CN109385474A - 乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群及诊断产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一组可以对乳腺癌分子分型及远处转移风险进行评估的基因群；公开了由检测这些基因群的基因表达水平的试剂在制备用于评估乳腺癌分子分型及远处转移风险的体外诊断产品中的应用；所述体外诊断产品包括检测试剂盒、基因芯片和蛋白质阵列。本发明还公开了利用所述检测试剂盒对乳腺癌分子分型及远处转移风险进行评估的方法。本发明所述方法对乳腺癌亚型分型及发生远处转移风险的评估具有较高的准确性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及乳腺癌亚型分型及评估远处转移风险基因群及其体外诊断产品和应用，本发明通过检测一组乳腺癌亚型及远处转移相关基因表达，对乳腺癌进行亚型分型及远处转移风险评估。
背景技术
乳腺癌的亚型分型由美国Charles Perou教授于2002年率先提出。以检测乳腺癌组织中的基因表达谱和分子生物学特征为基础提出的乳腺癌分子生物学分型，能较好地反映肿瘤的生物学行为，具有重要的临床治疗指导意义。当前国际上公认的基于肿瘤基因表达的乳腺癌分子分型产品为北卡罗来纳大学Perou教授与Prosigna合作共同开发的PAM50，其已得到美国FDA批准。PAM50通过检测55个基因表达水平，将乳腺癌分为4种亚型，管腔A型(Luminal A，简称LumA)、管腔B型(Luminal B，简称LumB)、HER2富集型(HER2-enriched，简称HER2)及基底细胞型(Basal-like，简称Basal)，并根据亚型及肿瘤增殖指数评估乳腺癌10年内远处转移的危险性。
虽然乳腺癌分子分型的概念已得到广泛接受并应用于指导临床治疗当中，但是由于其采用的NanoString技术要求较高、设备和试剂昂贵，一般的医疗机构没有条件开展，所以临床上往往采用免疫组化(IHC)的替代方法，通过半定量检测ER、PR、HER2和Ki67蛋白表达水平来估测乳腺癌亚型。目前，国内的乳腺癌亚型分型基本都采用IHC方法，但是，其分型并不精确，且与基于基因表达的分型有30％左右的不一致性，因此，常会影响临床治疗方案的正确制定。
近期的多项研究表明，乳腺癌组织当中的免疫基因表达水平与高危亚型的乳腺癌的远处转移的发生密切相关，包括管腔B型(Luminal B)、HER2富集型(HER2-enriched)及基底细胞型(Basal-like)。而PAM50除了检测技术要求高、费用昂贵外，其并没有将乳腺癌预后及治疗效果密切相关的免疫调控基因纳入分析系统，使最终的分型评分系统有一定局限性。
发明内容
针对以上的临床需求和产品不足，本发明开发了一组基于25个基因表达的，用于乳腺癌亚型分型及远处转移风险评估的方法。通过前期约2800例乳腺癌样本验证，25基因与PAM50的分子分型平均符合率为82％；远处转移风险评估符合率为80％。本发明通过引入免疫相关基因，以及基于免疫指数的计算，可以对高复发风险的管腔B型(Luminal B)、HER2富集型(HER2-enriched)及基底细胞型(Basal-like)乳腺癌做进一步风险评估，指导临床治疗，同时也可作为今后乳腺癌免疫检查点抑制剂治疗的伴随诊断指标。本发明乳腺癌亚型分型及远处转移风险基因群测试组合的特点在于，在保持与PAM50分型和风险评估高度一致的情况下，增加了免疫指数评估，同时本发明所述的检测方法(如定量PCR)操作简便、费用显著降低，易于在医疗机构或检测机构等中进行推广。
本发明所要解决的技术问题是针对目前评估乳腺癌分子分型基因检测的方法较为复杂、成本高以及评价体系不完善或免疫组化的不准确、具有局限性等的问题，提供了一组评估乳腺癌分子分型及远处转移风险的基因群及其体外诊断试剂盒，以更加准确预测乳腺癌亚型分型及远处转移风险，并指导临床治疗。
本发明提出了一组乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群，命名为普瑞泰(Precitype)，其包括24个分子分型及远处转移风险评估相关基因，1个看家基因；其中，所述24个分型及远处转移风险评估相关基因包括：基底细胞相关基因EGFR、KRT14、KRT17、KRT5、和SFRP1，雌激素受体相关基因BCL2、ESR1、NAT1、PGR和SCUBE2，HER2相关基因ERBB2和GRB7；免疫相关基因CCL5、CXCL9、GZMA、HLA-DMA和IL2RG，增殖相关基因AURKA、BIRC5、CCNB1、CDC20、MKI67、TOP2A、UBE2C，所述看家基因为ACTB。所述评估乳腺癌分子分型(亚型分型)及远处转移风险基因群如表1所示。
表1乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群
本发明还提供了如上所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群作为标志物在对乳腺癌进行分子分型及评估远处转移风险中的应用。
本发明还提供了如上所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群作为标志物在制备对乳腺癌进行分子分型及评估远处转移风险的产品中的应用。
本发明还提供了检测如上所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的基因表达水平的试剂在制备对乳腺癌进行分子分型及评估远处转移风险的体外诊断产品中的应用。
