方法を提供することにある。しかしながら、これら
の遺伝子を別個に検出することは、その作業が複雑化
し、手間や時間がかかるという問題点が存在する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＶＤＲ、
ＡｐｏＥおよびＥＲの３つの遺伝子を同時に増幅して検
出することにより、その組み合わせから、骨粗鬆症の治
療薬を選択するに当たり、各遺伝子をＰＣＲで増幅する
ためのプライマー対、および遺伝子多型をハイブリダイ
ゼーション法で検出するための検出プローブについて、
種々検討し、これらのプライマー対およびプローブの間
で、なるべく近い値の融点（以下、Ｔｍ）となるように
塩基配列を設計することにより、３遺伝子について同時
に増幅、検出できる試薬を作成することを見いだし、本
発明に到達した。
ＡｐｏＥおよびＥＲの３つの遺伝子を同時に増幅して検
出することにより、その組み合わせから、骨粗鬆症の治
療薬を選択するに当たり、各遺伝子をＰＣＲで増幅する
ためのプライマー対、および遺伝子多型をハイブリダイ
ゼーション法で検出するための検出プローブについて、
種々検討し、これらのプライマー対およびプローブの間
で、なるべく近い値の融点（以下、Ｔｍ）となるように
塩基配列を設計することにより、３遺伝子について同時
に増幅、検出できる試薬を作成することを見いだし、本
発明に到達した。
【０００６】すなわち、本発明はビタミンＤ受容体（以
下、ＶＤＲ）遺伝子、アポリポタンパクＥ（以下、Ａｐ
ｏＥ）遺伝子およびエストロゲン受容体（以下、ＥＲ）
遺伝子のそれぞれの遺伝子に特異的な増幅プライマー
対、およびＶＤＲ遺伝子多型、ＡｐｏＥ遺伝子多型およ
びＥＲ遺伝子多型をそれぞれ検出するための検出プロー
ブを含むことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ
遺伝子の遺伝子多型同時検出試薬である。
下、ＶＤＲ）遺伝子、アポリポタンパクＥ（以下、Ａｐ
ｏＥ）遺伝子およびエストロゲン受容体（以下、ＥＲ）
遺伝子のそれぞれの遺伝子に特異的な増幅プライマー
対、およびＶＤＲ遺伝子多型、ＡｐｏＥ遺伝子多型およ
びＥＲ遺伝子多型をそれぞれ検出するための検出プロー
ブを含むことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ
遺伝子の遺伝子多型同時検出試薬である。
【０００７】また、本発明は下記ＶＤＲ遺伝子に特異的
な増幅プライマー対(1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特
異的な増幅プライマー対(3)および(4)、およびＥＲ遺伝
子に特異的な増幅プライマー対(5)および(6)を含むこと
を特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子を増幅
する遺伝子増幅用試薬である。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３） cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） cctgcaccag aatatgtacc 20 (6) （配列番号６）
な増幅プライマー対(1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特
異的な増幅プライマー対(3)および(4)、およびＥＲ遺伝
子に特異的な増幅プライマー対(5)および(6)を含むこと
を特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子を増幅
する遺伝子増幅用試薬である。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３） cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） cctgcaccag aatatgtacc 20 (6) （配列番号６）
【０００８】また、本発明は下記ＶＤＲ遺伝子に特異的
な増幅プライマー対(1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特
異的な増幅プライマー対(13)および(14)、およびＥＲ遺
伝子に特異的な増幅プライマー対(5)および(15)を含む
ことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子を
増幅する遺伝子増幅用試薬である。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcc acatggagga 20 (13) （配列番号１３） cccggcctgg tacactgcc 20 (14) （配列番号１４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） cctgcaccag aatatgttac c 21 (15) （配列番号１５）
な増幅プライマー対(1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特
異的な増幅プライマー対(13)および(14)、およびＥＲ遺
伝子に特異的な増幅プライマー対(5)および(15)を含む
ことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子を
増幅する遺伝子増幅用試薬である。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcc acatggagga 20 (13) （配列番号１３） cccggcctgg tacactgcc 20 (14) （配列番号１４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） cctgcaccag aatatgttac c 21 (15) （配列番号１５）
【０００９】また、本発明はＶＤＲ遺伝子多型を検出す
るための検出プローブ(7)および(8)、およびＡｐｏＥ遺
伝子多型を検出するためのプローブ(9)および(10)、お
よびＥＲ遺伝子多型を検出するためのプローブ(11)およ
び(12)を含むことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよび
ＥＲ遺伝子多型を測定することのできる遺伝子多型同時
検出用試薬である。 ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: gtgtggtcta gagttg 16 (11) （配列番号１１） gtgtggtctg gagttg 16 (12) （配列番号１２）
るための検出プローブ(7)および(8)、およびＡｐｏＥ遺
伝子多型を検出するためのプローブ(9)および(10)、お
よびＥＲ遺伝子多型を検出するためのプローブ(11)およ
び(12)を含むことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよび
ＥＲ遺伝子多型を測定することのできる遺伝子多型同時
検出用試薬である。 ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: gtgtggtcta gagttg 16 (11) （配列番号１１） gtgtggtctg gagttg 16 (12) （配列番号１２）
【００１０】また、本発明はＶＤＲ遺伝子多型を検出す
るための検出プローブ(7)および(8)、およびＡｐｏＥ遺
伝子多型を検出するためのプローブ(9)および(10)、お
よびＥＲ遺伝子多型を検出するためのプローブ(16)およ
び(17)を含むことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよび
ＥＲ遺伝子多型を測定することのできる遺伝子多型同時
検出用試薬である。 ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６） gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７）
るための検出プローブ(7)および(8)、およびＡｐｏＥ遺
伝子多型を検出するためのプローブ(9)および(10)、お
よびＥＲ遺伝子多型を検出するためのプローブ(16)およ
び(17)を含むことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよび
ＥＲ遺伝子多型を測定することのできる遺伝子多型同時
検出用試薬である。 ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６） gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７）
【００１１】さらに、本発明はＶＤＲ遺伝子に特異的な
増幅プライマー対 (1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特
異的な増幅プライマー対 (3)および(4)、ＥＲ遺伝子に
特異的な増幅プライマー対 (5)および(6)、ＶＤＲ遺伝
子の多型を検出するための検出プローブ (7)および
(8)、ＡｐｏＥ遺伝子の多型を検出するための検出プロ
ーブ (9)および(10)、およびＥＲ遺伝子の多型を検出す
るための検出プローブ（11)および(12)を含むことを特
徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型同時検
出試薬である。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３） cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５) cctgcaccag aatatgtacc 20 (6) （配列番号６） ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: gtgtggtcta gagttg 16 (11) （配列番号１１） gtgtggtctg gagttg 16 (12) （配列番号１２）
増幅プライマー対 (1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特
異的な増幅プライマー対 (3)および(4)、ＥＲ遺伝子に
特異的な増幅プライマー対 (5)および(6)、ＶＤＲ遺伝
子の多型を検出するための検出プローブ (7)および
(8)、ＡｐｏＥ遺伝子の多型を検出するための検出プロ
ーブ (9)および(10)、およびＥＲ遺伝子の多型を検出す
るための検出プローブ（11)および(12)を含むことを特
徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型同時検
出試薬である。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３） cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５) cctgcaccag aatatgtacc 20 (6) （配列番号６） ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: gtgtggtcta gagttg 16 (11) （配列番号１１） gtgtggtctg gagttg 16 (12) （配列番号１２）
【００１２】さらに、本発明はＶＤＲ遺伝子に特異的な
増幅プライマー対 (1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特
異的な増幅プライマー対 (13)および(14)、ＥＲ遺伝子
に特異的な増幅プライマー対 (5)および(15)、ＶＤＲ遺
伝子の多型を検出するための検出プローブ (7)および
(8)、ＡｐｏＥ遺伝子の多型を検出するための検出プロ
ーブ (9)および(10)、およびＥＲ遺伝子の多型を検出す
るための検出プローブ（16)および(17)を含むことを特
徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型同時検
出試薬である。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcc acatggagga 20 (13) （配列番号１３） cccggcctgg tacactgcca 20 (14) （配列番号１４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） cctgcaccag aatatgttac c 21 (15) （配列番号１５） ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６） gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７）
増幅プライマー対 (1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特
異的な増幅プライマー対 (13)および(14)、ＥＲ遺伝子
に特異的な増幅プライマー対 (5)および(15)、ＶＤＲ遺
伝子の多型を検出するための検出プローブ (7)および
(8)、ＡｐｏＥ遺伝子の多型を検出するための検出プロ
ーブ (9)および(10)、およびＥＲ遺伝子の多型を検出す
るための検出プローブ（16)および(17)を含むことを特
徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型同時検
出試薬である。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcc acatggagga 20 (13) （配列番号１３） cccggcctgg tacactgcca 20 (14) （配列番号１４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） cctgcaccag aatatgttac c 21 (15) （配列番号１５） ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６） gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７）
【００１３】本発明は上記ＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ
遺伝子を増幅する試薬を使用して、試料中のＶＤＲ、Ａ
ｐｏＥおよびＥＲ遺伝子を増幅し、それぞれの遺伝子多
型の組み合わせを検出することを特徴とするＶＤＲ、Ａ
ｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出法である。
遺伝子を増幅する試薬を使用して、試料中のＶＤＲ、Ａ
ｐｏＥおよびＥＲ遺伝子を増幅し、それぞれの遺伝子多
型の組み合わせを検出することを特徴とするＶＤＲ、Ａ
ｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出法である。
【００１４】また、本発明は、上記ＶＤＲ、ＡｐｏＥお
よびＥＲ遺伝子多型同時検出試薬を使用して、試料中の
ＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型の組み
合わせを検出することを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥお
よびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出法である。
よびＥＲ遺伝子多型同時検出試薬を使用して、試料中の
ＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型の組み
合わせを検出することを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥお
よびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出法である。
【００１５】さらに、本発明は上記ＶＤＲ、ＡｐｏＥお
よびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出法により検出されたＶ
ＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型の組み合
わせと骨関連疾患の治療薬を結びつけることを特徴とす
る骨関連疾患治療薬の選択方法である。
よびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出法により検出されたＶ
ＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型の組み合
わせと骨関連疾患の治療薬を結びつけることを特徴とす
る骨関連疾患治療薬の選択方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明において、ビタミンＤ受容
体とは、ビタミンＤの効果発現系において大きな役割を
果たす４２７個のアミノ酸残基を有する蛋白質である。
ビタミンＤが骨およびカルシウム代謝の有力な制御因子
であることから、ＶＤＲも骨量などに大きく関わってい
る。ＶＤＲをコードする遺伝子はヒト第１２染色体上に
存在している。ＶＤＲ遺伝子については、いくつかの多
型が知られており、特にイントロン８上に存在するBsmI
制限酵素断片長多型、ApaI制限酵素断片長多型などがよ
く知られている。本発明におけるＶＤＲ遺伝子の遺伝子
多型とは、上記BsmI制限酵素多型を意味し、BsmIで切断
される遺伝子型をｂ型、切断されない遺伝子をＢ型とす
ることによる、ＢＢ、Ｂｂ、ｂｂの３種類の遺伝子多型
がある。本発明ではＢＢ、Ｂｂ型をＢ（＋）、ｂｂ型を
Ｂ（−）と表記することがある。
体とは、ビタミンＤの効果発現系において大きな役割を
果たす４２７個のアミノ酸残基を有する蛋白質である。
ビタミンＤが骨およびカルシウム代謝の有力な制御因子
であることから、ＶＤＲも骨量などに大きく関わってい
る。ＶＤＲをコードする遺伝子はヒト第１２染色体上に
存在している。ＶＤＲ遺伝子については、いくつかの多
型が知られており、特にイントロン８上に存在するBsmI
制限酵素断片長多型、ApaI制限酵素断片長多型などがよ
く知られている。本発明におけるＶＤＲ遺伝子の遺伝子
多型とは、上記BsmI制限酵素多型を意味し、BsmIで切断
される遺伝子型をｂ型、切断されない遺伝子をＢ型とす
ることによる、ＢＢ、Ｂｂ、ｂｂの３種類の遺伝子多型
がある。本発明ではＢＢ、Ｂｂ型をＢ（＋）、ｂｂ型を
Ｂ（−）と表記することがある。
【００１７】本発明においてアポリポタンパクＥとは、
脂肪の転送蛋白質の１種である２９９個のアミノ酸残基
からなる分子量３４，２００の蛋白質である。ＡｐｏＥ
をコードする遺伝子は、ヒト第１９染色体上に存在して
いる。ＡｐｏＥ遺伝子は以前よりアルツハイマー型痴呆
との関連が言われていたが、近年は骨量などとの関係も
言われるようになった。ＡｐｏＥには３つの遺伝子多型
が存在しており、１１２番目のアミノ酸をシステイン、
１５８番目のアミノ酸をアルギニンとコードしているも
のを３型、１１２番目のアミノ酸をアルギニンとコード
しているものを４型、１５８番目のアミノ酸をシステイ
ンとコードしているものを２型と呼ぶ。本発明における
ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型とは、上記２／２、２／
３、２／４、３／３、３／４または４／４がある。ま
た、本発明では４型を含む２／４、３／４または４／４
の遺伝子多型を４（＋）型、４型を含まない２／２、２
／３または３／３の遺伝子多型を４（−）型と表記する
ことがある。これらの４（＋）型および４（−）型は、
HhaI制限酵素断片長多型である。
脂肪の転送蛋白質の１種である２９９個のアミノ酸残基
からなる分子量３４，２００の蛋白質である。ＡｐｏＥ
をコードする遺伝子は、ヒト第１９染色体上に存在して
いる。ＡｐｏＥ遺伝子は以前よりアルツハイマー型痴呆
との関連が言われていたが、近年は骨量などとの関係も
言われるようになった。ＡｐｏＥには３つの遺伝子多型
が存在しており、１１２番目のアミノ酸をシステイン、
１５８番目のアミノ酸をアルギニンとコードしているも
のを３型、１１２番目のアミノ酸をアルギニンとコード
しているものを４型、１５８番目のアミノ酸をシステイ
ンとコードしているものを２型と呼ぶ。本発明における
ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型とは、上記２／２、２／
３、２／４、３／３、３／４または４／４がある。ま
た、本発明では４型を含む２／４、３／４または４／４
の遺伝子多型を４（＋）型、４型を含まない２／２、２
／３または３／３の遺伝子多型を４（−）型と表記する
ことがある。これらの４（＋）型および４（−）型は、
HhaI制限酵素断片長多型である。
【００１８】本発明においてエストロゲン受容体とは、
エストロゲンの効果発現系において大きな役割をはたす
５９５個のアミノ酸残基からなる分子量６６，２００の
蛋白質である。閉経後の女性に骨粗鬆症が多いことか
ら、エストロゲンおよびエストロゲン受容体との骨粗鬆
症の関連が言われている。ＥＲをコードする遺伝子はヒ
ト第６染色体上に存在している。ＥＲ遺伝子について
