ES2424118T3 - ZNF217, un nuevo biomarcador para el pronóstico y la predicción de fenotipos recurrentes, invasivos y metastásicos en el cáncer de mama - Google Patents

ZNF217, un nuevo biomarcador para el pronóstico y la predicción de fenotipos recurrentes, invasivos y metastásicos en el cáncer de mama Download PDF

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Abstract

Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente, que comprende lassiguientes etapas: a) ensayar una muestra previamente tomada de dicho paciente en busca de al menos un marcador depronóstico de cáncer de mama, y evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217 en dicha muestra; b) si la muestra presenta al menos un marcador de pronóstico que clasifica al cáncer de mama por tener unpronóstico favorable, reclasificar el cáncer de mama por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 estásobreexpresado en dicha muestra.

Description

ZNF217, un nuevo biomarcador para el pronóstico y la predicción de fenotipos recurrentes, invasivos y metastásicos en el cáncer de mama.
La presente invención se refiere a procedimientos y kits para determinar el pronóstico de un cáncer de mama. Los procedimientos implican determinar el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra tomada de un paciente en el que la sobreexpresión de ZNF217 está correlacionada con la probabilidad de metástasis y con la probabilidad de recaída/recidiva del cáncer.
El cáncer es una cuestión sanitaria importante, y mata a millones de personas a nivel mundial cada año. Los procedimientos de diagnóstico para el cáncer han mejorado y ahora es posible a menudo diagnosticar cánceres en etapas tempranas. A fin de que los tratamientos contra el cáncer sean eficaces, se requieren procedimientos exactos y simples para el pronóstico del cáncer.
El pronóstico del cáncer se determina a menudo basándose en datos histológicos y clínicos tales como el tamaño del tumor, la invasión, la extensión de los nódulos linfáticos o metástasis. Sin embargo, esta determinación es a menudo difícil de realizar en cánceres que se diagnostican en etapas tempranas, cuando los síntomas clínicos y los datos histológicos no están disponibles o no son evidentes.
Los marcadores del cáncer de mama tales como ER alfa (ER) (detectado mediante inmunohistoquímica) y ERBB2/HER2 (detectado mediante inmunohistoquímica y/o FISH) se han usado clásicamente para el pronóstico del cáncer, y los tumores de mama negativos a ER y/o positivos a ERBB2/HER2 son tumores con un mal pronóstico. Sin embargo, ≈60-70% de los cánceres de mama son ER+, y los cánceres de mama ERBB2/HER2+ representan sólo ≈15-20% de todos los cánceres de mama. De este modo, existe una urgente necesidad de nuevos biomarcadores de pronóstico para añadir un nuevo valor de pronóstico/predictivo a los biomarcadores actualmente usados, o para predecir la recaída/recidiva del cáncer, en particular en aquellos cánceres de mama considerados actualmente como “cánceres con un mejor pronóstico”, es decir, en cánceres de mama positivos a ER, y en particular en cánceres de mama positivos a ER y negativos a HER2.
Recientemente, los parámetros inmunohistológicos (ER, PR, HER2, KI67) y/o clínicos (SBR) se han propuesto para clasificar cánceres de mama en subtipos que son biológicamente distintos y se comportan diferentemente (Blows et al., 2010; Cheang et al., 2009; Hugh et al., 2009; Millar et al., 2009; Nguyen et al., 2008). El pronóstico y sensibilidad a la quimioterapia de los diferentes subgrupos moleculares son diferentes. Los cánceres semejantes al luminal son ER+ y/o positivos a PR (receptor de progesterona), y por lo tanto son sensibles a terapia endocrina, y pueden tener un pronóstico más favorable que los subtipos HER2+ y Triple negativos, incluso en la ausencia de cualquier terapia. El subtipo luminal B es equivalente a aquellos que expresan HER2 o que poseen un fenotipo muy proliferativo dado por KI67 o SBR (que tiene en cuenta el número de mitosis observadas) (Cheang et al., 2009; Hugh et al., 2009; Millar et al., 2009; Nguyen et al., 2008; Voduc et al., 2010). Se ha demostrado que los cánceres de mama luminal B tienen una supervivencia a largo plazo menos favorable que los cánceres de mama luminal B (Blows et al., 2010; Cheang et al., 2009; Hugh et al., 2009; Nguyen et al., 2008; Voduc et al., 2010). Se da entonces la máxima importancia a marcadores dirigidos a reestratificar las subclases luminales, en particular la subclase luminal A.
El documento WO 98/02539 describe genes de una región de amplificación en el cromosoma 20 asociado con cánceres. Los genes descritos se pueden usar como sondas específicas para el amplicón 20q13 para monitorizar la copia relativa de secuencias correspondientes en el genoma de células tumorales. Según este documento, el gen ZABC-1 (gen ZNF217) se localiza en el núcleo del amplicón 20q13.2 y está sobreexpresado en tumores primarios y estirpes celulares de cáncer de mama que tienen la amplificación 20q13.2. Según el documento WO 98/02539, la presencia o ausencia y/o el nivel de expresión de las proteínas 20q13 puede ser indicativo de la presencia, ausencia
o grado de un cáncer. Sin embargo, en el documento WO 98/02539, los niveles de expresión del gen ZABC-1 (gen ZNF217) no se miden en muestras de tumores, y una supervivencia más corta libre de la enfermedad sólo está correlacionada con una amplificación de 20q13 de nivel elevado.
El documento WO 2006/065940 describe una nueva diana de pronóstico y terapéutica, el gen HTPAP, que, cuando se amplifica, confiere un mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama. La amplificación del gen HTPAP puede estar asociada con la detección de otras amplificaciones, tales como el amplicón ZNF217.
Sun Guiqin et al. (2008) describen la influencia del silenciamiento de ZNF217 en el comportamiento biológico de una estirpe celular de cáncer ovárico humano (Sun et al., 2008).
Según Li Jing et al. (2006), la amplificación de ZNF217 está asociada significativamente con cáncer ovárico (Li et al., 2006).
Quinlan et al. (2007) se centra en la prueba de que ZNF217 es un oncogén que está amplificado en diversos cánceres (Quinlan et al., 2007).
Huang Guiqing et al. (2005) proporciona experimentos de laboratorio que muestran que ZNF217 suprime la muerte celular asociada con quimioterapia y disfunción telomérica (Huang et al., 2005).
El documento WO 03/079748 se refiere a la potenciación de terapias contra el cáncer mediante la inhibición de ZNF217.
Se encuentran amplificaciones de 20q13 de nivel elevado en 6,8% (Tanner et al., 2000) 8% (Ginestier et al., 2006; Plevova et al., 2010) y 19% (Letessier et al., 2006) de cánceres de mama. Sin embargo, puesto que varios estudios han mostrado que el nivel de amplificación de un gen o de una región cromosómica puede tener, en algunos casos, impacto sustancial sobre el nivel de expresión del gen o de los genes en muestras tumorales, otros mecanismos tales como mecanismos epigenéticos, transcripcionales o post-transcripcionales son también sucesos importantes que contribuyen a la expresión génica. Esto es también cierto para la amplificación de ZNF217 y niveles de expresión de ZNF217, puesto que se pudieron observar niveles de expresión de ZNF217 elevados en tumores de mama y estirpes celulares de mama que no poseen la amplificación (Collins et al., 1998; Collins et al., 2001). Además, Mackay et al. (2009) no encontraron ninguna correlación significativa entre la expresión de ZNF217 y el número de copias del gen ZNF217 (Mackay et al., 2009).
Adicionalmente, no está claro hasta qué grado está correlacionada la amplificación de 20q13 con un mal pronóstico en cáncer de mama. Letessier et al. (2006) no encontraron ninguna asociación entre la amplificación de 20q13 de nivel elevado y un mal resultado en cánceres de mama (Letessier et al., 2006). Contrariamente, otro estudio pudo observar el valor de pronóstico de la amplificación de 20q13 en cáncer de mama, pero sólo con la amplificación de 20q13 de nivel elevado y no con la amplificación de 20q13 de nivel bajo/intermedio (Tanner et al., 1995). Notablemente, la amplificación de 20q13 puede estar asociada con un buen pronóstico o con un mal pronóstico en cáncer de mama. Ginestier et al. (2006) observaron dos tipos de amplificación. En el primer tipo, el locus de ZNF217 se amplificó, pero la amplificación no se detectó en los otros dos loci de 20q13 (Ginestier et al., 2006). En el segundo tipo, la región amplificada pareció más grande, e implicó dos o tres loci entre ZNF217, MYBL2 y STK6. Los dos tipos mostraron perfiles de expresión génica diferentes, y estaban asociados con diferentes características histoclínicas, incluyendo estado de ganglios linfáticos y supervivencia. Los tumores con amplificación en dos o tres loci estaban asociados con un buen pronóstico, mientras que los tumores con la amplificación en ZNF217 sólo estaban asociados más frecuentemente con un mal pronóstico. Ginestier et al. confirmaron además que no hubo ninguna correlación estadística entre los niveles de expresión de ARNm de ZNF217 y la amplificación de ZNF217 en los tumores amplificados solamente en ZNF217, y que los niveles de expresión de ARNm de ZNF217 no fueron capaces de discriminar estos tumores de los tumores sin ninguna amplificación (Ginestier et al., 2006).
Finalmente, dos estudios encontraron la amplificación de ZNF217 asociada con el estado ER- y PR- (Letessier et al., 2006; Plevova et al., 2010).
El valor de pronóstico de la amplificación de ZNF217 y del nivel de expresión de ZNF217 en cáncer de mama ha permanecido por lo tanto mucho tiempo incierto.
La presente invención muestra que el nivel de expresión de ZNF217, independientemente de la amplificación del gen ZNF217, representa un nuevo marcador de mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama que tienen tendencia a la recidiva y a desarrollar metástasis. Más particularmente, ZNF217 es un potente marcador de mal pronóstico de cánceres de mama clasificados por los marcadores/parámetros clínicos actualmente disponibles como cánceres con buen/mejor pronóstico (por ejemplo la subclase ER+, la subclase HER2-, la subclase luminal (ER+ y/o PR+), la subclase ER+/HER2-, la subclase SBR1 y/o SBR2, la subclase sin invasión o con poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la subclase ER+ y/o PR+ y SBR1 y/o SBR2, la subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2, la subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2/ninguna o poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la subclase luminal A). De este modo, la evaluación de los niveles de expresión de ZNF217, solo o en asociación con otros marcadores de pronóstico, permite la reestratificación de estos cánceres clasificados por tener buen/mejor pronóstico en dos subclases: cánceres de mama de “buen pronóstico” (con bajos niveles de expresión de ZNF217) o cánceres de mama de “mal pronóstico” (con niveles de expresión de ZNF217 elevados), ayudando así a los médicos a la decisión terapéutica.
Sorprendentemente, ZNF217 tiene un mayor valor pronóstico que otros marcadores usados habitualmente para el pronóstico del cáncer, tales como ERBB2/HER2 y ESR1/ER.
Los pacientes clasificados por tener un “buen pronóstico” mediante técnicas convencionales pero con tumores que expresan niveles mayores que los normales de ZNF217 son por lo tanto candidatos para la terapia contra el cáncer agresiva.
Además, puesto que los niveles de expresión de ZNF217 desregulados están asociados con una respuesta reducida a terapia endocrina o a terapia endocrina/quimioterapia, ZNF217 también representa un marcador predictivo para terapias contra el cáncer, y en particular para la terapia endocrina.
La presente invención muestra que ZNF217 es una herramienta poderosa para identificar en tumores de mama positivos a ER o en tumores de mama positivos a ER y negativos a HER2, pacientes con tumores agresivos, con un mal pronóstico para la supervivencia libre de recaídas y/o con un mal pronóstico para la supervivencia global. De este modo, ZNF217 es un biomarcador de pronóstico malo que posee un valor añadido en comparación con los biomarcadores actuales de cáncer de mama, puesto que ZNF217 permite la estratificación de muestras de tumores de mama ER+ y/o PR+ y muestras de tumores de mama ER+ y/o PR+/HER2-. Los tumores de mama positivos a ER se tratan habitualmente mediante terapia endocrina. La determinación del estado de expresión de ZNF217 proporciona información útil a los médicos para decidir sobre el mejor curso de tratamiento, puesto que los tumores positivos a ZNF217 positivos a ER negativos a HER2 son tumores más agresivos que tienen tendencia a desarrollar metástasis y/o a volver a ocurrir bajo terapia. De este modo, estos tumores son candidatos para una terapia más agresiva contra el cáncer.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente, teniendo dicho cáncer de mama un buen pronóstico según se determina mediante clasificación inmunohistoquímica y/o histológica convencional, que comprenden medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra de dicho paciente, y clasificar el cáncer por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
Preferentemente, los procedimientos de la presente invención permiten la reestratificación o reclasificación de un paciente que tiene un “buen pronóstico” según se determina mediante procedimientos convencionales. Preferentemente, dicho paciente ha sido diagnosticado con un cáncer de mama que presenta al menos un marcador de buen pronóstico seleccionado entre ER+, PR+, HER2-, índice proliferativo bajo (dado por SBR1 y SBR2, o dado por KI67 bajo), subclase luminal, subclase luminal A y estado de los ganglios linfáticos (ningún/pocos ganglios linfáticos invadidos, <3).
En los procedimientos de la presente invención, el cáncer se clasifica o reclasifica como propenso a volver a aparecer y/o propenso a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
En una primera realización, la presente invención se refiere a procedimientos para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente, que comprenden las siguientes etapas:
-
ensayar una muestra previamente tomada de dicho paciente para determinar al menos un marcador de pronóstico de cáncer de mama y evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217 en dicha muestra;
-
si la muestra presenta al menos un marcador que clasifica al cáncer de mama por tener un pronóstico favorable, reclasificar el cáncer de mama por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
En otra realización, la presente invención se refiere a procedimientos para determinar el pronóstico de un paciente con cáncer de mama en un paciente, que comprenden las siguientes etapas:
-
ensayar una muestra previamente tomada de dicho paciente para determinar al menos un marcador de pronóstico de cáncer de mama,
-
evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217 si la muestra presenta al menos un marcador que clasifica al cáncer de mama por tener un pronóstico favorable,
-
clasificar el cáncer de mama por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
Preferentemente, dicho marcador de pronóstico que clasifica el cáncer de mama por tener un pronóstico favorable se determina mediante un sistema de clasificación histológica y/o un sistema de clasificación inmunohistoquímica y/o detección de la amplificación de ERBB2).
