CN102575291A - Znf217：乳腺癌复发、浸润和转移表型的一种新预后和预测生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及确定癌症预后的方法。方法包括确定癌细胞样本或肿瘤样本中ZNF217基因的表达水平，其中ZNF217的过量表达与癌症转移的几率和癌症再发/复发的几率相关。

Description

ZNF217:乳腺癌复发、浸润和转移表型的一种新预后和预测生物标志物

本发明涉及用于确定乳腺癌预后的方法和试剂盒。方法涉及确定取自患者的样本中ZNF217基因的表达水平，其中ZNF217的过量表达与癌症的转移几率和再发/复发几率相关联。

癌症是主要的健康问题，每年使全世界几百万人死亡。癌症的诊断方法已经得到改进，现在经常有可能在早期诊断癌症。为了使癌症治疗有效，需要精确和简单的癌症预后方法。

经常基于组织学和临床数据确定癌症预后，如肿瘤大小、浸润、扩散到淋巴结或转移。然而，这种确定方式经常难以当在临床症状和组织学数据不可用或不可信时早期诊断的癌症中进行。

传统地，乳腺癌标志物如ERα(ER)(通过免疫组织化学检测)和ERBB2/HER2(通过免疫组织化学和/或FISH检测)已经用于癌症预后，并且ER-阴性和/或ERBB2/HER2-阳性的乳腺肿瘤是具有不良的预后的肿瘤。然而，约60-70％的乳腺癌是ER+乳腺癌，而ERBB2/HER2+乳腺癌仅代表全部乳腺癌的约15-20％。因此急需新的预后生物标志物，或者向目前使用的生物标志物增加新的预后/预测价值，或者预测癌症的复发/再发，特别是在目前视为“具有较好预后的癌症”的那些乳腺癌，即在ER-阳性乳腺癌中，和特别地，在ER-阳性HER2-阴性乳腺癌中。

近来，已提出了免疫组织学(ER、PR、HER2、KI67)和/或临床(SBR)参数将乳腺癌分类为生物上独特和行为完全不同的亚型(Blows等，2010；Cheang等，2009；Hugh等，2009；Millar等，2009；Nguyen等，2008)。不同分子亚组的预后和化学治疗敏感性不同。Luminal-样癌症是ER+和/或PR(黄体酮受体)-阳性的，并且因此对于内分泌治疗敏感，具有比HER2+和Triple阴性亚型更有利的预后，甚至在不进行任何治疗的情况下。Luminal B亚型与表达HER2或具有由KI67或SBR给出的高增殖表型的那些亚型等同(考虑观察到的有丝分裂次数)(Cheang等，2009；Hugh等，2009；Millar等，2009；Nguyen等，2008；Voduc等，2010)。已显示Luminal B乳腺癌具有比Luminal A乳腺癌更不利的长期存活率(Blows等，2010；Cheang等，2009；Hugh等，2009；Nguyen等，2008；Voduc等，2010)。最重要的是关于旨在将Luminal亚类，特别是Luminal A亚类重新分级的标志物。

WO98/02539描述了来自癌症相关的染色体20上扩增区域的基因。披露的基因可以用作对20q13扩增子特异的探针，用于监测肿瘤细胞基因组中相应序列的相对拷贝。根据此文件，ZABC-1基因(ZNF217基因)定位于20q13.2扩增子的核心，并且在原发性和具有20q13.2扩增的乳癌细胞系中过量表达。根据WO98/02539，是否存在20q13蛋白和/或20q13蛋白的表达水平是是否存在癌症或癌症程度的指示。然而，在WO98/02539中，肿瘤样本中未测量ZABC-1基因(ZNF217基因)的表达水平，而较短的无病存活仅与高水平20q13扩增相关联。

WO2006/065940描述了新的预后和治疗靶标，HTPAP基因，当其扩增后可以在乳腺癌患者中赋予不良的预后。HTPAP基因的扩增可以与其它扩增如ZNF217扩增子的检测相关。

Sun Guiqin等(2008)描述了ZNF217沉默对于人类卵巢癌细胞系生物行为的影响(Sun等，2008)。

根据Li Jing等(2006)，ZNF217扩增与卵巢癌显著相关(Li等，2006)。

Quinlan等(2007)关注ZNF217是致癌基因的证据，其在多种癌症中扩增(Quinlan等，2007)。

Huang Guiqing等(2005)提供了实验室实验，显示ZNF217抑制与化学治疗和端粒功能紊乱有关的细胞死亡(Huang等，2005)。

WO03/079748涉及通过ZNF217抑制的癌症治疗的作用增强。

在6.8％(Tanner等，2000)、8％(Ginestier等，2006；Plevova等，2010)和19％(Letessier等，2006)的乳腺癌中发现高水平20q13扩增。然而，由于几项研究已显示，在某些情况下，基因或染色体区域的扩增水平对肿瘤样本中基因表达水平具有主要影响，其它机制如外遗传、转录或后转录机制也是对基因表达做出贡献的重要事件。对于ZNF217的扩增和ZNF217的表达水平也是如此，因为在乳腺肿瘤和不具有扩增的乳腺细胞系中能观察到高ZNF217表达水平(Collins等，1998；Collins等，2001)。此外，Mackay等(2009)未发现ZNF217表达和ZNF217基因拷贝数之间的任何显著关联(Mackay等，2009)。

进一步地，20q13扩增与乳腺癌中具有不良的预后的关联程度还不清楚。Letessier等(2006)未发现高水平20q13扩增和乳腺癌中不良结果之间的任何关联(Letessier等，2006)。相反地，另一项研究可观察到乳腺癌中20q13扩增的预后值，但是只有高水平20q13扩增而没有低/中水平20q13扩增(Tanner等，1995)。引人注目的是，20q13扩增可能同时与乳腺癌中良好的预后或预后差有关。Ginestier等(2006)观察到两种类型的扩增。在第一种类型中，ZNF217基因座扩增但是20q13的另外两个基因座没有检测到扩增(Ginestier等，2006)。在第二种类型中，扩增区域更长而且涉及ZNF217、MYBL2和STK6中的两个或三个基因座。两种类型表现出不同的基因表达谱，并且与包括淋巴结状态和存活率的不同组织临床特征相关。在两个或三个基因座扩增的肿瘤与良好的预后相关，而仅在ZNF217扩增的肿瘤更频繁地与不良的预后相关。Ginestier等进一步确证了ZNF217 mRNA表达水平和仅扩增ZNF217的肿瘤中的ZNF217扩增之间没有统计学关联，而且ZNF217 mRNA表达水平不能将这些肿瘤与没有任何扩增的肿瘤相区分(Ginestier等，2006)。

最后，两项研究发现ZNF217扩增与ER-和PR-阴性状态相关(Letessier等，2006；Plevova等，2010)。

因此乳腺癌中ZNF217扩增和ZNF217表达水平的预后值仍然很不清楚。

本发明显示ZNF217的表达水平，其独立于ZNF217基因的扩增，代表乳腺癌患者中易再发和发展转移的不良的预后的新标志物。更具体地，ZNF217是乳腺癌的强力的不良的预后标志物，所述乳腺癌通过目前可用的临床标志物/参数分类为具有良好/更好的预后的癌症(例如ER+亚类，HER2-亚类，Luminal亚类(ER+和/或PR+)，ER+/HER2-亚类，SBR1和/或SBR2亚类，无/少淋巴结侵入亚类(≤3)，ER+和/或PR+和SBR1和/或SBR2亚类，ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2亚类，ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/无/少淋巴结侵入(≤3)亚类，Luminal A亚类)。因此单独或者与其它预后标志物一起评价ZNF217表达水平可以将分类为具有良好/更好的预后的癌症重新分级为两个亚类：“良好的预后”乳腺癌(低ZNF217表达水平)或“预后差”乳腺癌(高ZNF217表达水平)，从而帮助临床医生做出治疗决定。

令人吃惊地是，ZNF217比常用于癌症预后的其它标志物如ERBB2/HER2和ESR1/ER的预后值更高。

因此通过常规技术分类为具有“良好的预后”，但具有表达的ZNF217水平高于正常水平的肿瘤的患者为侵袭性癌症治疗的候选者。

此外，由于去调控的ZNF217表达水平与对内分泌治疗或内分泌/化学治疗的应答减弱有关，所以ZNF217也代表抗癌治疗的预测性标志物，并且特别是，内分泌治疗的预测性标志物。

本发明显示ZNF217是一种强大的工具，用于在ER-阳性或ER-阳性HER2-阴性乳腺肿瘤中鉴定患有侵袭性肿瘤、对于无复发存活具有不良的预后和/或对于总存活具有不良的预后的患者。因此，ZNF217是不良预后的生物标志物，与乳腺癌的实际生物标志物相比具有增加的价值，因为ZNF217允许对ER+和/或PR+乳腺肿瘤样本和ER+和/或PR+/HER2-乳腺肿瘤样本进行分级。通常通过内分泌疗法治疗ER-阳性乳腺肿瘤。ZNF217表达状态的确定为临床医生提供有用的信息来决定最佳疗程，因为ER-阳性HER2-阴性ZNF217-阳性肿瘤是易于发展转移和/或在治疗下再发的更具侵袭性的肿瘤。这些肿瘤因此为更具有侵袭性的癌症疗法的候选者。

发明简述

本发明涉及用于确定患者中乳腺癌预后的方法，所述乳腺癌如由传统免疫组织化学和/或组织学分级确定的具有良好的预后，所述方法包括测定来自所述患者的样本中ZNF217基因的表达水平，和如果所述样本中ZNF217基因过量表达则将癌症分类为具有不良的预后。