本发明还提供了一种对乳腺癌进行分子分型及评估远处转移风险的体外诊断产品，所述体外诊断试剂包括特异性检测如上所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的基因表达水平的试剂。
其中，所述体外诊断产品包括但不限于是检测试剂盒、基因芯片和蛋白质阵列等。其中，所述检测试剂盒为一步法实时多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括扩增如上所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的引物和/或探针。其中，所述基因芯片包括如上所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的cDNA或寡核苷酸探针点样于固相支持物表面制备而成。
其中，所述引物为Taqman引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1～25所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.26～50所示；所述探针为Taqman探针，所述探针的序列如SEQ ID NO.51～75所示。
本发明还提出了用于检测如上所述乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群表达的引物和探针组，所述引物为Taqman引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1～25所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.26～50所示；所述探针为Taqman探针，所述探针的序列如SEQ ID NO.51～75所示，其中，所述探针通过特异性地与如上所述乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群中的基因杂交来检测出所述基因。
本发明还提供了如上所述的引物和探针组在用于制备对乳腺癌进行分子分型及评估远处转移风险的产品中的应用。
本发明中，所述乳腺癌的亚型包括管腔A型、管腔B型、HER2富集型及基底细胞型，所述高危亚型乳腺癌包括管腔B型、HER2富集型及基底细胞型。
本发明所述检测试剂盒较佳地还包括：总RNA抽提试剂、逆转录试剂和/或定量PCR试剂。
其中，所述总RNA抽提试剂为本领域常规的总RNA抽提试剂。
其中，所述逆转录试剂是本领域常规的逆转录试剂，较佳地包括dNTP溶液和/或RNA逆转录酶。
其中，所述定量PCR试剂为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行定量PCR检测的要求即可。所述定量PCR试剂较佳地为市售可得。所述定量PCR为本领域常规的定量PCR，较佳地，为Taqman-实时荧光定量PCR技术。所述PCR试剂较佳地还包括可供构建定量PCR的文库的试剂。
本发明所述检测试剂盒较佳地还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取检测样本的器械；更佳地，还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取组织或血液的器械，所述器械较佳地为任何能用于取血的釆血针、注射器等。
其中，所述检测样本为只要能满足抽提出检测对象的总RNA即可。所述检测样本较佳地为组织样本、血液、血浆和体液中的一种或几种，更佳地为组织样本，更佳地为石蜡组织样本或穿刺活检的新鲜组织样本，优选地为肿瘤细胞含量高的组织样本。
本发明还提出一组免疫相关基因，其包括如表1所示的五个基因：CCL5、CXCL9、GZMA、HLA-DMA和IL2RG。
本发明还提出如上所述的免疫相关基因CCL5、CXCL9、GZMA、HLA-DMA和IL2RG在制备评估乳腺癌远处转移风险的体外诊断产品中的应用。
本发明还提出一种检测如上所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的方法，其包括以下步骤：
(1)利用如上所述的检测试剂盒提取检测对象的总RNA；
(2)对步骤(1)所得对应每个基因的RNA进行一步法实时多重荧光定量RT-PCR检测。
其中，步骤(2)所述一步法实时多重荧光定量RT-PCR检测的方法为Taqman实时多重荧光定量RT-PCR，对24个靶基因(即24个分子分型及远处转移风险评估相关基因)和1个看家基因分成8个反应体系，分别进行荧光定量RT-PCR检测。每个反应体系包含3个靶基因和1个看家基因，每个反应体系中包含4个探针，4个探针分别标记不同荧光。其中，每个反应体系配制如下：
如上所述RNA样本2μl(总量100-400ng)，如上所述的4对正向、反向两条特异性引物(10μM)各0.4μl，4个Taqman荧光探针(10μM)各0.2μl，反应混合液6μl，酶混合液4μl，DEPC水4μl；其中，逆转录反应在50℃15-20分钟，预变性95℃5分钟；扩增反应包括变性95℃10秒，退火、延伸及荧光检测60℃45-60秒，进行45个循环，其中60℃荧光检测通道为FAM/HEX/VIC/ROX/Cy5；扩增反应结束后，记录每个基因的Ct值，代表了各个基因的表达水平。
其中，所述方法还包括步骤(3)，将所得检测结果进行统计分析，根据自主开发并优化的计算方法来进行乳腺癌亚型分子分型，并结合增殖指数和免疫指数计算乳腺癌的远处转移风险。
