CN102399772A - 乳腺癌分子标志物相关探针的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乳腺癌分子标志物相关探针的制备方法，还涉及利用这些探针制备乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒。利用本发明提供的方法制备的HER2、TOP2A、AGTR1基因探针，结合人17号染色体计数探针、杂交缓冲液、未标记的竞争性DNA及DAPI复染剂可以制备一种乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒，该试剂盒的应用大大提高了乳腺癌的检出率，更加准确的进行乳腺癌分型，指导个体化治疗方案制定，选择合适治疗药物，从而降低死亡率，减少复发风险，达到优化诊疗效果的目的。

Description

乳腺癌分子标志物相关探针的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及乳腺癌分子标志物相关探针的制备方法，还涉及利用这些探针制备乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒，本发明的乳腺癌分子标志物相关探针及相应的试剂盒可以用于确定乳腺癌的类型，特别是可用于指导乳腺癌个体化治疗方案的制定，评价治疗效果、监测复发和转移、估价预后等。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7％～10％，仅次于宫颈癌。流行病学调查发现，5％～10％的乳腺癌是家族性的，有明显的家族遗传倾向。在40～60岁间、绝经期前后的妇女发病率较高。在我国，妇女乳腺癌发病率正逐年上升，并且显示出年轻化趋势。与30年前相比，我国乳腺癌死亡率上升了34.1％，其中城市上升了38.8％，它正以每年3％～4％的速度递增，死亡率已经排在女性癌症死亡率之首。造成这一结果的原因，除早期诊断率低外，与治疗方式的合理选择密切相关。

临床上对于乳腺癌的治疗手段较多，包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、内分泌治疗、免疫治疗和生物靶向治疗等。一般在治疗过程中会根据乳腺癌的临床分期，选择不同的治疗方案。随着分子生物学技术、医疗技术水平和临床研究水平的发展提高，越来越多的研究表明，各种治疗方案的效果和不同药物的疗效在不同个体间均存在明显差异。肿瘤异质性、耐药性，药物反应性、疗效的差异给治疗带来很多困难。因此，利用分子生物学检测(Albertson，D.G.，2006.Gene amplification in cancer.Trends Genet.22(8)，447-455.Albertson，D.G.，Collins，C.，McCormick，F.，Gray，J.W.，2003.Chromosome aberrations in solid tumors.Nat.Genet.34(4)：369-376.)对患者进行分别评估，根据不同分子分型制定不同治疗方案，实行个体化诊疗，对于提高诊疗效果，减少复发率，降低死亡率都极具意义；同时也能够避免将一些昂贵的药物用于所有患者，从而有效控制医疗费用。目前，国外在乳腺癌的个体化治疗方面取得很大成就，相应的检测手段已经常规开展。而国内受各方面条件限制，个体化诊疗才刚刚起步，国内现状主要表现在检测方法滞后，缺少相应的分子诊断试剂，相关标志物的诊断试剂依赖进口，试剂价格高，很难在检测人群中普及。