は、いくつかの多型が存在しており、例えばＥＲ遺伝子
イントロン１上に存在するXbaIで切断される制限酵素断
片長多型や、PvuII制限酵素断片長多型などが知られて
いる。本発明におけるＥＲ遺伝子の遺伝子多型とは、上
記XbaI制限酵素断片長多型であり、制限酵素XbaIで切断
されるものをｘ型、切断されないものをＸ型とすること
による、ＸＸ,Ｘｘ,ｘｘの3種類の遺伝子多型がある。
遺伝子型ＸＸ、ＸｘをＸ（＋）型、遺伝子型ｘｘをＸ
（−）型と表記することがある。
エストロゲンの効果発現系において大きな役割をはたす
５９５個のアミノ酸残基からなる分子量６６，２００の
蛋白質である。閉経後の女性に骨粗鬆症が多いことか
ら、エストロゲンおよびエストロゲン受容体との骨粗鬆
症の関連が言われている。ＥＲをコードする遺伝子はヒ
ト第６染色体上に存在している。ＥＲ遺伝子について
は、いくつかの多型が存在しており、例えばＥＲ遺伝子
イントロン１上に存在するXbaIで切断される制限酵素断
片長多型や、PvuII制限酵素断片長多型などが知られて
いる。本発明におけるＥＲ遺伝子の遺伝子多型とは、上
記XbaI制限酵素断片長多型であり、制限酵素XbaIで切断
されるものをｘ型、切断されないものをＸ型とすること
による、ＸＸ,Ｘｘ,ｘｘの3種類の遺伝子多型がある。
遺伝子型ＸＸ、ＸｘをＸ（＋）型、遺伝子型ｘｘをＸ
（−）型と表記することがある。
【００１９】本発明において使用するＶＤＲ遺伝子に特
異的なプライマーとは、ポリメラーゼ・チェイン・リア
クション（以下、ＰＣＲ）法によって、本発明の検出目
標部位であるＶＤＲのイントロン8のBsmI制限酵素多型
を含むようなＶＤＲ遺伝子領域を増幅するように設計さ
れたオリゴヌクレオチドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ
遺伝子の増幅プライマー対と似通ったＴｍを有するもの
である。具体的には、ＰＣＲ時のアニーリング温度が５
０℃のものとして、下記増幅プライマー対を例示するこ
とができる。 gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） および ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２）
異的なプライマーとは、ポリメラーゼ・チェイン・リア
クション（以下、ＰＣＲ）法によって、本発明の検出目
標部位であるＶＤＲのイントロン8のBsmI制限酵素多型
を含むようなＶＤＲ遺伝子領域を増幅するように設計さ
れたオリゴヌクレオチドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ
遺伝子の増幅プライマー対と似通ったＴｍを有するもの
である。具体的には、ＰＣＲ時のアニーリング温度が５
０℃のものとして、下記増幅プライマー対を例示するこ
とができる。 gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） および ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２）
【００２０】本発明において使用するＡｐｏＥ遺伝子に
特異的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の
検出目標部位であるＡｐｏＥの多型領域を含むようなＡ
ｐｏＥ遺伝子領域を増幅するように設計されたオリゴの
うち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の増幅プライマー対と
似通ったＴｍを有するものである。具体的にはＰＣＲ時
のアニーリング温度が５０℃のものとして、下記増幅プ
ライマー対を例示することができる。 ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３） および cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４） または ctgggcgcc acatggagga 20 (13) （配列番号１３） および cccggcctgg tacactgcca 20 (14) （配列番号１４）
特異的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の
検出目標部位であるＡｐｏＥの多型領域を含むようなＡ
ｐｏＥ遺伝子領域を増幅するように設計されたオリゴの
うち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の増幅プライマー対と
似通ったＴｍを有するものである。具体的にはＰＣＲ時
のアニーリング温度が５０℃のものとして、下記増幅プ
ライマー対を例示することができる。 ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３） および cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４） または ctgggcgcc acatggagga 20 (13) （配列番号１３） および cccggcctgg tacactgcca 20 (14) （配列番号１４）
【００２１】本発明において使用するＥＲ遺伝子に特異
的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の検出
目標部位であるＥＲのイントロン1のXbaI制限酵素多型
を含むようなＥＲ遺伝子領域を増幅するように設計され
たオリゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＡｐｏＥ
遺伝子の増幅プライマー対と似通ったＴｍを有するもの
である。具体的にはＰＣＲ時のアニーリング温度が５０
℃のものとして、下記増幅プライマー対を例示すること
ができる。 gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） および cctgcaccag aatatgtacc 20 (6) （配列番号６） または gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） および cctgcaccag aatatgttac c 21 (15) （配列番号１５）
的なプライマーとは、ＰＣＲ法によって、本発明の検出
目標部位であるＥＲのイントロン1のXbaI制限酵素多型
を含むようなＥＲ遺伝子領域を増幅するように設計され
たオリゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＡｐｏＥ
遺伝子の増幅プライマー対と似通ったＴｍを有するもの
である。具体的にはＰＣＲ時のアニーリング温度が５０
℃のものとして、下記増幅プライマー対を例示すること
ができる。 gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） および cctgcaccag aatatgtacc 20 (6) （配列番号６） または gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） および cctgcaccag aatatgttac c 21 (15) （配列番号１５）
【００２２】本発明において使用するＶＤＲ遺伝子を検
出するためのプローブとは、ＶＤＲ遺伝子のBsmI多型部
分において、Ｂ型またはｂ型と結合するオリゴヌクレオ
チドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検出プロー
ブと似通ったＴｍを有するものである。具体的にハイブ
リダイゼーション時の温度が４５℃の場合のものとし
て、下記検出用プローブを例示することができる。 caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） および caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８）
出するためのプローブとは、ＶＤＲ遺伝子のBsmI多型部
分において、Ｂ型またはｂ型と結合するオリゴヌクレオ
チドのうち、ＡｐｏＥ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検出プロー
ブと似通ったＴｍを有するものである。具体的にハイブ
リダイゼーション時の温度が４５℃の場合のものとし
て、下記検出用プローブを例示することができる。 caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） および caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８）
【００２３】本発明において使用するＡｐｏＥ遺伝子を
検出するためのプローブとは、ＡｐｏＥ遺伝子の多型部
分において４（＋）型または４（−）型と結合するオリ
ゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検
出プローブと似通ったＴｍを有するものである。具体的
にハイブリダイゼーション時の温度が45℃の場合のもの
として、下記検出用プローブを例示することができる。 aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） および aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０）
検出するためのプローブとは、ＡｐｏＥ遺伝子の多型部
分において４（＋）型または４（−）型と結合するオリ
ゴヌクレオチドのうち、ＶＤＲ遺伝子、ＥＲ遺伝子の検
出プローブと似通ったＴｍを有するものである。具体的
にハイブリダイゼーション時の温度が45℃の場合のもの
として、下記検出用プローブを例示することができる。 aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） および aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０）
【００２４】本発明において使用するＥＲ遺伝子を検出
するためのプローブとは、ＥＲ遺伝子のXbaI多型部分に
おいてＸ型またはｘ型と結合するオリゴヌクレオチドの
うち、ＶＤＲ遺伝子、ＡｐｏＥ遺伝子の検出プローブと
似通ったＴｍを有するものである。具体的にハイブリダ
イゼーション時の温度が４５℃の場合のものとして、下
記検出用プローブを例示することができる。 gtgtggtcta gagttg 16 (11) gtgtggtctg gagttg 16 (12) （配列番号１２） tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６） および gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７）