其中，检测所述乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的方法中，检测平台为ABI7500实时荧光定量PCR仪或罗氏480II实时荧光定量PCR仪或其他所有可进行实时荧光定量检测的PCR仪。
本发明中，所述检测方法可用于诊断目的或非诊断目的。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：与目前已有的PAM50技术相比，本发明在远处转移风险评估体系中增加了免疫指数，使得对高危亚型乳腺癌远处转移风险的评估更加准确。所采用的定量PCR方法，检测成本低，易于在医疗机构和检测机构等中进行推广；与目前常用的IHC技术相比，本发明对乳腺癌分子分型的准确度提高20％以上，并可计算出远处转移风险，对远处转移风险进行预测，可更加精确指导临床治疗。通过约2800例乳腺癌样本验证，本发明所述的25个基因与PAM50的分子分型平均符合率为82％；远处转移风险评估符合率为80％。
附图说明
图1表示根据乳腺癌组织中19个基因表达水平，将乳腺癌分为管腔A型(LumA)、管腔B型(Lum B)、基底细胞型(Basal)和HER2富集型(HER2)。A、1951欧美病例；B、824中国病例。
图2表示乳腺癌每种亚型远处转移风险有不同。其中，管腔A型远处转移风险显著低于其他三种亚型。手术后5年之内远处转移风险，管腔B型(Lum B)小于基底细胞型(Basal)，而基底细胞型(Basal)小于HER2富集型(HER2)。手术后10年后，欧美病例三者没有显著差别，中国病例HER2富集型预后最差。A、1951欧美病例；B、824中国病例。
图3表示免疫指数对乳腺癌的预后有重要影响。其中，对于高风险型的乳腺癌亚型中的基底细胞型(Basal)和HER2富集型(HER2)，免疫功能强可显著降低病人乳腺癌远处转移风险，而对于管腔B型(Lum B)，免疫功能强降低病人乳腺癌远处转移风险的作用相对较弱；对于低风险乳腺癌亚型管腔A型(LumA)，免疫功能的强弱对于预后无明显影响。A、1951欧美病例；B、824中国病例。
图4表示根据所计算出的复发风险指数，肿瘤远处转移的风险分为三组，低风险(0-39)、中等风险(40-59)和高风险(60-100)。A、1951欧美病例；B、824中国病例。
图5与Oncotype Dx(21基因风险评估)和PAM50风险评估相比，本发明Precitype风险评估引入了免疫指数，使得风险评估体系更为准确。由于免疫强(免疫指数高)可降低远处转移风险，部分原来21基因或PAM50评估为中风险甚至少数评估为高风险的病例，在采用本发明引入免疫指数的Precitype风险评估方法进行评估后，被评估为低风险(右框)；反之，免疫弱(免疫指数低)可增加远处转移风险，部分原来21基因或PAM50评估为中风险的病例，在采用本发明引入免疫指数的Precitype风险评估方法进行评估后，被评估为高风险(左框)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1评估乳腺癌亚型分型及远处转移风险相关基因群的筛选
实验方法：通过EPIG基因表达谱分析程序分析14项乳腺癌队列研究中的1951例乳腺癌肿瘤基因表达和临床变量，筛选出与乳腺癌远处转移风险密切相关的免疫相关基因与细胞周期基因，结合已报导的ER、PR及亚型分型相关基因，在每组基因中计算并优选对分型及远处转移风险贡献率大的基因。
实验结果：共筛选获得了与乳腺癌亚型分型及远处转移风险相关的24个基因及1个看家基因，组成一组25个基因测试组合。基因列表见表1。
实施例2采用所筛选的乳腺癌亚型分型及远处转移风险相关基因群对乳腺癌进行分子分型及远处转移风险评估
实验方法：采用25基因测试组合，其中19个乳腺癌分子分型基因群(基底细胞相关基因EGFR、KRT14、KRT17、KRT5和SFRP1，雌激素受体相关基因BCL2、ESR1、NAT1、PGR和SCUBE2，HER2相关基因ERBB2和GRB7；增殖相关基因AURKA、BIRC5、CCNB1、CDC20、MKI67、TOP2A、UBE2C)用于分子分型，5个基因(免疫相关基因CCL5、CXCL9、GZMA、HLA-DMA和IL2RG，)用于计算免疫指数，1个基因内参(看家基因ACTB)作为内标。计算远处转移风险指数时采用表1中除1个基因内参(看家基因为ACTB)外的其他所有24个基因。首先对欧美乳腺癌公共数据库中1951例欧美乳腺癌肿瘤患者的数据进行分子分型(亚型分型)和远处转移风险评估(图1A)；并对824例中国乳腺癌肿瘤样品进行分子分型(亚型分型)和远处转移风险评估(图1B)，并将两者进行比较。
实验结果：
1、乳腺癌分子分型
如上所述，利用表1所示19个乳腺癌分子分型基因群对以上乳腺癌病例进行分子分型，将乳腺癌肿瘤分为四个亚型(图1)，并对其治疗给出不同建议：
1)、管腔A型(LuminalA)
管腔A型肿瘤患者的p53基因突变率很低，预后较好，其对化疗不敏感，而适合内分泌治疗，故对临床内分泌治疗有指导意义。
2)、管腔B型(Luminal B)
管腔B型属于内分泌治疗敏感的肿瘤，但对于HER2阳性患者来说，采用三苯氧胺治疗的疗效较管腔A型差，而采用芳香化酶抑制剂的效果较好。对于HER2阳性的管腔B型肿瘤患者，可进行分子靶向治疗。
3)、HER2富集型(HER2-enriched)
HER2富集型肿瘤患者的p53基因的突变率很高，肿瘤分化相对较差，此型对靶向分子治疗相对敏感，但预后较差。HER2富集型的肿瘤广泛采用赫赛汀联合系统化疗的治疗方案。