优选地，本发明的方法可以将如通过常规方法确定的具有“良好”预后的患者重新分级或重新分类。优选地，所述患者已经诊断为患有乳腺癌，显示选自如下的良好的预后的至少一种标志物：ER+、PR+、HER2-、低增殖指数(由SBR1和SBR2给出或由低KI67给出)、Luminal亚类、Luminal A亚类和淋巴结状态(无/少淋巴结侵入，≤3)。

在本发明的方法中，如果所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症分类或再分类为易复发和/或易发展浸润或转移表型。

在第一个实施方案中，本发明涉及用于确定患者中乳腺癌预后的方法，所述方法包括下述步骤：

-对先前取自所述患者的样本测试乳腺癌的至少一种预后标志物，并评价所述样本中ZNF217基因的表达水平；

-如果样本显示出可将乳腺癌分类为具有有利的预后的至少一种标志物，当所述样本中ZNF217基因过量表达时则将乳腺癌再分类为具有不良的预后。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于确定患者中乳腺癌患者的预后的方法，所述方法包括下述步骤：

-对先前取自所述患者的样本测试乳腺癌的至少一种预后标志物，

-如果样本显示至少一种将乳腺癌分类为具有有利的预后的标志物，则评价ZNF217基因的表达水平，

-如果所述样本中ZNF217基因过量表达，将乳腺癌分类为具有不良的预后。

优选地，所述将乳腺癌分类为具有有利的预后的预后标志物通过组织学分级系统和/或免疫组织化学分级系统和/或ERBB2扩增的检测而确定。

更优选地，所述将乳腺癌分类为具有有利的预后的预后标志物选自下组：ER+、PR+、HER2-、低增殖指数(由SBR1和SBR2给出或有低KI67给出)、Luminal亚型、Luminal A亚型和淋巴结状态(无/少淋巴结浸润(≤3))。

甚至更优选地，所述将乳腺癌分类为具有有利的预后的预后标志物将乳腺癌分类为选自下组的亚类：ER+亚类、HER2-亚类、Luminal亚类(ER+和/或PR+)、ER+/HER2-亚类、SBR1和/或SBR2亚类、无/少淋巴结浸润亚类(≤3)、ER+和/或PR+和SBR1和/或SBR2亚类、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2亚类、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/无/少淋巴结浸润(≤3)亚类、Luminal A亚类。表现为低增殖表型的SBR1和/或SBR2可以由相应亚类中的低KI67代替。

优选地，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症再分类为易复发和/或易发展浸润或转移表型。

优选地，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症分类或再分类为对于无再发存活具有不良的预后。

在其它实施方案中，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症分类或再分类为对于总存活具有不良的预后。

在其它实施方案中，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症分类或再分类为在内分泌治疗下具有不良的预后。

在其它实施方案中，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症分类或再分类为在化学治疗和/或在内分泌治疗下具有不良的预后。

在其它实施方案中，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症分类或再分类为在内分泌治疗下具有不良的预后。

在其它实施方案中，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症分类或再分类为在化学治疗下具有不良的预后。

在本发明的方法中，ZNF217基因的表达水平优选与对照样本相比较。

在一些实施方案中，对照样本是健康群体中观察到的ZNF217基因表达的中值水平。

有利地，对照样本是取自患有乳腺癌的患者的样本中ZNF217表达的中值水平。优选地，所述样本是乳腺肿瘤样本。

本发明还涉及将如通过免疫组织化学和/或ERBB2扩增的检测和/或组织学分级确定的具有有利的预后的乳腺癌患者再分级的方法，所述方法包括测量来自至少一位患者的样本中的ZNF217基因的表达水平，并且如果在所述样本中ZNF217基因过量表达则将患者再分类为具有不良的预后。

优选地，乳腺癌患者具有选自如下的良好的预后的至少一个标志物：ER+、PR+、HER2-、SBR1和/或SBR2、低KI67、Luminal亚类、Luminal A亚类和淋巴结状态(≤3)。

优选地，本发明的方法包括通过定量ZNF217基因的mRNA而测量样本中ZNF217基因的表达水平。

优选地，本发明的方法包括通过定量由ZNF217基因编码的多肽而测量样本中ZNF基因的表达水平。

发明详述

本发明基于ZNF217基因的表达水平是乳腺癌的显著预后标志物的观察结果。更具体地，ZNF217在乳腺癌患者中有高的预后值，所述患者先前已通过传统技术分类为具有“有利”或“良好”的预后。ZNF217是通过当前可用的临床标志物/指示物分类为具有良好/更好的预后的乳腺癌(例如ER+亚类、HER2-亚类、Luminal亚类(ER+和/或PR+)、ER+/HER2-亚类、SBR1和/或SBR2亚类、无/少淋巴结浸润亚类(≤3)、ER+和/或PR+和SBR1和/或SBR2亚类、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2亚类、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/无/少淋巴结浸润(≤3)亚类、Luminal A亚类、表现出低增殖表型的SBR1和/或SBR2可以由相应亚类中的低KI67代替)的强的预后不良标志物。因此单独或与其它预后标志物一起评价ZNF217表达水平可以将这些分类为具有良好/更好的预后的癌症再分级成两个亚类：“预后良好”的乳腺癌(低ZNF217表达水平)或“预后差”的乳腺癌(高ZNF217表达水平)，从而为临床医生提供有帮助的信息。令人惊讶的是，ZNF217具有高于常用于癌症预后的其他标志物，如ERBB2/HER2和ESR1/ER的预后值。

ZNF217的过量表达或高表达水平是具有浸润或转移表型、对于无再发存活具有不良的预后和/或对于总存活具有不良的预后的乳腺肿瘤的特征。这个基因在乳腺癌细胞中的过量表达与疾病复发增加和预后变差在统计学上显著相关。

本发明涉及鉴定易复发的乳腺癌和/或乳腺肿瘤和/或患有或易发展浸润或转移表型的乳腺癌和/或乳腺肿瘤的方法。更特别地，本发明涉及鉴定易复发的乳腺癌和/或乳腺肿瘤和/或患有或易发展浸润或转移表型的乳腺癌和/或乳腺肿瘤的方法，其中所述乳腺癌或乳腺肿瘤先前由传统技术分类为具有有利的预后。

“癌”指疾病，所述疾病中一组细胞表现不受控制的生长/分化、浸润和有时转移。

“统计上显著的”优选指至少95％的置信水平(p＜0.05)的关联或相关。

术语“浸润”或“侵袭”指癌或快速生长的肿瘤，其具有扩展超越其边界进入临近组织的趋势。

术语“转移”指癌或肿瘤从起源器官扩散至患者体内的其它气管/远端部位。

在优选的实施方案中，本发明涉及确定患者中乳腺癌预后的方法，所述乳腺癌如通过免疫组织化学和/或ERBB2扩增的检测和/或组织学分级确定的具有“良好”的预后，所述方法包括测量来自所述患者的样本中ZNF217基因的表达水平，并且如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌再分类为具有不良的预后。

在第一个实施方案中，本发明涉及确定患者中乳腺癌预后的方法，所述方法包括下述步骤：

-对先前取自所述患者的样本测试乳腺癌的至少一种预后标志物，并评价所述样本中ZNF217基因的表达水平；

-如果样本显示将乳腺癌分类为具有有利的预后的至少一种标志物，并且如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将乳腺癌再分类为具有不良的预后。

可以同时对样本测试至少一种传统预后标志物和ZNF217表达水平。也可以连续和独立评价预后标志物和ZNF217表达水平。

在另一个实施方案中，本发明涉及确定患者中乳腺癌预后的方法，所述方法包括下述步骤：

-对先前取自所述患者的样本测试乳腺癌的至少一种预后标志物，

-如果样本显示至少一种将乳腺癌分类为具有有利的预后的标志物，则评价ZNF217基因的表达水平，

-如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将乳腺癌分类为具有不良的预后。

对于通过传统方法确定为具有有利的预后的乳腺癌，ZNF217表达水平的预后值增强。

很多通过常规方法确定为具有“良好”的预后的乳腺癌患者仍然发展浸润、转移型癌或具有降低的无再发存活率或具有降低的总存活率。测量ZNF217基因的表达水平可将这些先前分类为具有“良好”的预后的患者再分类为两个亚类：“预后良好”的乳腺癌(低ZNF217表达水平)或“预后差”的乳腺癌(高ZNF217表达水平)。

术语“良好的预后”或“有利的”预后指患者比没有预后优良的一个或几个给定标志物的患者和/或具有预后差的一个或几个给定标志物的患者具有更好的预后。

术语“标志物”指提供乳腺癌预后的指示物。乳腺癌肿瘤的亚分型和亚分类通常用标志物组合进行。这些标志物将乳腺癌分类成不同的亚型或亚类。

传统上使用免疫组织化学和/或ERBB2扩增的检测和组织学分级确定乳腺癌的预后，从而确定对于乳腺癌患者最有效的疗程。

优选地，本发明的方法供用于对通过常规方法如免疫组织化学和/或ERBB2扩增的检测和组织学分级确定的具有“良好”的预后的患者再分级或再分类。

例如浸润性乳腺癌的恶性可以根据任何合适的组织学分级系统评分。目前用于乳腺癌的大多数肿瘤分级系统组合了核分级、微管形成和有丝分裂率。最常用的分级系统之一是Scarff-Bloom-Richardson(SBR)系统(Bloom和Richardson，1957)。SBR等级或组织学等级对应于肿瘤微管形成分数，加上有丝分裂分数的数目，加上核多形性分数的加和。然后将组合的分数转换成下述SBR等级：SBR1对应于低等级，SBR2对应于中等级，SBR3对应于高等级。

