CN104293910A - 一组评估乳腺癌分子分型基因群及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组评估乳腺癌分子分型基因群及其检测试剂盒。所述评估乳腺癌分子分型基因群是由216个基因组成的基因群。本发明还公开了一种评估乳腺癌分子分型基因群的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括可以检测所述评估乳腺癌分子分型和癌症复发风险的基因群中的基因的引物。本发明采用Illumina的二代测序技术DASL-Seq对癌症组织进行表达谱检测，并以此为基础对中国妇女的乳腺癌病例进行五类分子分型：1)管腔A型、2)管腔B型、3)HER2富集型、4)基底细胞型和5)类似正常细胞型，同时结合增殖和免疫指数计算癌症复发风险，预测10年内复发的可能性，以此指导乳腺癌个体化治疗。

Description

一组评估乳腺癌分子分型基因群及其检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组评估乳腺癌分子分型基因群及其检测试剂盒。

背景技术

乳腺癌在都市人群中的发病率自20世纪80年代末开始一直呈上升趋势，已渐渐成为对都市女性威胁最大的恶性肿瘤。最新调查结果显示：目前上海每年新发乳腺癌的病人已经超过4500人，发病率高居全国榜首。每300名上海女性中，就有1名患乳腺癌。就全国来说，每年大约有30万女性乳腺癌新发病例，并以每年2-3％的比例在上升。美国2013年数据显示，1期乳腺癌的生存率到达100％，2期达到93％，3期达到72％，1990-2007年期间，美国乳腺癌的死亡率以每年2.2％的速度下降，与此同时，中国的乳腺癌死亡率却上升了155％。导致这个差距的重要原因之一是，美国80％的乳腺癌诊断于早期，而中国只有大约20％的乳腺癌患者诊断于早期。对乳腺癌患者的个性化管理，将是提升乳腺癌患者生存率的一大关键点。

乳腺癌并非一个简单的单一疾病，而是包括了多种具有不同细胞来源、体细胞突变和病因的肿瘤亚型。因此，乳腺癌病人的病程会有极大差别。常规临床上常用分期、分级结合激素受体状态来显示这些差异)。遗憾的是这些参数对疾病结果的预测能力有限，所以乳腺癌病人常常面临如何选择系统的治疗方案的难题。原发性乳腺癌的基因表达分析揭示了肿瘤内在的异质性，而且作为一种新的分子分型方法弥补了现有标准分级的不足。斯坦福大学前期应用基因表达谱划分的五种乳腺癌亚型是来源于两类功能完全不同的细胞类型，基底细胞和管腔上皮细胞(Perou,C.M.,T.Sorlie,et al.2000；Hu,Z.,C.Fan,et al.2006)。这一分类是基于一种“本征”分析，为一种统计方法，可以发现同一肿瘤内表达差异很小而不同肿瘤间表达差异很大的基因。这些基因可以最好地反映出肿瘤的本征和固有特性。而基因表达的检测则是亚型分型的最佳方法。目前，基于基因表达对乳腺癌进行分型和预后分析的产品主要有Genomic Health的Oncotype Dx，Agendia的MammaPrint以及Prosigna的PAM50。

Oncotype DX是针对早期、雌激素受体阳性乳腺癌患者复发的危险性以及化疗是否对患者有一的一种检测。Oncotype DX采用定量PCR的方法，通过分析肿瘤组织中21个基因的表达来计算出一个“癌症复发风险”。复发指数是一个0到100之间的数值，以此预测初期诊断后10年复发的危险。通过对患者危险度进行低、中、高分类，帮助医生和病人决定治疗方案，尤其是是否需要化疗或仅需内分泌治疗，以避免过度治疗。

MammaPrint是评估乳腺癌是否会转移到身体其他部位的一种检测。也可以帮助医生判断化疗是否对患者有益。MammaPrint采用基因芯片的方法检测肿瘤组织中70个乳腺癌相关基因表达。2007年2月，美国FDA批准了MammaPrint可用于对淋巴结阴性、雌激素受体阴性或阳性且肿瘤小于5厘米的任何年龄的乳腺癌患者进行检测。

PAM50同样是用于评估乳腺癌10年内远处转移的危险性的一种检测。PAM50采用NanoStringDx分析系统检测55个基因表达水平，结合增殖系数、肿瘤体积和其他一些临床变量来计算Prosigna分数(0-100)，以此预测复发危险及内分泌治疗或联合治疗效果。PAM50适用于淋巴结阴性和阳性、HER2阴性患者的评估，目前已获得美国FDA批准。