4)、基底细胞型(Basal-like)
基底细胞型肿瘤是侵入性最强的肿瘤，即人们常说的三阴性肿瘤(ER-，HER2-，PR-)。基底细胞型肿瘤患者对目前的乳腺癌治疗方案都不敏感，一般临床预后较差；但如果肿瘤组织免疫相关基因表达强，预后则相对好。
如图2所示，上述四个亚型的远处转移风险不同，管腔A型的远处转移风险最低，风险中等；对于5年远处转移风险来说，管腔B型低于HER2富集型和基底细胞型；对于10年远处转移风险来说，管腔B型、HER2富集型和基底细胞型三者无显著差异，均属高风险亚型。
2、免疫指数对不同亚型远处转移风险的影响
根据5个免疫基因CCL5、CXCL9、GZMA、HLA-DMA和IL2R的表达水平计算免疫指数，根据免疫指数可将每个亚型进一步分为两组，即，免疫强的组和免疫弱的组，并观察两组之间的转移风险差异。其中，管腔B型(Luminal B)、基底细胞型(Basal-like)及HER2富集型(HER2-enriched)亚型中，免疫强的病例的远处转移风险显著低于(P＜0.001)免疫弱的病例；而管腔A型(LuminalA)，免疫强的病例和免疫弱的病例的远处转移风险差异不显著(图3)。
3、远处转移风险评估
根据肿瘤的亚型、免疫指数和增殖指数计算远处转移风险评分(复发风险指数)，用以评估肿瘤远处转移风险，计算方法如下。
远处转移风险评分(Risk ofRecurrence Score,RRS)的计算：0-100
0-39，低风险；40-59，中风险；60-100，高风险；
RRS＝0.48x Basal+0.21x HER2–0.22x LumA+0.37x LumB+0.27x增殖指数-0.26x免疫指数
其中，“Basal”代表该肿瘤与基底细胞型肿瘤的pearson相关系数；
“HER2”代表该肿瘤与HER2富集型肿瘤的pearson相关系数；
“LumA”代表该肿瘤与管腔A型肿瘤的pearson相关系数；
“LumB”代表该肿瘤与管腔B型肿瘤的pearson相关系数。
如图4所示，根据所计算得出的远处转移风险评分，可将肿瘤远处转移的风险分为三组，低风险(0-39)、中等风险(40-59)和高风险(60-100)。
对于低风险组病例，如果淋巴结检查阴性，则不建议进行辅助化疗。
实施例3评估高危乳腺癌亚型免疫相关基因的引物和探针设计及实验室验证
实验方法：采用Taqman荧光定量PCR技术，分别设计并优化25对Taqman引物和25个探针，取乳腺癌肿瘤组织，提取肿瘤细胞中的RNA(Roche Catalog Number#3270289001或Qiangen CatalogNumber#73504)。采用Taqman荧光定量PCR方法，对100例中国乳腺癌病人新鲜肿瘤组织或石蜡包埋的肿瘤组织，分别检测实施例1所筛选得到的如表1所示基因的表达水平。
实验结果：检测实施例1所筛选得到的基因的表达水平的引物和探针序列见表2。
表2乳腺癌亚型分型及远处转移风险基因相关Taqman引物和探针序列
实施例4一组评估乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的定量PCR检测试剂盒分析方法
步骤1：取检测对象肿瘤新鲜或石蜡包埋组织，利用检测试剂盒中的方法获取检测对象中含肿瘤细胞高的区域为原始材料。
步骤2：提取组织中总RNA。可以使用Roche公司生产的RNA抽提试剂盒来提取组织中的RNA(产品号为Roche Catalog Number#3270289001)或者Qiangen公司的RNA抽提试剂盒来提取(Qiagen RNease FFPE kit,CatalogNumber#73504)。
步骤3：一步法多重荧光定量RT-PCR检测。所述一步法实时多重荧光定量RT-PCR检测的方法为Taqman实时多重荧光定量RT-PCR，将表1中24个靶基因和1个看家基因分成8个反应体系，分别进行荧光定量RT-PCR检测。每个反应体系包含3个靶基因和1个看家基因，采用4个探针分别标记不同荧光。每个反应体系配制如下：
RNA样本2μl(总量100-400ng)，如上所述的4对正向、反向两条特异性引物(10μM)各0.4μl，4个Taqman荧光探针(10μM)各0.2μl，反应混合液6μl，酶混合液4μl，DEPC水4μl；其中，逆转录反应在50℃15-20分钟，预变性95℃5分钟；扩增反应包括变性95℃10秒，退火、延伸及荧光检测60℃45-60秒，进行45个循环，其中60℃荧光检测通道为FAM/HEX/VIC/ROX/Cy5；扩增反应结束后，记录每个基因的Ct值，代表了各个基因的表达水平。
步骤4：结果统计分析。将所得测序结果进行统计分析，根据Hu等提出的单一样品预测法SSP(Single Sample Predictor)或Parker等优化的方法来进行乳腺癌分型和风险预测。对所得测序结果基因表达数据进行分析。
实施例5本发明25基因方法与PAM50方法对乳腺癌进行分子分型及远处转移风险评估体系的比较
采用本发明25基因方法与PAM50的55基因方法对1951例欧美乳腺癌病例进行分子分型及远处转移风险评估的一致性分别达到82％(表3)和80％(表4)。
采用本发明25基因方法与PAM50的55基因方法对824例中国乳腺癌病例进行分子分型及远处转移风险评估的一致性分别为84％(表5)和80％(表6)。
本发明的25基因方法采用荧光定量PCR的方法，操作相对容易，检测费用较低，更加容易临床推广。而现有技术中的PAM50方法并不包含本发明在25基因的测试组合方法中所采用的本发明人独立研究得出的与乳腺癌远处转移密切相关的5个免疫基因。