Más preferentemente, dicho marcador de pronóstico que clasifica al cáncer de mama por tener un pronóstico favorable se selecciona de entre el grupo constituido por ER+, PR+, HER2-, índice proliferativo bajo (dado por SBR1 y SBR2, o dado por KI67 bajo), subtipo luminal, subtipo luminal A y estado de los ganglios linfáticos (ningún/pocos ganglios linfáticos invadidos (≤3)).
Incluso más preferido, dicho marcador de pronóstico que clasifica al cáncer de mama por tener un pronóstico favorable clasifica al cáncer de mama por tener un subtipo seleccionado del grupo que consiste en la subclase ER+, la subclase HER2-, la subclase luminal (ER+ y/o PR+), la subclase ER+/HER2-, la subclase SBR1 y/o SBR2, la subclase sin invasión/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la subclase ER+ y/o PR+ y SBR1 y/o SBR2, la 4
subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2, la subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2/ninguna invasión/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la subclase luminal A). SBR1 y/o SBR2 que indican fenotipo proliferativo bajo se pueden sustituir por KI67 bajo en las subclases correspondientes.
5 Preferentemente, el cáncer se reclasifica como propenso a reaparecer y/o propenso a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
Preferentemente, el cáncer se clasifica o reclasifica por tener un mal pronóstico para la supervivencia libre de recaídas si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
10 En otras realizaciones, el cáncer se clasifica o reclasifica por tener un mal pronóstico para la supervivencia global si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
En otras realizaciones, el cáncer se clasifica o reclasifica por tener un mal pronóstico bajo terapia endocrina si el gen 15 ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
En otras realizaciones, el cáncer se clasifica o reclasifica por tener un mal pronóstico bajo quimioterapia y/o terapia endocrina si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
20 En otras realizaciones, el cáncer se clasifica o reclasifica por tener un mal pronóstico bajo terapia endocrina si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
En otras realizaciones, el cáncer se clasifica o reclasifica por tener un mal pronóstico bajo quimioterapia si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
25 En los procedimientos de la presente invención, el nivel de expresión del gen ZNF217 se compara preferentemente con una muestra de control.
En algunas realizaciones, la muestra de control es el nivel de expresión de la mediana del gen ZNF217 observado 30 en una población sana.
Ventajosamente, la muestra de control es el nivel de expresión de la mediana de ZNF217 en muestras tomadas de pacientes que tienen cánceres de mama. Preferentemente, la muestra es una muestra de tumor de mama.
35 La presente invención también se refiere a procedimientos para la reestratificación de pacientes con cáncer de mama que tienen un buen pronóstico como se determina mediante inmunohistoquímica y/o detección de la amplificación de ERBB2 y/o clasificación histológica, que comprenden medir el nivel de expresión del gen ANF217 en una muestra de al menos un paciente, y reclasificar al paciente por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
40 Preferentemente, los pacientes con cáncer de mama tienen al menos un marcador de buen pronóstico seleccionado entre ER+, PR+, HER2-, SBR1 y/o SBR2, KI67 bajo, subclase luminal, subclase luminal A y estado de ganglios linfáticos (≤3).
45 Preferentemente, los procedimientos de la presente invención comprenden medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra mediante cuantificación del ARNm del gen ZNF217.
Preferentemente, los procedimientos de la presente invención comprenden medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra mediante cuantificación del polipéptido o polipéptidos codificados por el gen ZNF217. 50
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en la observación de que el nivel de expresión del gen ZNF217 es un marcador de pronóstico extraordinario para el cáncer de mama. Más particularmente, ZNF217 tiene un valor de pronóstico 55 elevado en pacientes con cáncer de mama que se han clasificado previamente por tener un pronóstico “favorable” o “bueno” mediante técnicas convencionales. ZNF217 es un marcador de mal pronóstico potente para cánceres de mama clasificados por los marcadores/indicadores clínicos actualmente disponibles como cánceres con buen/mejor pronóstico (por ejemplo, la subclase ER+, la subclase HER2-, la subclase luminal (ER+ y/o PR+), la subclase ER+/HER2-, la subclase SBR1 y/o SBR2, la subclase sin invasión/con poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la 60 subclase ER+ y/o PR+ y SBR1 y/o SBR2, la subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2, la subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2/sin invasión/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la subclase luminal A). SBR1 y/o SBR2 que indican fenotipo proliferativo bajo se pueden sustituir por KI67 bajo en las subclases correspondientes). La evaluación de los niveles de expresión de ZNF217, solo o en asociación con otros marcadores de pronóstico, proporciona de este modo la reestratificación de estos cánceres clasificados por tener buen/mejor pronóstico en dos subclases: cánceres 65 de mama de “buen pronóstico” (con niveles de expresión de ZNF217 bajos) o cánceres de mama de “mal
pronóstico” (con niveles de expresión de ZNF217 elevados), proporcionando así una información útil a los médicos. Sorprendentemente, ZNF217 tiene un valor de pronóstico mayor que otros marcadores usados habitualmente para el pronóstico del cáncer, tales como ERBB2/HER2 y ESR1/ER.
La sobreexpresión o los niveles elevados de expresión de ZNF217 son característicos de tumores de mama que tienen un fenotipo invasivo o metastásico, con un mal pronóstico para la supervivencia libre de recaídas y/o con un mal pronóstico para la supervivencia global. La sobreexpresión de este gen en células de cáncer de mama está correlacionada de forma estadísticamente significativa con una mayor recidiva y pronóstico peor de la enfermedad.
La presente invención se refiere a un procedimiento para identificar un cáncer de mama y/o un tumor de mama que tiende a reaparecer y/o un cáncer de mama y/o un tumor de mama que tiene o con tendencia a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para identificar un cáncer de mama y/o un tumor de mama con tendencia a reaparecer y/o un cáncer de mama y/o un tumor de mama que tiene o con tendencia a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico, en el que el cáncer de mama o el tumor de mama se ha clasificado previamente por tener un pronóstico favorable mediante técnicas convencionales.
“Cáncer” se refiere a enfermedades en las que un grupo de células presenta crecimiento/división sin control, invasión y algunas veces metástasis.
“Estadísticamente significativo” se refiere preferentemente a una correlación o a una asociación a un nivel de confianza de al menos 95% (p < 0,05).
Los términos “invasivo” o “agresivo” se refieren a un cáncer o a un tumor que crece rápidamente que tiene tendencia a extenderse más allá de sus fronteras en tejidos adyacentes.
El término “metastásico” se refiere a la extensión de un cáncer o tumor desde el órgano de origen a órganos adicionales/sitios distantes en el paciente.
En realizaciones preferidas, la presente invención se refiere a procedimientos para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente, teniendo dicho cáncer de mama un “buen” pronóstico según se determina mediante inmunohistoquímica y/o detección de la amplificación de ERBB2 y/o clasificación histológica, que comprenden medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra de dichos pacientes, y clasificar o reclasificar el cáncer por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
En una primera realización, la presente invención se refiere a procedimientos para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente, que comprenden las siguientes etapas:
-
ensayar una muestra tomada previamente de dicho paciente para determinar al menos un marcador de pronóstico de cáncer de mama y evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217 en dicha muestra;
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si la muestra presenta al menos un marcador que clasifica al cáncer de mama por tener un pronóstico favorable, reclasificar el cáncer de mama por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
La muestra se puede ensayar simultáneamente para determinar al menos un marcador de pronóstico convencional y para determinar el nivel de expresión de ZNF217. El marcador o marcadores de pronóstico y el nivel de expresión de ZNF217 también se pueden evaluar sucesivamente y de forma independiente.
En otra realización, la presente invención se refiere a procedimientos para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente, que comprenden las siguientes etapas:
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ensayar una muestra tomada previamente de dicho paciente para determinar al menos un marcador de pronóstico de cáncer de mama,
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evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217 si la muestra presenta al menos un marcador que clasifica al cáncer de mama por tener un pronóstico favorable,
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clasificar el cáncer de mama por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
El valor de pronóstico del nivel de expresión de ZNF217 está potenciado para cánceres de mama que tienen un pronóstico favorable según se determina mediante procedimientos convencionales.
Un número de pacientes con cáncer de mama que tienen un “buen” pronóstico según se determina mediante procedimientos convencionales todavía desarrollan un cáncer invasivo, metastásico, o tienen una supervivencia libre 6 10
de recaídas más corta, o tienen una tasa de supervivencia global más corta. La medición del nivel de expresión del gen ZNF217 proporciona la reestratificación o reclasificación de estos pacientes previamente clasificados por tener un “buen” pronóstico en dos clases: cánceres de mama de “buen pronóstico” (con niveles de expresión de ZNF217 bajos) o cánceres de mama de “mal pronóstico” (con niveles de expresión de ZNF217 elevados).
Las expresiones “buen pronóstico” o pronóstico “favorable” se refieren a pacientes que tienen un mejor pronóstico que pacientes sin uno o varios marcadores dados de un buen pronóstico, y/o pacientes con uno o varios marcadores dados de mal pronóstico.
El término “marcador” se refiere a un indicador que podría proporcionar un pronóstico para un cáncer de mama. El subtipado y la subclasificación de los tumores de cáncer de mama se llevan a cabo habitualmente con una combinación de marcadores. Estos marcadores clasifican a los cánceres de mama en subtipos o subclases diferentes.
La inmunohistoquímica y/o detección de la amplificación de ERBB2 y la clasificación histológica se han usado clásicamente para determinar el pronóstico de cánceres de mama a fin de determinar el curso más eficaz de tratamiento para pacientes con cáncer de mama.
Preferentemente, los procedimientos de la presente invención proporcionan la reestratificación o reclasificación de un paciente que tiene un “buen” pronóstico según se determina mediante procedimientos convencionales tales como inmunohistoquímica y/o detección de la amplificación de ERBB2 y clasificación histológica.
La malignidad del cáncer de mama infiltrante se puede puntuar, por ejemplo, según cualquier sistema de clasificación histológica apropiado. La mayoría de los sistemas de clasificación de tumores actualmente empleados para el cáncer de mama combinan grado nuclear, formación de túbulos y tasa mitótica. Uno de los sistemas de clasificación más habituales usados es el sistema de Scarff-Bloom-Richardson (SBR) (Bloom y Richardson, 1957). El grado SBR o grado histológico corresponde a la adición de la puntuación de formación de túbulos tumorales, más el número de puntuación de mitosis, más la puntuación de pleomorfismo nuclear. La puntuación combinada se convierte entonces al siguiente grado SBR: SBR1 que corresponde a un grado bajo, SBR2 que corresponde a un grado intermedio, SBR3 que corresponde a un grado elevado.
Los procedimientos de la presente invención proporcionan la reestratificación de pacientes con cáncer de mama que tienen un grado SBR favorable. Entre estos pacientes previamente clasificados por tener un “buen pronóstico”, los niveles de expresión elevados de ZNF217 son un marcador para un mal pronóstico.
Otros marcadores convencionales son el estado del receptor basado en la presencia o ausencia del receptor de estrógenos (ER), el receptor de progesterona (PR) y/o el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2/ErbB-2). Generalmente, los cánceres de mama ER+, PR+ y/o HER2- se clasifican por tener un “mejor”/”buen” pronóstico. El estado del receptor se puede determinar clásicamente mediante inmunohistoquímica y/o detección de la amplificación de ERBB2 según procedimientos bien conocidos. La detección de la amplificación de ERBB2 se lleva a cabo habitualmente mediante FISH (hibridación in situ con fluorescencia).
Los cánceres de mama de la subclase ER+ y/o HER2- se consideran que tienen un pronóstico “favorable”, aunque un número de estos pacientes experimentará una recidiva de su cáncer de mama. En los procedimientos de la presente invención, se lleva a cabo una clasificación o reestratificación más precisa de estos pacientes/tumores de mama al evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217.
Otros subtipos de cáncer de mama considerados clásicamente por tener un “buen” pronóstico son los subtipos luminal y luminal A. Los cánceres de tipo luminal son cánceres de mama ER+ y/o PR+. Los cánceres de mama luminal A son aquellos que son ER+ y/o PR+, HER2- y que tienen un índice proliferativo bajo (dado por KI67 bajo, o dado por SBR1 y SBR2) (Cheang et al., 2009; Hugh et al., 2009; Voduc et al., 2010). Los cánceres de mama luminal A también pueden ser cánceres de mama con estado ER+ y/o PR+ y HER2- (Millar et al., 2009; Nguyen et al., 2008)
o cánceres de mama con ER+ y/o PR+ e índice proliferativo bajo (dado por KI67 bajo, o dado por SBR1 y SBR2) (Voduc et al., 2010). Los cánceres de mama luminal B son aquellos cánceres que poseen un estado ER+ y/o PR+ y también poseen HER2+ o índice proliferativo elevado (KI67 elevado o SBR3) (Cheang et al., 2009; Hugh et al., 2009). Los cánceres de mama luminal B también pueden ser aquellos con ER+ y/o PR+ y HER2+ solamente (Millar et al., 2009; Nguyen et al., 2008).
En los procedimientos de la presente invención, los tumores de mama del subtipo luminal y/o luminal A se reestratifican o reclasifican mediante evaluación del nivel de expresión del gen ZNF217.
Otro indicador de pronóstico bien conocido en cáncer de mama es el estado de los ganglios linfáticos. Los pacientes que sufren de cánceres de mama sin ganglios linfáticos invadidos o con pocos ganglios linfáticos invadidos (≤3) se clasifican convencionalmente por tener un pronóstico favorable.
