CN108456730A - 乳腺癌分型内远处复发风险基因群及体外诊断产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一组评估乳腺癌分子分型内远处复发风险进行评估的基因群；公开了由检测这些基因群的基因表达水平的试剂在制备用于评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品中的应用；所述体外诊断产品包括二代测序(NGS)检测试剂盒、定量PCR等；本发明还公开了利用所述检测试剂盒对乳腺癌分子分型内远处复发风险进行评估的方法。本发明所述方法对乳腺癌分子分型内远处复发风险的评估具有较高的准确性，同时可以预测这类乳腺癌患者对将来免疫检查点抑制剂的应答。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳腺癌分型内远处复发风险基因群及体外诊断产品和应用。
背景技术
乳腺癌在都市人群中的发病率自20世纪80年代末开始一直呈上升趋势，已渐渐成为对都市女性威胁最大的恶性肿瘤。最新调查结果显示：目前上海每年新发乳腺癌的病人已经超过4500人，发病率高居全国榜首。每300名上海女性中，就有1名患乳腺癌。就全国来说，每年大约有30万女性乳腺癌新发病例，并以每年2-3％的比例在上升。美国2013年数据显示，1期乳腺癌的生存率到达100％，2期达到93％，3期达到72％，1990-2007年期间，美国乳腺癌的死亡率以每年2.2％的速度下降，与此同时，中国的乳腺癌死亡率却上升了155％。导致这个差距的重要原因之一是，美国80％的乳腺癌诊断于早期，而中国只有大约20％的乳腺癌患者诊断于早期。对乳腺癌患者的个性化管理，将是提升乳腺癌患者生存率的一大关键点。
乳腺癌并非一个简单的单一疾病，而是包括了多种具有不同细胞来源、体细胞突变和病因的肿瘤亚型。因此，乳腺癌病人的病程会有极大差别。常规临床上常用分期、分级结合激素受体状态来显示这些差异)。遗憾的是这些参数对疾病结果的预测能力有限，所以乳腺癌病人常常面临如何选择系统的治疗方案的难题。原发性乳腺癌的基因表达分析揭示了肿瘤内在的异质性，而且作为一种新的分子分型方法弥补了现有标准分级的不足。斯坦福大学前期应用基因表达谱划分的五种乳腺癌亚型是来源于两类功能完全不同的细胞类型，基底细胞和管腔上皮细胞(Perou,C.M.,T.Sorlie,et al.2000；Hu,Z.,C.Fan,etal.2006)。这一分类是基于一种“本征”分析，为一种统计方法，可以发现同一肿瘤内表达差异很小而不同肿瘤间表达差异很大的基因。这些基因可以最好地反映出肿瘤的本征和固有特性。而基因表达的检测则是亚型分型的最佳方法。目前，基于基因表达对乳腺癌进行分型和复发风险评估已得到临床上的广泛认可。北卡罗来纳大学Perou教授与Prosigna合作共同开发出乳腺癌分子分型及复发风险评估产品PAM50，并已得到美国FDA批准。
PAM50通过检测55个基因表达水平，将乳腺癌分为4种亚型，管腔A型(Luminal A)、管腔B型(Luminal B)、HER2富集型(HER2-enriched)及基底细胞型(Basal-like)并根据亚型及肿瘤增殖指数评估乳腺癌10年内远处转移的危险性。但是，PAM50乳腺癌基因表达分子分型的方法仍然存在着一些缺陷和不足。首先，没有将乳腺癌预后及治疗效果密切相关的免疫调控基因并将其纳入分析系统，使最终的分型评分系统有一定局限性，尤其是结果不能配合指导目前日益受到重视的肿瘤细胞免疫治疗方案。其次，在同一种亚型内部，例如高危亚型基底细胞(Basal-like)型，尽管其平均远处复发风险较高，在亚型内部仍然存在不同复发风险的亚组，对临床治疗方案的制定有重要意义。在其它乳腺癌亚型内也有同样的发现。第三，测试体系的研发均在美国或欧洲进行，所纳入的病例种族绝大多数为高加索人、少量非洲人和极少数的亚洲人，中国人对测试体系的敏感性和特异性尚未得到有效验证。
前期我们在已有乳腺癌分子分型基础上，引入肿瘤组织免疫相关基因表达，进一步完善了乳腺癌分子分型和风险评估体系，并获得国家发明专利授权。“一组评估乳腺癌分子分型基因群及其检测试剂盒，专利号CN201410353809.2”。我们的进一步研究还发现，除管腔A型外的其它亚型，在其亚型内部的远处复发风险与部分基因表达水平密切相关，是本发明的基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前高复发风险亚型的乳腺癌进行远处复发风险的进一步评估，提供一组评估乳腺癌分子亚型内远处复发风险基因群及其检测试剂盒，以指导针对不同亚型的中国人群乳腺癌患者的临床治疗。