目前已有大量的实验和临床研究表明，乳腺癌组织中，浸润淋巴细胞数及免疫相关基因表达水平与乳腺癌的预后以及治疗效果密切相关，但是目前市场上尚无任何一个乳腺癌分子检测产品(包括PAM50)，将免疫相关基因表达与增殖相关基因表达及分子亚型相结合来预测乳腺癌远处转移风险。
本发明的临床研究数据证实，基于免疫相关基因的表达水平计算获得的免疫指数，是乳腺癌预后的关键参数指标，其对高风险型乳腺癌的远处转移风险评估有重要影响；免疫基因高表达表明肿瘤的远处转移风险降低；反之，免疫基因低表达提示肿瘤的转移风险增加。本发明通过免疫基因表达水平来计算免疫指数，并结合增殖指数和分子亚型计算远处转移风险，对于高风险亚型的远处风险预测更为精确，对临床治疗指导有重要意义(图3、图4、图5)。
表3、1951例欧美病例25基因与PAM50方法对乳腺癌亚型分型比较
表4、1951例欧美病例25基因与PAM50远处转移风险评估比较
表5、824例中国病例25基因与PAM50方法对乳腺癌亚型分型比较
表6、824例中国病例25基因与PAM50远处转移风险评估比较
对于本领域技术人员而言，显而易见的是，在不脱离本发明所附权利要求所披露的范围和精神的前提下，可以进行多种修改和变型，并且这些修改和变型均落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 上海善准生物科技有限公司
<120> 乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群及诊断产品和应用
<150> 201810164715.9
<151> 2018-02-27
<160> 75
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 1
cactcttcca gccttccttc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 2
catggagatt gcctcttcta gg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 3
ggtcaagccc agaaagtgat a 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 4
gccagggtca gagttaaata gag 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 5
gcttcgatga tgggcttact 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 6
gaccattgat ggcaggaact a 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 7
ctcctttggg tcagagctta tt 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 8
catcagggag ctacttcctt tc 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 9
ccttccttcc tgcttgagtt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 10
gggctttgtc ctctctttgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 11
gctcaggctg accactttat 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 12
gagactcgtg caatggagat t 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 13
gttcctgaca cagacagact ac 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 14
tgcccacatc aaggagtatt t 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 15
gtgtgcctta acctccctat tc 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 16
tgggaagggt tgtgaatgag 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 17
gatgcagaag atggagctga t 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 18
caaggagaac cagcctgaaa 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 19
taacaccatc agcagggaaa g 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 20
gacgcttcgt tatgggaaga ta 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 21