するためのプローブとは、ＥＲ遺伝子のXbaI多型部分に
おいてＸ型またはｘ型と結合するオリゴヌクレオチドの
うち、ＶＤＲ遺伝子、ＡｐｏＥ遺伝子の検出プローブと
似通ったＴｍを有するものである。具体的にハイブリダ
イゼーション時の温度が４５℃の場合のものとして、下
記検出用プローブを例示することができる。 gtgtggtcta gagttg 16 (11) gtgtggtctg gagttg 16 (12) （配列番号１２） tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６） および gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７）
【００２５】本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝
子増幅用試薬とは、上記増幅プライマー(1),(2),(3),
(4),(5),および(6)を含む。該増幅試薬は、さらに耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよび緩衝液を含
む。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Taq ＤＮＡ
ポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、PfuＤＮＡポリ
メラーゼなどが例示される。ｄＮＴＰｓとはdATP,dCTP,
dGTP,dTTPの混合物をいう。さらに緩衝液としては、使
用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに応じて選ばれる。例
えばTaqポリメラーゼではＭｇイオン、グリセロールを
含むトリス緩衝液などを使用する。
子増幅用試薬とは、上記増幅プライマー(1),(2),(3),
(4),(5),および(6)を含む。該増幅試薬は、さらに耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよび緩衝液を含
む。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Taq ＤＮＡ
ポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、PfuＤＮＡポリ
メラーゼなどが例示される。ｄＮＴＰｓとはdATP,dCTP,
dGTP,dTTPの混合物をいう。さらに緩衝液としては、使
用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに応じて選ばれる。例
えばTaqポリメラーゼではＭｇイオン、グリセロールを
含むトリス緩衝液などを使用する。
【００２６】本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝
子の遺伝子多型同時検出用試薬は、上記検出用プローブ
(7),(8),(9),(10),(11)および(12)、(7),(8),(9),(10),
(16)および(17)を含む。増幅プライマーまたは検出プロ
ーブは直接または間接的に標識物質を結合してもよい。
標識物質としては放射性物質、酵素、蛍光性物質または
ビオチンなどが例示される。標識物質が放射性物質であ
れば、その放射線量を計測する。また、標識物質が酵
素、例えばアルカリホスファターゼであれば、その基質
である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールリン酸
−ｐ−トルイジン塩（BCIP）およびニトロ・ブルー・テ
トラゾリウム（NBT）を作用させ、その生成物の発色強
度を測定する。また、アルカリホスファターゼには、
１，２−ジオキセタン化合物などの発光物質を作用さ
せ、該化合物が分解する際に生じる発光量を測定するこ
とも可能である。アルカリホスファターゼ以外の酵素、
例えばペルオキシダーゼ等も常法に従い使用できる。標
識物質がビオチンであれば、ＰＣＲ後、例えばアルカリ
ホスファターゼ結合アビジンを反応させ、反応後のアル
カリホスファターゼを常法に従い、測定する。
子の遺伝子多型同時検出用試薬は、上記検出用プローブ
(7),(8),(9),(10),(11)および(12)、(7),(8),(9),(10),
(16)および(17)を含む。増幅プライマーまたは検出プロ
ーブは直接または間接的に標識物質を結合してもよい。
標識物質としては放射性物質、酵素、蛍光性物質または
ビオチンなどが例示される。標識物質が放射性物質であ
れば、その放射線量を計測する。また、標識物質が酵
素、例えばアルカリホスファターゼであれば、その基質
である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールリン酸
−ｐ−トルイジン塩（BCIP）およびニトロ・ブルー・テ
トラゾリウム（NBT）を作用させ、その生成物の発色強
度を測定する。また、アルカリホスファターゼには、
１，２−ジオキセタン化合物などの発光物質を作用さ
せ、該化合物が分解する際に生じる発光量を測定するこ
とも可能である。アルカリホスファターゼ以外の酵素、
例えばペルオキシダーゼ等も常法に従い使用できる。標
識物質がビオチンであれば、ＰＣＲ後、例えばアルカリ
ホスファターゼ結合アビジンを反応させ、反応後のアル
カリホスファターゼを常法に従い、測定する。
【００２７】本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝
子の遺伝子多型同時検出用試薬は、上記増幅プライマー
(1),(2),(3),(4),(5)および(6)、または(1),(2),(13),
(14),(5)および(6)、さらに上記検出用プローブ(7),
(8),(9),(10),(11)および(12)、または(7),(8),(9),(1
0),(16)および(17)を含んでいてもよい。上記増幅試薬
において、プライマーはＰＣＲ最終組成物中、０．１〜
１．０μＭであることが好ましい。また、上記検出試薬
において、プローブは、０．１〜１．０pmol/μＬであ
ることが好ましい。
子の遺伝子多型同時検出用試薬は、上記増幅プライマー
(1),(2),(3),(4),(5)および(6)、または(1),(2),(13),
(14),(5)および(6)、さらに上記検出用プローブ(7),
(8),(9),(10),(11)および(12)、または(7),(8),(9),(1
0),(16)および(17)を含んでいてもよい。上記増幅試薬
において、プライマーはＰＣＲ最終組成物中、０．１〜
１．０μＭであることが好ましい。また、上記検出試薬
において、プローブは、０．１〜１．０pmol/μＬであ
ることが好ましい。
【００２８】本発明において上記遺伝子多型を検出する
生体試料としては、上記タンパク（ＶＤＲ、ＡｐｏＥ，
ＥＲ）を産生する生体から採取されるゲノムであれば、
特に制限されないが、例えば、ヒト血球成分からフェノ
ールなどにより抽出し、必要により精製したゲノム（Ｄ
ＮＡ）がある。本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺
伝子の遺伝子多型検出方法とは、通常の遺伝子検出法に
従う。すなわち、試料中のＤＮＡをＶＤＲ、ＡｐｏＥお
よびＥＲ遺伝子に特異的な増幅プライマーを含む増幅試
薬を用いて増幅し、次いでＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ
遺伝子多型を検出するための検出プローブを含む検出用
試薬を用いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺
伝子の遺伝子多型を検出する方法である。具体的には、
試料中のＤＮＡ、例えばヒト血液から精製したＤＮＡを
上記増幅プライマーを含む増幅試薬を用いて増幅し、増
幅された試料を上記検出用プローブを含む検出用試薬を
用いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の
遺伝子多型を検出する方法である。
生体試料としては、上記タンパク（ＶＤＲ、ＡｐｏＥ，
ＥＲ）を産生する生体から採取されるゲノムであれば、
特に制限されないが、例えば、ヒト血球成分からフェノ
ールなどにより抽出し、必要により精製したゲノム（Ｄ
ＮＡ）がある。本発明のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺
伝子の遺伝子多型検出方法とは、通常の遺伝子検出法に
従う。すなわち、試料中のＤＮＡをＶＤＲ、ＡｐｏＥお
よびＥＲ遺伝子に特異的な増幅プライマーを含む増幅試
薬を用いて増幅し、次いでＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ
遺伝子多型を検出するための検出プローブを含む検出用
試薬を用いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺
伝子の遺伝子多型を検出する方法である。具体的には、
試料中のＤＮＡ、例えばヒト血液から精製したＤＮＡを
上記増幅プライマーを含む増幅試薬を用いて増幅し、増
幅された試料を上記検出用プローブを含む検出用試薬を
用いて、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の
遺伝子多型を検出する方法である。
【００２９】増幅方法の１つは、一般にポリメラーゼ・
チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲ）法と呼ばれる
方法であって、２本鎖の試料ＤＮＡを加熱して、１本鎖
としてから、該1本鎖を鋳型として増幅プライマーをア
ニールさせ、次いで加温してＤＮＡポリメラーゼにより
該プライマーからｄＮＴＰｓを合成し、伸張させる。得
られた２本鎖を１本鎖に分離して、上記反応を繰り返す
ことにより、効率的に目標領域を有するＤＮＡを増幅す
ることができる。一般に反応条件は９２〜９５℃で３０
秒間〜１分間、５０〜６５℃を２０秒〜１分間、７０〜
７５℃を２０秒から５分間を、２０〜４０回繰り返す。
５０〜６５℃の部分で上記アニールがおこり、反応を成
功させるためのアニール温度は、主にプライマーの組成
によって規定される。７０〜７５℃の部分で伸張がおこ
り、反応を成功させるための伸張時間は増幅する目標領
域の長さによって規定される
チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲ）法と呼ばれる
方法であって、２本鎖の試料ＤＮＡを加熱して、１本鎖
としてから、該1本鎖を鋳型として増幅プライマーをア