本发明提供一组评估乳腺癌分子亚型内远处复发风险基因群及其检测试剂盒，其中评估基底细胞型内远处复发风险基因CD8A、FN1、GREM1、IL2RB、IRF1、POSTN、PRF1、SULF1和UBD；评估HER2富集型乳腺癌远处复发风险基因AEBP1、CD2、CDH11、CKAP2、COL5A1、CXCL9、FBN1、GZMK、HLA-F、HTRA1、PSMB9、STAT1和TAP1；评估管腔B型乳腺癌远处复发风险基因BRF2、C3、CSF1R、EIF4EBP1、HLA-DPB1、HLA-DRA、LSM1、PRR11和RIOK3，所述评估乳腺癌亚型内远处复发风险基因群如表1所示。
表1评估乳腺癌分子分型的基因
本发明提出了一种复发风险基因群作为标志物在制备评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的产品中的应用。
本发明提出了一种检测所述的复发风险基因群的基因表达水平的试剂在制备用于评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品中的应用。
本发明提出了一种评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品，所述体外诊断试剂包括特异性检测所述复发风险基因群的基因表达水平的试剂。
其中，所述体外诊断产品包括二代测序(NGS)检测试剂盒、定量PCR；所述固体支持体包括阵列、微阵列或蛋白质阵列。
其中，所述检测试剂盒包括扩增所述复发风险基因群的引物。
其中，所述基底细胞型内远处复发风险基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1～9所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.10～18所示。
其中，所述HER2富集型乳腺癌远处复发风险基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.19～31所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.32～44所示。
其中，所述管腔B型乳腺癌远处复发风险基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.45～53所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.54～62所示。
本发明提出了一种所述引物在用于制备评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的产品中的应用。
其中，上述乳腺癌分子分型包括基底细胞型、HER2富集型和管腔B型。
本发明还提出一种检测所述复发风险基因群的方法，其包括以下步骤：
(1)利用所述的检测试剂盒提取检测对象的总RNA；
(2)将纯化的总RNA反转录为cDNA，然后制成可供二次测序的文库；
(3)对步骤(2)所得DNA测序文库进行测序。
其中，步骤(2)所述DNA测序文库的构建方法包括以下步骤：将提取的总RNA反转录生成相关基因的cDNA；末端补平并进行5’端磷酸化，将30μ1DNA、45μ1纯水、10μ1具有10mMATP的T4 DNA连接酶缓冲液、4μ1包含10mM dNTP Mix、5μ1T4 DNA聚合酶、1μl Klenow酶、5μ1Τ4连接酶混合后，在20℃温浴30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬液A:将上步的产物溶解在32μ1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μ1，1mM dATP 10μ1、KlenowΕχο-3μ1，在37℃保持30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(part#28004)连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2χ25μ1、PEAdapter Oligo Mix 10μl，DNA连接酶5μ1,在20℃保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA即得文库。
其中，利用IlluminaMiSeq测序仪进行二代测序；利用如上述引物对相关基因进行扩增，根据步骤(2)所制备的文库的不同，对所得基因序列进行二次测序；较佳地，所述二次测序为DASL-seq技术，用Illumina MiSeq测序仪进行双端测序。