本发明的方法供用于对具有有利的SBR等级的乳腺癌患者再分级。在这些先前分类为具有“良好的预后”的患者中，ZNF217的高表达水平是预后差的标志物。

其它传统标志物是基于下述受体存在与否的受体状态：雌性激素受体(ER)、黄体酮受体(PR)和/或人类表皮生长因子受体2(HER2/ErbB-2)。通常地，将ER+、PR+和/或HER2-乳腺癌分类为具有“较好”/“良好”的预后。通常可根据公知的方法通过免疫组织化学和/或ERBB2扩增的检测而确定受体状态。ERBB2扩增的检测通常通过FISH(荧光原位杂交)而进行。

尽管很多这类患者将经历他们的乳腺癌复发，但是仍将ER+和/或HER2-亚类的乳腺癌视作具有“有利的”预后。在本发明的方法中，通过评价ZNF217基因的表达水平而进行这些患者/乳腺肿瘤的更精确的分类或再分级。

其它传统上视为预后“优良”的乳腺癌亚型是Luminal和Luminal A亚型。Luminal-样癌症是ER+和/或PR+的乳腺癌。Luminal A乳腺癌为ER+和/或PR+，HER2-并且具有低增殖指数(由低KI67给出或由SBR1和SBR2给出)(Cheang等，2009；Hugh等，2009；Voduc等，2010)。Luminal A乳腺癌也可为具有ER+和/或PR+和HER2-状态的乳腺癌(Millar等，2009；Nguyen等，2008)或具有ER+和/或PR+和低增殖指数(由低KI67给出或由SBR1和SBR2给出)的乳腺癌(Voduc等，2010)。Luminal B乳腺癌是具有ER+和/或PR+并且也具有HER2+或高增殖指数(高KI67或SBR3)状态的那些癌症(Cheang等，2009；Hugh等，2009)。Luminal B乳腺癌也可为仅具有ER+和/或PR+和HER2+的那些癌症(Millar等，2009；Nguyen等，2008)。

在本发明的方法中，Luminal和/或Luminal A亚型的乳腺肿瘤通过评价ZNF217基因的表达水平而再分级或再分类。

乳腺癌中另一个公知的预后指示物是淋巴结状态。患有没有或很少浸润淋巴结(≤3)的乳腺癌的患者通常分类为具有有利的预后。

在本发明的方法中，评价ZNF217基因的表达水平也供用于对组合几种“良好”预后标志物的乳腺肿瘤亚型再分级，所述标志物如ER+亚类，HER2-亚类，Luminal亚类(ER+和/或PR+)，ER+/HER2-亚类，SBR1和/或SBR2亚类，无/少淋巴结浸润亚类(≤3)，ER+和/或PR+和SBR1和/或SBR2亚类，ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2亚类，ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/无/少淋巴结浸润(≤3)亚类，Luminal A亚类。显示低增殖表型的SBR1和/或SBR2可以由相应亚类中的低KI67替代。

在本发明的方法中，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将具有有利预后的至少一个传统指示物的乳腺癌再分类或再分级为易复发和/或易发展浸润或转移表型。

在一些实施方案中，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将乳腺癌再分类或再分级为对于无再发存活具有不良的预后。

在其它实施方案中，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将乳腺癌再分类或再分级为对于总存活率具有不良的预后。

在其它实施方案中，如果在所述样本中ZNF217基因过量表达，则将乳腺癌分类为在内分泌治疗下具有不良的预后。百分之七十的乳腺癌患者对于雌性激素受体α(ERα)是阳性的，因此适合于内分泌治疗，其为旨在阻断雌性激素对乳腺癌细胞促有丝分裂作用的策略。内分泌治疗中使用不同的分子：选择性雌性激素受体调节剂(SERM)如他莫昔芬(tamoxifen)，其防止雌性激素与其受体结合；选择性雌性激素受体下调剂(SERD)如氟维司群(fulvestrant)(ICI 182，780)，也可诱导受体去稳定化和降解的ER拮抗剂；芳香酶抑制剂(如依西美坦(exemestane)，来曲唑(letrozole)，阿那曲唑(anastrozole))，其通过阻断芳香酶活性而抑制雄激素转化成雌性激素。

因此ZNF217的表达水平也具有预测价值。在内分泌治疗下的患者中，ZNF217表达水平与转移和侵袭型乳腺癌相关联。

因此在其它实施方案中，ZNF217的表达水平也具有预测价值。在内分泌治疗和/或化学治疗下的患者中，ZNF217表达水平和转移和侵袭型乳腺癌相关联。

在本发明的方法中，ZNF217基因的表达水平优选与对照样本比较。

在一些实施方案中，对照样本是健康群体中观察到的ZNF基因表达的中值水平。

更有利地，对照样本是取自患有乳腺癌的患者的样本(更优选乳腺肿瘤样本)中ZNF217表达的中值水平。

本发明还涉及对如通过免疫组织化学和/或ERBB2扩增的检测和/或组织学分级确定的具有良好的预后的乳腺癌患者再分级的方法，所述方法包含测量来自至少一名患者的样本中ZNF217基因的表达水平，和如果在所述样本中ZNF217基因过量表达则将所述患者再分类为具有不良的预后。

优选地，本发明的方法包括通过定量ZNF217基因的mRNA而测量样本中ZNF217基因的表达水平。

在其它实施方案中，本发明的方法包括通过定量由ZNF217基因编码的多肽而测量样本中ZNF217基因的表达水平。

本发明证明患者原发性乳腺肿瘤中ZNF217的高表达水平或过量表达易再发和/或发展转移。有趣的是，ZNF217表达的预后值高于乳腺癌其它预后标志物如ERBB2/HER2和ESR1/ER的预后值。

“预后”是疾病可能的进程和结果。预后可包括癌症并发症、转移、扩散的可能性，癌症的可能的结果，恢复的可能性，总存活率和/或总死亡率。优选地，预后是患者恢复或具有癌症的复发/再发的概率。这个信息不仅对于患者有用，对于医生和/或临床医生确定最有效的疗程也有用。确定癌症再发的可能性或转移的可能性能帮助医生和/或临床医生确定是否应采取更保守或更激进的治疗方法。预后供用于对预测为可从给定治疗方案获益的患者进行选择和分类。

本发明的方法在诊断为乳腺癌之后和/或癌症的治疗，特别是在内分泌治疗下的过程中为乳腺癌提供预后。

在本发明的方法中，ZNF217基因的过量表达与对于无再发存活具有不良/更差的预后相关联。

在一个实施方案中，不良的预后是具有更高水平的ZNF217基因表达的癌症患者发生癌症复发或再发的概率高于患相同癌症但没有ZNF217过量表达的患者。

与患相同癌症但没有ZNF217过量表达的患者相比，来自患者的样本中更高水平的ZNF217基因表达与患者中癌症再发或复发的更高概率相关联。

优选地，不良的预后是癌症患者从取样之日在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年内癌症有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的机会再发。在一些实施方案中，有30％或更多的机会癌症会在10年内再发。

无再发存活(RFS)定义为在原发性乳腺癌的诊断后不再发的患者的百分比。在这种情况下，Kaplan-Meier曲线只代表在y时间后不再发的患者的x％。

在另一个实施方案中，不良的预后是具有较高水平的ZNF217基因表达的癌症患者的总生存率低于患相同癌症而无ZNF217过量表达的患者。

与患相同癌症而无ZNF217过量表达的患者相比，来自患者的样本中更高水平的ZNF217基因表达与癌症对于所述患者会是致死性的更高几率相关联。

优选地，不良的预后是从取样之日起1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年内癌症患者具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的机会所述癌症会是致死性的。在一些实施方案中，有30％或更多的机会所述癌症在5年内会是致命性的。

总生存率(OS)定义为在原发性乳腺癌的诊断后存活的患者百分比。在这种情况下，Kaplan-Meier曲线简单代表y时间后存活患者的x％。

本发明还涉及提供乳腺癌患者中发展转移的预测、无再发存活率(RFS)的预后或总存活率的预后(OS)的预后的方法，所述方法包括：

a)从所述患者获得样本，

b)测量所述样本中ZNF217的表达水平，

c)根据ZNF217测量水平预测发生转移、RFS或OS的可能性，其中，当ZNF217的所述水平与对照或正常样本相比增加时，发生转移的所述可能性增加，所述RFS降低或所述OS降低。

本发明还涉及提供乳腺癌患者中发展转移的预测、无再发存活率的预后(RFS)或总存活率的预后(OS)的方法，所述方法包括：

a)从所述患者获得样本，

b)对所述样本测试常规的乳腺癌预后标志物，

c)如果样本具有“良好”预后的至少一个标志物或标志物组合，则评价所述样本中ZNF217基因的表达水平，

d)基于ZNF217的测量水平预测发生转移、RFS或OS的可能性，其中当ZNF217的所述表达水平与对照或正常样本相比增加时，发生转移的所述可能性增加，所述RFS降低或所述OS降低。

本发明还涉及提供乳腺癌患者中发展转移的预测、无再发存活率的预后(RFS)或总存活率的预后(OS)的方法，所述方法包括：

a)从所述患者获得样本，

b)对所述样本测试常规的乳腺癌预后标志物，并评价ZNF217基因的表达水平，

c)如果样本具有至少一个预后“优良”标志物或标志物组合，则评价所述样本中ZNF217基因的表达水平，基于ZNF217测量水平预测发生转移、RFS或OS的可能性，其中当ZNF217的所述水平与对照或正常样本相比增加时，发生转移的所述可能性增加，所述RFS降低或所述OS降低。