ニールさせ、次いで加温してＤＮＡポリメラーゼにより
該プライマーからｄＮＴＰｓを合成し、伸張させる。得
られた２本鎖を１本鎖に分離して、上記反応を繰り返す
ことにより、効率的に目標領域を有するＤＮＡを増幅す
ることができる。一般に反応条件は９２〜９５℃で３０
秒間〜１分間、５０〜６５℃を２０秒〜１分間、７０〜
７５℃を２０秒から５分間を、２０〜４０回繰り返す。
５０〜６５℃の部分で上記アニールがおこり、反応を成
功させるためのアニール温度は、主にプライマーの組成
によって規定される。７０〜７５℃の部分で伸張がおこ
り、反応を成功させるための伸張時間は増幅する目標領
域の長さによって規定される
【００３０】検出方法とは、上記増幅方法により増幅し
たＤＮＡを検出プローブによって検出する方法である。
増幅プライマーには何らかの標識物質が結合してあるこ
とが好ましい。標識物質はプライマーに複数結合してい
てもよい。
たＤＮＡを検出プローブによって検出する方法である。
増幅プライマーには何らかの標識物質が結合してあるこ
とが好ましい。標識物質はプライマーに複数結合してい
てもよい。
【００３１】本発明では、例えば１つの固相担体に３種
の検出プローブを固定化し、該検出プローブに増幅した
試料ＤＮＡを結合させることにより、固相担体上でＶＤ
Ｒ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型を検出する
ことが可能である。固相担体としては、ナイロン膜、マ
イクロタイター・プレートなどが使用できる。検出プロ
ーブを固相担体へ固定化するには、例えば、該検出プロ
ーブの末端に、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・
トランスフェラーゼ（TdT）によってｄＴＴＰを鎖状に
付加（polyT付加）し、上記担体へ物理的吸着させる方
法がある。1つの担体、例えばナイロン膜の別々の場
所、あるいはマイクロプタイター・プレートの個々のウ
ェルにＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の検出プロー
ブを固相、固定化することにより、1つの増幅試料中の
３つの遺伝子多型を同時に判定することができる。
の検出プローブを固定化し、該検出プローブに増幅した
試料ＤＮＡを結合させることにより、固相担体上でＶＤ
Ｒ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型を検出する
ことが可能である。固相担体としては、ナイロン膜、マ
イクロタイター・プレートなどが使用できる。検出プロ
ーブを固相担体へ固定化するには、例えば、該検出プロ
ーブの末端に、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・
トランスフェラーゼ（TdT）によってｄＴＴＰを鎖状に
付加（polyT付加）し、上記担体へ物理的吸着させる方
法がある。1つの担体、例えばナイロン膜の別々の場
所、あるいはマイクロプタイター・プレートの個々のウ
ェルにＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の検出プロー
ブを固相、固定化することにより、1つの増幅試料中の
３つの遺伝子多型を同時に判定することができる。
【００３２】固相担体上で検出プローブにハイブリダイ
ズした増幅ＤＮＡは、結合する標識物質を測定すること
により検出できる。例えば、図１に示すように、検出プ
ローブ(7)に対して反応する試料をＶＤＲ Ｂ型（＋）、
検出プローブ(8)に対して反応する試料をＶＤＲ Ｂ
（−）型、検出プローブ(9)に対して反応する試料をＡ
ｐｏＥ ４（＋）型、検出プローブ(10)に対して反応す
る試料をＡｐｏＥ４（−）型、検出プローブ(11)に対し
て反応する試料をＥＲ Ｘ（＋）型、検出プローブ(12)
に対して反応する試料をＥＲ Ｘ（−）型と判定する。
これらの組み合わせにより、試料中の３種遺伝子の遺伝
子多型を検出することができる。
ズした増幅ＤＮＡは、結合する標識物質を測定すること
により検出できる。例えば、図１に示すように、検出プ
ローブ(7)に対して反応する試料をＶＤＲ Ｂ型（＋）、
検出プローブ(8)に対して反応する試料をＶＤＲ Ｂ
（−）型、検出プローブ(9)に対して反応する試料をＡ
ｐｏＥ ４（＋）型、検出プローブ(10)に対して反応す
る試料をＡｐｏＥ４（−）型、検出プローブ(11)に対し
て反応する試料をＥＲ Ｘ（＋）型、検出プローブ(12)
に対して反応する試料をＥＲ Ｘ（−）型と判定する。
これらの組み合わせにより、試料中の３種遺伝子の遺伝
子多型を検出することができる。
【００３３】本発明の骨関連治療薬の選択方法は、上記
ＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出法
により検出されたＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の
遺伝子多型の組み合わせと骨関連疾患の治療薬を結びつ
けることが可能である。すなわち、ＶＤＲ遺伝子多型が
Ｂ（−）型であるヒト検体は、ビタミンＤ３に対する感
受性が高いと判断し、ＶＤＲ遺伝子多型がＢ（＋）であ
り、ＡｐｏＥ遺伝子多型が４（−）であるヒト検体は、
ビタミンＫ２に対する感受性が高いと判断し、ＶＤＲ遺
伝子多型がＢ（＋）、ＡｐｏＥ遺伝子多型が４（＋）、
かつＥＲ遺伝子多型がＸ（＋）であるヒト検体は、エス
トロゲンに対する感受性が高いと判断する。また、ＶＤ
Ｒ遺伝子多型がＢ（＋）、ＡｐｏＥ遺伝子多型が４
（＋）、ＥＲ遺伝子多型が（−）のヒト検体は、ビタミ
ンＤ３、ビタミンＫ２およびエストロゲンの感受性が低
いと判断し、これら３種以外の薬剤の投与を検討するこ
とが可能となる。
ＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出法
により検出されたＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の
遺伝子多型の組み合わせと骨関連疾患の治療薬を結びつ
けることが可能である。すなわち、ＶＤＲ遺伝子多型が
Ｂ（−）型であるヒト検体は、ビタミンＤ３に対する感
受性が高いと判断し、ＶＤＲ遺伝子多型がＢ（＋）であ
り、ＡｐｏＥ遺伝子多型が４（−）であるヒト検体は、
ビタミンＫ２に対する感受性が高いと判断し、ＶＤＲ遺
伝子多型がＢ（＋）、ＡｐｏＥ遺伝子多型が４（＋）、
かつＥＲ遺伝子多型がＸ（＋）であるヒト検体は、エス
トロゲンに対する感受性が高いと判断する。また、ＶＤ
Ｒ遺伝子多型がＢ（＋）、ＡｐｏＥ遺伝子多型が４
（＋）、ＥＲ遺伝子多型が（−）のヒト検体は、ビタミ
ンＤ３、ビタミンＫ２およびエストロゲンの感受性が低
いと判断し、これら３種以外の薬剤の投与を検討するこ
とが可能となる。
【００３４】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳細に説明す
る。実施例１ 下記４種の試薬〜を調製した。 試薬 50%グリセロール 試薬 5mM 塩化マグネシウム 試薬 0.25M 塩化ナトリウム 0.05M トリスー塩酸緩衝液 0.05% ゼラチン 1mM ｄＮＴＰｓ 試薬 3μM 5'末端にビオチンを付加したＶＤＲプライマー(1) 3μM ＶＤＲプライマー(2) 3μM 5'末端にビオチンを付加したＡｐｏＥプライマー(3) 3μM ＡｐｏＥプライマー(4) 3μM 5'末端にビオチンを付加したＥＲプライマー(5) 3μM ＥＲプライマー'(6)
る。実施例１ 下記４種の試薬〜を調製した。 試薬 50%グリセロール 試薬 5mM 塩化マグネシウム 試薬 0.25M 塩化ナトリウム 0.05M トリスー塩酸緩衝液 0.05% ゼラチン 1mM ｄＮＴＰｓ 試薬 3μM 5'末端にビオチンを付加したＶＤＲプライマー(1) 3μM ＶＤＲプライマー(2) 3μM 5'末端にビオチンを付加したＡｐｏＥプライマー(3) 3μM ＡｐｏＥプライマー(4) 3μM 5'末端にビオチンを付加したＥＲプライマー(5) 3μM ＥＲプライマー'(6)
【００３５】ヒト血液から精製したＤＮＡ５μＬ(n=8）
に、試薬〜をそれぞれ１０μＬ添加し、さらに滅菌
済み精製水４．８μＬおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ToYoBo Taq Polymerase）０．２μＬを加えた。得ら
れた溶液を９５℃ ５分、［９５℃ ３０秒、５０℃ ２
０秒、７２℃ ２０秒］３０回繰り返し、７２℃ １０分
間の条件で、ＰＣＲを行った。増幅産物をアガロース・
ゲル電気泳動にかけた。その結果を図２に示す。図２か
ら明らかなように、３つの試料のいずれからもＶＤＲ、
ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子のものと考えられるバンドが
検出された。
に、試薬〜をそれぞれ１０μＬ添加し、さらに滅菌
済み精製水４．８μＬおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ToYoBo Taq Polymerase）０．２μＬを加えた。得ら
れた溶液を９５℃ ５分、［９５℃ ３０秒、５０℃ ２
０秒、７２℃ ２０秒］３０回繰り返し、７２℃ １０分
間の条件で、ＰＣＲを行った。増幅産物をアガロース・
ゲル電気泳動にかけた。その結果を図２に示す。図２か
ら明らかなように、３つの試料のいずれからもＶＤＲ、
ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子のものと考えられるバンドが
検出された。
【００３６】実施例２ ＶＤＲプローブ(7),(8)、ＡｐｏＥプローブ(9),(10)、
およびＥＲプローブ(11),(12)の６種のプローブに対し
て、TaKaRa ターミナル・デオキシヌクレオチジル・ト
ランスフェラーゼとｄＴＴＰでpolyＴ付加を行い、poly
T付加を行ったプローブを１枚のナイロン膜（４×０．
４ｃｍ）上の別々の場所にそれぞれ０．５μＬずつ塗布
し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化して、
検出ストリップを作成した。次いで、下記２種類の試薬
を調製した。 実施例１で増幅した試料１０μＬに、試薬１０μＬを
加えてよく攪拌し、５分間放置した。この試料溶液中
に、試薬１ｍＬおよび上記検出ストリップ１枚を加
え、反応温度４５℃のもとで３０分間振とうして反応さ
せた。その後、ストレプトアビジンに結合したアルカリ
ホスファターゼを加え、さらにＢＣＩＰおよびＮＢＴを
加えて、検出ストリップ上の各プローブと結合した試料
に結合したアルカリホスファターゼを発色させた。その
発色強度から得た結果を図３に示す。図３から試料No.