本发明根据乳腺癌分子标志物的研究成果和美国临床肿瘤学会(ASCO)推荐指标，选择了以下四个指标的染色体作为乳腺癌检测靶标来制备基因探针：①HER2。HER2(Humanepidermal growth factor receptor-2，也称erbB2，c-erbB2，HER-2/neu)，编码表皮生长因子受体蛋白2，属酪氨酸激酶受体家族，HER2在20～30％的原发性乳腺浸润性导管癌中有基因的扩增和蛋白的过度表达，是一个重要的临床预后指标，直接影响乳腺癌的风险级别，过表达或基因扩增的乳腺癌患者无病生存期和总生存期缩短，肿瘤负荷更大，淋巴结转移几率高，复发风险高。针对HER-2扩增患者，临床研究表明该群体对CMF化疗方案和他莫昔芬(TAM)内分泌治疗的反应性低，但对高剂量强度的蒽环类药物、紫杉醇化疗和曲唑的反应性明显高于HER-2阴性患者。一种小分子靶向药物拉帕替尼也适用于Her2高表达乳腺癌患者，FDA1998批准将一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)用于HER2过度表达转移性乳腺癌的一线联合化疗及接受过一个或多个化疗方案晚期乳腺癌单药治疗，可以降低50％的复发风险和35％左右的死亡风险。(Jeffrey S.Ross，JonathanA.Fletcher，Gerald P.Linette，etal.The Her-2/neu gene and protein in breast cancer 2003：biomarker and target of therapy.TheOncologist 2003；8：307-325.Masafumi Kurosumi.Recent trends of HER-2 testing and trastuzumabtherapy for breast cancer.Breast Cancer2009；16：284-287.Walter P Carnery，Kim Leitzel，Suhail Ali，et al.HER-2/neu diagnostics in breast cancer. Breast Cancer Research.9：207.Edgerton SE，MerkelD，Moore DH，Thor AD：HER-2/neu/erbb2 status by immunohistochemistry and FISH：clonality and regression with recurrence and metastases.Appl Immunohistochem Mol Morphol2003，111：214-221.Johnston SRD，Leory A.Lapatinib：a novel EGFR/HER2 tryosinekinaseinhibitor for cancer.Drugs Today 2006，42：441-453.)、②TOP2A。TOP2A基因(Topoisomerase IIalpha，TOPIIα)编码DNA拓扑异构酶IIα，能调节核酸空间结构动态变化、控制核酸生理功能。TOP2A基因参与乳腺癌细胞的复制，存在TOP2A基因异常的患者预后差，无复发生存期缩短，尤其是TOP2A基因缺失的患者预后更差。基因扩增提示肿瘤有复发的可能，或者远期的疗效下降。研究表明，TOP2A基因异常的患者对于含蒽环类药物的治疗方案更敏感，TOP2A扩增患者在使用CEF化疗方案治疗时能降低65％的复发风险和67％的死亡风险，而对TOP2A基因无变异患者，CEF和CMF的疗效无明显差别。(Kirsten Vang Nielsen，Sven Muller，SusanneMoller，et al.Aberrations of ERBB2 and TOP2A genes in breast cancer.Molecular oncology4(2010)161-168.Bouchalova，K.，Trojanec，R.，Kolar，Z.，Cwiertka，K.，Cernakova，I.，Mihal，V.，Hajduch，M.，2006.Analysis of ERBB2 and TOP2A gene status using fluorescence in situhybridization versus immunohistochemistry in localized breast cancer.Neoplasma 53(5)，393-401.Ja¨rvinen，T.A.，Tanner，M.，Rantanen，V.，Barlund，M.，Borg，A.，Grenman，S.，Isola，J.，2000.Amplification and deletion of topoisomerase IIa associate with ErbB-2 amplification and affectsensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer.Am.J.Pathol 156(3)，839-847.)、③AGTR1。AGTR1基因(angiotensin II receptor，type 1，AGTR1)血管紧张素II受体1型，早期研究主要集中在与高血压相关方面，2009年发现它也是一种与乳腺癌关联的基因。当前研究表明，AGTR1在约五分之一的乳腺癌患者中有过度表达，与癌细胞的侵入行为相关。治疗高血压的药物氯沙坦(losartan)对AGTR1过度表达的肿瘤有抑制效果，能够减少肿瘤细胞。(Ateeq B，Tomlins SA，Chinnaiyan AM.AGTR1 as a therapeutic target in ER-positiveand ERBB2-negative breast cancer cases.Cell Cycle.2009Dec；8(23)：3794-5.Rhodes DR，Ateeq B，Cao Q，et al.AGTR1 overexpression defines a subset of breast cancer and confers sensitivity tolosartan，an AGTR1 antagonist.Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Jun 23；106(25)：10284-9.González-Zuloeta Ladd AM，Arias Vásquez A，Siemes C，et al.Differential roles ofAngiotensinogen and Angiotensin Receptor type 1 polymorphisms in breast cancer risk.BreastCancer Res Treat.2007 Mar；101(3)：299-304.Koh WP，Yuan JM，Van Den Berg D，et al.Polymorphisms in angiotensin II type 1 receptor and angiotensin I-converting enzyme genes andbreast cancer risk among Chinese women in Singapore.Carcinogenesis.2005 Feb；26(2)：459-64.)和④17号染色体。最新临床研究表明，当使用蒽环类药物治疗，17号染色体多倍体患者复发风险下降了35％-40％，而无17号染色体单体的患者并无从蒽环类药物获益，更倾向于其它治疗选择，如紫杉醇类等。(Bai YF，Ren GP，Wang B，Teng LS，Liu X.Comparison betweenanalysis of HER2 gene and chromosome 17 in breast cancer by dual-probe chromogenic in situhybridization and fluorescence in situ hybridization.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi.2010Mar；39(3)：161-5.)。利用探针对上述四种标志物进行检测，可以大大提高了乳腺癌的检出率，更加准确的进行乳腺癌分型，指导个体化治疗方案制定，选择合适治疗药物，从而降低死亡率，减少复发风险，达到优化诊疗效果的目的。