本发明的方法包括测量来自患者的样本中ZNF217基因的表达水平。

优选地，本发明的方法为体外方法。本发明的方法在先前取自患者的生物学样本上进行。通常地，患者已被诊断患有乳腺癌。

术语“样本”指获得自/取自患者的任何生物学样本，包括血液样本、血浆样本、组织样本、细胞样本或肿瘤样本。通常地，样本包含癌细胞或肿瘤细胞，例如乳腺癌细胞。在优选的实施方案中，样本是先前取自患者的乳腺肿瘤样本。

本发明的方法包括检测或测量ZNF217基因的表达水平。ZNF217基因是首先由Collins等描述的20q13.2上的候选致癌基因(Collins等，1998)。ZNF217基因的GENBANK登录号是NC_000020.10(RefSeq：NM_006526.2)。

术语“表达”可指测量基因的转录水平和/或翻译水平。在第一个实施方案中，本发明的方法包括通过定量ZNF217基因转录物(mRNA)而测量样本中ZNF217基因的表达水平。在另一个实施方案中，本发明的方法包括通过定量由ZNF217基因编码的多肽而测量样本中ZNF217基因的表达水平。

在其它实施方案中，可以间接通过测量可调控基因表达的非编码RNA(如miRNA)而评价ZNF217mRNA的量。MicroRNA(miRNA)是可结合目标信使RNA转录物(mRNA)的3’未翻译区(3’UTR)中互补序列的转录后调节子，通常引起基因沉默。miRNA是短核糖核酸(RNA)分子，平均仅22个核苷酸长。人类基因组可以编码1000个以上的miRNA，其可靶向约60％的哺乳动物基因，并且在很多人类细胞类型中是丰富的。每个miRNA可以抑制上百个mRNA。miRNA在真核生物体中非常保守，被认为是基因调控的至关重要并且进化上古老的元件。其后，miRNA研究已揭示了其在负调控中的多种作用(转录物降解和掩蔽，翻译抑制)并可能参与正调控(转录和翻译活化)。通过影响基因调控，miRNA可能参与大多数生物过程。已经在大量疾病状态中出现miRNA的异常表达，并且基于miRNA的疗法正在研究当中。已经发现几个miRNA与一些类型的癌症有关。

通过技术人员已知的多种方法中的任何方法确定ZNF217基因的表达水平。

例如通过下述方法定量ZNF217基因的mRNA或转录物：杂交或反转录并扩增(RT-PCR)，然后通过任何已知的方法定量检测产物。在本发明的方法中可以使用任何定量扩增方法。优选地，用SEQ ID NO.1(5’-AGTCCAAATCCCTGCCATCT-3’)的引物和SEQ ID NO.2(5’-GGGGAAACACTGGTTTTAGG-3’)的引物进行定量RT-PCR。

例如通过免疫印迹、ELISA、质谱或结合试验定量ZNF217多肽。优选地，在结合试验中用一个或几个抗-ZNF217抗体测量ZNF217多肽水平。

优选地，本发明的方法包括检测来自患者的肿瘤细胞或癌细胞样本中ZNF217基因的表达水平，并将所述表达水平与对照表达水平或对照样本中的表达水平相比较。基于癌/肿瘤中ZNF的表达是否高于对照而确定癌/肿瘤的侵袭性和预后。

术语“过量表达”指统计学上显著高于对照样本中检测的表达水平的表达水平。

如果表达水平比对照样本中检测的表达水平高至少10％、25％、50％、75％、100％或更高，则将ZNF217的表达水平鉴定为“过量表达”或“高于”对照。

对照可以是“正常”对照样本，意指非肿瘤细胞对照样本或非癌细胞对照样本。对照样本可以是获得自患者的自体对照样本。在这种情况下，从获得待评价样本的同一患者获得对照样本。对照样本优选来自同一细胞类型或来自同一器官。对照样本可为获得自未患癌的个体的正常对照样本。

正常对照样本也可以是标准样本，其包含在生物样本中正常发现的相同量的ZNF217。

正常对照样本也可以是取自至少5、10、15、20或更多个不同患者的样本中ZNF217表达的中值水平，所述患者患有乳腺癌或患有相同亚型的乳腺癌。对照样本优选收集自组织库(Tissue Bank)或生物资源中心(ResourcesBiological Center)，其中患者的完整临床、组织学和生物学信息是可用的。

如果与对照样本相比较，待评价样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症分类或再分类为易复发的乳腺癌和/或患有或易发展浸润或转移表型的乳腺癌。

本发明还涉及鉴定易复发的乳腺癌和/或患有或易发展浸润或转移表型的癌症的试剂盒，其包含源自ZNF217基因的引物和/或探针，和用于比较ZNF217基因表达水平的对照样本。

本发明还涉及鉴定易复发的肿瘤和/或患有或易发展浸润或转移表型的肿瘤的试剂盒，其包含ZNF217抗体，和用于比较ZNF217基因表达水平的对照样本。

试剂盒还可以包含阳性对照、阴性对照和进行本发明的方法所需的任何试剂或任何装置。

本发明的方法和试剂盒还可以包含“不变”对照，其可为看家基因的表达水平。

本发明还涵盖用于实施本发明的方法的所述试剂盒的用途，和具体地鉴定易复发的癌症和/或患有或易发展浸润或转移表型的癌症或确定癌症预后。

附图简述

图1：MDA-MB-231乳腺癌细胞中ZNF217的过量表达。用抗-ZNF217抗体通过Western印迹分析来自细胞系的全部蛋白提取物。将α-微管蛋白的表达用作不变对照。

图2：ZNF过量表达对于MDA-MB-231细胞系中细胞增殖和细胞周期蛋白表达水平的影响。(A)如材料和方法部分所述，使用BrdU标记试剂盒分析增殖细胞。结果表示为来自三次独立实验的平均值±s.d.(标准偏差)。**根据Student’s t-检验，与相应的MDA-MB-231对照细胞相比，P＜0.01。(B)ZNF-217转染的MDA-MB-231细胞中细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E2蛋白表达水平的Western印迹分析。将α-微管蛋白的表达用作不变对照。

图3：MDA-MB-231细胞中ZNF217的过量表达增加了它们在软琼脂中形成菌落的能力。在6-孔板中将MDA-MB-231对照、ZNF217-1和ZNF217-2细胞涂布在含0.45％琼脂的10％FCS-DMEM上(10000个细胞/孔)。在涂布后20天拍摄显微照片(图(A)和计数(B))。结果表示为来自至少三次独立实验的平均值±s.d.。***根据Student’s t-检验，与相应的MDA-MB-231相比，P＜0.001。所有图像均在1.25倍放大倍数下拍摄。

图4：博伊登小室侵袭试验。在包含荧光-阻断多孔聚碳酸酯膜插片的Transwell细胞培养小室中进行对照、ZNF217-1和ZHF217-2细胞侵袭的定量。通过荧光在滤膜下侧检测通过Matrigel侵袭的细胞并计数。计数滤膜的全部表面，并且对于每种条件将每个试验一式三份进行两次。结果表示为平均值±s.d.。

图5：对照、ZNF217-1和ZNF217-2细胞侵袭培养试验。(A)在Matrigel中培养1、4、7、11、14和18天后来自至少三次独立实验的代表图片。所有图片均在1.5倍的放大倍数下拍摄。(B)使用ImageJ软件测量对照(白色柱)、ZNF217-1(黑色柱)和ZNF217-2(灰色柱)细胞的Matrigel侵袭面积。结果表示为来自至少三次独立实验的平均值±s.d.。**根据Student’s t-检验，P＜0.01和***P＜0.001。

图6：ZNF217促进乳腺癌细胞迁移(创伤愈合)

将对照或过量表达ZNF217的MDA-MB-231细胞的汇合单层通过刮擦受伤，并在0小时(H 0)、26小时(H 26)拍摄照片。图片是至少三次独立实验的代表，并在2.5倍放大倍数下拍摄。

图7：ZNF217诱导表皮乳腺MCF10A细胞中的EMT。(A)10倍放大倍数下MCF10A-对照和MCF10A-ZNF217细胞形态的代表图片。(B)如材料和方法部分所述，使用特定抗体对ZNF217、表皮标志物(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和遮光蛋白)和间充质细胞标志物(波形蛋白和纤连蛋白)进行的Western印迹分析。测量α-微管蛋白的表达作为不变对照。显示的Western印迹来自至少三次独立试验的一个代表实验和细胞裂解物。

图8：ZNF217mRNA水平的预后值。(A)来自CLB1群的乳腺肿瘤中RFS的Kaplan-Meier曲线(对数级测试分析)。(B)来自CLB1群的乳腺肿瘤中OS的Kaplan-Meier曲线(对数级测试分析)。

图9：来自CLB2群的乳腺肿瘤(n＝113)中ZNF217mRNA水平的预后值。RFS的Kaplan-Meier曲线(对数级测试分析)。

图10：来自CLB2群的ER-阳性(ER+)乳腺肿瘤(n＝68)中ZNF217mRNA水平的预后值。RFS的Kaplan-Meier曲线(对数级测试分析)。

图11：来自CLB2群的ER+和HER2-阴性(HER2-)乳腺肿瘤(n＝57)中ZNF217mRNA水平的预后值。RFS的Kaplan-Meier曲线(对数级测试分析)。

图12：ZNF217和ER表达水平在乳腺癌细胞中相关联。用抗-ZNF217和抗-ERα抗体通过Western印迹分析来自细胞系的总蛋白提取物。将α-微管蛋白的表达用作不变对照。(A)组成型表达ER的MDA-MB-231乳腺癌稳定转染子(S30细胞)中ZNF217的过量表达。(B)在用乱序RNA(乱序的MCF7)或用siRNA-ZNF217(MCF7siRNA-ZNF217)转染的MCF7细胞中ZNF217和ERα表达的Western-印迹分析。