１〜３は、下記表１に示す遺伝子多型を有すると判定し
た。
およびＥＲプローブ(11),(12)の６種のプローブに対し
て、TaKaRa ターミナル・デオキシヌクレオチジル・ト
ランスフェラーゼとｄＴＴＰでpolyＴ付加を行い、poly
T付加を行ったプローブを１枚のナイロン膜（４×０．
４ｃｍ）上の別々の場所にそれぞれ０．５μＬずつ塗布
し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化して、
検出ストリップを作成した。次いで、下記２種類の試薬
を調製した。 実施例１で増幅した試料１０μＬに、試薬１０μＬを
加えてよく攪拌し、５分間放置した。この試料溶液中
に、試薬１ｍＬおよび上記検出ストリップ１枚を加
え、反応温度４５℃のもとで３０分間振とうして反応さ
せた。その後、ストレプトアビジンに結合したアルカリ
ホスファターゼを加え、さらにＢＣＩＰおよびＮＢＴを
加えて、検出ストリップ上の各プローブと結合した試料
に結合したアルカリホスファターゼを発色させた。その
発色強度から得た結果を図３に示す。図３から試料No.
１〜３は、下記表１に示す遺伝子多型を有すると判定し
た。
【００３７】
【表１】
【００３８】なお、実施例１において使用した試料につ
いて、別途、ＶＤＲ遺伝子については、制限酵素BsmIに
よる制限酵素断片長によって遺伝子型を判定した。ま
た、ＡｐｏＥ遺伝子については、ＡｐｏＥの遺伝子型の
みを検出する試薬（商品名、INNO-LiPA ＡｐｏＥ、Inno
genetics社製）を用いて判定した。さらにＥＲ遺伝子に
ついては制限酵素XbaIによう制限酵素断片長によって遺
伝子型を判定した。その結果を図４〜６および表2に示
す。
いて、別途、ＶＤＲ遺伝子については、制限酵素BsmIに
よる制限酵素断片長によって遺伝子型を判定した。ま
た、ＡｐｏＥ遺伝子については、ＡｐｏＥの遺伝子型の
みを検出する試薬（商品名、INNO-LiPA ＡｐｏＥ、Inno
genetics社製）を用いて判定した。さらにＥＲ遺伝子に
ついては制限酵素XbaIによう制限酵素断片長によって遺
伝子型を判定した。その結果を図４〜６および表2に示
す。
【００３９】
【表２】
【００４０】表１と表２から明らかなように、両者の結
果は一致を示した。
果は一致を示した。
【００４１】実施例３ 下記４種の試薬〜を調製した。 試薬 50%グリセロール 試薬 5mM 塩化マグネシウム 試薬 0.25M 塩化ナトリウム 0.05M トリスー塩酸緩衝液 0.05% ゼラチン 1mM ｄＮＴＰｓ 試薬 3μM 5'末端にビオチンを付加したＶＤＲプライマー(1) 3μM ＶＤＲプライマー(2) 3μM 5'末端にビオチンを付加したＡｐｏＥプライマー(13) 3μM ＡｐｏＥプライマー(14) 3μM 5'末端にビオチンを付加したＥＲプライマー(5) 3μM ＥＲプライマー(15)
【００４２】ヒト血液から精製したＤＮＡ５μＬ(n=
３）に、試薬〜をそれぞれ１０μＬ添加し、さらに
滅菌済み精製水４．８μＬおよび耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ（ToYoBo Taq Polymerase）０．２μＬを加えた。
得られた溶液を９５℃ ５分、［９５℃ ３０秒、５０℃
２０秒、７２℃ ２０秒］３０回繰り返し、７２℃ １
０分間の条件で、ＰＣＲを行った。増幅産物をアガロー
ス・ゲル電気泳動にかけた。その結果は図１と同様であ
った。
３）に、試薬〜をそれぞれ１０μＬ添加し、さらに
滅菌済み精製水４．８μＬおよび耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼ（ToYoBo Taq Polymerase）０．２μＬを加えた。
得られた溶液を９５℃ ５分、［９５℃ ３０秒、５０℃
２０秒、７２℃ ２０秒］３０回繰り返し、７２℃ １
０分間の条件で、ＰＣＲを行った。増幅産物をアガロー
ス・ゲル電気泳動にかけた。その結果は図１と同様であ
った。
【００４３】実施例４ ＶＤＲプローブ(7),(8)、ＡｐｏＥプローブ(9),(10)、
およびＥＲプローブ(16),(17)の６種のプローブに対し
て、TaKaRa ターミナル・デオキシヌクレオチジル・ト
ランスフェラーゼとｄＴＴＰでpolyＴ付加を行い、poly
T付加を行ったプローブを１枚のナイロン膜（４×０．
４ｃｍ）上の別々の場所にそれぞれ０．５μＬずつ塗布
し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化して、
検出ストリップを作成した。次いで、下記２種類の試薬
を調製した。 実施例３で増幅した試料１０μＬに、試薬１０μＬを
加えてよく攪拌し、５分間放置した。この試料溶液中
に、試薬１ｍＬおよび上記検出ストリップ１枚を加
え、反応温度４５℃のもとで３０分間振とうして反応さ
せた。その後、ストレプトアビジンに結合したアルカリ
ホスファターゼを加え、さらにＢＣＩＰおよびＮＢＴを
加えて、検出ストリップ上の各プローブと結合した試料
に結合したアルカリホスファターゼを発色させた。その
発色強度から得た結果を図２と同様であった。この結果
から試料No.１〜３は、下記表３に示す遺伝子多型を有
すると判定した。
およびＥＲプローブ(16),(17)の６種のプローブに対し
て、TaKaRa ターミナル・デオキシヌクレオチジル・ト
ランスフェラーゼとｄＴＴＰでpolyＴ付加を行い、poly
T付加を行ったプローブを１枚のナイロン膜（４×０．
４ｃｍ）上の別々の場所にそれぞれ０．５μＬずつ塗布
し、３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して固定化して、
検出ストリップを作成した。次いで、下記２種類の試薬
を調製した。 実施例３で増幅した試料１０μＬに、試薬１０μＬを
加えてよく攪拌し、５分間放置した。この試料溶液中
に、試薬１ｍＬおよび上記検出ストリップ１枚を加
え、反応温度４５℃のもとで３０分間振とうして反応さ
せた。その後、ストレプトアビジンに結合したアルカリ
ホスファターゼを加え、さらにＢＣＩＰおよびＮＢＴを
加えて、検出ストリップ上の各プローブと結合した試料
に結合したアルカリホスファターゼを発色させた。その
発色強度から得た結果を図２と同様であった。この結果
から試料No.１〜３は、下記表３に示す遺伝子多型を有
すると判定した。
【００４４】
【表３】
【００４５】なお、実施例３において使用した試料につ
いて、別途、ＶＤＲ遺伝子については、制限酵素BsmIに
よる制限酵素断片長によって遺伝子型を判定した。ま
た、ＡｐｏＥ遺伝子については、ＡｐｏＥの遺伝子型の
みを検出する試薬（商品名、INNO-LiPA ＡｐｏＥ、Inno
genetics社製）を用いて判定した。さらにＥＲ遺伝子に
ついては制限酵素XbaIによう制限酵素断片長によって遺
伝子型を判定した。その結果を表４に示す。
いて、別途、ＶＤＲ遺伝子については、制限酵素BsmIに
よる制限酵素断片長によって遺伝子型を判定した。ま
た、ＡｐｏＥ遺伝子については、ＡｐｏＥの遺伝子型の
みを検出する試薬（商品名、INNO-LiPA ＡｐｏＥ、Inno
genetics社製）を用いて判定した。さらにＥＲ遺伝子に
ついては制限酵素XbaIによう制限酵素断片長によって遺
伝子型を判定した。その結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】表３と表４から明らかなように、両者の結
果は一致を示した。
果は一致を示した。
【００４８】
【発明の効果】本発明の検出試薬を使用して、ＶＤＲ、
ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の３つの遺伝子を同時に増幅
し、その増幅物を用いて１回の操作で３つの遺伝子多型
を検出することができる。また、これらの遺伝子が骨粗
鬆症に関わっていることから、該検出試薬を使用して、
ヒト検体中のこれら遺伝子の遺伝子多型を検出した結果
から、その組みあわせにより、有効な骨粗鬆症治療薬を
選択することが可能となる。
ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の３つの遺伝子を同時に増幅
し、その増幅物を用いて１回の操作で３つの遺伝子多型
を検出することができる。また、これらの遺伝子が骨粗
鬆症に関わっていることから、該検出試薬を使用して、
ヒト検体中のこれら遺伝子の遺伝子多型を検出した結果
から、その組みあわせにより、有効な骨粗鬆症治療薬を
選択することが可能となる。
【００４９】
【配列表】 ＜１１０＞ 株式会社ニッショー ＜１２０＞ ビタミンＤ受容体遺伝子、アポリポタンパクＥ遺伝子およびエスト ロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型同時検出用試薬および該遺伝子多型同時検出法 ＜１３０＞ １２−０３４ ＜１５０＞ 日本、平成１１年特許願第１３６６５３号 ＜１５１＞ 平成１１年５月１８日 ＜１８０＞ １７
【００５０】 ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１２染色体 ＜２２３＞ ビタミンＤ受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ gtgcaggcga ttcggtaggg 20
【００５１】 ＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１２染色体 ＜２２３＞ ビタミンＤ受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ ccagcggaag aggtcaaggg 20
【００５２】 ＜２１０＞ ３ ＜２１１＞ １６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１９染色体 ＜２２３＞ アポリポタンパクＥ遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ ctgggcgcgg acatgg 16