其中，所述方法还包括步骤(4)，将所得检测结果进行统计分析进行远处复发风险预测。
其中，基底细胞型分型和复发风险预测的具体计算和风险评估标准如下：
基底免疫指数(Basal Immune Score，BIS)＝(CD8A+IL2RB+PRF1)÷3；
基底间质指数(Basal Extracell Score，BES)＝(FN1+SULF1+GREM1+POSTN)÷4；
基底细胞型远处复发风险指数(Basal Risk of Recurrence,BRR)计算
BRR＝0.5x BES-1.0x BIS-0.3x UBD-0.8x IRF1；
乳腺癌基底细胞型分为低、中和高复发风险组，其10年远处复发的风险分别为，12％n＝55、40％n＝219和58％n＝36。
其中，HER2富集型分型和复发风险预测的具体计算和风险评估标准如下：
HER2免疫指数(HER2 Immune Score，HIS)＝(CD2+GZMK+CXCL9)÷3
HER2间质指数(HER2 Extracell Score，HES)＝(HTRA1+FBN1+COL5A1+AEBP1+CDH11)÷5
HER2抗原指数(HER2 Antigen Score，HAS)＝(HLA-F+TAP1+PSMB9+STAT1)÷4
HER2富集型远处复发风险指数(HER2 Risk of Recurrence，HRR)计算
HRR＝0.8x HES-0.5x HIS-0.7x HAS-0.3x CKAP2
乳腺癌HER2富集型分为中和高复发风险组，其10年远处复发的风险分别为，25％n＝134和62％n＝77。
其中，管腔B型分型和复发风险预测的具体计算和风险评估标准如下：
管腔B免疫指数(Luminal B Immune Score，LBIS)＝(CSF1R+C3+HLA-DPB1+HLA-DRA)÷4
管腔B组蛋白指数(Luminal B Histone Score，LBHS)＝(BRF2+EIF4EBP1+LSM1)÷3
管腔B胞液指数(Luminal B Cytosol Score，LBCS)＝(PRR11+RIOK3)÷2
管腔B型远处复发风险指数(Luminal B Risk of Recurrence，LBRR)计算LBRR＝0.5x LBHS+0.7x LBCS-0.8x LBIS
乳腺癌管腔B型分为中和高复发风险组，其10年远处复发的风险分别为，34％n＝272和62％n＝78。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：与目前已有的技术相比，)本发明首次对乳腺癌分子亚型内，包括基底细胞型(Basal-like)、HER2富集型(HER2-enriched)和管腔B型(LuminalB)，再进一步进行与临床远处复发密切相关的分子亚型再分型与风险评估，进一步加强了对这一类型乳腺癌风险评估的准确性，提临床治疗的能力，并在中国乳腺癌病例中进行方法的验证和优化，创立适合中国乳腺癌分子亚型内远处复发风险的最佳方案。
附图说明
图1表示根据乳腺癌基底细胞型肿瘤样本(n＝310)的9个基因表达水平，通过聚类分析，可将乳腺癌基底细胞型(Basal-like)进一步分为基底细胞型I(Basal I)、基底细胞型II(Basal II)、基底细胞型III(Basal III)和基底细胞型IV(Basal IV)。
图2表示根据的9个基因表达水平计算远处复发风险指数(BRR)，可将乳腺癌基底细胞型分为低、中和高复发风险组，其10年远处复发的风险分别为，12％(n＝55)、40％(n＝219)和58％(n＝36)。
图3表示根据乳腺癌HER2富集型肿瘤样本(n＝211)的13个基因表达水平，通过聚类分析，可将乳腺癌基底细胞型进一步分为HER2富集型I(HER2 I)和HER2富集型II(HER2II)。
图4表示根据的13个基因表达水平计算远处复发风险指数(HRR)，可将乳腺癌HER2富集型分为中和高复发风险组，其10年远处复发的风险分别为，25％(n＝134)和62％(n＝77)。
图5表示根据乳腺癌管腔B型肿瘤样本(n＝351)的9个基因表达水平，通过聚类分析，可将乳腺癌基底细胞型进一步分为管腔B型I(LumB I)、管腔B型II(LumB II)管腔B型III(LumB III)。