现有的乳腺癌基因表达分子分型的方法仍然存在着一些缺陷和不足。首先，现最为重要的缺陷在于由于缺乏有效的分析手段，无法识别乳腺癌预后及治疗效果密切相关的免疫调控基因并将其纳入分析系统，使最终的分型评分系统有一定局限性，尤其是结果不能配合指导目前日益受到重视的肿瘤细胞免疫治疗方案。其次，以上所有测试体系的研发均在美国或欧洲进行，所纳入的病例种族绝大多数为高加索人、少量非洲人和极少数的亚洲人，中国人对测试体系的敏感性和特异性尚未得到有效验证。第三，每种检测体系在敏感度、检测能力都有一定局限性。第四、所有检测的检测成本均相对较高，不适合当前我国的经济条件。第五，目前的测试方法只提供复发指数给医生作为参考，没有明确提供分子分型的结果。实际上分子分型可以进一步指导治疗方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前评估乳腺癌分子分型基因群的方法较为局限，特别是针对亚洲人群和中国人群的评估乳腺癌分子分型基因群的研究非常有限，现有的评估方法检测的敏感性和特异性有待验证且成本较高患者花费过高的缺陷，提供了一组评估乳腺癌分子分型基因群及其检测试剂盒。

本发明提供一组评估乳腺癌分子分型基因群，所述评估乳腺癌分子分型基因群包含216个所评估乳腺癌分子分型基因群如表1所示。

更佳地，所述评估乳腺癌分子分型基因群包含60个基因，所述评估乳腺癌分子分型基因群如表3所示。

本发明提供一种评估乳腺癌分子分型的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：扩增本发明所述评估乳腺癌分子分型基因群的引物。

其中，所述的引物为本领域常规的引物，所述引物较佳地为基因专一性高的合成寡聚核苷酸片段，只要能与本发明所述评估乳腺癌分子分型基因群中的基因部分序列互补，并扩增出本发明所述评估乳腺癌分子分型基因群的基因即可。较佳地，所述引物的序列如表2或表3所示。较佳地，所述引物的序列如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。所述引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成。

其中，所述的检测试剂盒较佳地还包括：总RNA抽提试剂、逆转录试剂和/或二代测序试剂。

其中，所述总RNA抽提试剂为本领域常规的总RNA抽提试剂。

其中，所述的逆转录试剂是本领域常规的逆转录试剂，较佳地包括dNTP溶液和/或RNA逆转录酶。

其中，所述二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。所述二代测序试剂较佳地为市售可得。所述的二代测序为本领域常规的二代测序，较佳地，为DASL-seq技术。所述的二代测序试剂较佳地还包括可供构建RASL-seq的文库的试剂。

本发明所述的检测试剂盒较佳地还包括从检测对象提取检测样本的器械；更佳地，还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取组织或血液的器械，所述器械较佳地为任何能用于取血的釆血针、注射器等。

本发明所述的检测样本较佳地为来自检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的总RNA即可。所述检测样本较佳地为组织样本、血液、血浆和体液中的一种或几种，更佳地为组织样本，更佳地为石蜡组织样本，优选地为肿瘤细胞含量高的组织。

本发明所述检测试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：

(1)利用本发明所述检测试剂盒提取检测对象的总RNA(total RNA)；

(2)将纯化的RNA反转录为cDNA，然后制成可供二次测序的文库；

(3)对步骤(2)所得DNA测序文库进行测序即得。

其中，步骤(1)所述的提取方法为本领域常规方法，较佳地为利用检测试剂盒提取检测对象的新鲜冷冻组织(Fresh Frozen)或石蜡包埋组织(FFPE)的总RNA。更佳地为利用Roche公司生产的RNA抽提试剂盒来提取(产品号为Roche Catalog Number#3270289001)。

其中，步骤(2)所述文库的构建方法为本领域常规的文库构建方法，所述文库的构建方法较佳地包括以下步骤：

将提取的总RNA反转录生成如表1所述的216个基因的cDNA。末端补平并进行5’端磷酸化，将30μ1DNA、45μ1纯水、10μ1具有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液、4μ1包含10mM dNTP Mix、5μ1T4DNA聚合酶、1μ1Klenow酶、5μ1Τ4连接酶混合后，在20℃温浴30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquickPCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬液A:将上步的产物溶解在32μ1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μ1，1mM dATP10μ1、KlenowΕχο-3μ1，在37℃保持30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(part#28004)连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2χ25μ1、PE AdapterOligo Mix10μl，DNA连接酶5μ1,在20℃保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA即得文库。

其中，步骤(3)所述测序的方法为本领域常规的测序方法，较佳地为利用Illumina MiSeq测序仪进行二代测序。利用试剂盒中的引物对表1所示的基因进行扩增，根据步骤(2)所制备的文库的不同，可以对所得基因序列进行二次测序。较佳地，所述二次测序为DASL-seq技术，用IlluminaMiSeq测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成。