tctggaatta gggagggtga g 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 22
cactcttcca gccttccttc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 23
gtgggtggag atgtcaatgt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 24
gtgggtggtg agatcaatgt 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 25
catggagatt gcctcttcta gg 22
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 26
gtacaggtct ttgcggatgt 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 27
tctcctggga accaaagaat g 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 28
aaagactgtg ggcagagaag 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 29
gcctctcttg cggagtattt 20
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 30
cctgatcatg gagggtcaaa tc 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 31
ggctgatcct tcccagaaat ta 22
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 32
gtggaggata aagaggagaa agg 23
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 33
ccactgggca acgaataca 19
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 34
ggcctcagaa tccacaaaga 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 35
gccatcatcc atgctgaagt a 21
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 36
ggtgcactgg agagaagaaa 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 37
cgagggtctc cgcatttatt 20
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 38
ggcagctgca ggaataaga 19
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 39
gatgtactcc cgaacccatt t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 40
cgaaccttgc ctccagatta t 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 41
gctgtctcta ctttccagga tg 22
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 42
tcccgaccca gtaggtattt 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 43
ggatcttggc ttcctctaca tc 22
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 44
ctgcactgga gttcccataa a 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 45
gggccagttg tgatggataa 20
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 46
gggaaggcag aaatcccttt at 22
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 47
gtacaggtct ttgcggatgt 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 48
catccttgcg gttcttctct 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 49
cggttcttct ctgccatctt 20
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 50
tctcctggga accaaagaat g 21