图6表示根据的9个基因表达水平计算远处复发风险指数(LRR)，可将乳腺癌管腔B型分为中和高复发风险组，其10年远处复发的风险分别为，34％(n＝272和62％(n＝78)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常型规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1评估乳腺癌分子亚型内远处复发风险基因群的筛选
实验方法：
通过EPIG基因表达谱分析程序分析14项乳腺癌队列研究中的310例基底细胞型(Basal-like)、211例HER2富集型(HER2-enriched)和351例管腔B型(Luminal B)基因表达和临床变量，筛选评估乳腺癌fenz亚型内远处复发风险基因群。所有队列研究数据均为公开发表、上传并储存于公共数据库数据。其中在ArrayExpress数据库1项，编号E-TABM-158，GEO数据库13项，编号分别为GSE11121、GSE12093、GSE1456、GSE2034、GSE2603、GSE3494、GSE45255、GSE4922、GSE5327、GSE6532、GSE7390、GSE8193和GSE9195。
分析包括两个部分:1、非监督性聚类分析识别表达谱及相关基因，2、候选基因的稳定性分析。首先通过聚类分析计算每个基因在样亚型样本中的彼此相关系数并以此聚类形成基因特异表达谱(r>0.7，P<0.001)，然后计算每个基因与特异表达谱的相关性，以此选择候选基因(r>0.7，P<0.001)。为了测试候选基因在每种乳腺癌亚型远处复发风险评估中的稳定性，我们随机选取每个亚型样本的一半进行同样过程分析，并重复1000次，对在所有1000次测试都出现的基因加以保留。
实验结果：筛选获得了9个评估基底细胞亚型(Basal-like)乳腺癌远处复发风险的基因，13个评估HER2富集亚型(HER2-enriched)乳腺癌远处复发风险的基因，9个评估管腔B亚型(Luminal B)乳腺癌远处复发风险的基因，基因列表见表1。
实施例2评估乳腺癌亚型内远处复发风险的基因的引物设计。
采用DASL-seq技术和MiSeq仪器二代测序法，针对基底细胞亚型(Basal-like)、HER2富集亚型(HER2-enriched)和管腔B亚型(Luminal B)，分别设计并优化9、13、9个基因测序的9、13、9对引物，并分别检测100例中国乳腺癌病人新鲜肿瘤组织或石蜡包埋的肿瘤组织中实施例1所筛选得到的基因表达水平。检测实施例1所筛选得到的基因和引物见表2-4，一些核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～SEQ ID No.64中所示。
实验结果：
1、基因筛选及引物设计
筛选获得了9个评估基底细胞亚型(Basal-like)乳腺癌远处复发风险的基因的9对引物。基因及引物列表见表2。
表2 9个评估基底细胞亚型(Basal-like)的基因的引物
| 基因名 | 基因上游区专一引物序列(f) | 基因下游区专一引物序列(r) |
| CD8A | ACTTGTGGGGTCCTTCTCCT | GAAAGGCTGGGCTTGTCTC |
| FN1 | CCATAAAGGGCAACCAAGAG | ACCTCGGTGTTGTAAGGTGG |
| GREM1 | TCTTCTCAGCCTCCTAGCCA | TCGAGTTGCAAGGGTTCTCT |
| IL2RB | AGAGATGGCCACGGTCC | TTACATCCACAGGGTGGAGC |
| IRF1 | GACCCTGGCTAGAGATGCAG | CTTCCATGGGATCTGGAAGA |
| POSTN | TTCAACAGATTTTGGGCACC | CAGCCTTTCATTCCTTCCAT |
| PRF1 | GCCTCGGTGAAGAGAGGATA | AGCAGCAGGAGAAGGATGC |
| SULF1 | ATGCAGGTTCTTCAAGGCAG | TGGAGTTCTTGAATTAGGTATCCTG |
| UBD | TGTCTGCAGAGATGGCTCC | TCATATGGGTTGGCATCAAA |
筛选获得了13个评估HER2亚型(HER2-enriched)乳腺癌远处复发风险的基因的13对引物。基因及引物列表见表3。
表3 13个评估HER2亚型(HER2-enriched)的基因的引物
| 基因名 | 基因上游区专一引物序列(f) | 基因下游区专一引物序列(r) |
| AEBP1 | GGTCCGAAAAGCCCAGG | TCTTGCCTTTCTTCCCTTTG |
| CD2 | CTGAAGACCGATGATCAGGA | CAGGTCAGGGTTGTGTTGAT |