图13：在OH-Tam-抗性CL6.7细胞中存在siRNA-ZNF217的情况下逆转内分泌抗性。用抗-ZNF217通过Western印迹分析来自细胞系的总蛋白提取物。将α-微管蛋白的表达用作不变对照。(A)在用乱序RNA或siRNA-ZNF217转染的MVLN和CL6.7细胞中ZNF217的Western-印迹分析。(B)在存在或不存在200nM OH-Tam的情况下，用乱序RNA或siRNA-ZNF217转染的MVLN和CL6.7细胞的细胞增殖(BrdU测试)。这个试验在无甾醇培养基中进行。当P＜0.05时认为P-值(Student’s t-检验)显著。

实施例

材料和方法

细胞培养

MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞购自ATCC，并根据推荐在补加10％胎牛血清(Invitrogen，Cergy Pontoise，Paris)的DMEM培养基中生长。S30细胞和它们的MDA-MB-231对照细胞先前已经描述(Levenson等，2003)。内分泌抗性的细胞模型(MVLN和CL6.7细胞)先前已建立并描述(Demirpence等，1993)。

MDA-MB-231-ZNF217稳定转染子

使用pcDNA6/V5-His质粒(Invitrogen，Cergy Pontoise，Paris)，用全长ZNF217cDNA构建ZNF217表达质粒。简言之，通过向由Collins博士慷慨提供的pEGFP-N1-ZNF217质粒加入缺失的cDNA序列(编码ZNF217蛋白的最后6个C-末端氨基酸)而获得全长ZNF217cDNA，然后将所述cDNA亚克隆入pcDNA6/V5-His质粒(pcDNA6/V5-His-ZNF217)。根据ATCC推荐培养MDA-MB-231乳腺癌细胞(具备低内源水平的ZNF217)，然后用6μg空pcDNA6/V5-His质粒或pcDNA6/V5-His-ZNF217稳定转染。在存在20μg/ml杀稻瘟菌素(Invitrogen)的情况下选择转染的细胞群。然后分离两个MDA-MB-231-ZNF217细胞克隆(称作ZNF217-1和ZNF217-2)。根据生产商的推荐，使用Qiagen(Germantown，MD，USA)RNA提取试剂盒提取总RNA。使用BioAnalyzer 2100^TM(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)评价RNA质量。

MCF10A-ZNF217稳定转染子

根据ATCC推荐培养MCF10A细胞，其是永生化的但未转化的来自乳腺组织的人类乳房表皮细胞(Soule等，1990)。用6μg空pcDNA6/V5-His质粒或pcDNA6/V5-His-ZNF217稳定转染细胞。在存在20μg/ml杀稻瘟菌素(Invitrogen)的情况下选择转染的细胞群。

实时定量PCR(RTQ-PCR)分析

将来自每个样本的一微克总RNA进行反转录，并如前所述(Girault等，2003；Vendrell等，2005)，使用LightCycler

(Roche，Meylan，France)或ABI Prism7700序列检测系统(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，根据生产商的推荐，用相应的SYBR Green试剂盒进行RTQ-PCR测量。设计正向引物5’-AGTCCAAATCCCTGCCATCT-3’和反向引物5’-GGGGAAACACTGGTTTTAGG-3’特异性地靶向ZNF217转录物(NM_006526.2)。靶向ESR1(雌激素受体α)转录物的引物是：正向引物5’-TGTTCCAAACCCATCGTCAGT-3’；反向引物5’-CTCTATAACCAATGACCTCTCTGTGAA-3’。靶向ERBB2转录物的引物是：正向引物：5’-ACTGGCCCTCATCCACCATA-3’；反向引物5’-GGTTGGCAGTGTGGAGCAG-3’。

Western印迹

如前所述(Vendrell等，2004)进行细胞提取物制备和Western印迹分析。由Covalab(Lyon，France)制备ZNF217抗体；E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和纤连蛋白抗体购自BD Biosciences(Franklin Lakes，NJ，USA)。遮光蛋白抗体来自Zymed Laboratories(San Francisco，CA，USA)，波形蛋白抗体来自Dako(Glostrup，Denmark)，细胞周期蛋白E2和ERα抗体来自Santa CruzBiotechnology Inc.(Santa Cruz，CA，USA)，细胞周期蛋白D1抗体来自CellSignaling(Beverly，MA，USA)，而细胞周期蛋白A2和α-微管蛋白抗体来自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)。

细胞增殖试验(BrdU)

使用细胞增殖ELISA，BrdU(比色)试剂盒(Roche，Meylan，France)分析增殖细胞。简而言之，用5-溴脱氧尿苷(BrdU)将细胞标记24小时，并根据生产商的推荐使用特定的抗-BrdU抗体鉴定标记的核。

软琼脂菌落形成试验

首先用包含0.75％琼脂(Seaplaque

Lonza，Basel，Switzerland)的琼脂层在补加10％FCS(Gibco)的DMEM覆盖六孔板。然后将MDA-MB-231对照、ZNF217-1和ZNF217-2细胞悬浮于包含0.45％琼脂的10％FCS-DMEM中并涂布入孔中(10000个细胞每孔)。将培养物返回至培养箱并每2天补加10％FCS-DMEM生长培养基。二十天后，用0.005％结晶紫(Sigma-Aldrich，SaintQuentin Fallavier，France)将细胞染色1小时。然后在1.25倍的放大倍数下拍摄菌落的显微照片。

博伊登小室侵袭试验

在包含荧光阻断多孔聚碳酸酯膜插片(Fluoroblock；BD Biosciences；孔大小为8μm)的Transwell细胞培养室中进行细胞侵袭的定量。在Transwell室中制备生长因子降低的100μl 2mg/ml Matrigel(来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤的商业上制备的重组基底膜；BD Biosciences)。将细胞培养为单层细胞，然后胰蛋白酶化并涂布在位于Transwell装置上部小室内厚层Matrigel(约500μm)顶层上包含2％FCS的培养基中(10⁵)。对照不做处理。然后分别用含2％和10％FCS的培养基填充上部和下部小室，从而建立化学诱剂的可溶性梯度，促进细胞对Matrigel的侵袭。将细胞在37℃储存于5％CO₂中并允许通过凝胶迁移，然后在3.7％甲醛中固定15分钟。通过荧光检测滤膜下侧上侵袭通过Matrigel的细胞并计数。计数滤膜的全部表面，并且对于每种条件将每个试验一式三份进行两次。

Matrigel侵袭分析

将厚层Matrigel(600μl)(BD Biosciences)覆盖在8-孔LabTec小室玻片上，并进行部分聚合。将一百万个细胞悬浮于1μl DMEM中，并接种于Matrigel层中间。在37℃温育30分钟后，我们加入150μl DMEM；每2天更换培养基。一式三份分析样本。使用Centre Commun de Quantimétrie(Lyon，UniversitéClaude Bernard，法国)的倒置Diavert显微镜(Leica Microsystems，Rueil-Malmaison，法国，1.5倍放大倍数)，每1、4、7、11、14和18天拍摄照片。使用由National Institute of Health(USA)开发的ImageJ软件测量经过Matrigel的细胞侵袭的数量/数量级(magnitude)。

创伤愈合

使用创伤愈合试验检测细胞运动性的改变。将细胞以DMEM中2.5x 10⁶个细胞涂布在60-mm培养板上。在Centre Commun de Quantimétrie(Lyon)使用P-200移液器尖端将汇合的单层通过刮擦受伤，并在0小时和26小时拍摄照片(2.5倍放大倍数)。

基因沉默

由Invitrogen获得靶向ZNF217的Stealth^TM siRNA(siRNA-ZNF217)和乱序的对照RNA(乱序的)。用lipofectamin RNAimax(Invitrogen)将五纳摩尔siRNA-ZNF217或乱序的转染入细胞系。

CLB1群：来自Centre Léon Bérard的乳腺肿瘤样本(n＝47)

我们选择了47个获得自在Centre Léon Bérard(Lyon，法国)手术的女性的原发性乳腺肿瘤样本(表1)。已获得全部患者的知情同意，并且实验得到机构伦理委员会的批准。乳腺肿瘤样本切除自手术前未接受内分泌治疗、化学治疗或放射性治疗的女性。在进行化学治疗和/或内分泌治疗时，十四名患者发展转移(Met+组)，而33名患者未发展转移(Met-组)。标准预后因子如表1所示。患者(平均年龄：53岁；范围：40-82)符合下述标准：原发性单侧乳腺癌；可用的完整的临床、组织学和生物学信息；术前未进行放射性治疗或化学治疗；和在CentreLéon Bérard的完全随访。在手术时确立阳性腋窝淋巴结的组织学类型和数目。根据Scarff-Bloom-Richardson(SBR)组织学分级系统(Bloom和Richardson，1957)给浸润癌瘤的恶性评分。使用χ²检验，两组间在年龄、组织学等级、淋巴结状态、肿瘤大小或雌激素受体状态上没有显著差异(表1)。通过免疫组织化学确定雌激素受体α(ER)状态。Met+组的患者在术后0.6-4.6年之间发展转移。手术后立即将肿瘤样本放在液氮中，直至RNA提取。使用Macherey-Nagel(Hoerd，France)RNA提取试剂盒，根据生产商的推荐，提取总RNA。使用BioAnalyzer2100^TM(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)评价RNA质量。