En los procedimientos de la presente invención, la evaluación del nivel de expresión del gen ZNF217 también proporciona la reestratificación de subtipos de tumores de mama que combinan varios marcadores de “buen” pronóstico, tales como la subclase ER+, la subclase HER2-, la subclase luminal (ER+ y/o PR+), la subclase ER+/HER2-, la subclase SBR1 y/o SBR2, la subclase sin invasión/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la
5 subclase ER+ y/o PR+ y SBR1 y/o SBR2, la subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2, la subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2/sin invasión/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la subclase luminal A. SBR1 y/o SBR2 que indican fenotipo proliferativo bajo se pueden sustituir por KI67 bajo en las subclases correspondientes.
En los procedimientos de la presente invención, los cánceres de mama que tienen al menos un indicador clásico de
10 un pronóstico favorable se reclasifican o reestratifican como propensos a reaparecer y/o propensos a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
En algunas realizaciones, los cánceres de mama se reclasifican o reestratifican por tener un mal pronóstico para la supervivencia libre de recaídas si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
15 En otras realizaciones, los cánceres de mama se reclasifican o reestratifican por tener un mal pronóstico para la tasa de supervivencia global si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
En otras realizaciones, el cáncer se clasifica por tener un mal pronóstico bajo terapia endocrina si el gen ZNF217
20 está sobreexpresado en dicha muestra. El 70 por ciento de pacientes con cáncer de mama son positivos para el receptor alfa de estrógenos (ER α) y por lo tanto son adecuados para la terapia endocrina, una estrategia que se dirige a bloquear los efectos mitogénicos de estrógeno sobre células de cáncer de mama. En la terapia endocrina se usan diferentes moléculas: los moduladores del receptor de estrógenos selectivos (SERM) tales como tamoxifeno, que evita la unión de estrógeno a su receptor; los reductores selectivos del receptor de estrógenos (SERD) tales
25 como fulvestrant (ICI 182.780), un antagonista de ER que también induce desestabilización y degradación del receptor; los inhibidores de aromatasas (tales como exemestano, letrozol, anastrozol) que, bloqueando la actividad de aromatasas, inhiben la conversión de andrógenos en estrógenos.
Por lo tanto, los niveles de expresión de ZNF217 tienen también un valor predictivo. Los niveles de expresión de 30 ZNF217 están correlacionados con metástasis y cáncer de mama agresivo en pacientes bajo terapia endocrina.
En otras realizaciones, los niveles de expresión de ZNF217 tienen por lo tanto también un valor predictivo. Los niveles de expresión de ZNF217 están correlacionados con metástasis y cáncer de mama agresivo en pacientes bajo terapia endocrina y/o quimioterapia.
35 En los procedimientos de la presente invención, el nivel de expresión del gen ZNF217 se compara preferentemente con una muestra de control.
En algunas realizaciones, la muestra de control es el nivel de expresión de la mediana del gen ZNF217 observado 40 en una población sana.
Más ventajosamente, la muestra de control es el nivel de expresión de la mediana de ZNF217 en muestras tomadas de pacientes que tienen cánceres de mama, y más preferentemente en muestras de tumor de mama.
45 La presente invención también se refiere a procedimientos para la reestratificación de pacientes con cáncer de mama que tienen un buen pronóstico según se determina mediante inmunohistoquímica y/o detección de la amplificación de ERBB2 y/o clasificación histológica, que comprenden medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra procedente de al menos un paciente, y reclasificar el paciente por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
50 Preferentemente, los procedimientos de la presente invención comprenden medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra mediante cuantificación del ARNm del gen ZNF217.
En otras realizaciones, los procedimientos de la presente invención comprenden medir el nivel de expresión del gen 55 ZNF217 en una muestra mediante cuantificación del polipéptido o polipéptidos codificados por el gen ZNF217.
La presente invención demuestra niveles de expresión elevados o sobreexpresión de ZNF217 en tumores de mama primarios de pacientes con tendencia a la recaída y/o a desarrollar metástasis. De forma interesante, el valor de pronóstico de la expresión de ZNF217 es mayor que el valor de pronóstico de otros marcadores de pronóstico para
60 cáncer de mama, tales como ERBB2/HER2 y ESR1/ER.
Un “pronóstico” es el curso probable y resultado de una enfermedad. El pronóstico puede incluir la probabilidad de complicaciones del cáncer, de metástasis, de extensión, resultado probable del cáncer, probabilidad de recuperación, tasa de supervivencia global y/o tasa de muerte global. Preferentemente, es la probabilidad de que un 65 paciente se recuperará o tendrá una recidiva/recaída del cáncer. Esta información es útil al paciente pero también al
médico y/o especialista a la hora de determinar el curso de tratamiento más eficaz. Una determinación de la probabilidad de una recaída del cáncer o de la probabilidad de metástasis puede ayudar al médico y/o al especialista a determinar si se debería tomar un enfoque más conservativo o más radical para la terapia. El pronóstico proporciona la selección y clasificación de pacientes que se predice que se beneficiarán de un régimen terapéutico dado.
Los procedimientos de la presente invención proporcionan pronóstico para un cáncer de mama después de que se ha diagnosticado y/o durante el tratamiento terapéutico de un cáncer, en particular bajo terapia endocrina.
En los procedimientos de la presente invención, la sobreexpresión del gen ZNF217 está correlacionada con un mal/peor pronóstico para la supervivencia libre de recaídas.
En una realización, mal pronóstico es que un paciente con cáncer que tiene un mayor nivel de expresión del gen de ZNF217 tiene una mayor probabilidad de desarrollar una recidiva o recaída del cáncer que un paciente que tiene el mismo cáncer sin sobreexpresión de ZNF217.
Un mayor nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra procedente del paciente está correlacionado con una mayor probabilidad de recaída o recidiva del cáncer en el paciente, en comparación con un paciente que tiene el mismo cáncer sin sobreexpresión de ZNF217.
Preferentemente, un mal pronóstico es que un paciente con cáncer tenga al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más de probabilidad de que el cáncer reaparecerá en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más años desde la fecha cuando se tomó la muestra. En algunas realizaciones, hay una probabilidad del 30% o más de que el cáncer reaparecerá en 10 años.
Supervivencia libre de recaídas (RFS) se define como el porcentaje de pacientes que no recayeron después del diagnóstico de un cáncer de mama primario. En este caso, la curva de Kaplan-Meier representa simplemente el x% de pacientes que no recayeron después de una cantidad de tiempo y.
En otra realización, mal pronóstico es que un paciente con cáncer que tiene un mayor nivel de expresión del gen ZNF217 tiene una tasa de supervivencia global menor que un paciente que tiene el mismo cáncer sin sobreexpresión de ZNF217.
Un mayor nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra procedente del paciente está correlacionado con una mayor probabilidad de que el cáncer será mortal para el paciente, en comparación con un paciente que tenga el mismo cáncer sin sobreexpresión de ZNF217.
Preferentemente, un mal pronóstico es que un paciente con cáncer tenga al menos una probabilidad de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más de que el cáncer será mortal en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más años desde la fecha cuando se tomó la muestra. En algunas realizaciones, hay una probabilidad del 30% o más de que el cáncer será mortal en 5 años.
Supervivencia global (OS) se define como el porcentaje de pacientes que sobreviven después del diagnóstico de un cáncer de mama primario. En este caso, la curva de Kaplan-Meier representa simplemente el x% de pacientes que sobrevivieron después de una cantidad de tiempo y.
La presente invención también se refiere a procedimientos para proporcionar una predicción del desarrollo de metástasis, un pronóstico de la supervivencia libre de recaídas (RFS) o un pronóstico de la tasa de supervivencia global (OS) en un paciente con cáncer de mama, que comprenden:
a) obtener una muestra de dicho paciente,
b) medir el nivel de expresión de ZNF217 en dicha muestra,
c) predecir la probabilidad de aparición de metástasis, RFS u OS basándose en el nivel medido de ZNF217, en el que, cuando dicho nivel de ZNF217 está incrementado en comparación con una muestra de control o normal, dicha probabilidad de aparición de metástasis aumenta, dicha RFS disminuye o dicha OS disminuye.
La presente invención también se refiere a procedimientos para proporcionar una predicción del desarrollo de metástasis, un pronóstico de la supervivencia libre de recaídas (RFS) o un pronóstico de la tasa de supervivencia global (OS) en un paciente con cáncer de mama, que comprenden:
a) obtener una muestra de dicho paciente,
b) ensayar dicha muestra en busca de marcadores de pronóstico convencionales de cánceres de mama,
c) si la muestra tiene al menos un marcador o una combinación de marcadores de “buen” pronóstico, evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217 en dicha muestra,
d) predecir la probabilidad de aparición de metástasis, RFS u OS basándose en el nivel medido de ZNF217, en el que, cuando dicho nivel de ZNF217 está incrementado en comparación con una muestra de control o normal, dicha probabilidad de aparición de metástasis aumenta, dicha RFS disminuye o dicha OS disminuye.
La presente invención también se refiere a procedimientos para proporcionar una predicción del desarrollo de metástasis, un pronóstico de la supervivencia libre de recaídas (RFS) o un pronóstico de la tasa de supervivencia global (OS) en un paciente con cáncer de mama, que comprenden:
a) obtener una muestra de dicho paciente,
b) ensayar dicha muestra en busca de marcadores de pronóstico convencionales de cánceres de mama, y evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217,
c) si la muestra tiene al menos un marcador o una combinación de marcadores de “buen” pronóstico, evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217 en dicha muestra, prediciendo la probabilidad de aparición de metástasis, RFS u OS basándose en el nivel medido de ZNF217, en el que, cuando dicho nivel de ZNF217 está incrementado en comparación con una muestra de control o normal, dicha probabilidad de aparición de metástasis aumenta, dicha RFS disminuye o dicha OS disminuye.
Los procedimientos de la presente invención comprenden medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra procedente de un paciente.
Preferentemente, los procedimientos de la presente invención son procedimientos in vitro. Los procedimientos de la presente invención se llevan a cabo en una muestra biológica tomada previamente de un paciente. Típicamente, el paciente ha sido diagnosticado con cáncer de mama.
El término “muestra” se refiere a cualquier muestra biológica obtenida/tomada de un paciente, incluyendo una muestra de sangre, una muestra de plasma, una muestra de tejido, una muestra de células o una muestra de tumor. Típicamente, la muestra contiene células cancerosas o tumorales tales como, por ejemplo, células de cáncer de mama. En realizaciones preferidas, la muestra es una muestra de tumor de mama previamente tomada de un paciente.
Los procedimientos de la invención incluyen detectar o medir el nivel de expresión del gen ZNF217. El gen ZNF217 es un oncogén candidato en 20q13.2 descrito en primer lugar por Collins et al. (Collins et al., 1998). El número de acceso de GENBANK para el gen ZNF217 es NC_000020.10 (RefSeq: NM_006526.2).
El término “expresión” se puede referir a medir el nivel de transcripción y/o el nivel de traducción del gen. En una primera realización, los procedimientos de la presente invención comprenden medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra mediante cuantificación del transcrito o transcritos del gen ZNF217 (ARNm). En otra realización, los procedimientos de la presente invención comprenden medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra mediante cuantificación del polipéptido o polipéptidos codificados por el gen ZNF217.
En otras realizaciones, la cantidad de ARNm de ZNF217 se puede evaluar indirectamente mediante la medida de un ARN no codificante (tal como miARN) que regula la expresión génica. Los microARN (miARN) son reguladores posttranscripcionales que se unen a secuencias complementarias en las regiones no traducidas de 3’ (3’ UTRs) de transcritos de ARN mensajero diana (ARNm), que dan habitualmente como resultado un silenciamiento génico. Los miARN son moléculas de ácido ribonucleico (ARN) cortas, con una media de solamente 22 nucleótidos de longitud. El genoma humano puede codificar alrededor de 1000 miARN, que pueden seleccionar como dianas a alrededor de 60% de genes de mamíferos y son abundantes en muchos tipos de células humanas. Cada miARN puede reprimir centenares de ARNm. Los miARN están bien conservados en organismos eucariotas, y se piensa que son un componente vital y evolutivamente primitivo de la regulación genética. Desde entonces, la investigación con miARN ha revelado múltiples papeles en la regulación negativa (degradación de transcritos y secuestro, supresión traduccional) y posible implicación en la regulación positiva (activación transcripcional y traduccional). Al afectar a la regulación génica, es probable que los miARN estén implicados en la mayoría de los procesos biológicos. La expresión aberrante de los miARN se ha visto implicada en numerosos estados mórbidos, y las terapias a base de miARN están bajo investigación. Se han encontrado varios miARN que tienen conexiones con ciertos tipos de cáncer.
Los niveles de expresión del gen ZNF217 se determinan mediante cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos por la persona experta.
El ARNm o los transcritos del gen ZNF217 se cuantifican, por ejemplo, mediante hibridación o transcripción inversa y amplificación (RT-PCR) seguido de detección cuantitativa del producto mediante cualquier procedimiento conocido.
En los procedimientos de la presente invención se puede usar cualquier procedimiento de amplificación cuantitativo. Preferentemente, RT-PCR cuantitativa se lleva a cabo con el cebador de SEC ID nº 1 (5’-AGTCCAAATCCCTGCCATCT-3’) y el cebador de SEC ID NO. 2 (5’-GGGGAAACACTGGTTTTAGG-3’).
El polipéptido o polipéptidos de ZNF217 se cuantifican, por ejemplo, mediante inmunotransferencia, ELISA, espectrometría de masas o ensayos de unión. Preferentemente, los niveles del polipéptido de ZNF217 se miden en un ensayo de unión con uno o varios anticuerpos anti-ZNF217.
Preferentemente, los procedimientos de la presente invención incluyen detectar un nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra de células tumorales o células cancerosas procedente de un paciente, y comparar este nivel de expresión con un nivel de expresión de control o con el nivel de expresión en una muestra de control. La agresividad y pronóstico del cáncer/tumor se determina en base a si la expresión de ZNF217 en el cáncer/tumor es mayor que en el control.