| CDH11 | CTGACTTGTGAATGGGACCG | CGCTGAGCTGAAAACACAGT |
| CKAP2 | AGAGATGCGACACACGATTG | CTTCCTTGCTTGCACAAGACT |
| COL5A1 | CCATACCCGCTGGAAAGC | TCAGGCAAGTTGTGAAAATCT |
| CXCL9 | CCTTAAACAATTTGCCCCAA | TCACATCTGCTGAATCTGGG |
| FBN1 | TCAATGGAGGAAGGTGTGTG | AAACATGGGCCTGTCCTGTA |
| GZMK | CGTTTGTGGAGGTGTTCTGA | GAGAGTGTGCGCCTAAAACC |
| HLA-F | GCTCCGCAGATACTTGGAGA | GTGGCCTCATGGTCAGAGAT |
| HTRA1 | ACACCTACGCCAACCTGTG | ATTTATGGCGCAAACTGTTG |
| PSMB9 | ACCAACCGGGGACTTACC | ACTCGGGAATCAGAACCCAT |
| STAT1 | AGGAAGACCCAATCCAGATGT | TGAATATTCCCCGACTGAGC |
| TAP1 | TCCGGAAACCGTGTGTACTT | TCAGGGCTTTCGTACAGGAG |
筛选获得了9个评估管腔B亚型(Luminal B)乳腺癌远处复发风险的基因的9对引物。基因及引物列表见表4。
表4 9个评估管腔B亚型(Luminal B)的基因的引物
| 基因名 | 基因上游区专一引物序列(f) | 基因下游区专一引物序列(r) |
| BRF2 | CATCTCTGTGCTTGGCAGAA | CACCAACTGCATTGTTCGAG |
| C3 | CCTGGACTGCTGCAACTACA | GCAATGATGTCCTCATCCAG |
| CSF1R | AAAGCGTGAGAGCACGAAGT | TTGGGCTGATCCTCTTCTTC |
| EIF4EBP1 | CGGGGACTACAGCACGAC | AGTTCCGACACTCCATCAGG |
| HLA-DPB1 | CGTTACTGATGGTGCTGCTC | AGCGCTGTGTCCCATTAAAC |
| HLA-DRA | TGGAGTCCCTGTGCTAGGAT | ATAGAACTCGGCCTGGATGA |
| LSM1 | CTCGAGGGATTTTTGTGGTC | ATACTTGCTGGAGGGGTGTG |
| PRR11 | AAAGCCAAAGCCGAAAGATT | TGATGTTAGCCAGCTTCTGC |
| RIOK3 | ATCTGGTAGGAGTGGCATCG | GGCCAGCTGTTCACTCATTAC |
2、二代测序数据库的建立。所有实施例2中所述的每个亚型的100例中国乳腺癌病人的新鲜肿瘤组织或石蜡包埋的肿瘤组织进行二代测序的原始数据都会上传到一个基于网络的数据储存和分析库。这一方法采用自行开发的基于阿里云的Precitype平台，能够1)、直接从Illumina MiSeq仪器输入数据；2)、可以灵活的方式显示录入的数据，并可按不同的需求，如基因相关性、样本或实验组别，进行索引；3)、计算以看家基因标化后的基因表达谱；4)、分析特定元素的细节；5)、以不同的格式输出数据，如XML、excel和文本格式；6)、可安全管理、确保数据隐私保护。
实施例3利用评估乳腺癌亚型内筛选基因群进行分子亚型再分型及远处复发风险评估。
取乳腺癌肿瘤组织，抽取肿瘤细胞中的RNA(Roche Catalog Number#3270289001或QiangenCatalog Number#73504)。对实施例2中所筛选获得的3组评估基因的基因群表达谱用通用的Bowti方法来进行定量分析MiSeq原始资料，然后用Hu等的SSP方法(Hu Z etal.,A compact VEGF signature associated with distant metastases and pooroutcomes.BMC Med 2009,7:9.)对乳腺癌肿瘤样品进行亚型内再分型和复发风险测定。
实验结果：
1、基底细胞型(Basal-like)分型和复发风险预测
基底细胞型(Basal-like)肿瘤一般认为是侵入性最强的肿瘤，即绝大多数属于我们常说的三阴性肿瘤(ER-，HER2-，PR-)。正因如此，基底细胞型肿瘤目前的乳腺癌治疗方案都不敏感，临床预后较差。我们利用评估乳腺癌基底细胞型(Basal-like)亚型分型基因群进行基底细胞型(Basal-like)乳腺癌再分型，可以进一步将乳腺癌基底细胞型(Basal-like)再分为4型(图1)，并根据其远处复发风险(图2)对治疗提出不同建议：