来自Centre RenéHuguenin的乳腺肿瘤样本

我们选择了48个获得自在Centre RenéHuguenin(St Cloud，法国)手术的女性的ER+原发性乳腺肿瘤样本(表2)。已获得全部患者的知情同意，并且实验得到机构伦理委员会的批准。肿瘤取自原始手术后仅辅助内分泌治疗的患者。在进行内分泌治疗时，二十四名患者再发并发展转移(Met+组)，而24名患者未再发和发展转移(Met-组)。标准预后因子如表2所示。患者(平均年龄：70.7岁；范围：54-86)符合下述标准：原发性单侧绝经后乳腺癌；可用的完整的临床、组织学和生物学信息；术前未进行放射性治疗或化学治疗；和在Centre RenéHuguenin的完全随访。在手术时确立阳性腋窝淋巴结的组织类型和数目。根据SBR组织学分级系统(Bloom和Richardson，1957)给浸润肿瘤的恶性评分。使用χ²检验，两组间在年龄、组织学等级、淋巴结状态或肿瘤大小上没有显著差异(表2)。通过使用定量生物化学方法(葡聚糖-炭末法或酶免疫试验)在蛋白质水平确定ER状态，并通过RTQ-PCR确认。所有患者都接受术后辅助内分泌治疗(他莫昔芬，每天20mg，持续3-5年)而不进行其它治疗。Met+组的患者在术后和他莫昔芬治疗开始时1.3-10.0年之间发展转移。手术后立即将肿瘤样本放在液氮中，直至RNA提取。通过酸-酚胍盐方法从冷冻肿瘤样本提取总RNA。通过变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。

CLB2群：来自Centre Léon Bérard的乳腺肿瘤样本(n＝113)

我们选择了113个获得自在Centre Léon Bérard(Lyon，法国)手术的女性的原发性乳腺肿瘤样本(表7)。已获得全部患者的知情同意，并且实验得到机构伦理委员会的批准。乳腺肿瘤样本采自手术前未接受内分泌治疗、化学治疗或放射性治疗的女性。在进行化学治疗和/或内分泌治疗时，十九名患者再发(再发组)，而94名患者未再发(无再发组)。标准预后因子如表7所示。患者(平均年龄：53岁；范围：40-82)符合下述标准：原发性单侧乳腺癌；可用的完整的临床、组织学和生物学信息；术前未进行放射性治疗或化学治疗；和在Centre Léon Bérard的完全随访。在手术时确立阳性腋窝淋巴结的组织类型和数目。根据SBR组织学分级系统(Bloom和Richardson，1957)给浸润肿瘤的恶性评分。通过免疫组织化学确定ER和黄体酮受体(PR)状态。通过免疫组织化学确定HER2状态并通过FISH对少量样本进行验证。使用χ²检验，两组间在年龄、组织学等级、淋巴结状态、肿瘤大小、ER状态、PR状态或HER2状态上没有显著差异(表7)。再发组的患者在术后0.5-4.5年之间发展转移。手术后立即将肿瘤样本放在液氮中，直至RNA提取。使用Macherey-Nagel RNA提取试剂盒，根据生产商的推荐提取总RNA。使用BioAnalyzer 2100^TM(Agilent Technologies)评价RNA质量。

CLB2群中乳腺癌亚型的分类

使用目前临床使用的免疫组织化学和临床病理学参数，将乳腺肿瘤分为以下分子亚组：Luminal亚类(ER+和/或PR+)，HER2+亚类(ER-/PR-/HER2+)和Triple阴性亚类(ER-/PR-/HER2-)。根据Hugh等(2009)和Cheang等(2009)或Millar等(2009)和Nguyen等(2008)给出的分类将Luminal亚类再分类为Luminal A和Luminal B亚组。在第一种分类中，Luminal A乳腺肿瘤为ER+和/或PR+、HER2-和低增殖指数(由低KI67给出或由SBR1和SBR2给出)，而Luminal B具有ER+和/或PR+，还具有HER2+或高增殖指数(高KI67或SBR3)状态；在第二种分类中，Luminal A肿瘤是具有ER+和/或PR+而且HER2-状态的乳腺癌，而Luminal B肿瘤仅具有ER+和/或PR+和HER2+。

统计分析

使用

3plus软件(Statgraphics Centurion，Herndon，VA，USA)，用Mann-Whitney检验和Spearman等级检验进行RTQ-PCR的统计分析。置信水平大于95％的结果(P＜0.05)视为显著。对于每个基因，将乳腺肿瘤群分为2组：一个为“低”mRNA水平(低于所有乳腺肿瘤样本的mRNA水平中值)，而另一个为“高”mRNA水平(高于所有乳腺肿瘤样本的mRNA水平中值)。感兴趣的事件是总存活(OS)和无再发存活(RES)。从诊断之日起至死亡或在最后一次随访时检查通过期间测量OS。从诊断之日至再发或在最后一次随访时检查通过期间测量RFS。通过Kaplan-Meier方法估计存活率分布，并使用软件(Chicago，IL，USA)，通过对数-秩检验(单变量分析)确定存活率之间的差异显著性。因为本研究为探索性分析，所以全部统计分析在0.05显著性水平进行，并且未对多次测试施以校正。在多变量Cox模型中输入单变量分析中0.10显著水平的RFS的候选预后因子，并使用反向选择过程建立最终的模型。

结果

MDA-MB-231乳腺癌细胞中ZNF217过量表达促进细胞增殖

建立组成型过量表达ZNF217蛋白的稳定MDA-MB-231乳腺癌细胞(参见材料和方法)。选择这些细胞是因为它们的内源ZNF217表达水平低。用包含ZNF217全长cDNA序列的真核表达载体pcDNA6/V5-His或用作阴性对照的空载体转染MDA-MB-231细胞。在杀稻瘟菌素选择后，选择过量表达ZNF217mRNA和蛋白的两个细胞克隆(ZNF217-1和ZNF217-2)以及用空pcDNA6/V5-His转染的细胞克隆(MDA-MB-231对照细胞)。ZNF217-1和ZNF217-2细胞中的ZNF217mRNA水平分别为MDA-MB-231对照细胞的2.0至3.5倍(数据未给出)。因此，与MDA-MB-231对照细胞相比，ZNF217-1和ZNF217-2细胞中ZNF217蛋白表达分别增加5.4和5.1倍(图1)。因此，可观察到在mRNA水平和蛋白水平，ZNF217的表达之间有良好的一致性。在使用BrdU标记的细胞增殖试验中，ZNF217-1和ZNF217-2中ZNF217过量表达与细胞增殖增加(图2A)和细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E2的表达增加(图2B)相关。

ZNF217促进乳腺癌细胞的非贴壁依赖性生长、迁移和体外浸润性。

非贴壁依赖性增殖是恶性细胞在体内形成肿瘤的标志(Irshad等，2004；Lee等，2004)，被认为与高度转移的癌细胞相关(Glondu等，2002；Muraoka-Cook等，2004)，并且能通过软琼脂菌落形成而测定。因此我们接着检查了不同细胞群中ZNF217过量表达对软琼脂菌落形成的影响。我们发现与MDA-MB-231对照细胞相比，当ZNF217过量表达时形成的ZNF217-1和ZNF217-2菌落增加约67倍和70倍(图3)。

基底膜的破坏或渗透被认为是肿瘤细胞浸润的必需步骤。强迁移能力是肿瘤恶性的另一个标志(Gupta和Massague，2006)。在多项研究中，高度转移的肿瘤细胞在使用博伊登小室进行的体外浸润试验(Chen等，2006；Galaup等，2006)和创伤愈合试验(Hu和Verkman，2006)中表现出上调的迁移性。因此我们试图研究ZNF217过量表达是否影响肿瘤浸润和/或迁移。我们在体外博伊登小室试验(图4)中研究了ZNF217-1、ZNF217-2和对照细胞的浸润性，其中将细胞涂布在模拟生理基底膜的厚层Matrigel顶部。图4显示，随着ZNF217的表达，浸润性显著增加，在两个克隆中有相似的变化。与对照细胞相比，ZNF217-过量表达克隆中的浸润细胞数高6.3和7。Matrigel浸润试验提供了支持数据，也清楚地证明了ZNF217-1和ZNF217-2细胞的浸润性质(图5)。MDA-MB-231细胞中ZNF217的过量表达也导致迁移性增加，如创伤愈合试验所证明的(图6)。总之，这些结果表明了ZNF217在乳腺癌细胞的浸润性以及非贴壁依赖性生长中的重要作用。

ZNF217诱导表皮-间充质转移(EMT)

因为已经证明EMT与癌细胞浸润有关(Yilmaz和Christofori，2009)，所以我们接着检查人类乳腺表皮细胞MCF10A(Soule等，1990；Tait等，1990)中ZNF217的影响。在稳定转染的MCF10A细胞中ZNF217的过量表达足以触发EMT的一些形态学特征，包括成纤维细胞的形态学，这些特征与表皮标志物(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、遮光蛋白)的显著降低和间充质蛋白水平(波形蛋白和纤连蛋白)的增加有关(图7)。因此我们提出促进EMT的能力是潜藏于ZNF217浸润能力增强之下的另一个重要特征。

ZNF217是转移性乳腺癌的预后标志物

为了研究ZNF217的临床相关性，我们通过RTQ-PCR考察了在CentreLéon Bérard(法国)收集的47个乳腺肿瘤样本(CLB1群)中ZNF217mRNA水平(表1)。使用Mann-Whitney检验，我们用临床和病理学参数比较了ZNF217的表达(表3)；在任何一种情况下都没有观察到显著的相关性。因为所述群由在化学治疗和/或内分泌治疗时发展转移(术后0.6和4.6年)(Met+组，n＝14)或未转移(Met-组，n＝33)的女性组成，所以我们评价了这两组患者的ZNF217表达水平。如表4所示，高ZNF217mRNA水平与转移的发展显著相关(Met+组中显著的ZNF217mRNA过量表达，P＝0.002，Mann-Whitney检验)。