【００５３】 ＜２１０＞ ４ ＜２１１＞ １６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１９染色体 ＜２２３＞ アポリポタンパクＥ遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ cccggcctgg tacact 16
【００５４】 ＜２１０＞ ５ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストレゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ gttccaaatg tcccagccgt 20
【００５５】 ＜２１０＞ ６ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ cctgcaccag aatatgtacc 20
【００５６】 ＜２１０＞ ７ ＜２１１＞ １６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１２染色体 ＜２２３＞ ビタミンＤ受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ caggcctgcg cattcc 16
【００５７】 ＜２１０＞ ８ ＜２１１＞ １６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１２染色体 ＜２２３＞ ビタミンＤ受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ caggcctgca cattcc 16
【００５８】 ＜２１０＞ ９ ＜２１１＞ １４ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１９染色体 ＜２２３＞ アポリポタンパクＥ遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ aggacgtgcg cggc 14
【００５９】 ＜２１０＞ １０ ＜２１１＞ １５ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１９染色体 ＜２２３＞ アポリポタンパクＥ遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ aggacgtgtg cggcc 15
【００６０】 ＜２１０＞ １１ ＜２１１＞ １６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ gtgtggtcta gagttg 16
【００６１】 ＜２１０＞ １２ ＜２１１＞ １６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ gtgtggtctg gagttg 16
【００６２】 ＜２１０＞ １３ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１９染色体 ＜２２３＞ アポリポタンパクＥ遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ ctgggcgcc acatggagga 20
【００６３】 ＜２１０＞ １４ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１９染色体 ＜２２３＞ アポリポタンパクＥ遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ cccggcctgg tacactgcca 20
【００６４】 ＜２１０＞ １５ ＜２１１＞ ２１ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１９染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体の塩基配列の一部 ＜４００＞ cctgcaccag aatatgttac c 21
【００６５】 ＜２１０＞ １６ ＜２１１＞ １６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１９染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体の塩基配列の一部 ＜４００＞ tctggagttg ggatga 16
【００６６】 ＜２１０＞ １７ ＜２１１＞ １６ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第１９染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体の塩基配列の一部 ＜４００＞ gtggtctaga gttggg 16
【図１】固相担体上でＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝
子を検出した場合の結果と各遺伝子の遺伝子多型を示す
模式図である。
子を検出した場合の結果と各遺伝子の遺伝子多型を示す
模式図である。
【図２】本発明のプライマーにより増幅した遺伝子の電
気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】本発明の方法により増幅した試料を、１つの固
相担体上でＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型を検
出した結果を示す図面。
相担体上でＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型を検
出した結果を示す図面。
【図４】実施例1の試料について、ＶＤＲ遺伝子につい
てのみ、ＰＣＲ法で増幅し、制限酵素BsmIについて制限
酵素断片長によりＶＤＲ遺伝子の遺伝子多型を判別した
電気泳動の結果を示す図面に変わる写真である。
てのみ、ＰＣＲ法で増幅し、制限酵素BsmIについて制限
酵素断片長によりＶＤＲ遺伝子の遺伝子多型を判別した
電気泳動の結果を示す図面に変わる写真である。
【図５】実施例1の試料について、ＡｐｏＥ遺伝子につ
いてのみ、市販ＡｐｏＥ遺伝子検出試薬（商品名、INNO
-LiPA ApoE Innogenetics社製）を使用して、遺伝子多
型を判別した結果を示す図面。
いてのみ、市販ＡｐｏＥ遺伝子検出試薬（商品名、INNO
-LiPA ApoE Innogenetics社製）を使用して、遺伝子多
型を判別した結果を示す図面。
【図６】実施例１の試料について、ＥＲ遺伝子について
のみＰＣＲ法で増幅し、制限酵素XbaIについて制限酵素
断片長によりＥＲ遺伝子の遺伝子多型を判別した電気泳
動の結果を示す図面に変わる写真である。
のみＰＣＲ法で増幅し、制限酵素XbaIについて制限酵素
断片長によりＥＲ遺伝子の遺伝子多型を判別した電気泳
動の結果を示す図面に変わる写真である。
Claims (11)
- 【請求項１】 ビタミンＤ受容体（以下、ＶＤＲ）遺伝
子、アポリポタンパクＥ（以下、ＡｐｏＥ）遺伝子およ
びエストロゲン受容体（以下、ＥＲ）遺伝子のそれぞれ
の遺伝子に対して、特異的な増幅プライマー対、および
ＶＤＲ遺伝子多型、ＡｐｏＥ遺伝子多型およびＥＲ遺伝
子多型をそれぞれ検出するための検出プローブを含むこ
とを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺
伝子多型同時検出試薬。 - 【請求項２】 ＶＤＲ遺伝子の遺伝子多型が、ＶＤＲ遺
伝子のイントロン８上のBsmI制限酵素断片長多型ＢＢ、
Ｂｂまたはｂｂであり、ＡｐｏＥ遺伝子の遺伝子多型
が、ＡｐｏＥ遺伝子のHhaI制限酵素断片長多型２／２、
２／３、２／４、３／３、３／４または４／４であり、
ＥＲ遺伝子の遺伝子多型が、ＥＲ遺伝子のイントロン１
上のXbaI制限酵素断片長多型ＸＸ、Ｘｘまたはｘｘであ
る請求項１記載のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の
遺伝子多型同時検出用試薬。 - 【請求項３】 下記ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライ
マー対(1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的な増幅プ
ライマー対(3)および(4)、およびＥＲ遺伝子に特異的な
増幅プライマー対(5)および(6)を含むことを特徴とする
ＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子を増幅する遺伝子増
幅用試薬。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３） cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） cctgcaccag aatatgtacc 20 (6) （配列番号６） - 【請求項４】 下記ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライ
マー対(1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的な増幅プ
ライマー対(13)および(14)、およびＥＲ遺伝子に特異的
な増幅プライマー対(5)および(15)を含むことを特徴と
するＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子を増幅する遺伝
子増幅用試薬。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) (配列番号１) ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) (配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcc acatggagga 20 (13) (配列番号１３） cccggcctgg tacactgcca 20 (14) (配列番号１４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) (配列番号５） cctgcaccag aatatgttac c 21 (15) (配列番号１５） - 【請求項５】 ＶＤＲ遺伝子多型を検出するための検出