图1表示根据乳腺癌基底细胞型肿瘤样本(n＝310)的9个基因表达水平，通过聚类分析，可将乳腺癌基底细胞型(Basal-like)进一步分为基底细胞型I(Basal I)、基底细胞型II(Basal II)、基底细胞型III(Basal III)和基底细胞型IV(Basal IV)。
图2表示根据的9个基因表达水平计算远处复发风险指数(BRR)，可将乳腺癌基底细胞型分为低、中和高复发风险组，其10年远处复发的风险分别为，12％(n＝55)、40％(n＝219)和58％(n＝36)。
10年远处转移风险计算如下：
Basal immunescore＝(CD8A+IL2RB+PRF1)÷3
Basal extracellscore＝(FN1+SULF1+GREM1+POSTN)÷4
BasalRiskof Recurrence＝0.5x basal extracellscore-1.0x basalimmunescore-0.3x UBD-0.8x IRF1
基底细胞型低远处转移风险组。尽管属于乳腺基底细胞型肿瘤，但此组病例的预后非常好，10年远处转移的风险小于12％。对于此类患者，如果没有淋巴结转移，手术后可考虑不进行化疗。即使少数病例发生远处转移，当前的免疫治疗PD1抑制剂会有较好的疗效。此组病例表现为免疫应答基因及相关抗原递呈基因高表达，显示具有良好的免疫功能。而对预后有不良影响的细胞间质结构相关基因低表达。该组病例约占乳腺癌基底细胞型(Basal-like)的18％左右。
基底细胞型中远处转移风险组。此组病例预后不良，10年远处转移的风险约为40％。对于此类患者，手术后应积极进行化疗。此组病例表现为免疫应答基因及相关抗原递呈基因表达均较低，同时细胞间质结构相关基因表达也较低。此组病例对PD1抑制剂治疗可能不敏感，可能需要配合其他细胞免疫治疗，提升免疫功能。此风险组约占乳腺癌基底细胞型(Basal-like)的70％左右。
基底细胞型高远处转移风险组。此组病例预后极差，10年远处转移的风险约在58％以上，且绝大多数在4年内转移，需要在术后4年内密切随访、观察。对于此类患者，手术后应积极进行化疗。此组病例表现为免疫应答基因及相关抗原递呈基因均低表达，而细胞间质结构相关基因高表达。此组病例对PD1抑制剂治疗可能不敏感，可能需要配合其他细胞免疫治疗，提升免疫功能。此风险组约占乳腺癌基底细胞型(Basal-like)的11％左右。
2、HER2富集型(HER2-enriched)分型和复发风险预测
此型p53基因的突变率很高，肿瘤分化相对较差，此型对靶向分子治疗相对敏感，但预后较差。HER2富集型的肿瘤广泛采用赫赛汀联合系统化疗的治疗方案。通过13个基因表达的检测，可进一步分为2个亚型(图3)，并根据其远处复发风险(图4)分为中复发风险组和高复发风险组。
图3表示根据乳腺癌HER2富集型肿瘤样本(n＝211)的13个基因表达水平，通过聚类分析，可将乳腺癌基底细胞型进一步分为HER2富集型I(HER2I)和HER2富集型II(HER2II)。
图4表示根据的13个基因表达水平计算远处复发风险指数(HRR)，可将乳腺癌HER2富集型分为中和高复发风险组，其10年远处复发的风险分别为，25％(n＝134)和62％(n＝77)。
HIS＝(CD2+GZMK+CXCL9)÷3
HES＝(HTRA1+FBN1+COL5A1+AEBP1+CDH11)÷5
HAS＝(HLA-F+TAP1+PSMB9+STAT1)÷4
HRR＝0.8x HES-0.5x HIS-0.7x HAS-0.3x CKAP2
HER2型中远处转移风险组。此组病例预后不良，10年远处转移的风险约为25％。对于此类患者，手术后应积极进行靶向治疗和化疗。此组病例多数病例表现为免疫应答基因及相关抗原递呈基因表达相对较高，同时细胞间质结构相关基因表达也较低。此组病例对PD1抑制剂治疗应有较好疗效。此风险组约占乳腺癌HER2富集型的64％左右。
HER2富集型高远处转移风险组。此组病例预后极差，10年远处转移的风险约在62％以上，同样是绝大多数在4年内转移，需要在术后4年内密切随访、观察。对于此类患者，手术后应积极进行靶向治疗和化疗。此组病例表现为免疫应答基因及相关抗原递呈基因均低表达，而细胞间质结构相关基因高表达。此组病例对PD1抑制剂治疗可能不敏感，可能需要配合其他细胞免疫治疗，提升免疫功能。此风险组约占乳腺癌HER2富集型的36％左右。