本发明提供了四种乳腺癌分子标志物相关探针的制备方法，并在此基础上利用这些探针自主研制了乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒，填补了国内该检测领域的空白，具有十分重大的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供HER2、TOP2A、AGTR1基因探针、人17号染色体计数探针四种探针的制备方法。

根据本发明一个优选的实施方案，HER2、TOP2A、AGTR1基因探针的制备步骤包括：

(1)克隆筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有含有HER2基因、TOP2A基因、AGTR1基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。

(2)克降培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买相应的克隆(Invitrogen RPCI11.C)，取10μl克隆菌液添加到5ml TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；针对HER2、TOP2A、AGTR1基因探针使用相应的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。

(3)基因探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩；获得探针，避光、-20±5℃储存。

(4)基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。

根据本发明一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有HER2基因最优选的克隆，编号为RP11-909L6。

根据本发明一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有TOP2A基因最优选的克隆，编号为RP11-1029L16。

根据本发明一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有AGTR1基因最优选的克隆，编号为RP11-366P9。

根据本发明一个优选的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列分别为HER2基因探针：上游引物5’-AGGGGAGAATAAATAAAATCTGTGG-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物5’-CAGGAGTGAGACACTCTCCATG-3’(SEQ ID NO：2)；TOP2A基因探针：上游引物5’-ATTCAAAGCTGGATCCCTTT-3’(SEQ ID NO：3)和下游引物5’-AGCTGTGACAAATGCCTGTA-3’(SEQ ID NO：4)；AGTR1基因探针：上游引物5’-TTGCATTATTTTCAAAGCCCTT-3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’-TCCTACCAGCTTAGGCCAGA-3’(SEQ ID NO：6)；PCR扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×40循环；72℃10分钟。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针制备步骤中质粒DNA提取可使用市售的质粒提取试剂盒，优选Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针制备步骤中质粒DNA的定量是将质粒DNA稀释后分别测定260nm和280nm下的吸光度，计算产物浓度。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针制备步骤中质粒DNA进行荧光标记可以使用切口平移方法标记，利用DNaseI和DNA聚合酶I实现基因探针的荧光标记。

根据本发明一个优选的实施方案，50μl切口平移体系中DNA聚合酶I的使用量在10U～20U间，DNase I使用量在0.001U～0.01U间，标记条件为16℃2小时。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针标记的荧光素为荧光素标记的dUTP，并优选Spectrum dUTP。

根据本发明一个优选的实施方案，基因探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使用3～5μl灭菌纯化水或Human Cot-1 DNA(1μg/μl)溶解沉淀。

17号染色体计数探针的制备可以参照专利“一种人17号染色体计数探针的制备方法及其应用”(申请号为200910039410.6)中17号染色体计数探针的制备方法。

本发明的另一个目的是利用HER2、TOP2A、AGTR1基因探针及人17号染色体计数探针制备一种乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒。

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：

(1)样本处理和制片：按照原位杂交方法对各类型样本进行处理。

(2)杂交：配制杂交液，主要包括荧光标记探针混合物和杂交缓冲液。合适温度下进行8～16小时的杂交，然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针；DAPI复染剂复染。

(3)通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号，对不同信号进行观察计数。

基于以上技术方案发明的试剂盒包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50％～70％，硫酸葡聚糖浓度为0.1g/ml。

根据本发明的一个优选实施方案，荧光标记探针混合物包括HER2基因探针、TOP2A基因探针、AGTR1基因探针及人17号染色体计数探针，每人份荧光标记探针混合物中HER2基因探针、TOP2A基因探针、AGTR1基因探针的使用量均为0.5μl，17号染色体计数探针的使用量为5～10ng。

根据本发明的一个优选实施方案，由杂交缓冲液、荧光标记探针混合物和未标记的竞争性DNA配制杂交液，其中未标记的竞争性DNA选择Human COT-1 DNA。每人份杂交液中加入7μl杂交缓冲液，1.6μl荧光标记探针混合物，Human COT-1 DNA使用量为1μg，并用H₂O补至10μl。。

根据本发明的一个优选实施方案，其中DAPI复染剂配制方法为50～250ng DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。

