CN103695531A

CN103695531A - Abcb1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒

Info

Publication number: CN103695531A
Application number: CN201310486429.1A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: SHANDONG BOSIYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANDONG BOSIYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-10-17
Filing date: 2013-10-17
Publication date: 2014-04-02

Abstract

本发明提供了一种用于检测ABCB1基因多态性的焦磷酸测序检测方法及试剂盒。本发明对ABCB1基因多态性检测具体是指多态性位点rs1128503，rs2032582和rs1045642的单核苷酸多态性。本发明从核酸提取到完成多态性检测报告，全程只需5小时，可以快速、准确、高通量对ABCB1基因进行定性定量检测，指导患者的个性化用药。

Description

ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒

所属技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法及试剂盒。

背景技术

ABCB1转运蛋白家族是一类跨膜蛋白，其主要功能是利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物等主动转出质膜，ABCB1基因在人类多药耐药基因族中起主导作用，其表达受各种因素的影响，属于可调控基因。研究显示与ABCB1的基因表达、蛋白结合能力影响较大的3个单核苷酸多态性分别为：rs1128503，rs2032582和rs1045642。ABCB1定位于人类7号染色体q21.1，由28个外显子组成，编码一个170kDa的跨膜糖蛋白-P糖蛋白。它是人体内重要的转运蛋白之一，在胃肠道、肝脏、肾脏、脑等重要组织器官广泛分布，参与多种药物的吸收、分布及分泌和排泄。

ABCB1是一种能量依赖性药物输出泵，当化疗药物靠浓度梯度到达细胞后与ABCB1蛋白结合，导致ATP结合区活化，此时其核苷酸结合位点与ATP结合，ATP随即水解为ADP释放能量，在Mg2+作用下使P糖蛋白形态发生变化，在药物尚未发生细胞毒作用之前被转移至细胞外，使细胞内药物浓度降低，于是作用到药物靶位细胞核位置的药物浓度相对降低而产生多药耐药。rs2032582是位于ABCB1外显子上第893位密码子上G到T／A突变，导致893位丙氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸，生化分析证实这种突变会影响药物转运。GG野生型细胞内的铂类药物浓度高于突变型，导致细胞死亡和严重的中心粒细胞毒性。在美国前列腺癌人群中被发现该位点和rs1045642的多倍型与多西紫杉醇治疗的中性粒细胞毒性的显著相关。

氯吡格雷是一种新型噻吩吡啶类的抗血小板药物，氯吡格雷为药物前体，本身无活性，氯吡格雷约50％经胃肠道吸收后在肝脏内迅速代谢，血浆中原形药物浓度极低。氯吡格雷在小肠的吸收受到ABCB1基因编码的质子泵P糖蛋白调控。研究表明ABCB1基因rs1128503，rs2032582和rs1045642三者存在连锁不平衡关系含有两个ABCB1C3435T等位基因变异体可降低氯吡格雷的血药浓度。在对白种人中研究时发现携带3435TT突变型纯合子基因型个体的P糖蛋白的表达量比正常野生型个体低51％。FAST-MI研究显示携带两个ABCB1C3435T等位基因的患者比没有携带的主要终点事件(死亡，非致命性卒中、心肌梗死等)的风险高。在接受氯吡格雷治疗的患者中，ABCB13435C→T基因型与心血管死亡、心肌梗死及卒中等事件风险呈显著相关(P=0.0064)，与ABCB1基因型3435CT／CC携带者相比，纯合子TT携带者主要终点事件风险增加72％；在健康人群中，纯合子3435TT携带者应用氯吡格雷后血小板最大聚集率出现绝对降低，但降幅较CT／CC携带者减小7.3％(P=0.0127)。ABCB1基因型3435TT携带者降低了对血小板的抑制，且在氯吡格雷治疗期间复发性缺血事件的风险有所增加。

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术，相对传统的Sanger测序法，焦磷酸测序更快、更简单，且便宜得多。焦磷酸测序方法由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就能将其加入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram TM转化为一个峰值，其高度与核苷酸数目成正比。其操作简单，结果准确可靠，可以行大规模分析。

基于以上所述，本发明采用焦磷酸测序对ABCB1基因的三个多态性位点进行检测，对进行化疗的肿瘤患者或接受氯吡格雷治疗的患者提供个性化治疗方案提供决策依据。

发明内容

本发明的目的在于，提供一组用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503的核苷酸序列。

本发明的目的在于，提供一种用于检测ABCB1基因多态性位点rs2032582的核苷酸序列。

本发明的目的在于，提供一种用于检测ABCB1基因多态性位点rs1045642的核苷酸序列。

本发明的目的在于，提供一种用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs104564的焦磷酸测序方法及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸测序方法中使用的PCR引物及测序引物，其特征在于，其组成为：

检测rs1128503的PCR引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，测序引物如序列表SEQ ID No.3所示；