3、管腔B型(Luminal B)分型和复发风险预测
此型属于内分泌治疗敏感的肿瘤，但对三苯氧胺的疗效较管腔A型差，对芳香化酶抑制剂的效果较好。有部分患者可HER2阳性，可尝试进行分子靶向治疗，但效果不如HER2富集型效果好。通过9个基因表达的检测，可进一步分为3型(图5)，并根据其远处复发风险(图6)分为中复发风险组和高复发风险组。
图5表示根据乳腺癌管腔B型肿瘤样本(n＝351)的9个基因表达水平，通过聚类分析，可将乳腺癌基底细胞型进一步分为管腔B型I(LumB I)、管腔B型II(LumB II)管腔B型III(LumB III)。
图6表示根据的9个基因表达水平计算远处复发风险指数(LRR)，可将乳腺癌管腔B型分为中和高复发风险组，其10年远处复发的风险分别为，34％(n＝272和62％(n＝78)。
LBI＝(CSF1R+C3+HLA-DPB1+HLA-DRA)÷4
LBH＝(BRF2+EIF4EBP1+LSM1)÷3
LBCS＝(PRR11+RIOK3)÷2
LBRR＝0.5x LBHS+0.7x LBCS-0.8x LBIS
管腔B型中远处转移风险组。此组病例预后不良，10年远处转移的风险约为34％。对于此类患者，手术后应积极进行化疗。此组病例表现为免疫应答基因高或中等表达，而对预后有不良影响的组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性等相关基因低或中等表达。此组病例对PD1抑制剂治疗应有较好疗效。此风险组约占乳腺癌管腔B型的77％左右。
管腔B型高远处转移风险组。此组病例预后极差，10年远处转移的风险约在62％，且绝大多数在5年内转移，需要在术后5年内密切随访、观察。对于此类患者，手术后应积极进行化疗。此组病例表现为免疫应答基因低表达，而对预后有不良影响的组蛋白赖氨酸甲基转移酶活性等相关基因高表达。此组病例对PD1抑制剂治疗可能不敏感，可能需要配合其他细胞免疫治疗，提升免疫功能。此风险组约占乳腺癌管腔B型的77％左右。
实施例4利用评估乳腺癌分子亚型内远处复发风险基因群的检测试剂盒进行亚型内分型和远处复发风险评估。
试剂盒的使用：
步骤1：取检测对象肿瘤或石蜡包埋组织，利用检测试剂盒中的方法获取检测对象含肿瘤细胞高的区域为原始材料。
步骤2：提取组织中总RNA。可以使用Roche公司生产的RNA抽提试剂盒来提取组织中的RNA(产品号为Roche Catalog Number#3270289001)或者Qiangen公司的RNA抽提试剂盒来提取(QiagenRNease FFPE kit,Catalog Number#73504。
步骤3：将所得RNA制成可供测序的文库。将所得组织的RNA制成可供DASL-seq技术二代测序的文库，文库的制备方法包括以下步骤：
将提取组织的RNA在专一引物的指导下用反转录酶生成感兴趣的多种基因(如表1所述的9个基因)cDNA。末端补平并进行5’端磷酸化，将30μ1DNA、45μ1纯水、10μ1具有10mMATP的T4 DNA连接酶缓冲液、4μ1包含10mM dNTPMix、5μ1T4 DNA聚合酶、1μl Klenow酶、5μ1Τ4连接酶混合后，在20℃温浴30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。末端悬A:将上步的产物溶解在32μ1缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μ1，1mM dATP 10μ1、KlenowΕχο-3μ1，在37℃保持30分钟(试剂来自Illumina样本准备试剂盒)，产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(part#28004)连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2χ25μ1、PEAdapterOligo Mix 10μl，DNA连接酶5μ1,在20℃保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001)，温浴后釆用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA即得文库。
步骤4：利用实施例2表2-4中的引物序列对所得DNA文库进行用MiSeq进行二代测序。用Illumina MiSeq测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成(Illumina公司)。