El término “sobreexpresión” se refiere a un nivel de expresión que es estadística y significativamente mayor que el nivel de expresión detectado en la muestra de control.
El nivel de expresión de ZNF217 se identifica como “sobreexpresado” o “mayor” que el control si el nivel de expresión es al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100% o más mayor que el nivel de expresión detectado en la muestra de control.
El control puede ser una muestra de control “normal”, que quiere decir una muestra de control de célula no tumoral o una muestra de control de célula no cancerosa. La muestra de control puede ser una muestra de control autóloga obtenida del paciente. En ese caso, la muestra se obtiene del mismo paciente del que se obtiene la muestra a evaluar. La muestra de control es preferentemente del mismo tipo celular o del mismo órgano. La muestra de control puede ser una muestra de control normal obtenida de un individuo que no tiene cáncer.
La muestra de control normal también puede ser una muestra estándar que contiene la misma cantidad de ZNF217 que la que se encuentra normalmente en muestras biológicas.
La muestra de control normal también puede ser un nivel de expresión de la mediana de ZNF217 en muestras tomadas de al menos 5, 10, 15, 20 o más pacientes diferentes con el cáncer de mama o con el mismo subtipo de cáncer de mama. Las muestras de control se recogen preferentemente de un banco de tejidos o de un centro biológico de fuentes en el que existe la información clínica, histológica y biológica completa del paciente.
El cáncer se clasifica o reclasifica como cáncer de mama con tendencia a reaparecer y/o como cáncer de mama que tiene o con tendencia a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en la muestra a evaluar en comparación con la muestra de control.
La invención también está dirigida a kits para identificar un cáncer de mama que tiene tendencia a reaparecer y/o un cáncer que tiene o con tendencia a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico, que comprenden cebadores y/o sondas derivados del gen ZNF217 y una muestra de control para el nivel de expresión del gen ZNF217.
La invención también se refiere a kits para identificar un tumor con tendencia a reaparecer y/o un tumor que tiene o con tendencia a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico, que comprenden anticuerpos anti-ZNF217 y una muestra de control para el nivel de expresión del gen ZNF217.
Los kits también pueden comprender un control positivo, un control negativo y cualesquiera reactivo o cualesquiera dispositivos necesarios para llevar a cabo los procedimientos de la invención.
Los procedimientos y kits de la presente invención también pueden comprender un control “invariante”, que puede ser el nivel de expresión de un gen de mantenimiento.
La invención también engloba el uso de tales kits para llevar a cabo los procedimientos de la presente invención, y en particular para identificar un cáncer con tendencia a reaparecer y/o un cáncer que tiene o con tendencia a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico, o para determinar el pronóstico de un cáncer.
Figuras
Figura 1: Sobreexpresión de ZNF217 en células de cáncer de mama MDA-MB-231. Los extractos proteicos totales de estirpes celulares se analizaron mediante transferencia Western con un anticuerpo anti-ZNF217. Como control invariante, se usó la expresión de α-tubulina.
Figura 2: Impacto de la sobreexpresión de ZNF217 sobre la proliferación celular y sobre los niveles de
expresión de ciclina en células MDA-MB-231. (A) Las células proliferantes se analizaron usando un kit
marcador de BrdU como se describe en la sección de Materiales y procedimientos. Los resultados se
expresan como media ± s.d. (desviación estándar) de tres experimentos independientes. ** P < 0,01 frente a las células de control MDA-MB-231 correspondientes según la prueba de la t de Student. (B) Análisis de transferencia Western de los niveles de expresión proteica de ciclina A2, ciclina D1 y ciclina E2 en células MDA-MB-231 transfectadas con ZNF217. Como control invariante, se usó la expresión de α-tubulina.
Figura 3: La sobreexpresión de ZNF217 en células MDA-MB-231 aumenta su capacidad para formar colonias en agar blando. Células de control MDA-MB-231, ZNF217-1 y ZNF217-2 se colocaron en placas de 6 pocillos en 10% de FCS-DMEM con agar al 0,45% (10.000 células/pocillo). Se tomaron fotomicrografías (fotos (A) y recuento (B)) 20 días después de la colocación en placas. Los resultados se expresan como media ± s.d. de al menos tres experimentos independientes. *** P < 0,001 frente a los controles de MDA-MB-231 correspondientes según la prueba de la t de Student. Todas las imágenes se tomaron a un aumento de x1,25.
Figura 4: Ensayo de invasión de la cámara de Boyden. La cuantificación de la invasión de células de control, de células ZNF217-1 y ZNF217-2 se llevó a cabo en cámaras de cultivo celular Transwell que contienen insertos de membrana de policarbonato porosa que bloquea la fluorescencia. Las células que habían invadido a través del Matrigel se detectaron en el lado inferior del filtro mediante fluorescencia, y se contaron. Se contó toda la superficie del filtro, y cada ensayo se llevó a cabo dos veces por triplicado para cada condición. Los resultados se expresan como media ± s.d.
Figura 5: Ensayo de cultivo de invasión de células de control, ZNF217-1 y ZNF217-2. (A) Imágenes representativas de al menos tres experimentos independientes después de 1, 4, 7, 11, 14 y 18 días de cultivo en Matrigel. Todas las imágenes se tomaron a un aumento de x1,5. (B) El área de invasión de Matrigel de las células de control (barras blancas), ZNF217-1 (barras negras) y ZNF217-2 (barras grises) se midió usando un software ImageJ. Los resultados se expresan como media ± s.d. de al menos tres experimentos independientes. ** P < 0,01 y *** P < 0,001 según la prueba de la t de Student.
Figura 6: ZNF217 promueve la migración de células de cáncer de mama (curación de daños). La monocapa confluente de células de control o de células MDA-MB-231 que sobreexpresan ZNF217 se dañó raspando, y se fotografió a 0 horas (H 0), 26 horas (H 26). Las imágenes son representativas de al menos tres experimentos independientes, y se tomaron a un aumento de x2,5.
Figura 7: ZNF217 induce EMT en células MCF10A de mama epiteliales. (A) Imágenes representativas de la morfología de células de control MCF10A y de células MCF10A-ZNF217 a un aumento de x10. (B) Análisis de transferencia Western de ZNF217, marcadores epiteliales (cadherina E, α-catenina, β-catenina y ocludina) y marcadores mesenquimatosos (vimentina y fibronectina) usando anticuerpos específicos como se describe en la sección de Materiales y procedimientos. Como control invariante, se midió la expresión de α-tubulina. Las transferencias Western mostradas proceden de un experimento representativo de al menos tres experimentos independientes y lisados celulares.
Figura 8: Valor de pronóstico del nivel de ARNm de ZNF217. (A) Curva de Kaplan-Meier (análisis de la prueba de rango logarítmico) para RFS en tumores de mama a partir de la cohorte CLB1. (B) Curva de Kaplan-Meier (análisis de la prueba de rango logarítmico) para OS en tumores de cáncer de mama de la cohorte CLB1.
Figura 9: Valor de pronóstico del nivel de ARNm de ZNF217 en los tumores de mama (n = 113) de la cohorte CLB2. Curva de Kaplan-Meier (análisis de la prueba de rango logarítmico) para RFS.
Figura 10: Valor de pronóstico del nivel de ARNm de ZNF217 en tumores de mama positivos a ER (ER+) (n = 68) de la cohorte CLB2. Curva de Kaplan-Meier (análisis de la prueba de rango logarítmico) para RFS.
Figura 11: Valor de pronóstico del nivel de ARNm de ZNF217 en tumores de mama ER+ y negativos a HER2 (HER2-) (n = 57) de la cohorte CLB2. Curva de Kaplan-Meier (análisis de la prueba de rango logarítmico) para RFS.
Figura 12: Los niveles de expresión de ZNF217 y de ER están correlacionados en células de cáncer de mama. Los extractos proteicos totales de las estirpes celulares se analizaron mediante transferencia Western con un anticuerpo anti-ZNF217 y anti-ER α. Como control invariante se usó la expresión de α-tubulina. (A) Sobreexpresión de ZNF217 en transfectantes estables de cáncer de mama MDA-MB-231 que expresan constitutivamente ER (células S30). (B) Análisis de transferencia Western de la expresión de ZNF217 y de ER α en células MCF7 transfectadas con ARN mezclado (MCF7 mezclado) o con siRNA-ZNF217 (siRNA-ZNF217 de MCF7).
Figura 13: La resistencia endocrina se invierte en presencia de siRNA-ZNF217 en células CL6.7 resistentes a OH-Tam. Los extractos proteicos totales de estirpes celulares se analizaron mediante transferencia Western con un anticuerpo anti-ZNF217. Como control invariante se usó la expresión de α-tubulina. (A) Análisis de
transferencia Western de ZNF217 en células MVLN y CL6.7 transfectadas con ARN mezclado o con siRNA-ZNF217. (B) Proliferación celular (ensayo de BrdU) de células MVLN y CL6.7 transfectadas con ARN mezclado o siRNA-ZNF217, en presencia o ausencia de 200 nM de OH-Tam. Este ensayo se llevó a cabo en medio libre de esteroides. El valor P (prueba de la t de Student) se consideró como significativo cuando P < 0,05.
Ejemplos
Materiales y procedimientos
Cultivo celular
Las células de cáncer de mama MCF7 y MDA-MB-231 se adquirieron de ATCC y se hicieron crecer según recomendaciones en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen, Cergy Pontoise, París). Las células S30 y sus células de control MDA-MB-231 se han descrito previamente (Levenson et al., 2003). El modelo celular de resistencia endocrina (células MVLN y CL6.7) se ha establecido y descrito previamente (Demirpence et al., 1993).
Transfectantes estables MDA-MB-231-ZNF217
Se usó ADNc de ZNF217 de longitud completa para construir el plásmido de expresión ZNF217 usando el plásmido pcDNA6/V5-His (Invitrogen, Cergy Pontoise, París). De forma breve, el ADNc de ZNF217 de longitud completa se obtuvo añadiendo la secuencia de ADNc que falta (que codifica los últimos 6 aminoácidos C-terminales de la proteína ZNF217) al plásmido pEGFP-N1-ZNF217 proporcionado generosamente por Dr. Collins, después se subclonó en el plásmido pcDNA6/V5-His (pcDNA6/V5-His-ZNF217). Las células de cáncer de mama MDA-MB-231 (que poseen un nivel endógeno bajo de ZNF217) se hicieron crecer según las recomendaciones de ATCC, y después se transfectaron de forma estable con 6 μg de plásmido pcDNA6/V5-His vacío o pcDNA6/V5-His-ZNF217. Las poblaciones de células transfectadas se seleccionaron en presencia de 20 μg/ml de blasticidina (Invitrogen). Entonces se aislaron dos clones celulares MDA-MB-231-ZNF217 (denominados ZNF217-1 y ZNF217-2). El ARN total se extrajo usando un kit de extracción de ARN de Qiagen (Germantown, MD, USA) según las recomendaciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó usando el BioAnalyzer 2100™ (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).
Transfectantes estables MCF10A-ZNF217
Células MCF10A, que son células epiteliales mamarias humanas inmortalizadas pero no transformadas derivadas de tejido de mama (Soule et al., 1990), se hicieron crecer según las recomendaciones de ATCC. Las células se transfectaron de forma estable con 6 μg de plásmido pcDNA6/V5-His vacío o pcDNA6/V5-His-ZNF217. Las poblaciones de células transfectadas se seleccionaron en presencia de 20 μg/ml de blasticidina (Invitrogen).
Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (RTQ-PCR)
Un microgramo de ARN total de cada muestra se transcribió de forma inversa, y se realizaron medidas de RTQ-PCR como se describe previamente (Girault et al., 2003; Vendrell et al., 2005), usando un LightCycler 480® (Roche, Meylan, Francia) o un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) con el kit SYBR Green correspondiente, según las recomendaciones del fabricante. El cebador directo 5’-AGTCCAAATCCCTGCCATCT-3’ y el cebador inverso 5’-GGGGAAACACTGGTTTTAGG-3’ se diseñaron para seleccionar específicamente al transcrito ZNF217 (NM_006526.2) como diana. Los cebadores que seleccionan como diana al transcrito ESR1 (receptor alfa de estrógenos) fueron: cebador directo 5’-TGTTCCAAACCCATCGTCAGT-3’; cebador inverso 5’-CTCTATAACCAATGACCTCTCTGTGAA-3’). Los cebadores que seleccionan como diana al transcrito ERBB2 fueron: cebador directo: 5’-ACTGGCCCTCATCCACCATA-3’; cebador inverso 5’-GGTTGGCAGTGTGGAGCAG-3’.
Transferencia Western
La preparación del extracto celular y el análisis de la transferencia western se llevaron a cabo como se describe previamente (Vendrell et al., 2004). El anticuerpo anti-ZNF217 se obtuvo mediante Covalab (Lyon, Francia); los anticuerpos anti-E-cadherina, α-catenina, β-catenina y fibronectina se adquirieron de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA). El anticuerpo anti-ocludina procedió de Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA), el anticuerpo anti-vimentina procedía de Dako (Glostrup, Dinamarca), los anticuerpos anti-ciclina E2 y ER α procedieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA), el anticuerpo anti-ciclina D1 procedía de Cell Signaling (Beverly, MA, USA), y los anticuerpos anti-ciclina A2 y α-tubulina procedieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
Ensayo de proliferación celular (BrdU)
Las células proliferantes se analizaron usando el kit de BrdU (colorimétrico) Cell Proliferation ELISA (Roche, Meylan, Francia). De forma breve, las células se marcaron durante 24 h con 5-bromodesoxiuridina (BrdU), y los núcleos marcados se identificaron usando un anticuerpo específico anti-BrdU según las recomendaciones del fabricante.