检测rs2032582的PCR引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，测序引物如序列表SEQ ID No.6所示；

检测rs1045642的PCR引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，测序引物如序列表SEQ ID No.9所示；

一组用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸测序方法中使用的核酸，其特征在于，该组核酸包括核苷酸序列分别如序列表SEQID No.1和SEQ ID No.2所示的用于rs1128503PCR扩增的引物对和测序引物SEQ IDNo.3、如序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的用于rs2032582PCR扩增的引物对和测序引物SEQ ID No.6、如序列表SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的用于rs1045642PCR扩增的引物对和测序引物SEQ ID No.9和携带有SEQ ID No.10所示的阳性对照。

一种用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

PCR缓冲液；

用于rs1128503PCR扩增上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，测序引物如SEQ ID No.3所示；

用于rs2032582PCR扩增上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.5，所示测序引物如SEQ ID No.6所示；

用于rs1045642PCR扩增上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，测序引物如SEQ ID No.9所示；；

dNTP；

MgCl2；

Pfu DNA聚合酶；

双蒸水；

阴性对照：灭菌生理盐水；

阳性对照：所述质粒携带的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

一种用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸测序方法：

(1)样品采集、核酸提取：本发明可检测本发明可检测血液和组织切片等样本；采集到的血液样本首先通过蛋白酶K消化、裂解之后用氯仿抽提提取核酸或采用商品化试剂盒提取核酸。

(2)在反应管中分别加入反应液和核酸，记录样品编号和对应管号，放入PCR仪中扩增；

其中，最适的PCR反应体系如下：

优选的PCR反应条件如下：

第一步：96℃3分钟；第二步：96℃5秒，60℃20秒，72℃20秒，40个循环；第三步，72℃2分钟；

(3)将PCR产物进行变性后纯化分离单链，然后在焦磷酸测序仪上进行序列分析。

(4)分析、判定结果：本发明结果判定标准为：阴性对照无对照峰，阳性对照的测序结果与仪器中设定的结果一致，否则结果无效。仪器自动给出样本中的ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1128503的碱基百分比。

本发明的有益效果在于，

本发明提供了一种用于检测ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸测序方法，其具有以下特点：

(1)特异性好，根据ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的保守序列设计的特异性引物，具有很高的准确性，假阳性率低；采用特异的测序引物可以快速用于ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的检测。

(2)灵敏度高，可对样品进行定性及定量检测；

(3)操作简单，高通量，一次可以全自动检测24或96份样品。

本发明提供的用于ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸测序方法及试剂盒，适用于ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642检测，对准备进行化疗的肿瘤患者或接受氯吡格雷治疗的患者个性化治疗方案的制定以及预后评估具有重要临床意义。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

附图为采用本发明方法及试剂盒对ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸测序检测结果。

具体实施方式

本发明方法采用焦磷酸测序进行ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的检测，其具体原理为，根据ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的保守序列，设计该区域特异性引物进行PCR扩增，然后再采用特异的测序引物进行焦磷酸测序进行分析，所建立的方法可用于快速进行ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642检测。

实施例1：用于PCR扩增ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的特异引物以及焦磷酸测序引物的制备

根据ABCB1基因多态性位点rs1128503所处的12外显子、rs2032582所处的21外显子和rs1045642所处的26外显子相邻的核酸序列，选择参考序列(GeneBankNo.NC_018918.2)，根据引物的退火温度在60℃左右，设计出针对rs1128503的PCR引物如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2以及测序引物SEQ ID No.3，PCR产物长度为110bp。上游引物SEQ ID No.1序列为GCCTTGAAGTTTTTTTCTCACTCG；下游引物SEQ ID No.2序列为CTCTTCCCACAGCCACTGTTT。上游引物SEQ ID No.1的5’端采用生物素标记。测序引物SEQ ID No.3序列为GCCCACTCTGCACCT。

针对rs2032582的PCR引物序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示，PCR产物长度为199bp。上游引物SEQ ID No.4序列为AATAGCAGGAGTTGTTGAAATGAA；下游引物SEQ ID No.5序列为CTTTGAGGAATGGTTATAAACACA。下游引物SEQ ID No.5的5’端采用生物素标记。测序引物SEQ ID No.6序列为CACTGAAAGATAAGAAAGAAC。

针对rs1045642的PCR引物如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，PCR产物长度为135bp。上游引物SEQ ID No.7序列为GGAGCCCATCCTGTTTGA；下游引物SEQ ID No.8序列为TTAGGCAGTGACTCGATGAAGG。下游引物SEQ ID No.8的5’端采用生物素标记。测序引物SEQ ID No.9序列为TGGTGTCACAGGAAGAG。

引物委托英潍捷基上海有限公司合成，其中测序引物的纯化必须采用HPLC方法纯化。

实施例2：ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642焦磷酸测序方法PCR反应体系的建立和优化