然后我们使用单变量分析(对数-秩检验)进一步研究ZNF217的预后值。单变量分析显示ZNF217mRNA的高表达水平与较短的RFS显著相关(P＝0.003，表5和图8A)。没有观察到在ZNF217mRNA水平和OS之间显著的相关性，但存在接近显著的趋势(P＝0.15，表6和图8B)。

然后我们评价了不同地理来源的乳腺癌患者独立群中我们的发现的相关性。该群由Centre RenéHuguenin(法国)收集，由在内分泌治疗时发展或未发展转移(24个Met+样本和24个Met-样本)的ER+乳腺癌患者组成。同样地，发现与Met-组(中值＝1.0；范围：0.21-2.15；P＝0.0003，Mann-Whitney检验)相比，在Met+组中ZNF217表达显著上升(中值＝2.4；范围：0.24-14.62)，并且ZNF217的高表达水平与更短的RFS(P＝0.039，对数-秩检验)显著相关。因此我们确认，在两个不同的乳腺癌患者群中，第一，易发展转移的患者的原发性乳腺肿瘤中ZNF217高表达水平的存在和，第二，ZNF217与RFS的显著相关。总之，这些数据表明ZNF217能代表一种新的不良预后标志物。

ERBB2(HER2)是乳腺癌中一种公知的不良预后标志物。ERBB2表达水平与RFS或OS没有显著相关性(表5和6)。然而，对于RFS可以观察到接近显著的趋势(P＝0.09，对数秩检验；表5)。也没有ESR1(ER α)表达水平和RFS或OS相关的证据(表5和6)。以单变量分析中0.10的显著性水平使用RFS的候选预后因子进行RFS的Cox多变量回归分析(ZNF217和ERBB2)。最有趣的发现是在多变量分析中(P＝0.002；HR＝9.56；95％CI；1.57至31.59；表5)，只有ZNF217的预后值保持显著。总而言之，这些结果证明，第一，ZNF217是易发展转移的乳腺癌患者中与RFS相关的新预后标志物，和第二，ZNF217的预后值可以提供的信息比ERBB2更多。

最后，我们通过来自60个乳腺肿瘤样本的先前研究的基因表达阵列数据的回溯统计分析研究了我们的发现的相关性，所述样本来自在使用他莫昔芬时已发展转移或未发展转移的患者(28个Met+和32个Met-)(Ma等，2004)。基于这个基因表达谱研究的数据，我们发现Met+样本中ZNF217的表达水平显著高于Met-样本(P＝7.5x 10^-4，Mann-Whitney检验)，而且ZNF217的高表达水平与RFS显著相关(P＝0.01；对数-秩检验)，因此验证了我们的发现。

ZNF217在分类为“具有良好预后的肿瘤”的乳腺肿瘤中具有较高的预后值

使用由Centre RenéBérard收集的113个乳腺肿瘤样本的新群(称为CLB2群)(表7)研究在乳腺肿瘤的特定亚类中ZNF217的预后值是否仍存在或改进。

使用Mann-Whitney检验，我们比较了ZNF217表达的临床和病理学参数：在任何情况下都没有观察到显著相关(表8)。然而，我们确证了ZNF217的高表达水平和更短的RFS显著相关(P＝0.023，对数秩检验；表9和图9)。在评价这个群中几种临床和病理学参数的预后值时，我们仅发现淋巴结状态(＞3个浸润节)与更短的RFS相关(P＝0.044，对数秩检验，表9)。使用ZNF217和节浸润状态进行RFS的Cox多变量回归分析。令人惊讶的是，在多变量分析中只有ZNF217的预后值保持显著(P＝0.019；HR＝5.54；表9)，证明ZNF217的预后值提供的信息比淋巴结浸润状态更多。

由免疫组织化学检测的乳腺癌标志物如ER和HER2(ERBB2)传统上用于癌症预后，而ER-和/或HER2+的乳腺肿瘤是具有不良的预后的肿瘤。然而，只有30-40％的乳腺癌是ER-，而15-20％的乳腺癌是HER2+。因此在目前被视为“更好预后癌症”(即具有ER+和/或HER2-状态)的乳腺癌中急需新的预后生物标志物。

在CLB2群的ER+(n＝68)和ER+/HER2-(n＝57)亚类中，仍然存在与RFS相关的ZNF217预后值，并且令人惊讶的是，与全部群中获得的预后值相比得到了改进(分别为P＝0.014和P＝0.004，对数秩检验，表10，图10和11)。通过独立群的回溯分析(Ma等，2004)，我们验证了与全部群(P＝0.014，对数秩检验，表10)相比，在ER+/HER2-亚类中的ZNF217预后值更显著(P＝0.001，对数秩检验，表10)。

在使用ER状态、HER2状态、SBR状态和/或淋巴结状态将CLB2群的113个乳腺肿瘤分级时，我们发现在显示“预后优良”的标志物的乳腺肿瘤亚类，即ER+(P＝0.014)、HER2-(P＝0.007)、SBR1+SBR2(P＝0.004)或SBR2亚类(P＝0.01)中，ZNF217的高表达水平与更短的RFS显著相关(对数秩检验，表11)。在收集自具有少量浸润淋巴结(≤3)的患者的肿瘤中也能观察到接近显著的趋势(P＝0.052，对数秩检验，表11)。相反地，在显示“预后差”的常规标志物，如ER-、HER2+、SBR3或淋巴结状态(＞3)的乳腺肿瘤亚类中没有发现ZNF217和RFS之间的显著关联(对数秩检验，表11)。最后在组合几种“良好预后”参数如ER+和/或PR+、ER+和/或PR+和SBR1+2、ER+/SBR1+2，或ER+/HER2-/SBR1+2的亚类中，ZNF217的高表达水平仍然与更短的RFS显著相关(分别为P＝0.013，P＝0.002，P＝0.015和P＝0.031，对数秩检验，表11)。有趣的是，在ER+/HER2-/SBR1+2/淋巴结(≤3)亚类(n＝27)中几乎达到显著水平(P＝0.067，对数秩检验，表11)。最后，仅在全部群中ZNF217的高表达水平与OS显著相关(P＝0.049；对数秩检验，表11)。有趣的是，在ER+/HER2亚类(n＝27)中也存在接近显著的趋势(P＝0.055)(表11)。

近来，已经提出免疫组织学(ER，PR，HER2，KI67)和/或临床(SBR)参数，将乳腺癌分为生物学上独特而且行为方式不同的亚类(Blows等，2010；Cheang等，2009；Hugn等，2009；Millar等，2009；Nguyen等，2008)。不同分子亚组的预后和化学治疗敏感性不同。Luminal-样癌症是ER+和/或PR(黄体酮受体)-阳性的，因此对于内分泌治疗敏感，而且即使不进行任何治疗，也可具有比HER2+和Triple阴性亚型更有利的预后。Luminal B亚型相当于表达HER2或具有由KI67或SBR(考虑观察到的有丝分裂数目)给出的高增殖表型的亚型(Cheang等，2009；Hugh等，2009；Millar等，2009；Nguyen等，2008；Voduc等，2010)。Luminal B乳腺癌已经显示比Luminal A乳腺癌更不利的长期存活(Blows等，2010；Cheang等，2009；Hugh等，2009；Nguyen等，2008；Voduc等，2010)。最重要的是旨在对Luminal亚类，特别是Luminal A亚类再分级的标志物。在CLB2群中，我们发现Luminal乳腺癌中ZNF217的高表达水平与更短的RFS显著相关(P＝0.013，对数秩检验，表12)，但是HER2+或Triple阴性亚型中则不是。有趣的是，在Luminal B亚类中检测不到ZNF217的预后值，而在LuminalA亚类中高ZNF217表达水平与更短的RFS相关(P＝0.012和P＝0.014，对数秩检验，表12)。

总之，这些数据证明ZNF217表达水平是乳腺癌患者中不良预后的新标志物，特别是在具有至少一种良好预后的常规标志物(ER+和/或PR+、HER2-、SBR1+2、淋巴结状态(≤3)、Luminal A)的乳腺肿瘤中。因此ZNF217对于目前的常规标志物有增加的值，并允许将患有视为具有良好预后的癌症的乳腺癌的患者再分级。因此，ZNF217状态可以帮助临床医生作出治疗决定。

ZNF217和ER信号传导途径之间存在交流(cross-talk)

鉴于ER+乳腺癌中ZNF217的不良预后值起主要作用的事实，我们考察了ZNF217和ER表达之间的关系。通过RTQ-PCR，我们发现在乳腺肿瘤样本的两个独立群中ZNF217mRNA水平和ESR1mRNA水平之间显著相关：Spearman秩相关系数＝+0.47；P＝0.0001(在33个ER+和34个ER-的乳腺肿瘤群中)和Spearman秩相关系数＝+0.69；P＝0.0001(在39个ER+乳腺肿瘤群中)。之前已经用野生型ERS1稳定转染ER-MDA-MB-231细胞系，产生组成型表达ERα的新细胞系(S30细胞)(Levenson等，2003)。我们通过Western印迹证明S30细胞中ER的组成型表达与对照MDA-MB-231细胞相比更高的ZNF217蛋白表达水平相关(图12A)。相反地，在ER+MCF7乳腺癌细胞系中，所述细胞系具有高内源水平的ZNF217，通过siRNA策略敲除ZNF217表达与降低的ER表达相关(图12B)。