Ensayo de formación de colonias en agar blando
Placas de seis pocillos se cubrieron en primer lugar con una capa de agar que contiene 0,75% de agar (Seaplaque Agarose®, Lonza, Basilea, Suiza) en DMEM suplementado con 10% de FCS (Gibco). Las células de control MDAMB-231, y las células ZNF217-1 y ZNF217-2 se suspendieron entonces en 10% de FCS-DMEM que contiene 0,45% de agar, y se colocaron en los pocillos (10.000 células por pocillo). Los cultivos se devolvieron a la incubadora y se alimentaron cada 2 días con medio de crecimiento 10% de FCS-DMEM. Veinte días más tarde, las células se tiñeron con violeta de cristal al 0,005% (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) durante 1 hora. Entonces se tomaron fotomicrografías de colonias a un aumento de x1,25.
Ensayo de invasión de cámara de Boyden
La cuantificación de la invasión celular se llevó a cabo en cámaras de cultivo celular Transwell que contienen insertos de membrana de policarbonato porosa que bloquea la fluorescencia (Fluoroblock; BD Biosciences; tamaño de poros 8 μm). Se prepararon 100 μl de 2 mg/ml de Matrigel con factores de crecimiento reducidos (una membrana de basamento reconstituida comercialmente preparada de tumores de Engelbreth-Holm-Swarm; BD Biosciences) en una cámara Transwell. Las células se cultivaron como monocapas antes de la tripsinización, y se colocaron en placa
(105) en medio que contiene 2% de FCS encima de la capa gruesa (alrededor de 500 μm) de Matrigel en la cámara superior de un aparato Transwell. Los controles se dejaron sin tratar. Las cámaras superior e inferior se llenaron entonces con respectivamente medios que contienen 2% y 10% de FCS, estableciendo así un gradiente soluble de quimioatrayente que promueve la invasión celular a través del Matrigel. Las células se almacenaron a 37ºC en 5% de CO2 y se dejaron migrar a través del gel antes de fijarlas durante 15 min. en 3,7% de formaldehído. Las células que habían invadido a través del Matrigel se detectaron mediante fluorescencia en el lado inferior del filtro, y se contaron. Toda la superficie del filtro se contó, y cada ensayo se llevó a cabo dos veces por triplicado para cada condición.
Análisis de invasión de Matrigel
Una capa gruesa de Matrigel (600 μl) (BD Biosciences) se revistió sobre un portaobjetos de cámara LabTec de 8 pocillos, y se dejó polimerizar parcialmente. Se suspendió un millón de células en 1 μl de DMEM, y se sembraron en la mitad de la capa de Matrigel. Después de 30 min. de incubación a 37ºC, se añadieron 150 μl de DMEM; el medio se cambió cada 2 días. Las muestras se analizaron por triplicado. Se tomaron imágenes cada 1, 4, 7, 11, 14 y 18 días usando un microscopio Diavert invertido (Leica Microsystems, Rueil-Malmaison, Francia, aumento x1,5) en el Centre Commun de Quantimétrie (Lyon, Université Claude Bernard, Francia). La magnitud de invasión celular a través del Matrigel se midió usando software ImageJ, desarrollado por el National Institute of Health (USA).
Sanación de daños
El ensayo de sanación de daños se usó para detectar la alteración de la movilidad celular. Las células se colocaron en placas a 2,5 x 106 células en DMEM sobre placas de cultivo de 60 mm. Una monocapa confluente se dañó usando una punta de pipeta P-200 mediante raspado, y se fotografió a 0 horas y 26 horas (aumento x2,5) en el Centre Commun de Quantimétrie (Lyon).
Silenciamiento génico
Stealth™ siRNA que selecciona como diana ZNF217 (siRNA-ZNF217) y ARN de control mezclado (mezclado) se obtuvieron de Invitrogen. Se transfectaron cinco nanomoles de siRNA-ZNF217 o mezclado en estirpes celulares con lipofectamine RNAimax (Invitrogen).
Cohorte CLB1: Muestras de tumor de mama del Centre Léon Bérard (n = 47)
Se seleccionaron 47 muestras de tumor de mama primario obtenidas de mujeres operadas en el Centre Léon Bérard (Lyon, Francia) (Tabla 1). Se obtuvo la autorización firmada de todos los pacientes, y el estudio fue aprobado por el comité ético de la institución. Las muestras de tumor de mama se extirparon de mujeres que no habían recibido terapia endocrina, quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Catorce pacientes desarrollaron metástasis mientras se encontraban en quimioterapia y/o terapia endocrina (grupo Met+), mientras que 33 pacientes no lo hicieron (grupo Met). En la Tabla 1 se muestran los factores de pronóstico estándar. Los pacientes (edad media: 53 años; intervalo 40-82) cumplieron los siguientes criterios: carcinoma de mama unilateral primario; información clínica, histológica y biológica completa disponible; nada de radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía; y seguimiento total en el Centre Léon Bérard. El tipo histológico y el número de nódulos axilares positivos se establecieron en el
momento de la cirugía. La malignidad de los carcinomas infiltrantes se puntuó según el sistema de clasificación histológica de Scarff-Bloom-Richardson (SBR) (Bloom y Richardson, 1957). Usando la prueba de χ2, no hubo diferencia significativa en edad, grado histológico, estado de ganglios linfáticos, tamaño tumoral o estado del receptor de estrógenos entre los dos grupos (Tabla 1). El estado del receptor α de estrógenos (ER) se determinó mediante inmunohistoquímica. Los pacientes en el grupo Met+ desarrollaron metástasis entre 0,6 y 4,6 años después de la cirugía. Inmediatamente tras la cirugía, las muestras tumorales se colocaron en nitrógeno líquido hasta la extracción del ARN. El ARN total se extrajo usando un kit de extracción de ARN Macherey-Nagel (Hoerd, Francia) según las recomendaciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó usando el BioAnalyzer 2100™ (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).
Muestras de tumor de mama procedentes del Centre René Huguenin
Se seleccionaron 48 muestras de tumor de mama primario ER+ obtenidas de mujeres operadas en el Centre René Huguenin (St Cloud, Francia) (Tabla 2). Se obtuvo la autorización firmada de todos los pacientes, y el estudio fue aprobado por el comité ético de la institución. Los tumores se tomaron de pacientes tratadas con cirugía primaria seguido de terapia endrocrina adyuvante sola. Veinticuatro pacientes recayeron mientras se encontraban en terapia endocrina y desarrollaron metástasis (grupo Met+), y 24 no lo hicieron (grupo Met-). En la Tabla 2 se muestran los factores de pronóstico estándar. Los pacientes (edad media: 70,7 años; intervalo: 54-86) cumplieron los siguientes criterios: carcinoma de mama post-menopáusico unilateral primario; información clínica, histológica y biológica completa disponible; nada de radioterapia o quimioterapia antes de cirugía; y seguimiento total en el Centre René Huguenin. El tipo histológico y el número de nódulos axilares positivos se establecieron en el momento de la cirugía. La malignidad de los carcinomas infiltrantes se puntuó según el sistema de clasificación histológica SBR (Bloom y Richardson, 1957). Usando la prueba χ2, no hubo ninguna diferencia significativa en edad, grado histológico, estado de ganglios linfáticos o tamaño tumoral entre los dos grupos (Tabla 2). El estado de ER se determinó a nivel proteico usando procedimientos bioquímicos cuantitativos (procedimiento de carbón revestido con dextrano o inmunoensayo enzimático), y se confirmó mediante RTQ-PCR. Todos los pacientes recibieron terapia endocrina adyuvante postoperatoria (tamoxifeno, 20 mg diarios durante 3-5 años) y ningún otro tratamiento. Las pacientes en el grupo Met+ desarrollaron metástasis entre 1,3 y 10,0 años después de la cirugía y el comienzo del tratamiento con tamoxifeno. Inmediatamente después de la cirugía, las muestras tumorales se colocaron en nitrógeno líquido hasta la extracción del ARN. El ARN total se extrajo de muestras tumorales congeladas usando el procedimiento de guanidinio y fenol ácido. La integridad del ARN se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante.
Cohorte CLB2: Muestras de tumor de mama del Centre Léon Bérard (n = 113)
Se seleccionaron 113 muestras de tumor de mama primario obtenidas de mujeres operadas en el Centre Léon Bérard (Lyon, Francia) (Tabla 7). Se obtuvo la autorización firmada de todos los pacientes, y el estudio fue aprobado por el comité ético de la institución. Las muestras de tumor de mama se extirparon de mujeres que no habían recibido terapia endocrina, quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Diecinueve pacientes recayeron mientras se encontraban en quimioterapia y/o terapia endocrina (grupo de recaída), mientras que 94 pacientes no lo hicieron (grupo de no recaída). En la Tabla 7 se muestran los factores de pronóstico estándar. Los pacientes (edad media: 53 años; intervalo: 40-82) cumplieron los siguientes criterios: carcinoma de mama unilateral primario; información clínica, histológica y biológica completa disponible; nada de radioterapia o quimioterapia antes de cirugía; y seguimiento total en el Centre Léon Bérard. El tipo histológico y el número de nódulos axilares positivos se establecieron en el momento de la cirugía. La malignidad de los carcinomas infiltrantes se puntuó según el sistema de clasificación histológica SBR (Bloom y Richardson, 1957). El estado de ER y del receptor de progesterona (PR) se determinó mediante inmunohistoquímica. El estado de HER2 se determinó mediante inmunohistoquímica y se validó para unas pocas muestras mediante FISH. Usando la prueba χ2, no hubo diferencia significativa en la edad, grado histológico, estado de los ganglios linfáticos, tamaño tumoral, estado de ER, estado de PR o estado de HER2 entre los dos grupos (Tabla 7). Los pacientes en el grupo de recaída desarrollaron metástasis entre 0,5 y 4,5 años después de la cirugía. Inmediatamente después de la cirugía, las muestras tumorales se colocaron en nitrógeno líquido hasta la extracción del ARN. El ARN total se extrajo usando un kit de extracción de ARN Macherey-Nagel según las recomendaciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó usando el BioAnalyzer 2100™ (Agilent Technologies).
Clasificación de subtipos de cáncer de mama entre la cohorte CLB2
Usando los parámetros inmunohistoquímicos y clinicopatológicos actualmente usados en clínica, los tumores de mama se clasificaron en subgrupos moleculares: la subclase Luminal (ER+ y/o PR+), la subclase HER2+ (ER-/PR/HER2+) y la subclase Triple negativa (ER-/PR-/HER2-). La subclase Luminal se reclasificó en los subgrupos Luminal A y Luminal B según la clasificación dada por Hugh et al., (2009) y Cheang et al. (2009), o la dada por Millar et al. (2009) y Nguyen et al. (2008). En la primera clasificación, los tumores de mama Luminal A fueron ER+ y/o PR+, HER2- e índice proliferativo bajo (dado por KI67 bajo o dado por SBR1 y SBR2), y Luminal B posee estado ER+ y/o PR+ y también posee HER2+ o índice proliferativo elevado (KI67 elevado o SBR3); en la segunda clasificación, los tumores Luminal A fueron cánceres de mama con estado ER+ y/o PR+ y HER2-, y los tumores Luminal B fueron aquellos con ER+ y/o PR+ y HER2+ solamente.
Análisis estadísticos
Los análisis estadísticos de las medidas de RTQ-PCR se llevaron a cabo con la prueba de Mann-Whitney y la prueba de rangos de Spearman usando el software Statgraphics® 3 plus (Statgraphics Centurion, Herndon, VA, USA). Los resultados se juzgaron significativos a un nivel de confianza mayor que 95% (P < 0,05). Para cada gen, las cohortes de tumores de mama se dividieron en dos grupos: uno con un nivel de ARNm “bajo” (menor que la mediana de los niveles de ARNm de todas las muestras de tumor de mama) y el otro con un nivel de ARNm “elevado” (mayor que la mediana de los niveles de ARNm de todas las muestras de tumor de mama). Los sucesos de interés fueron supervivencia global (OS) y supervivencia libre de recaídas (RFS). OS se midió a partir de la fecha de diagnóstico hasta la muerte o hasta que se censó en el último seguimiento. RFS se midió desde la fecha del diagnóstico hasta la recaída, o hasta que se censó en el último seguimiento. La distribución de supervivencias se estimó mediante el procedimiento de Kaplan-Meier, y la significancia de las diferencias entre las tasas de supervivencia se averiguó mediante la prueba de rango logarítmico (análisis univariado), usando el SPSS® Software (Chicago, IL, USA). Puesto que este estudio es un análisis de prospección, todos los análisis estadísticos se realizaron a un nivel de significancia de 0,05, y no se aplicó ninguna corrección para ensayos múltiples. Los factores de pronóstico candidatos para RFS con un nivel de significancia de 0,10 en el análisis univariado se introdujeron en un modelo de Cox multivariado, y se usó un procedimiento de selección hacia atrás para construir el modelo final.
Resultados
La sobreexpresión de ZNF217 en células de cáncer de mama MDA-MB-231 promueve la proliferación celular.
Se establecieron células de carcinoma de mama MDA-MB-231 estables que sobreexpresan constitutivamente la proteína ZNF217 (véase Materiales y Procedimientos). Estas células se escogieron debido a su bajo nivel de expresión de ZNF217 endógena. Las células MDA-MB-231 se transfectaron con el vector de expresión eucariota pcDNA6/V5-His que contiene la secuencia de ADNc de longitud completa de ZNF217 o con el vector vacío usado como control negativo. Después de la selección con blasticidina, se seleccionaron dos clones celulares que sobreexpresan ARNm de ZNF217 y la proteína (ZNF217-1 y ZNF217-2), así como también un clon celular transfectado con el pcDNA6/V5-His vacío (células de control MDA-MB-231). Los niveles de ARNm de ZNF217 fueron 2,0 a 3,5 veces mayores en las células ZNF217-1 y ZNF217-2, respectivamente, que en las células de control MDA-MB-231 (datos no mostrados). En consecuencia, la expresión de la proteína ZNF217 se incrementó en 5,4 y 5,1 veces en las células ZNF217-1 y ZNF217-2, respectivamente, en comparación con las células de control MDAMB-231 (Figura 1). Por lo tanto, se pudo observar una buena concordancia entre la expresión de ZNF217 a nivel de ARNm y a nivel proteico. En un ensayo de proliferación celular que usa el marcaje con BrdU, la sobreexpresión de ZNF217 en células ZNF217-1 y ZNF217-2 se asoció con una mayor proliferación celular (Figura 2A) y una mayor expresión de ciclina A2, ciclina D1 y ciclina E2 (Figura 2B).