プローブ(7)および(8)、ＡｐｏＥ遺伝子多型を検出する
ためのプローブ(9)および(10)、およびＥＲ遺伝子多型
を検出するためのプローブ(11)および(12)を含むことを
特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型を測
定する遺伝子多型同時検出用試薬。 ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) (配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: gtgtggtcta gagttg 16 (11) （配列番号１１） gtgtggtctg gagttg 16 (12) （配列番号１２） - 【請求項６】 ＶＤＲ遺伝子多型を検出するための検出
プローブ(7)および(8)、ＡｐｏＥ遺伝子多型を検出する
ためのプローブ(9)および(10)、およびＥＲ遺伝子多型
を検出するためのプローブ(16)および(17)を含むことを
特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型を測
定する遺伝子多型同時検出用試薬。 ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６） gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７） - 【請求項７】 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー
対 (1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的な増幅プラ
イマー対 (3)および(4)、ＥＲ遺伝子に特異的な増幅プ
ライマー対 (5)および(6)、ＶＤＲ遺伝子の多型を検出
するための検出プローブ (7)および(8)、ＡｐｏＥ遺伝
子の多型を検出するための検出プローブ (9)および(1
0)、およびＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プロ
ーブ（11)および(12)を含むことを特徴とするＶＤＲ、
ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型同時検出試薬。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcgg acatgg 16 (3) （配列番号３） cccggcctgg tacact 16 (4) （配列番号４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） cctgcaccag aatatgtacc 20 (6) （配列番号６） ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: gtgtggtcta gagttg 16 (11) （配列番号１１） gtgtggtctg gagttg 16 (12) （配列番号１２） - 【請求項８】 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー
対(1)および(2)、ＡｐｏＥ遺伝子に特異的な増幅プライ
マー対(3)および(4)、ＥＲ遺伝子に特異的な増幅プライ
マー対(5)および(6)、ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するた
めの検出プローブ (7)および(8)、ＡｐｏＥ遺伝子の多
型を検出するための検出プローブ (9)および(10)、およ
びＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ（1
1)および(12)を含むことを特徴とするＶＤＲ、ＡｐｏＥ
およびＥＲ遺伝子多型同時検出試薬。 ＶＤＲ遺伝子に特異的な増幅プライマー対： gtgcaggcga ttcggtaggg 20 (1) （配列番号１） ccagcggaag aggtcaaggg 20 (2) （配列番号２） Ａｐｏ遺伝子に特異的な増幅プライマー対: ctgggcgcc acatggagga 20 (13) （配列番号１３） cccggcctgg tacactgcca 20 (14) （配列番号１４） ＥＲ遺伝子の特異的な増幅プライマー対: gttccaaatg tcccagccgt 20 (5) （配列番号５） cctgcaccag aatatgttac c 21 (15) （配列番号１５） ＶＤＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: caggcctgcg cattcc 16 (7) （配列番号７） caggcctgca cattcc 16 (8) （配列番号８） Ａｐｏ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: aggacgtgcg cggc 14 (9) （配列番号９） aggacgtgtg cggcc 15 (10) （配列番号１０） ＥＲ遺伝子の多型を検出するための検出プローブ: tctggagttg ggatga 16 (16) （配列番号１６） gtggtctaga gttggg 16 (17) （配列番号１７） - 【請求項９】 請求項３または４記載のＶＤＲ、Ａｐｏ
ＥおよびＥＲ遺伝子を増幅する試薬を使用して、試料中
のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子を増幅し、それぞ
れの遺伝子多型の組み合わせを検出することを特徴とす
るＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型同時
検出法。 - 【請求項１０】 請求項１、２、５〜８のいずれか１項
記載のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子多型同時検出
試薬を使用して、試料中のＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ
遺伝子の遺伝子多型の組み合わせを検出することを特徴
とするＶＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型
同時検出法。 - 【請求項１１】 請求項１０記載のＶＤＲ、ＡｐｏＥお
よびＥＲ遺伝子の遺伝子多型検出法により検出されたＶ
ＤＲ、ＡｐｏＥおよびＥＲ遺伝子の遺伝子多型の組み合
わせと骨関連疾患の治療薬を結びつけることを特徴とす
る骨関連疾患治療薬の選択方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000142951A JP2001029088A (ja) | 1999-05-18 | 2000-05-16 | ビタミンｄ受容体遺伝子、アポリポタンパクｅ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型同時検出用試薬および該遺伝子多型同時検出法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-136653 | 1999-05-18 | ||
| JP13665399 | 1999-05-18 | ||
| JP2000142951A JP2001029088A (ja) | 1999-05-18 | 2000-05-16 | ビタミンｄ受容体遺伝子、アポリポタンパクｅ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型同時検出用試薬および該遺伝子多型同時検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001029088A true JP2001029088A (ja) | 2001-02-06 |
Family
ID=26470157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000142951A Pending JP2001029088A (ja) | 1999-05-18 | 2000-05-16 | ビタミンｄ受容体遺伝子、アポリポタンパクｅ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型同時検出用試薬および該遺伝子多型同時検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001029088A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006520190A (ja) * | 2003-01-21 | 2006-09-07 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | 流体の微小流体的な操作、増幅、および分析（例えば、細菌アッセイおよびアンチグロブリン試験）のための方法およびシステム |
-
2000
- 2000-05-16 JP JP2000142951A patent/JP2001029088A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006520190A (ja) * | 2003-01-21 | 2006-09-07 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | 流体の微小流体的な操作、増幅、および分析（例えば、細菌アッセイおよびアンチグロブリン試験）のための方法およびシステム |
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