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 51
agtttcgtgg atgccacagg actc 24
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 52
tctagaccaa gccaattgca gaacca 26
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 53
aatagtgaca gcaaagggac caggg 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 54
aagaacatct gagaacctcc tcggc 25
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 55
tggttcacat gatcaactgg gcga 24
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 56
cgatgctggg tttggacgct cata 24
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 57
aagaaaggga gaggaggagg aggg 24
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 58
ttctacaaca ccaccactca ccga 24
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 59
tcgttggaag aggaacagca ctgg 24
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 60
tcgctcggca ggatgagata atgc 24
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 61
agtcagctct tctccatcct accaca 26
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 62
ccctttgttg tgcgagggtg ttt 23
<210> 63
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 63
caagcgccat gttgaagcca tcat 24
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 64
agcagtcgtc tttgtcaccc gaaa 24
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 65
agtgaaagta gccacgagaa ttgtgct 27
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 66
tgggctatgg gtgaggttcc aatg 24
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 67
ttgaggaaga gcaagcagtc agacc 25
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 68
agacgcccac caagaaggaa catc 24
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 69
ccaaaccagc aggaggtgat gagaa 25
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 70
atggttccca catcaaaggc ttgc 24
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 71
aggatcgtcc tgtggatctg gcta 24
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 72
agtttcgtgg atgccacagg actc 24
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 73
tgcgtgacca gtatgagaag atggc 25
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 74
atcctcaacg agatgcgtga ccag 24
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列（人工序列）)
<400> 75
tctagaccaa gccaattgca gaacca 26
Claims (14)
1.一组乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群，其特征在于，其包括24个分子分型及远处转移风险评估相关基因，和1个看家基因；其中，所述24个分子分型及远处转移风险评估相关基因包括：基底细胞相关基因EGFR、KRT14、KRT17、KRT5、和SFRP1，雌激素受体相关基因BCL2、ESR1、NAT1、PGR和SCUBE2，HER2相关基因ERBB2和GRB7，免疫相关基因CCL5、CXCL9、GZMA、HLA-DMA和IL2RG，和增殖相关基因AURKA、BIRC5、CCNB1、CDC20、MKI67、TOP2A、UBE2C；所述看家基因为ACTB。