ZNF217 promueve el crecimiento independiente del anclaje, la migración y la capacidad invasiva in vitro de células de carcinoma de mama
Se piensa que la proliferación independiente del anclaje, un signo distintivo de células malignas que forman tumores in vivo (Irshad et al., 2004; Lee et al., 2004), está asociada con células cancerosas muy metastásicas (Glondu et al., 2002; Muraoka-Cook et al., 2004), y se puede evaluar mediante formación de colonias en agar blando. De este modo, a continuación se examinó el efecto de la sobreexpresión de ZNF217 sobre la formación de colonias en agar blando en las diferentes poblaciones celulares. Se encontró un incremento de aproximadamente 67 veces y 70 veces en el número de colonias de ZNF217-1 y ZNF217-2 formadas cuando se sobreexpresó ZNF217, en comparación con las células de control MDA-MB-231 (Figura 3).
Se piensa que la destrucción o penetración de la membrana de basamento es una etapa esencial en la invasión de células tumorales. Otro signo distintivo de la malignidad tumoral es la fuerte capacidad para la migración (Gupta y Massague, 2006). En un número de estudios, las células tumorales muy metastásicas mostraron una migración aumentada en ensayos de invasión in vitro llevados a cabo usando cámaras de Boyden (Chen et al., 2006; Galaup et al., 2006) y en ensayos de curación de daños (Hu y Verkman, 2006). Por lo tanto, se buscó investigar si la sobreexpresión de ZNF217 afecta a la invasión y/o migración tumoral. Se estudió la capacidad invasiva de células ZNF217-1, ZNF217-2 y de control en un ensayo de cámara de Boyden in vitro (Figura 4) cuando las células se colocaron en placas encima de una capa gruesa de Matrigel que imita la membrana de basamento fisiológica. La Figura 4 muestra que la capacidad invasiva aumenta significativamente con la expresión de ZNF217, con aproximadamente las mismas variaciones en ambos clones. El número de células invasivas fue 6,3 y 7 mayor en clones que sobreexpresan ZNF217 en comparación con células de control. Se proporcionaron datos de apoyo mediante ensayos de invasión de Matrigel que también demuestran claramente las propiedades invasivas de las células ZNF217-1 y ZNF217-2 (Figura 5). La sobreexpresión de ZNF217 en las células MDA-MB-231 condujo también a un aumento en la migración, según se demostró mediante el ensayo de curación de daños (Figura 6). En conjunto, estos resultados sugieren el papel importante de ZNF217 en la capacidad invasiva así como el crecimiento de células de carcinoma de mama independiente del anclaje.
ZNF217 induce la transición epitelial-mesenquimal (EMT) 16
Debido a que se ha demostrado que EMT está implicada en la invasión de células cancerosas (Yilmaz y Christofori, 2009), se examinaron a continuación los efectos de ZNF217 en células epiteliales mamarias humanas MCF10A (Soule et al., 1990; Tait et al., 1990). La sobreexpresión de ZNF217 en células MCF10A transfectadas de forma estable fue suficiente para disparar algunos rasgos morfológicos de EMT, incluyendo la morfología fibroblástica, asociada con una disminución significativa de marcadores epiteliales (E-cadherina, α-catenina, β-catenina, ocludina) y un incremento de los niveles proteicos mesenquimales (vimentina y fibronectina) (Figura 7). Por lo tanto, se sugiere que la capacidad para promover EMT es otro rasgo importante que subyace a la capacidad invasiva potenciada de ZNF217.
ZNF217 es un marcador de pronóstico de cáncer de mama metastásico
Con el objetivo de investigar la importancia clínica de ZNF217, se exploró mediante RTQ-PCR los niveles de ARNm de ZNF217 en 47 muestras de tumor de mama recogidas en el Centre Léon Bérard (Francia) (cohorte CLB1) (Tabla 1). Usando la prueba de Mann-Whitney, se comparó la expresión de ZNF217 con parámetros clínicos y patológicos (Tabla 3); no se observó asociación significativa en ningún caso. Puesto que la cohorte estaba compuesta de mujeres que habían desarrollado metástasis (a 0,6 y 4,6 años a partir de la cirugía) mientras se encontraban en quimioterapia y/o terapia endocrina (grupo Met+, n = 14) o que no lo habían desarrollado (grupo Met-, n = 33), se evaluaron los niveles de expresión de ZNF217 en estos dos grupos de pacientes. Como se muestra en la Tabla 4, niveles de ARNm de ZNF217 elevados se asociaron significativamente con el desarrollo de metástasis (sobreexpresión de ARNm de ZNF217 significativa en el grupo Met+, P = 0,002, prueba de Mann-Whitney).
Entonces se usó análisis univariado (prueba de rango logarítmico) para estudiar adicionalmente el valor de pronóstico de ZNF217. El análisis univariado mostró que niveles elevados de expresión de ARNm de ZNF217 estaban asociados significativamente con RFS más corta (P = 0,003, Tabla 5 y Figura 8A). No se pudo observar ninguna asociación significativa entre el nivel de ARNm de ZNF217 y OS, pero hubo una tendencia hacia la significancia (P = 0,15, Tabla 6 y Figura 8B).
Entonces se evaluó la importancia de nuestros hallazgos en una cohorte independiente de pacientes con cáncer de mama de un origen geográfico diferente. Esta cohorte reunida por el Centre René Huguenin (Francia) estaba compuesta de pacientes con cáncer de mama ER+ que habían desarrollado o no metástasis en terapia endocrina (24 muestras Met+ y 24 muestras Met-). Nuevamente, la expresión de ZNF217 se encontró significativamente elevada en el grupo Met+ (mediana = 2,4; intervalo: 0,24-14,62) en comparación con el grupo Met- (mediana = 1,0; intervalo: 0,21-2,15; P = 0,0003, prueba de Mann-Whitney), y niveles de expresión de ZNF217 elevados estuvieron significativamente asociados con RFS más corta (P = 0,039, prueba de rango logarítmico). De este modo, se confirmó, en dos cohortes diferentes de pacientes con cáncer de mama, en primer lugar, la presencia de niveles de expresión elevados de ZNF217 en tumores de mama primarios de pacientes con tendencia a desarrollar metástasis, y, en segundo lugar, la asociación significativa de ZNF217 con RFS. En conjunto, estos datos sugieren que ZNF217 podría representar un nuevo marcador de un mal pronóstico.
ERBB2 (HER2) es un marcador bien conocido de mal pronóstico en cáncer de mama. Los niveles de expresión de ERBB2 no estuvieron significativamente asociados con RFS o con OS (Tablas 5 y 6). Sin embargo, se pudo observar una tendencia hacia la significancia para RFS (P = 0,09, prueba de rango logarítmico; Tabla 5). Tampoco hubo signos de una asociación entre los niveles de expresión de ESR1 (ER alfa) y RFS u OS (Tablas 5 y 6). Se llevó a cabo un análisis de regresión multivariado de Cox de RFS usando factores de pronóstico candidatos para RFS con un nivel de significancia de 0,10 en análisis univariado (ZNF217 y ERBB2). El hallazgo más interesante fue que sólo el valor de pronóstico de ZNF217 permaneció significativo en el análisis multivariado (P = 0,002; HR = 9,56; 95% CI: 1,57 a 31,59, Tabla 5). Tomados juntos, estos resultados demuestran en primer lugar que ZNF217 es un nuevo marcador de pronóstico asociado con RFS en pacientes con cáncer de mama con tendencia a desarrollar metástasis, y en segundo lugar que el valor de pronóstico de ZNF217 fue todavía más informativo que el de ERBB2.
Finalmente, se investigó la relevancia de nuestros hallazgos mediante un análisis estadístico retrospectivo de datos de conjuntos de expresión génica a partir de un estudio previo de 60 muestras de tumor de mama de pacientes que habían desarrollado o no metástasis en tamoxifeno (28 Met+ y 32 Met-) (Ma et al., 2004). Basándonos en los datos de este estudio de formación de perfiles de expresión génica, se encontró niveles de expresión de ZNF217 en muestras Met+ significativamente mayores que en muestras Met- (P = 7,5 x 10-4, prueba de Mann-Whitney), y una asociación significativa de niveles de expresión elevados de ZNF217 con RFS (P = 0,01; prueba de rango logarítmico), validando así nuestros hallazgos.
ZNF217 posee un valor de pronóstico elevado en tumores de mama clasificados como “tumores con buen pronóstico”
Se usó una nueva cohorte de 113 muestras de tumor de mama recogidas por el Centre Léon Bérard (denominada cohorte CLB2) (Tabla 7) para investigar si el valor de pronóstico de ZNF217 estaba todavía presente y/o mejorado en subclases específicas de tumores de mama.
Usando la prueba de Mann-Whitney, se comparó la expresión de ZNF217 con parámetros clínicos y patológicos: no se observó asociación significativa en ningún caso (Tabla 8). Sin embargo, se validó que los niveles de expresión elevados de ZNF217 estaban significativamente asociados con RFS más corta (P = 0,023, prueba de rango logarítmico; Tabla 9 y Figura 9). Cuando se evalúa en esta cohorte el valor de pronóstico de varios parámetros clínicos y patológicos, sólo se encuentra estado de ganglios linfáticos (>3 ganglios invadidos) asociado con RFS más corta (P = 0,044, prueba de rango logarítmico, Tabla 9). Se llevó a cabo el análisis de regresión multivariado de Cox de RFS usando ZNF217 y el estado de invasión de los ganglios. Notablemente, sólo el valor de pronóstico de ZNF217 permaneció significativo en el análisis multivariado (P = 0,019; HR = 5,54; Tabla 9) demostrando que el valor de pronóstico de ZNF217 fue todavía más informativo que el del estado de invasión de ganglios linfáticos.
Los marcadores de cáncer de mama detectados mediante inmunohistoquímica, tales como ER y HER2 (ERBB2), se han usado clásicamente para el pronóstico del cáncer, y los tumores de mama ER- y/o HER2+ son tumores con mal pronóstico. Sin embargo, sólo el 30-40% de los cánceres de mama son ER-, y el 15-20% de los cánceres de mama son HER2+. De este modo, hay una urgente necesidad de nuevos biomarcadores de pronóstico en cánceres de mama actualmente considerados de “cánceres de mejor pronóstico”, es decir, con un estado ER+ y/o HER2-.
En las subclases ER+ (n = 68) y en la ER+/HER2- (n = 57) de la cohorte CLB2, todavía estaba presente el valor de pronóstico de ZNF217 asociado con RFS, y sorprendentemente, en comparación con el valor de pronóstico obtenido en la cohorte completa, estaba mejorado (P = 0,014 y P = 0,004, respectivamente, prueba de rango logarítmico, Tabla 10, Figuras 10 y 11). Mediante análisis retrospectivo de una cohorte independiente (Ma et al., 2004), se validó que el valor de pronóstico de ZNF217 fue más significativo en la subclase ER+/HER2- (P = 0,001, prueba de rango logarítmico, Tabla 10) en comparación con la cohorte global (P = 0,014, prueba de rango logarítmico, Tabla 10).
Cuando se estratifican los 113 tumores de mama de la cohorte CLB2 usando el estado ER, el estado HER2, el estado SBR y/o el estado de los ganglios linfáticos, se encontró que niveles de expresión elevados de ZNF217 estaban asociados significativamente con RFS más corta en las subclases de tumores de mama que presentan marcadores de “buen pronóstico”, es decir, subclases ER+ (P = 0,014), HER2- (P = 0,007), SBR1+SBR2 (P = 0,004)
o SBR2 (P = 0,01) (prueba de rango logarítmico, Tabla 11). También se pudo observar una tendencia hacia la significancia en los tumores recogidos de pacientes que poseen pocos ganglios linfáticos invadidos (≤3) (P = 0,052, prueba de rango logarítmico, Tabla 11). Por el contrario, no se pudo encontrar ninguna asociación significativa entre ZNF217 y RFS en las subclases de tumores de mama que presentan marcadores convencionales de “mal pronóstico”, tales como ER-, HER2+, SBR3 o estado de ganglios linfáticos (>3) (prueba de rango logarítmico, Tabla 11). Finalmente en las subclases que combinan varios parámetros de “buen pronóstico”, tales como ER+ y/o PR+, ER+ y/o PR+ y SBR1+2, ER+/SBR1+2, o ER+/HER2-/SBR1+2, los niveles de expresión elevados de ZNF217 todavía estaban significativamente asociados con RFS más corta (P = 0,013, P = 0,002, P = 0,015 y P = 0,031, respectivamente, prueba de rango logarítmico, Tabla 11). De forma interesante, la significancia se alcanzó por poco (P = 0,067, prueba de rango logarítmico, Tabla 11) en la subclase ER+/HER2-/SBR1+2/ganglios linfáticos (≤3) (n = 27). Finalmente, los niveles de expresión elevados de ZNF217 estuvieron asociados significativamente con OS solamente en la cohorte completa (P = 0,049, prueba de rango logarítmico, Tabla 11). De forma interesante, también estuvo presente una tendencia hacia la significancia en la subclase ER+/HER2-, P = 0,055) (Tabla 11).