利用本发明的试剂盒，依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行信号计数。

本发明与现有技术相比，具有下列优点：

(1)实现了对同一样本进行四种乳腺癌分子标志物的同时检测，大大提高了乳腺癌的检出率，更加准确的进行乳腺癌分型。

(2)进行准确、快速的信号计数、且结果重复性好；

(3)无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，可用于中期或间期细胞信号计数，操作相对简单；

(4)通过制备成试剂盒，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应用，有助综合评价各分子标志物，了解其与肿瘤发生等的联系。

附图说明

图1显示克隆鉴定的电泳结果。目的产物138bps。其中1道为marker，2道为样本；箭头标示从上至下依次代表150bp、100bp。

图2显示克隆鉴定的电泳结果。目的产物108bps。其中1道为marker，2道为样本；箭头标示代表100bp。

图3显示克隆鉴定的电泳结果。目的产物252bps。其中1道为marker，2道为样本；箭头标示从上至下依次代表300bp、200bp。

图4显示人类外周血淋巴细胞中17号染色体(青色)和HER-2基因探针(红色)计数结果。

图5显示人类外周血淋巴细胞中TOP2A基因(绿色)检测结果。

图6显示人类外周血淋巴细胞中AGTR1基因(金色)检测结果。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：HER2基因探针的制备

(1)引物设计克隆筛选：HER2基因位于人染色体17q12区段，NCBI Mapview数据库检索所有含有HER2基因的克隆，筛选出包含有该基因的克隆，编号为RP11-909L6。

(2)克隆培养和鉴定：购买克隆RP11-909L6，取10μl克隆菌液添加到5mlTB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；菌液使用上游引物

5’-AGGGGAGAATAAATAAAATCTGTGG-3’和下游引物

5’-CAGGAGTGAGACACTCTCCATG-3’进行PCR扩增，扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×40循环；72℃10分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果分别在138bps具有明亮的条带(参见附图1)。

(3)基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/μl)＝OD260×50(ng/μl)计算质粒DNA浓度。采用高压灭菌的纯化水稀释为100ng/μl，采用1.5ml的离心管分装，-20℃密封保存。

通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum dUTP，选择orange-dUTP标记HER2基因。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

组分                     加入量

10×DNA聚合酶I buffer     5μl

0.5mM dTTP                1μl

1mM d3TP                  1μl

DNA聚合酶I  10U/μl       1μl

DNase I  0.001U/μl       5μl

0.2mM orange-dUTP         2.5μl

模板                      1μg

水                       补足50μl

配完后震荡混匀，16℃标记2小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。取5μl使用2％琼脂糖凝胶做电泳，要求在100-500bp之间存在弥散的带。

对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制：

标记产物             45μl

Human Cot-1 DNA      5μl

醋酸钠(3mol/L)       5μl

无水乙醇             125μl

混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用3μl灭菌纯化水溶解沉淀，获得HER2基因探针，避光、-20℃储存。

(4)HER2基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体(17号染色体)上均可见荧光信号。

实施例2：TOP2A基因探针的制备

(1)引物设计克隆筛选：TOP2A基因位于人染色体17q21区段，NCBI Mapview数据库检索所有含有TOP2A基因的克隆，筛选出包含有该基因的克隆，编号为RP11-1029L16。

(2)克隆培养和鉴定：购买克隆RP11-1029L16，取10μl克隆菌液添加到5mlTB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；菌液使用上游引物5’-ATTCAAAGCTGGATCCCTTT-3’和下游引物5’-AGCTGTGACAAATGCCTGTA-3’进行PCR扩增，扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×40循环；72℃10分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果分别在108bps具有明亮的条带(参见附图2)。

(3)基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/μl)＝OD260×50(ng/μl)计算质粒DNA浓度。采用高压灭菌的纯化水稀释为100ng/μl，采用1.5ml的离心管分装，-20℃密封保存。

通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum dUTP，选择green-dUTP标记TOP2A基因。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

组分                       加入量

10×DNA聚合酶Ibuffer       5μl

0.5mM dTTP                 1μl

1mM d3TP                   1μl

DNA聚合酶I  10U/μl        1μl

DNase I  0.001U/μl        5μl

0.2mM green-dUTP           2.5μl

模板                       1μg

水                         补足50μl

配完后震荡混匀，16℃标记2小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。取5μl使用2％琼脂糖凝胶做电泳，要求在100-500bp之间存在弥散的带。

对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制：

标记产物                 45μl

Human Cot-1 DNA          5μl

醋酸钠(3mol/L)           5μl

无水乙醇                 125μl

混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用3μl灭菌纯化水溶解沉淀，获得TOP2A基因探针，避光、-20℃储存。