2.如权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群作为标志物在评估乳腺癌分子分型及远处转移风险中的应用。
3.如权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群作为标志物在制备对乳腺癌进行分子分型及评估远处转移风险的产品中的应用。
4.检测如权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的基因表达水平的试剂在制备对乳腺癌进行分子分型及评估远处转移风险的体外诊断产品中的应用。
5.一种对乳腺癌进行分子分型及评估远处转移风险的体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断试剂包括特异性检测如权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的基因表达水平的试剂。
6.如权利要求5所述的体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断产品包括检测试剂盒、基因芯片和蛋白质阵列。
7.如权利要求6所述的体外诊断产品，其特征在于，所述检测试剂盒为多重定量PCR检测试剂盒，其包括扩增如权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的引物和/或探针；所述基因芯片由权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的cDNA或寡核苷酸探针点样于固相支持物表面制备而成。
8.如权利要求7所述的体外诊断产品，其特征在于，所述引物为Taqman引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1～25所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.26～50所示；所述探针为Taqman探针，所述探针的序列如SEQ ID NO.51～75所示。
9.用于检测如权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群表达的引物和探针组，其特征在于，所述引物为Taqman引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1～25所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.26～50所示；所述探针为Taqman探针，所述探针的序列如SEQ ID NO.51～75所示，其中，所述探针通过特异性地与如权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群中的基因杂交来检测出所述基因。
10.如权利要求9所述的引物和探针组在用于制备对乳腺癌进行分子分型及评估远处转移风险的产品中的应用。
11.如权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群或如权利要求2～4、10之任一项所述的应用或如权利要求5～8之任一项所述的体外诊断产品或如权利要求9所述的引物和探针组，其特征在于，所述乳腺癌包括管腔A型、管腔B型、HER2富集型及基底细胞型。
12.一组免疫相关基因，其特征在于，其包括：CCL5、CXCL9、GZMA、HLA-DMA和IL2RG。
13.如权利要求12所述的免疫相关基因在制备评估乳腺癌远处转移风险的体外诊断产品中的应用。
14.一种用于非诊断目的的检测如权利要求1所述的乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)利用针对不同样本的RNA提取试剂盒提取检测对象的总RNA；
(2)对步骤(1)所得对应每个基因的RNA进行一步法实时多重荧光定量RT-PCR检测。
其中，步骤(2)所述一步法实时多重荧光定量RT-PCR检测的方法为Taqman实时多重荧光定量RT-PCR，对24个靶基因和1个看家基因分成8个反应体系分别进行荧光定量RT-PCR检测。每个反应体系包含3个靶基因和1个看家基因，4个探针分别标记不同荧光。反应体系配制如下：
如上所述RNA样本2μl(总量100-400ng)，如上所述的4对正向、反向两条特异性引物(10μM)各0.4μl，4个Taqman荧光探针(10μM)各0.2μl，反应混合液6μl，酶混合液4μl，DEPC水4μl；其中，逆转录反应在50℃15-20分钟，预变性95℃5分钟；扩增反应包括变性95℃10秒，退火、延伸及荧光检测60℃45-60秒，进行45个循环，其中60℃荧光检测通道为FAM/HEX/VIC/ROX/Cy5；扩增反应结束后，记录每个基因的Ct值，代表了各个基因的表达水平；
其中，所述方法还包括步骤(3)，将所得检测结果进行统计分析，根据自主开发并优化的计算方法来进行乳腺癌亚型分型，并结合增殖指数和免疫指数计算乳腺癌的远处转移风险。
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190226 |