本发明所述检测试剂盒的使用方法较佳地还包括步骤(4)，将将所得测序结果进行统计分析，根据Hu等开创的单一样品预测法SSP(Single SamplePredictor)和Parker等优化的方法来进行乳腺癌分型和风险预测。对将所得测序结果基因表达数据进行分析即得。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：与目前已有的技术相比，本发明首次将免疫调控基因引入乳腺癌分子分型当中，进一步加强了乳腺癌分子分型的合理性和准确性，提升指导乳腺癌的临床治疗的能力。在中国乳腺癌病例中进行方法的验证和优化，创立适合中国乳腺癌分子分型的最佳方案。首次采用二代测序的检测基因表达并用于分子分型，增加了检测的敏感度，提高了检测能力和效率，同时极大降低了检测成本。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1评估乳腺癌分子分型基因群的筛选

实验方法：

通过EPIG基因表达谱分析程序分析14项欧美队列研究的2034例乳腺癌肿瘤基因表达和临床变量，筛选评估乳腺癌分子分型基因群。所有队列研究数据均为公开发表、上传并储存于公共数据库数据。其中在ArrayExpress数据库1项，编号E-TABM-158，GEO数据库13项，编号分别为GSE11121、GSE12093、GSE1456、GSE2034、GSE2603、GSE3494、GSE45255、GSE4922、GSE5327、GSE6532、GSE7390、GSE8193和GSE9195。

分析包括两个部分:1、非监督性聚类分析识别表达谱及相关基因，2、候选基因的稳定性分析。首先通过聚类分析计算每个基因在2034个样本中的彼此相关系数并以此聚类形成基因特异表达谱(r>0.7，P<0.001)，然后计算每个基因与特异表达谱的相关性，以此选择候选基因(r>0.7，P<0.001)。在8个特异表达谱中，前两位为细胞周期基因和免疫相关基因且与乳腺癌患者的生存密切相关。为了测试候选基因在乳腺癌分子分型及预后中的稳定性，我们随机选取2034样本的一半(1017)进行同样过程分析，并重复1000次，对在所有1000次测试都出现的基因加以保留。

实验结果：筛选获得了216个评估乳腺癌分子分型的基因，基因列表见表1。

表1 216个评估乳腺癌分子分型的基因

实施例2评估乳腺癌分子分型基因群的筛选

采用DASL-seq技术和MiSeq仪器二代测序法，检测200例中国乳腺癌病人新鲜肿瘤组织或石蜡包埋的肿瘤组织中实施例1所筛选得到的216个基因的表达水平。并通过比较预测效率及生物学意义，最终确定一个包含免疫相关基因在内的60个基因的评估乳腺癌分子分型基因群，作为进一步进行乳腺癌分型的依据。检测实施例1所筛选得到的216个基因的216对引物见表2，一些核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～SEQ ID No.10中所示。

表2 216个评估乳腺癌分子分型的基因的引物

实验结果：

1、筛选获得了60个评估乳腺癌分子分型的基因。基因列表见表3。

表3 60个评估乳腺癌分子分型的基因及其扩增引物

2、二代测序数据库的建立。所有实施例2中所述的200例中国乳腺癌病人的新鲜肿瘤组织或石蜡包埋的肿瘤组织进行二代测序的原始数据都会上传到一个基于网络的数据储存和分析库。这一方法采用Java软件开发并应用了许多J2EE(Java Enterprise Edition)组分和模式，能够1)、直接从IlluminaMiSeq仪器输入数据；2)、可以灵活的方式显示录入的数据，并可按不同的需求，如基因相关性、样本或实验组别，进行索引；3)、计算以看家基因标化后的基因表达谱；4)、分析特定元素的细节；5)、以不同的格式输出数据，如XML、excel和文本格式；6)、可安全管理、确保数据隐私保护。

实施例3利用评估乳腺癌分子分型基因群进行乳腺癌分型

取乳腺癌肿瘤组织，抽取肿瘤细胞中的RNA(Roche Catalog Number#3270289001)，对实施例2中所筛选获得的60个评估基因的基因群表达谱用通用的Bowti方法来进行定量分析MiSeq原始资料，然后用Hu等的SSP方法(Hu Z et al.,A compact VEGF signature associated with distant metastasesand poor outcomes.BMC Med2009,7:9.)对乳腺癌肿瘤样品进行分型和复发风险测定。