步骤5：结果统计分析。将所得测序结果进行统计分析，根据Hu等开创的单一样品预测法SSP(Single Sample Predictor)和Parker等优化的方法来进行亚型分型和风险预测。对将所得测序结果基因表达数据进行分析即得。
实施例5敏感度
本发明的检测方法无论是敏感度还是拷贝数检测能力都是最好。本发明实验研究表明用二代测序来测定基因表达谱，其敏感度(Sensitivity)远高于基因芯片法，同时也较定量PCR和Nanostring法更为敏感和优化。
实施例6重复性
本发明的检测方法重复性高。用石蜡组织RNA做的7个重复实验，相关系数高于0.97。用新鲜冷冻组织的15个重复，相关系数高于0.99。
对于本领域技术人员而言，显而易见的是，在不脱离本发明所附权利要求所披露的范围和精神的前提下，可以进行多种修改和变型，并且这些修改和变型均落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 海门善准生物科技有限公司
上海善准生物科技有限公司
<120> 乳腺癌分型内远处复发风险基因群及体外诊断产品和应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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ggccagctgt tcactcatta c 21
Claims (10)
1.一组乳腺癌分子分型内远处复发风险基因群，其特征在于，其包括评估基底细胞型内远处复发风险基因CD8A、FN1、GREM1、IL2RB、IRF1、POSTN、PRF1、SULF1和UBD；评估HER2富集型乳腺癌远处复发风险基因AEBP1、CD2、CDH11、CKAP2、COL5A1、CXCL9、FBN1、GZMK、HLA-F、HTRA1、PSMB9、STAT1和TAP1；评估管腔B型乳腺癌远处复发风险基因BRF2、C3、CSF1R、EIF4EBP1、HLA-DPB1、HLA-DRA、LSM1、PRR11和RIOK3。
2.如权利要求1所述的复发风险基因群作为标志物在制备评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的产品中的应用，所述乳腺癌分子分型包括基底细胞型、HER2富集型和管腔B型。
3.检测如权利要求1所述的复发风险基因群的基因表达水平的试剂在制备用于评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品中的应用，所述乳腺癌分子分型包括基底细胞型、HER2富集型和管腔B型。
4.一种评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断试剂包括特异性检测如权利要求1所述的复发风险基因群的基因表达水平的试剂。
5.如权利要求4所述的体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断产品包括二代测序检测试剂盒、定量PCR。
6.如权利要求5所述的体外诊断产品，其特征在于，所述检测试剂盒包括扩增如权利要求1所述的复发风险基因群的引物。
7.如权利要求6所述的体外诊断产品，其特征在于，所述基底细胞型内远处复发风险基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1～9所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.10～18所示。
8.如权利要求6所述的体外诊断产品，其特征在于，所述HER2富集型乳腺癌远处复发风险基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.19～31所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.32～44所示。
9.如权利要求6所述的体外诊断产品，其特征在于，所述管腔B型乳腺癌远处复发风险基因的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.45～53所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.54～62所示。
10.如权利要求7～9之任一项所述的引物在用于制备评估乳腺癌分子分型内远处复发风险的产品中的应用，所述乳腺癌分子分型包括基底细胞型、HER2富集型和管腔B型。
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