(4)TOP2A基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体(17号染色体)上均可见荧光信号。

实施例3：AGTR1基因探针的制备

(1)引物设计克隆筛选：AGTR1基因位于人染色体3q24区段，NCBI Mapview数据库检索所有含有AGTR1基因的克隆，筛选出包含有该基因的克隆，编号为RP11-366P9。

(2)克隆培养和鉴定：购买克隆RP11-366P9，取10μl克隆菌液添加到5mlTB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；菌液使用上游引物5’-TTGCATTATTTTCAAAGCCCTT-3’和下游引物5’-TCCTACCAGCTTAGGCCAGA-3’进行PCR扩增，扩增条件为：95℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×40循环；72℃10分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果分别在252bps具有明亮的条带(参见附图3)。

(3)基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行超低拷贝质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/μl)＝OD260×50(ng/μl)计算质粒DNA浓度。采用高压灭菌的纯化水稀释为100ng/μl，采用1.5ml的离心管分装，-20℃密封保存。

通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum dUTP，选择gold-dUTP标记AGTR1基因。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

组分                       加入量

10×DNA聚合酶I buffer      5μl

0.5mM dTTP                 1μl

1mM d3TP                   1μl

DNA聚合酶I  10U/μl        1μl

DNase I  0.001U/μl        5μl

0.2mM gold-dUTP            2.5μl

模板                       1μg

水                         补足50μl

配完后震荡混匀，16℃标记2小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。取5μl使用2％琼脂糖凝胶做电泳，要求在100-500bp之间存在弥散的带。

对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制：

标记产物                   45μl

Human Cot-1 DNA            5μl

醋酸钠(3mol/L)             5μl

无水乙醇                   125μl

混匀后置于-70℃冰箱中至少2小时，4℃13000rpm离心30分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃13000转/分钟离心15分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用3μl灭菌纯化水溶解沉淀，获得AGTR1基因探针，避光、-20℃储存。

(4)AGTR1基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体(3号染色体)上均可见荧光信号。

实施例4：乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒制备

以10人份/盒为例。

(1)杂交液配制

将标记好的探针依次放好，首先溶解探针。使用1μl灭菌纯化水溶解按实施例1方法制备的HER2基因探针干粉中，充分混匀。然后另取1μl灭菌纯化水溶解实施例2方法制备的TOP2A基因探针干粉中，充分混匀。然后另取1μl灭菌纯化水溶解实施例3方法制备的AGTR1基因探针干粉中，充分混匀。17号染色体计数探针稀释至100ng/μl。按下表方案配制荧光标记探针混合物：

按下表方案配制杂交液：

(2)DAPI复染剂配制

抗褪色液：全程操作必须避光，10mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中，调节pH为9.0，加入9ml甘油，反复震荡混匀，-20℃储存。终溶液应该为无色或者略带淡黄色，假如呈现黄色或者橙色则需废弃并重新配制。

用去离子水配制1mg/ml DAPI储存液。

取2.5μl的DAPI溶液(0.1mg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混匀，-20℃避光密闭保存。

(3)成品组装

组分名称	规格	数量
			杂交液	100μl/管	1管
DAPI复染剂	100μl/管	1管
			说明书		1份

实施例5：乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒的使用方法

以福尔马林固定石蜡埋的乳腺组织样本为例。

(1)玻片预处理

玻片放入65±5℃恒温箱中烤片过夜；取出玻片，放入室温二甲苯中30分钟，再将其放入室温1∶1(V∶V)的二甲苯∶无水乙醇中10分钟，放入室温无水乙醇中10分钟，再依次放入室温100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇各3分钟；室温去离子水中静置3分钟，吸取多余水分；100±5℃的去离子水中煮片25分钟(切片水平放置于容器中，样本面朝上)，晾干后，放入37±1℃预热的蛋白酶K反应液中消化8～15分钟左右，室温2×SSC中漂洗5分钟，依次放入室温70％，90％，100％梯度乙醇脱水各3分钟。晾干玻片；继续杂交过程。

(2)样品和探针同时变性

从试剂盒中取出杂交液，震荡混匀，瞬时离心；加8μl的杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；85±1℃的热台上变性5分钟；将玻片放入预热的杂交盒中，避光，37±1℃孵育过夜(约16小时)；继续杂交后洗涤步骤。