实验结果：

检测结果报告如表4所示。

表4、利用评估乳腺癌分子分型基因群进行乳腺癌分型和癌症复发风险测定。

利用评估乳腺癌分子分型基因群进行乳腺癌分型，可以将乳腺癌肿瘤分为5类，并对其治疗有不同建议：

1、管腔A型

这类肿瘤的p53基因突变率很低，此型预后最好。对化疗不敏感而适合内分泌治疗，故对临床内分泌治疗有指导意义。

2、管腔B型

此型属于内分泌治疗敏感的肿瘤，但由于HER2阳性，对三苯氧胺的疗效较管腔A型差，对芳香化酶抑制剂的效果较好。由于HER2阳性，患者可进行分子靶向治疗。

3、HER2-富集型

此型p53基因的突变率很高，肿瘤分化相对较差，此型对靶向分子治疗相对敏感，但预后较差。HER2富集型的肿瘤广泛采用赫赛汀联合系统化疗的治疗方案(Yeon and Pegram2005；Calabrich,Fernandes Gdos et al.2008)。

4、基底细胞样型

基底细胞型肿瘤是侵入性最强的肿瘤，即我们常说的三阴性肿瘤(ER-，HER2-，PR-)。正因如此，基地细胞型肿瘤目前的乳腺癌治疗方案都不敏感，临床预后较差。目前美国Albany大学正在开发一种RNA聚合物，针对基底细胞肿瘤高表达的13个VEGF聚类基因，将对此类肿瘤的治疗引入一个全新的治疗手段。

5、正常细胞样型

此型乳腺癌基因表达与正常乳腺组织、乳腺纤维瘤表达相似，高表达基底上皮及脂肪组织基因，低表达腔上皮基因，对化疗最不敏感，但预后较好。

实施例4利用评估乳腺癌分子分型基因群的检测试剂盒进行乳腺癌分型

试剂盒的使用：

步骤1：取检测对象肿瘤或石蜡包埋组织，利用检测试剂盒中的方法获取检测对象含肿瘤细胞高的区域为原始材料。

步骤2：提取组织中总RNA。可以使用Roche公司生产的RNA抽提试剂盒来提取组织中的RNA(产品号为Roche Catalog Number#3270289001)。

步骤3：将所得RNA制成可供测序的文库。将所得组织的RNA制成可供DASL-seq技术二代测序的文库，文库的制备方法包括以下步骤：

将提取组织的RNA在专一引物的指导下用反转录酶生成感兴趣的多种基因(如表1所述的216个基因)cDNA。末端补平并进行5’端磷酸化，将30μ1DNA、45μ1纯水、10μ1具有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液、4μ1包含10mM dNTP Mix、5μ1T4DNA聚合酶、1μ1Klenow酶、5μ1Τ4连接酶混合后，在20℃温浴30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬A:将上步的产物溶解在32μ1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μ1，1mM dATP10μ1、KlenowΕχο-3μ1，在37℃保持30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGEN MinElutePCR纯化试剂盒(part#28004)连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2χ25μ1、PE Adapter Oligo Mix10μl，DNA连接酶5μ1,在20℃保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA即得文库。

步骤4：利用实施例2表2中的引物序列对所得DNA文库进行用MiSeq进行二代测序。用Illumina MiSeq测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成(Illumina公司)。

步骤5：结果统计分析。将所得测序结果进行统计分析，根据Hu等开创的单一样品预测法SSP(Single Sample Predictor)和Parker等优化的方法来进行乳腺癌分型和风险预测。对将所得测序结果基因表达数据进行分析即得。

实施例5敏感度

本发明的检测方法无论是敏感度还是拷贝数检测能力都是最好。本发明实验研究表明用二代测序来测定基因表达谱，其敏感度(Sensitivity)远高于基因芯片法，同时也较定量PCR和Nanostring法更为敏感和优化。

实施例6重复性

本发明的检测方法重复性高。用石蜡组织RNA做的7个重复实验，相关系数高于0.97。用新鲜冷冻组织的15个重复，相关系数高于0.99。

Claims (10)

1.一组评估乳腺癌分子分型基因群，其特征在于，所述评估乳腺癌分子分型基因群是由216个基因组成的基因群，所述基因群如表1所示。

2.一组评估乳腺癌分子分型基因群，其特征在于，所述评估乳腺癌分子分型基因群是由60个基因组成的基因群，所述基因群如表3所示。

3.一种评估乳腺癌分子分型基因群的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：扩增权利要求1或权利要求2所述评估乳腺癌分子分型基因群的基因的引物。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物的序列如表2或表3所示。

5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物的序列如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。

6.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：总RNA抽提试剂、逆转录试剂和/或二代测序试剂。

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的逆转录试剂包括dNTP溶液和/或RNA逆转录酶。

8.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的二代测序试剂包括可供构建RASL-seq的文库的试剂。

9.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括从检测对象提取检测样本的器械。

10.一种扩增评估乳腺癌分子分型基因群基因的引物，其特征在于，所述引物的序列如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的任意一种所示。