在内分泌治疗下药物抗性和再发的发展代表ER+乳腺癌临床治疗中的真实问题。有趣的是，我们发现ZNF217是仅用辅助内分泌疗法治疗的下述两个患者群中不良预后和再发的标志物：由Centre RenéHuguenin收集的群(P＝0.039，对数秩检验)，和通过回溯分析，由Ma等描述的群(P＝0.014，对数秩检验)(Ma等，2004)。通过对来自基因表达阵列数据的回溯统计分析，所述数据来自之前另一项对于155个来自患者的乳腺肿瘤样本进行的研究，所述患者在使用他莫昔芬时发展转移或未发展转移(44个Met+和155个Met-)(Chanrion等，2008)，我们再次确证了高ZNF217mRNA水平是不良预后和再发的标志物(P＝0.01，对数秩检验)。

MVLN是源自MCF7细胞的ER+、激素应答和OH-他莫昔芬(OH-Tam)敏感的乳腺癌细胞系(Demirpence等，1993)。对MVLN使用OH-Tam六个月，允许出现OH-Tam抗性但是仍然依赖雌性激素的CL6.7细胞克隆。通过可在MVLN细胞中检测的分子的细胞抑制活性的损失和CL6.7细胞增殖的强刺激发生(雌性激素-样效应)，在用OH-Tam处理的情况下表征由CL6.7细胞发展出的OH-Tam抗性表型(Ghayad等，2010)(图13)。在使用BrdU标记的细胞增殖试验中，组合敲除ZNF217(siRNA策略)和OH-Tam处理导致敏感MVLN细胞系中对内分泌治疗(P＝0.001，Student检验)敏感性的增加和对CL6.7细胞系中激素抗性的恢复(OH-Tam雌性激素-样活性现在恢复至细胞增殖的35％抑制率，P＜10^-5)(图13)。

总之，这些数据表明在ZNF217和ER表达水平之间存在交流，并且高ZNF217表达水平与对内分泌治疗的应答降低相关。总之，这些数据强烈表明ZNF217可代表内分泌治疗的预测性标志物。

结论

总而言之，我们在体外实验中证明了乳腺癌细胞中ZNF217过量表达触发增殖性、无贴壁依赖性生长，并且与浸润和EMT表型相关。我们已显示ZNF217表达代表易再发和发展转移的乳腺癌患者不良预后的新标志物。更精确地，ZNF217表达水平是对于由目前可用的临床标志物/参数分类为具有良好/更好预后的癌症的乳腺癌(例如ER+亚类、HER2-亚类、Luminal亚类(ER+和/或PR+)、ER+/HER2-亚类、SBR1和/或SBR2亚类、无/少淋巴结浸润亚类(≤3)、ER+和/或PR+和SBR1和/或SBR2亚类、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2亚类、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/无/少淋巴结浸润(≤3)亚类、Luminal A亚类)的有力的不良预后标志物。因此单独或与其它预后标志物一起评价ZNF217表达水平可允许将这些分类为具有良好/更好预后的癌症再分级为两个亚类：“良好预后”乳腺癌(低ZNF217表达水平)或“预后差”乳腺癌(高ZNF217表达水平)，从而帮助临床医生作治疗决定。在Luminal乳腺癌中ZNF217的预后值可以(至少部分)由ZNF217和ER之间存在的交流解释。此外，因为去调节的ZNF217表达水平与对内分泌治疗(在3个群中发现)或对内分泌/化学治疗(在2个群中发现)的应答降低相关，所以ZNF217也可以代表抗癌治疗的预测性标志物，并且特别是内分泌治疗的预测性标志物。

表1

^aP＜0.05时认为P-值(χ²检验)显著。

^bScarff-Bloom-Richardson分类。

c通过免疫组织化学确定。

表2

^aP＜0.05时认为P-值(χ²检验)显著。

^bScarff-Bloom-Richardson分类。

表3

^aP＜0.05时认为P-值(χ²检验)显著。NS，不显著。

^bScarff-Bloom-Richardson分类。

^c通过免疫组织化学确定。

表4

^aP＜0.05时认为P-值(Mann-Whitney检验)显著。NS，不显著。

表5

^aHR，Hazard比例。

^b95％CI，95％置信区间。

^cP＜0.05时认为P-值(Mann-Whitney检验)显著。NS，不显著。

^dND，未分析。使用单变量分析中显著性水平低于0.10的变量进行多变量分析。

表6

^aHR，Hazard比例。

^b95％CI，95％置信区间。

^cP＜0.05时认为P-值(Mann-Whitney检验)显著。NS，不显著。

表7

^aP＜0.05时认为P-值(χ²检验)显著。

^bScarff-Bloom-Richardson分类。

^c对于112名患者可用的信息。

^d通过免疫组织化学测量的。

^e通过免疫组织化学测量的(通过FISH对少量样本验证)。

表8

^aP＜0.05时认为P-值(Mann-Whitney检验)显著。NS，不显著。

^bScarff-Bloom-Richardson分类。

^c对于112名患者可用的信息。

^d通过免疫组织化学测量的。

^e通过免疫组织化学测量的(通过FISH对少量样本验证)。

表9

^aHR，Hazard比例。

^b95％CI，95％置信区间。

^cP＜0.05时认为P-值(Mann-Whitney检验)显著。NS，不显著。

^dND，未分析。使用单变量分析中显著性水平低于0.10的变量进行多变量分析。

^e根据Hugh等(2009)和Cheang等(2009)的分类。

^f根据Millar等(2009)和Nguyen等(2008)的分类。

表10

^aHR，Hazard比例。

^b95％CI，95％置信区间。

^cP＜0.05时认为P-值显著。

表11

^aHR，Hazard比例。

^b95％CI，95％置信区间。

^cP＜0.05时认为P-值显著。NS，不显著。

^dND，未分析。

^eN/A，不适用，因为所有情况都在低ZNF217mRNA水平组中通过(censore)。

表12

^aHR，Hazard比例。

^b95％CI，95％置信区间。

^cP＜0.05时认为P-值显著。NS，不显著。

^d根据Hugh等(2009)和Cheang等(2009)分类。

^e根据Millar等(2009)和Nguyen等(2009)分类。

^fN/A，不适用，因为所有情况都在低ZNF217mRNA水平组中通过。

参考文献

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专利文献

WO98/02539

WO2006/065940

WO03/079748

Claims (18)

1.用于确定患者中乳腺癌预后的方法，所述方法包括下述步骤：

a)对先前取自所述患者的样本测试至少一种乳腺癌预后标志物，并评价所述样本中ZNF217基因的表达水平；

b)如果样本显示至少一种预后标志物，则将乳腺癌分类为具有有利的预后，如果所述样本中ZNF217基因过量表达，则重新将乳腺癌分类为具有不良的预后。

2.根据权利要求1的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中将乳腺癌分类为具有有利的预后的所述预后标志物通过组织学分级系统、免疫组织化学分级系统和/或ERBB2扩增的检测而确定。

3.根据权利要求1-2中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中将乳腺癌分类为具有有利的预后的预后标志物选自下组：ER+、PR+、HER2-、低增殖指数、无/少淋巴结侵入(≤3)、Luminal和Luminal A。

4.根据权利要求1-3中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中将乳腺癌分类为具有有利的预后的至少一种预后标志物可以将乳腺癌的亚型分类为下述亚型：ER+和/或PR+、HER2-、ER+/HER2-、SBR1和/或SBR2、无/少淋巴结侵入(≤3)、ER+和/或PR+/SBR1和/或SBR2、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2、无/少淋巴结侵入(≤3)、Luminal A。

5.根据权利要求1-4中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中如果所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症重新分类为易复发和/或易发展浸润或转移表型。

6.根据权利要求1-5中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中如果所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症重新分类为对于无再发存活具有不良的预后。

7.根据权利要求1-5中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中如果所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症重新分类为对于总存活具有不良的预后。

8.根据权利要求1-7中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中如果所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症重新分类为在内分泌治疗下具有不良的预后。

9.根据权利要求1-7中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中如果所述样本中ZNF217基因过量表达，则将癌症重新分类为在化学治疗和/或在内分泌治疗下具有不良的预后。

10.用于确定患者中乳腺癌预后的方法，所述方法包含下述步骤：

a)对于至少一种乳腺癌预后标志物，测试先前取自所述患者的样本，

b)如果样本显示至少一种将乳腺癌分类为具有有利的预后的标志物，则评价ZNF217基因的表达水平，

c)如果所述样本中ZNF217基因过量表达，则将乳腺癌分类为具有不良的预后。

11.根据权利要求10的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中将乳腺癌分类为具有有利的预后的所述预后标志物通过组织学分级系统、免疫组织化学分级系统和/或ERBB2扩增的检测而确定。

12.根据权利要求10-11中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中将乳腺癌分类为具有有利的预后的预后标志物选自下组：ER+、PR+、HER2-、低增殖指数、无/少淋巴结侵入(≤3)、Luminal和Luminal A。

13.根据权利要求10-12中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中将乳腺癌分类为具有有利的预后的至少一种预后标志物可以将乳腺癌的亚型分类为下述亚型：ER+和/或PR+、HER2-、ER+/HER2-、SBR1和/或SBR2、无/少淋巴结侵入(≤3)、ER+和/或PR+/SBR1和/或SBR2、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/无/少淋巴结侵入(≤3)、Luminal A。

14.根据权利要求1-13中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中将ZNF217基因的表达水平与对照样本相比较。

15.根据权利要求1-14中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中对照样本是取自患有乳腺癌的患者的样本中ZNF217表达的中值水平。

16.根据权利要求1-15中任一项的用于确定患者中乳腺癌预后的方法，其中所述样本是乳腺肿瘤样本。

17.根据权利要求1-16中任一项的方法，所述方法包括通过定量ZNF217基因的mRNA而测量样本中ZNF217基因的表达水平。

18.根据权利要求1-17中任一项的方法，所述方法包括通过定量由ZNF217基因编码的多肽而测量样本中ZNF217基因的表达水平。

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