(3)杂交后洗涤及复染

取出孵育过夜的杂交盒，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入37±1℃2×SSC中10分钟；再将其放入37±1℃0.1％NP-40/2×SSC洗涤2分钟；室温70％乙醇3分钟；暗处晾干。

复染：滴加10μl DAPI到载玻片目标区域，盖上盖玻片，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

(4)结果分析

在Olympus BX60荧光显微镜下，用滤镜组分别观察DAPI复染的杂交荧光信号，用CCD照相记录。在40×物镜下寻找，在100×物镜下计数；调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；调整焦距，在核的不同层次找到信号点；记录观察每个细胞中的各探针的数目。

(5)结果判定

按处理方法要求进行操作，记录HER2基因、TOP2A基因、AGTR1基因和17号染色体的数目。荧光原位杂交结果显示，中期染色体上可见两个信号点，未见其它荧光信号；间期细胞核中仅见两个信号点，未见其它荧光信号(参见附图4～6)。

实施例6：乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒的临床使用评价

临床收集20例乳腺癌样本，分别使用本实施例4中所述乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒进行检测，按照实施例5进行操作和结果判断。检测结果如表1所述。

表1HER2，TOP2A，AGTR1和17号染色体拷贝数改变基因状态(FISH)

目前临床对于乳腺肿瘤主要通过IHC进行ER/PR/HER-2等指标检测，部分医院使用FISH方法对HER-2/17号染色体两项指标进行检测，从而用于治疗方法及疗效判断；而对于TOP2A和AGTR1指标目前临床上并未开展检测。从检测结果知，免疫组化HER-2检测过表达(3+)的样本中同时可能存在TOP2A和17号染色体异常情况；而对于免疫组化HER-2疑似过表达(2+)的样本在临床上需要使用FISH或CISH进行确诊，进一步明确HER-2基因状态，较多的的研究都显示对于HER-22+的样本其中25％～48％可能表现为FISH检测阳性；对于免疫组化HER-2低表达(1+或-)样本中仍存在一定比例的TOP2A，AGTR1和17号染色体异常。

因此，通过对乳腺组织样本进行这四项指标的联合检测，有助综合评价各分子标志物，了解其与肿瘤发生等的联系。同时对于明确基因分类，指导临床用药/治疗和判断预后效果都极其有益。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种HER2、TOP2A、AGTR1基因探针的制备方法，其特征在于3种基因探针的制备步骤包括：

(1)克隆筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有含有HER2基因、TOP2A基因、AGTR1基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。

(2)克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买克隆Invitrogen RPCI11.C，取10μl克隆菌液添加到5ml含氯霉素抗性的TB培养液中，37℃摇床中摇菌活化培养8～12小时；再将菌液全部加入至500ml含氯霉素抗性的TB培养液中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；针对HER2、TOP2A、AGTR1基因探针使用相应的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。

(3)基因探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，通过缺口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩；获得探针，避光、-20±5℃储存。

(4)基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。

2.根据权利要求1的方法，其特征还在于克隆筛选步骤中含有HER2基因最优的克隆，编号为RP11-909L6，含有TOP2A基因最优选的克隆，编号为RP11-1029L16，含有AGTR1基因最优选的克隆，编号为RP11-366P9。

3.根据权利要求1的方法，其特征还在于克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列分别为：

HER2基因探针：上游引物5’-AGGGGAGAATAAATAAAATCTGTGG-3’和下游引物5’-CAGGAGTGAGACACTCTCCATG-3’；

TOP2A基因探针：上游引物5’-ATTCAAAGCTGGATCCCTTT-3’和下游引物5’-AGCTGTGACAAATGCCTGTA-3’；

AGTR1基因探针：上游引物5’-TTGCATTATTTTCAAAGCCCTT-3’和下游引物5’-TCCTACCAGCTTAGGCCAGA-3’。

4.根据权利要求1的方法，其特征还在于基因探针制备过程中50μl切口平移体系中DNA聚合酶I的使用量在10U～20U间，DNase I使用量在0.001U～0.01U间。

5.一种乳腺癌荧光原位杂交检测试剂盒，包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，荧光标记探针混合物包含17号染色体计数探针以及按权利要求1的方法制备的HER2基因探针、TOP2A基因探针、AGTR1基因探针，其特征在于每人份荧光标记探针混合物中HER2基因探针、TOP2A基因探针、AGTR1基因探针的使用量均为0.5μl，17号染色体计数探针的使用量为5～10ng。

6.根据权利要求5的试剂盒，其特征还在于未标记的竞争性DNA为Human COT-1 DNA。

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