Recientemente, se han propuesto parámetros inmunohistológicos (ER, PR, HER2, KI67) y/o clínicos (SBR) para clasificar cánceres de mama en subtipos que son biológicamente distintos y se comportan diferentemente (Blows et al., 2010; Cheang et al., 2009; Hugh et al., 2009; Millar et al., 2009; Nguyen et al., 2008). El pronóstico y la sensibilidad a la quimioterapia de los subgrupos moleculares diferentes son diferentes. Los cánceres semejantes a Luminal son ER+ y/o positivos a PR (receptor de progesterona), y por lo tanto son sensibles a terapia endocrina, y pueden tener un pronóstico más favorable que los subtipos HER2+ y Triple negativo, incluso en ausencia de cualquier terapia. El subtipo Luminal B es equivalente a aquellos que expresan HER2 o que poseen un fenotipo muy proliferativo dado por KI67 o SBR (que tiene en cuenta el número de mitosis observadas) (Cheang et al., 2009; Hugh et al., 2009; Millar et al., 2009; Nguyen et al., 2008; Voduc et al., 2010). Se ha demostrado que los cánceres de mama Luminal B tienen una supervivencia a largo plazo menos favorable que los cánceres de mama Luminal A (Blows et al., 2010; Cheang et al., 2009; Hugh et al., 2009; Nguyen et al., 2008; Voduc et al., 2010). Entonces se da máxima importancia a marcadores dirigidos a reestratificar las subclases luminal, en particular la subclase luminal A. En la cohorte CLB2, se encontró que los niveles de expresión elevados de ZNF217 estaban significativamente asociados con RFS más corta en cánceres de mama luminal (P = 0,013, prueba de rango logarítmico, Tabla 12), pero no en los subtipos HER2+ o Triple negativo. De forma interesante, no se detectó valor de pronóstico para ZNF217 en las subclases Luminal B, mientras que niveles de expresión de ZNF217 elevados se asociaron con RFS más corta en las subclases Luminal A (P = 0,012 y P = 0,014, prueba de rango logarítmico, Tabla 12).
En conjunto, estos datos demostraron que el nivel de expresión de ZNF217 es un nuevo marcador de mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama, en particular en tumores de mama que poseen al menos uno de los marcadores convencionales de buen pronóstico (ER+ y/o PR+, HER2-, SBR1+2, estado de ganglios linfáticos (<3), luminal A). De este modo, ZNF217 posee un valor añadido a los marcadores convencionales actuales, y permitiría la reestratificación de pacientes con cánceres de mama considerados como cánceres con buen pronóstico. De este modo, el estado de ZNF217 debería ayudar a los médicos a la decisión terapéutica.
Existe una comunicación entre rutas de señalización de ZNF217 y ER
Dado el hecho de que el valor de mal pronóstico de ZNF217 es predominante en cánceres de mama ER+, se exploró la relación entre la expresión de ZNF217 y de ER. Mediante RTQ-PCR, se encontró una correlación significativa entre los niveles de ARNm de ZNF217 y los niveles de ARNm de ESR1 en dos cohortes independientes de muestras de tumor de mama: coeficiente de correlación por rangos de Spearman = +0,47; P = 0,0001 (en una cohorte de 33 tumores de mama ER+ y 34 tumores de mama ER-) y coeficiente de correlación por rangos de Spearman = = +0,69; P = 0,0001 (en una cohorte de 39 tumores de mama ER+). La estirpe celular ER-MDA-MB-231 se ha transfectado previamente de forma estable con ESR1 de tipo salvaje para generar una nueva estirpe celular (células S30) que expresa constitutivamente ERalfa (Levenson et al., 2003). Se demostró mediante transferencia western que la expresión constitutiva de ER en células S30 estaba asociado con mayores niveles de expresión de la proteína ZNF217 en comparación con las células MDA-MB-231 de control (Figura 12A). Por el contrario, en la estirpe celular de cáncer de mama ER+MCF7, que posee niveles endógenos elevados de ZNF217, la eliminación de la expresión de ZNF217 mediante una estrategia de siRNA estuvo asociado con una expresión reducida de ER (Figura 12B).
El desarrollo de resistencia farmacológica y recaída bajo terapia endocrina representa un problema real en el manejo clínico de cánceres de mama ER+. De forma interesante, se encontró que ZNF217 es un marcador de mal pronóstico y de recaída en dos cohortes de pacientes tratados sólo mediante terapia endocrina adyuvante: la cohorte recogida por el Centre René Huguenin (P = 0,039, prueba de rango logarítmico), y mediante análisis retrospectivo, la cohorte descrita por Ma et al. (P = 0,014, prueba de rango logarítmico) (Ma et al., 2004). Mediante un análisis estadístico retrospectivo de datos de conjuntos de expresión génica procedentes de otro estudio previo de 155 muestras de tumor de mama de pacientes que habían desarrollado o no metástasis en tamoxifeno (44 Met+ y 155 Met-) (Chanrion et al., 2008), se validó una vez más que niveles elevados de ARNm de ZNF217 son marcadores de mal pronóstico y de recaída (P = 0,01, prueba de rango logarítmico).
MVLN es una estirpe celular de carcinoma de mama ER+, sensible a hormonas y sensible a OH-Tamoxifeno (OH-Tam), derivada de células MCF7 (Demirpence et al., 1993). La exposición durante seis meses de células MVLN a OH-Tam permitió la aparición de un clon celular CL6.7 resistente a OH-Tam pero todavía dependiente de estrógenos. El fenotipo de resistencia a OH-Tam desarrollado por las células CL6.7 se caracterizó bajo exposición a OH-Tam mediante la pérdida de la actividad citostática de la molécula que es detectable en células MVLN y la aparición de una fuerte estimulación de la proliferación de células CL6.7 (efecto similar a estrógeno) (Ghayad et al., 2010) (Figura 13). En un ensayo de proliferación celular que usa marcaje con BrdU, la combinación de la eliminación de ZNF217 (estrategia siRNA) con exposición a OH-Tam condujo a una mayor sensibilidad a terapia endocrina en la estirpe celular MVLN sensible (P = 0,001, prueba de Student) y a la inversión de resistencia hormonal en la estirpe celular CL6.7 (la actividad semejante a estrógeno de OH-Tam se invirtió ahora hasta una inhibición del 33% de la proliferación celular, P < 10-5) (Figura 13).
En conjunto, estos datos sugieren que existe una comunicación entre los niveles de expresión de ZNF217 y de ER, y que niveles de expresión elevados de ZNF217 están asociados con una respuesta reducida a terapia endocrina. En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que ZNF217 puede representar un marcador predictivo para la terapia endocrina.
Conclusión
En conclusión, se ha demostrado en experimentos in vitro que la sobreexpresión de ZNF217 en células de cáncer de mama dispara un crecimiento proliferativo, independiente del anclaje, y está asociada con un fenotipo invasivo y de EMT. Se ha mostrado que la expresión de ZNF217 representa un nuevo marcador de mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama que tienen tendencia a recaer y a desarrollar metástasis. De forma más precisa, el nivel de expresión de ZNF217 es un potente marcador de mal pronóstico de cánceres de mama clasificados mediante los marcadores/parámetros clínicos actualmente disponibles como cánceres con buen/mejor pronóstico (por ejemplo, la subclase ER+, la subclase HER2-, la subclase luminal (ER+ y/o PR+), la subclase ER+/HER2-, la subclase SBR1 y/o SBR2, la subclase ninguna/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la subclase ER+ y/o PR+ y SBR1 y/o SBR2, la subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2, la subclase ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2/ninguna/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), la subclase luminal A). La evaluación de los niveles de expresión de ZNF217, solo o en asociación con otros marcadores de pronóstico, permitiría de este modo la reestratificación de estos cánceres clasificados por tener buen/mejor pronóstico en dos subclases: cánceres de mama de “buen pronóstico” (con niveles de expresión de ZNF217 bajos) o cánceres de mama de “mal pronóstico” (con niveles de expresión de ZNF217 elevados), ayudando así a los médicos a la decisión terapéutica. El valor de pronóstico de ZNF217 en cánceres de mama luminal se podría explicar (al menos en parte) mediante la comunicación que existe entre ZNF217 y ER. Además, puesto que los niveles de expresión de ZNF217 desregulados están asociados con una respuesta reducida a terapia endocrina (encontrado en 3 cohortes) o a terapia endocrina/quimioterapia (encontrado en 2 cohortes), ZNF217 también puede representar un marcador predictivo para terapias contra el cáncer, y en particular para la terapia endocrina.
Tabla 1
Pacientes de la cohorte CLB1: Características de los 47 pacientes con cáncer de mama primario
Número de pacientes Grupo Met- (n = 33) Grupo Met+ (n = 14)
Pa
Edad (años)
� 70
29 14 NS (0,43)
> 70
4 0
Grado histológicob I + II 15 III 17 Estado de ganglios linfáticos < 3 16 � 3 17 Tamaño tumoral macroscópico < 30 mm 7 � 30 mm 26 Estado del receptor de estrógenosc Positivo 25 Negativo 8 a El valor P (prueba χ2) se consideró significativo cuando P < 0,05. b Clasificación de Scarff-Bloom-Richardson. c Determinado mediante inmunohistoquímica.
10 4 6 7 2 12 7 7 NS (0,22) NS (0,85) NS (0,88) NS (0,16)
Tabla 2
Pacientes del Centre René Huguenin (Saint-Cloud, Francia): Características de los 48 pacientes con cáncer de mama primario ER+ Número de pacientes Grupo Met- (n = 24) Grupo Met+ (n = 24) Pa Edad (años)
� 70 13 14 NS (1) > 70 11 10 Grado histológicob
I + II 22 16 NS (0,08) III 2 8
Estado de ganglios linfáticos < 3 � 3 19 5 Tamaño tumoral macroscópico < 30 mm � 30 mm 18 6 a El valor P (prueba χ2) se consideró significativo cuando P < 0,05. b Clasificación de Scarff-Bloom-Richardson.
13 11 14 10 NS (0,13) NS (0,36)
5
Tabla 3
Relaciones entre los niveles de ARNm de ZNF217 y los parámetros clínicos y patológicos en muestras de tumor de mama procedentes de la cohorte CLB1
Número de Niveles de ARNm (unidades arbitrarias)
Pa
muestras Mediana Intervalo
Edad (años)
� 70
43 3,88 0,21-36,15 NS (0,13)
> 70
4 2,30 1,26-3,33
Grado histológicob
I + II
25 4,35 0,21-23,01 NS (0,26)
III
22 3,23 0,72-36,15
Estado de ganglios linfáticos
< 3
26 3,21 0,21-17,08 NS (0,07)
� 3
21 4,59 0,92-36,15
Tamaño tumoral macroscópico
9
< 30 mm
38 3,21 0,92-13,91 NS (0,35)
� 30 mm
3,82 0,21-36,15
Estado del receptor de estrógenosc Positivo 32 3,71 0,21-36,15 NS (0,62) Negativo 15 3,75 0,72-23,33
a El valor P (prueba de Mann-Whitney) se consideró significativo cuando P < 0,05. NS, no significativo.
Relaciones entre los niveles de ARNm de ZNF217 y los parámetros clínicos y patológicos en muestras de tumor de mama procedentes de la cohorte CLB1
Número de Niveles de ARNm (unidades arbitrarias)
Pa
muestras Mediana Intervalo b Clasificación de Scarff-Bloom-Richardson. c Determinado mediante inmunohistoquímica.
Tabla 4
Análisis mediante RTQ-PCR de niveles de ARNm. Comparación estadística entre muestras de tumores Met- y Met+ procedentes de la cohorte CLB1 Genes Muestras tumorales Número de Niveles de ARNm (unidades arbitrarias)
Pa
muestras Mediana Intervalo
ZNF217 Met-33 3,21 0,21-23,01 0,002 Met+ 14 8,09 1,35-36,15
ERBB2 Met-33 1,52 0,07-84,82 NS (0,06) Met+ 14 5,30 0,40-143,26
ESR1 Met-33 0,597 0,01-149,76 NS (0,31) Met+ 14 0,19 0,01-2,46
a El valor P (prueba de Mann-Whitney) se consideró significativo cuando P < 0,05. NS, no significativo. Tabla 5
Análisis univariado y multivariado de las expresiones de los genes ZNF217, ERBB2 y ESR1 en relación con la supervivencia libre de recaídas en las 47 muestras de tumor de mama procedentes de la cohorte CLB1 Genes Univariado (n = 47) Multivariado (n = 47)
Pc
HRa 95% CIb HR 95% CI P
ZNF217
8,821 1,57 a 31,59 0,003 9,56 1,57 a 31,59 0,002
ERBB2 ESR1
2,821 0,732 0,82 a 8,32 0,21 a 0,19 NS (0,09) NS (0,39) NDd ND NS ND
a HR, Relación de riesgo. b 95% CI, 95% de intervalo de confianza. c El valor P se consideró significativo cuando P < 0,05. NS, no significativo. d ND, no realizado. El análisis multivariado se realizó usando las variables con un nivel de significancia inferior a 0,10 en el análisis univariado.
Tabla 6
Análisis univariado de la expresión de los genes ZNF217, ERBB2 y ESR1 en relación con la supervivencia global en las 47 muestras de tumor de mama de la cohorte CLB1
Genes Univariado (n = 47)
Pc
HRa 95% CIb
ZNF217 2,09 0,74 a 6,19 NS (0,15) ERBB2 0,02 0,35 a 2,48 NS (0,88) ESR1 0,11 0,31 a 2,27 NS (0,74) a HR, Relación de riesgo. b 95% CI, 95% de intervalo de confianza. c El valor P se consideró significativo cuando P < 0,05. NS, no significativo.
Tabla 7
Pacientes procedentes de la cohorte CLB2: Características de los 113 pacientes con cáncer de mama primario Número de pacientes
No grupo de recaída (n = 94) Grupo de recaída (n = 19)
Pa
Edad (Años)
50
43 12 NS (0,26)
> 50
51 7
Grado histológicob,c I + II III Estado de ganglios linfáticos 3 > 3 Tamaño tumoral macroscópicoc 20 mm > 20 mm Estado del receptor de estrógenosd Positivo
36 57 60 34 6 87 58 11 8 7 12 1 18 10 NS (0,20) NS (0,054) NS (0,75) NS (0,63)
21
Pacientes procedentes de la cohorte CLB2: Características de los 113 pacientes con cáncer de mama primario Número de pacientes No grupo de recaída (n = 94) Grupo de recaída (n = 19) Pa Negativo 36 9 Estado del receptor de progesteronad
Positivo Negativo Estado de HER2c,e
59 35 11 8 NS (0,89)
Positivo Negativo 23 71 7 11 a El valor P (prueba χ2) se consideró significativo cuando P < 0,05. b Clasificación de Scarff-Bloom-Richardson. c Información disponible para 112 pacientes. d Medido mediante inmunohistoquímica. e Medido mediante inmunohistoquímica (validado mediante FISH para unas pocas muestras).