1.引物浓度的优化

实验中将引物浓度从0.1μmol／L开始，以0.1μmol／L的幅度递增，直至0.6μmol／L，采用矩阵法进行对比实验，对比实验的其它条件完全一致。

2.Mg²⁺浓度的优化

Mg²⁺会影响PCR反应的特异性和扩增效率，在固定其它反应成分不变的情况下，采用Mg²⁺浓度梯度，对Mg²⁺浓度进行了优化，Mg²⁺浓度从1.5mmol／L开始，以0.5mmol／L的幅度递增，直至6mmol／L。

3.PCR反应条件的优化

为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，根据设计的引物退火温度，以58℃为基础，以0.5℃递加，直到63℃，在此基础上进行退火温度优化。

采用的反应体系如下：

在Bio-Rad iCycler PCR仪上进行扩增，按如下反应条件设置：第一步96℃，2分钟；第二步96℃，5秒，58-63℃，20秒，72℃，20秒，40个循环；第三步72℃2分钟。

4、结果

4.1引物浓度的优化

多次重复实验后选定PCR的引物浓度为0.3μmol／L。

4.2Mg²⁺浓度的优化

结果表明Mg²⁺浓度越低，反应的特异性越强，但扩增效率有所下降；反之Mg²⁺浓度越高，扩增效率有所提高，但特异性受到影响。本发明最终选定的实际Mg²⁺浓度为3mmol／L。

4.3PCR反应条件的优化

结果表明退火温度越高，反应的特异性越强，但扩增效率有所下降；反之退火温度越低，扩增效率有所提高，但特异性有所降低。本发明最终选择60℃作为实际的退火温度，保证特异性和扩增效率的组合能够达到最优。

实施例3：本发明方法检测临床样品

1、核酸提取

采用QIAGEN的核酸纯化试剂盒提取核酸，具体操作按照说明书进行。

2、扩增试剂准备

取出按照实施例2配制的PCR反应液，在室温下融化后，6000rpm离心5秒，配制PCR反应混合液，每45μLPCR混合液中包含PCR反应液44μL和pfu聚合酶1μL，将以上PCR反应混合液按照使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装45μL。

3、加样

在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸，盖上管盖，将PCR管放入PCR仪内，记录样本放置顺序。

4、PCR扩增

反应条件设定：第一步：96℃，3分钟；第三步：每个循环依次为96℃，5秒，62℃，10秒，72℃，20秒，共40个循环；第四步：72℃，1分钟。

5、焦磷酸测序

在PCR产物中加入磁珠进行纯化，然后将纯化的PCR产物放入焦磷酸测序仪中进行测序。

6、分析条件设定和结果判定

(1)质控标准：阴性对照无测序峰，阳性对照的测序结果与仪器中设定的结果一致。否则，此次实验视为无效。

(2)结果分析及判定：仪器自动给出样本中的ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的碱基百分比。

7、对临床样品的检测实例

按上述样品处理和ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸测序试剂盒，采用本发明方法对ABCB1基因多态性位点rs1128503、rs2032582和rs1045642进行焦磷酸测序分析，具体如图所示。

Claims

1.一组检测ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法中使用的引物，其特征在于，其组成为：检测ABCB1基因多态性位点rs1128503的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其中下游引物SEQ ID No.2所示引物5’端采用生物素标记，ABCB1基因的焦磷酸测序引物，如SEQID No.3所示。

2.一组检测ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法中使用的引物，其特征在于，其组成为：检测ABCB1基因多态性位点rs2032582的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQID No.4和SEQID No.5所示，其中下游引物SEQ ID No.5所示引物5’端采用生物素标记，ABCB1基因的焦磷酸测序引物，如SEQID No.6所示。

3.一组检测ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法中使用的引物，其特征在于，其组成为：检测ABCB1基因多态性位点rs1045642的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQID No.7和SEQID No.8所示，其中下游引物SEQ ID No.2所示引物5’端采用生物素标记。ABCB1基因的焦磷酸测序引物，如SEQ ID No.9所示。

4.一组检测ABCB1基因多态性焦磷酸测序方法中携带有SEQ ID No.10所示的阳性对照的阳性对照，阳性对照携带有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2引物对、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5引物对以及SEQ ID No.7和SEQ ID No.8引物对PCR扩增的产物核酸序列。

5.一种检测ABCB1基因多态性焦磷酸测序测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有SEQID No.1和SEQ ID No.2PCR扩增引物的PCR反应液，SEQID NO.3所示的测序引物；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5PCR扩增引物的PCR反应液，SEQID NO.6所示的测序引物；SEQ ID No.7和SEQ ID No.8PCR扩增引物的PCR反应液，SEQID NO.9所示的测序引物；其中，SEQID NO.2、SEQ ID No.5和SEQID No.8所示引物的5’端进行生物素标记。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括SEQ ID NO.10所示的阳性对照，所述阳性对照为插有SEQID NO.10所示核苷酸序列的质粒。