NS (0,33)
Tabla 8
Relaciones entre los niveles de ARNm de ZNF217 y los parámetros clínicos y patológicos en muestras de tumor de mama procedentes de la cohorte CLB2
Número de Niveles de ARNm (unidades arbitrarias)
Pa
muestras Mediana Intervalo
Edad (años) 50 > 50
55 58 0,46 0,41 0,01-56,50 0,01-49,40 NS (0,80)
Grado histológicob,c I + II III
47 65 0,54 0,38 0,01-49,40 0,01-56,50 NS (0,59)
Estado de ganglios linfáticos 3 > 3
67 46 0,41 0,45 0,01-49,40 0,01-56,50 NS (0,86)
Tamaño tumoral macroscópicoc 20 mm > 20 mm 7 105 0,66 0,40 0,16-49,40 0,01-56,50 NS (0,14)
Estado del receptor de estrógenosd Positivo Negativo 68 45 0,42 0,45 0,01-56,50 0,01-12,43 NS (0,53) Estado del receptor de progesteronad Positivo Negativo 70 43 0,41 0,45 0,01-56,50 0,01-12,43 NS (0,72) Estado de HER2c,e Positivo 30 0,49 0,04-56,50 NS (0,65) Negativo 82 0,41 0,01-49,40
a El valor P (prueba de Mann-Whitney) se consideró significativo cuando P < 0,05. NS, no significativo. b Clasificación de Scarff-Bloom-Richardson. c Información disponible para 112 pacientes. d Medido mediante inmunohistoquímica. e Medido mediante inmunohistoquímica (validado mediante FISH para unas pocas muestras).
Tabla 9
Análisis univariado y multivariado de la expresión del gen ZNF217 y parámetros clínicos en relación con la supervivencia libre de recaídas en las 113 muestras de cáncer de mama procedentes de la cohorte CLB2
Número de Univariado Multivariado
Pc
muestras HRa 95% CIb HR 95% CI P Análisis univariado y multivariado de la expresión del gen ZNF217 y parámetros clínicos en relación con la supervivencia libre de recaídas en las 113 muestras de cáncer de mama procedentes de la cohorte CLB2
Niveles de
ARNm 113 5,14 1,11 a 10,04 0,023 5,54 1,11 a 10,04 0,019
de ZNF217
Edad (
50 años: > 113 0,92 0,25 a 1,61 NS (0,337) NDd ND ND
50 años)
Tamaño
tumoral 112 0,02 0,15 a 8,74 NS (0,881) ND ND ND
macroscópico
(
20 mm: > 20 mm)
Estado de ganglios
113 4,04 0,99 a 6,40 0,044 NS (0,057)
linfáticos ( 3: >3)
Grado
histológico 112 1,49 0,23 a 1,42 NS (0,222) ND ND ND
(SBR1+2: SBR3)
Número de Univariado Multivariado
Pc
muestras HRa 95% CIb HR 95% CI P
Estado del receptor 113 0,35 0,31 a 1,88 NS (0,557) ND ND ND de estrógenos (negativo: positivo) Estado de HER2 113 0,59 0,56 a 3,73 NS (0,443) ND ND ND (negativo: positivo) Luminal (A: B)e 74 0,04 0,37 a 3,33 NS (0,842) ND ND ND Luminal (A: B)f 74 0,07 0,32 a 4,31 NS (0,798) ND ND ND a HR, Relación de riesgo. b 95% CI, 95% de intervalo de confianza. c El valor P se consideró significativo cuando P < 0,05. NS, no significativo. d ND, no realizado. El análisis multivariado se realizó usando las variables con un nivel de significancia inferior a 0,10 en el análisis univariado. e clasificación según Hugh et al. (2009) y Cheang et al. (2009). f clasificación según Millar et al. (2009) y Nguyen et al. (2008).
Tabla 10
Análisis univariado de la expresión del gen ZNF217 en diferentes subclases de cánceres de mama en relación con la supervivencia libre de recaídas (RFS) en la cohorte CLB2 y la cohorte descrita por Ma et al. (2004) Número de RFS muestras HRa 95% CIb Pc
Cohorte CLB2 Todas las muestras de tumor de 113 5,14 1,11 a 10,04 0,023 mama Subclase ER+ 68 6,05 1,09 a 67,93 0,014 Subclase ER+/HER2-57 8,27 N/Ad 0,004 Cohorte de Ma Todas las muestras de tumor de 60 5,99 1,17 a 5,76 0,014 mama Subclase ER+ 56 5,03 1,09 a 5,87 0,025
Subclase ER+/HER2-50 10,91 1,66 a 10,67 0,001 a HR, Relación de riesgo. b 95% CI, 95% de intervalo de confianza. c El valor P se consideró significativo cuando P < 0,05.
Tabla 11
Análisis univariado de la expresión del gen ZNF217 en relación con la supervivencia libre de recaídas (RFS) y supervivencia global (OS) en diferentes subclases de las 113 muestras de cáncer de mama procedentes de la cohorte CLB2
Número de RFS OS
Pe
muestras HRa 95% CIb HR 95% CI P
Todas las muestras de tumor de 113 5,14 1,11 a 0,023 3,89 0,97 a 6,45 0,049 mama 10,04
Subclase ER+
68 6,05 1,09 a 0,014 2,73 0,77 a NS (0,098)
67,93
11,06
Subclase ER-
45 0,36 0,55 a NS (0,548)
Subclase HER2+
30 0,7 1,53 0,38 a NS (0,403) NDd
10,29
Subclase HER2-
82 7,22 1,26 a 0,007 ND
76,98
Subclase ER+/HER2-
57 8,27 N/Ae 0,004 3,68 0,86 a NS (0,055)
19,56
Subclase SBR1+2
47 8,34 1,42 a 0,004 ND
86,75
Subclase SBR2
37 6,57 1,16 a 0,010 ND
74,37
Subclase SBR3
65 0,26 0,35 a NS (0,609) ND
6,08
Subclase del estado de ganglios
67 3,79 0,75 a NS(0,052) ND
linfáticos (<3)
52,09
Subclase del estado de ganglios
46 0,62 0,48 a NS (0,431) ND
Análisis univariado de la expresión del gen ZNF217 en relación con la supervivencia libre de recaídas (RFS) y supervivencia global (OS) en diferentes subclases de las 113 muestras de cáncer de mama procedentes de la cohorte CLB2
Número de RFS OS
Pe
muestras HRa 95% CIb HR 95% CI P
linfáticos (>3) 5,36 Subclase ER+ y/o PR+ 74 6,11 1,20 a 0,013 ND
24,50 Subclase ER+ y/o PR+/SBR1+2 41 9,51 N/A 0,002 ND Subclase ER+/SBR1+2 38 5,88 N/A 0,015 ND Subclase ER/HER2-/SBR1+2 34 4,65 N/A 0,031 ND Subclase ER+/HER2-27 3,35 N/A NS (0,067) ND /SBR1+2/estado de ganglios linfáticos (<3) a HR, Relación de riesgo. b 95% CI, 95% de intervalo de confianza. c El valor P se consideró significativo cuando P < 0,05.NS, no significativo. d ND, no realizado. e N/A, No aplicable puesto que todos los casos están censados en el grupo de nivel de ARNm de ZNF217 bajo.
Tabla 12
Análisis univariado de la expresión del gen ZNF217 en relación con la supervivencia libre de recaídas (RFS) en diferentes subclases de las 113 muestras de cáncer de mama procedentes de la cohorte CLB2
Número de muestras RFS
Pc
HRa 95% CIb
Subclase Luminal 74 6,11 1,20 a 24,50 0,013 (ER+ y/o PR+) HER2+ 16 0,20 0,17 a 16,03 NS (0,658) (ER-/PR-/HER2+) Triple Negativo (ER-/PR-/HER2-) 21 1,00 N/Af NS (0,320) Subclase Luminal A (ER+ y/o 35 6,34 N/A 0,012 PR+/HER2-/SBR1 o SBR2)d Subclase Luminal B (ER+ y/o 39 1,03 0,44 a 11,79 NS (0,311) PR+/HER2+ y/o SBR3)d Subclase Luminal A (ER+ y/o 60 6,04 1,09 a 67,87 0,014 PR+/HER2-)e Subclase Luminal B (ER+ y/o 14 0,39 0,19 a 23,27 NS (0,534) PR+/HER2+)e a HR, Relación de riesgo. b 95% CI, 95% de intervalo de confianza. c El valor P se consideró significativo cuando P < 0,05.NS, no significativo. d clasificado según Hugh et al. (2009) y Cheang et al. (2009). e clasificado según Millar et al. (2009) y Nguyen et al. (2008). f N/A, No aplicable puesto que todos los casos están censados en el grupo de nivel de ARNm de ZNF217 bajo.
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<120> ZNF217, un nuevo biomarcador para el pronóstico y la predicción de fenotipos recurrentes, invasivos y metastásicos en cáncer
<130> D27616 KH
<150> EP 09165733.8 15 <151> 17/07/2009
<150> US 61/223,304
<151> 17/07/2009
<160> 6 20 <170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> ADN 25 <213> Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 1 30 agtccaaatc cctgccatct 20
<210> 2
<211> 20
<212> ADN 35 <213> Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 2 40 ggggaaacac tggttttagg 20
<210> 3
<211> 21
<212> ADN 45 <213> Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 3 50 tgttccaaac ccatcgtcag t 21
<210> 4
<211> 27
<212> ADN 55 <213> Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 4 60 ctctataacc aatgacctct ctgtgaa 27
<210> 5
<211> 20
<212> ADN 65 <213> Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 5 actggccctc atccaccata 20 5
<210> 6
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial 10
<220>
<223> cebador
<400> 6 ggttggcagt gtggagcag 19 15

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente, que comprende las siguientes etapas:
    a) ensayar una muestra previamente tomada de dicho paciente en busca de al menos un marcador de pronóstico de cáncer de mama, y evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217 en dicha muestra;
    b) si la muestra presenta al menos un marcador de pronóstico que clasifica al cáncer de mama por tener un pronóstico favorable, reclasificar el cáncer de mama por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
  2. 2.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según la reivindicación 1, en el que dicho marcador de pronóstico que clasifica el cáncer de mama por tener un pronóstico favorable se determina mediante un sistema de clasificación histológica, un sistema de clasificación inmunohistoquímica y/o detección de la amplificación de ERBB2.
  3. 3.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicho marcador de pronóstico que clasifica el cáncer de mama por tener un pronóstico favorable se selecciona de entre el grupo constituido por ER+, PR+, HER2-, índice proliferativo bajo, ninguna/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), luminal y luminal A.
  4. 4.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho al menos un marcador de pronóstico que clasifica el cáncer de mama por tener un pronóstico favorable permite la clasificación del subtipo del cáncer de mama entre los subtipos que consisten en ER+ y/o PR+, HER2-, ER+/HER2-, SBR1 y/o SBR2, ninguna/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), ER+ y/o PR+/SBR1 y/o SBR2, ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2, ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2/ninguna/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), luminal A.
  5. 5.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cáncer se reclasifica como propenso a recaer y/o propenso a desarrollar un fenotipo invasivo o metastásico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
  6. 6.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cáncer se reclasifica por tener un mal pronóstico para la supervivencia libre de recaídas si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
  7. 7.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el cáncer se reclasifica por tener un mal pronóstico para la supervivencia global si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
  8. 8.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cáncer se reclasifica por tener un mal pronóstico bajo terapia endocrina si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
  9. 9.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cáncer se reclasifica por tener un mal pronóstico bajo quimioterapia y/o terapia endocrina si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
  10. 10.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente, que comprende las siguientes etapas:
    a) ensayar una muestra tomada previamente de dicho paciente en busca de al menos un marcador de pronóstico de cáncer de mama,
    b) evaluar el nivel de expresión del gen ZNF217 si la muestra presenta al menos un marcador que clasifica al cáncer de mama por tener un pronóstico favorable,
    c) clasificar el cáncer de mama por tener un mal pronóstico si el gen ZNF217 está sobreexpresado en dicha muestra.
  11. 11.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según la reivindicación 10, en el que dicho marcador de pronóstico que clasifica el cáncer de mama por tener un pronóstico favorable se determina mediante un sistema de clasificación histológica, un sistema de clasificación inmunohistoquímica y/o detección de la amplificación de ERBB2.
  12. 12.
    Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según las reivindicaciones 10 y 11, en el que dicho marcador de pronóstico que clasifica el cáncer de mama por tener un pronóstico favorable se selecciona en el grupo constituido por ER+, PR+, HER2-, índice proliferativo bajo, ninguna/poca invasión de
    5 ganglios linfáticos (≤3), luminal, luminal A.
  13. 13. Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicho al menos un marcador de pronóstico que clasifica el cáncer de mama por tener un pronóstico favorable permite la clasificación del subtipo del cáncer de mama entre los subtipos que
    10 consisten en ER+ y/o PR+, HER2-, ER+/HER2-, SBR1 y/o SBR2, ninguna/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), ER+ y/o PR+/SBR1 y/o SBR2, ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2, ER+/HER2-/SBR1 y/o SBR2/ninguna/poca invasión de ganglios linfáticos (≤3), luminal A.
  14. 14. Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 13, en el que el nivel de expresión del gen ZNF217 se compara con una muestra de control.
  15. 15. Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la muestra de control es el nivel de expresión de la mediana de ZNF217 en muestras tomadas de pacientes que tienen cánceres de mama.
  16. 16. Procedimiento para determinar el pronóstico de un cáncer de mama en un paciente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la muestra es una muestra de tumor de mama.
  17. 17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende medir el nivel de expresión del 25 gen ZNF217 en una muestra mediante cuantificación del ARNm del gen ZNF217.
  18. 18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende medir el nivel de expresión del gen ZNF217 en una muestra mediante cuantificación del polipéptido o polipéptidos codificados por el gen ZNF217.
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