CN114959034B - 仑伐替尼药敏标记物及其相关试剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种仑伐替尼药敏标记物及其相关试剂应用。所述仑伐替尼药敏标记物为仑伐替尼耐药标记物或者仑伐替尼敏感标记物，所述仑伐替尼耐药标记物为JUN及与JUN相关的一组标记物中任意一种，所述JUN相关的一组标记物为HIST1H1E、WNT6、ZC3H12D、CHAC1、ANKRD37、CST1、SPNS3、COX6A2；所述仑伐替尼敏感标记物为ACOT6、MT1X、NEDD4L、PCYOX1中任意一种。上述仑伐替尼药敏标记物可用于预测仑伐替尼的药效。通过对肝癌患者组织转录组测序，或通过PCR、基因芯片、组织芯片、NanoString技术、免疫组化的方法检测相关分子的表达，可为仑伐替尼的用药与肝癌的精准治疗提供线索。

Description

仑伐替尼药敏标记物及其相关试剂的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及肿瘤领域，具体为一种仑伐替尼药敏标记物及其相关试剂应用。
背景技术
原发性肝癌在我国目前常见的恶性肿瘤中，发病率排第四位，死亡率排第二位，严重威胁我国人民的生命和健康。肝癌早期患者(巴塞罗纳0期A期)，手术切除和肝移植等治疗可以有效地提高肝癌患者的治愈率和生存预后。然而由于肝癌起病隐匿，早期症状缺乏特异性，很多患者被诊断为肝癌时，就已经处于中期或晚期。长期以来，由于药物治疗方案少，而且临床有效率低，中晚期肝癌普遍显示预后差、生存率低。
索拉非尼(Sorafenib)是最早用于肝癌治疗药物，然而，索拉非尼仅能将中位生存期提高三个月，且有效率低，尚不足10％。仑伐替尼(Lenvatinib)是原发性肝癌临床中常用的一线药物，可作用的靶点包括VEGFR1-3、FGFR1-4、PDGFRα、KIT和RET，适用于不可切除的中国肝癌分期方案(China liver cancer staging，CNLC)中IIb、IIIa、IIIb期及肝功能Child-Pugh A级的肝癌病人。研究表明，仑伐替尼治疗后肝癌患者的中位生存期，不亚于索拉非尼。2018年美国国家癌症综合网络(NCCN)、欧洲肿瘤内科学会(ESMO)、欧洲肝脏研究学会(EASL)、中国临床肿瘤学会(CSCO)等指南推荐仑伐替尼作为晚期肝细胞癌一线标准治疗药物。尽管仑伐替尼显示出明显优于索拉非尼的临床有效率，但其临床有效率仅为24.1％，而且大部分人群并不适用，出现了很多无效治疗现象。因此，亟需补充仑伐替尼的药敏分子分型方案，提高肝癌治疗疗效。
发明内容
为了克服现有技术的问题，本发明的第一个目的在于提供一种仑伐替尼药敏标记物，采用其可对仑伐替尼耐药及敏感人群进行提示，为肝癌精准治疗提供依据。本发明的第二个目的提出仑伐替尼药敏标记物在非治疗目的的仑伐替尼用药研究中的应用。本发明的第三个目的是，提供该仑伐替尼药敏标记物相关试剂的一些应用，该标记物的相关试剂包括：检测其表达的定量试剂、抑制剂、促进剂等，这些相关试剂的应用能够填补肝癌精准诊疗领域的空白。
本发明的目的是这样实现的：
本发明的第一方面：发现JUN及以JUN为核心的一组基因耐药标记物为HIST1H1E、WNT6、ZC3H12D、CHAC1、ANKRD37、CST1、SPNS3、COX6A的高表达与仑伐替尼耐药相关。发现基因ACOT6、MT1X、NEDD4L、PCYOX1对仑伐替尼作用敏感。因此这些基因表达能够作为指导原发性肝癌治疗的潜在药敏生物标记物。即本发明提供了一种仑伐替尼药敏标记物，为仑伐替尼耐药标记物或者仑伐替尼敏感标记物；所述仑伐替尼耐药标记物为JUN及与JUN相关的一组标记物中任意一种，所述JUN相关的一组标记物为HIST1H1E、WNT6、ZC3H12D、CHAC1、ANKRD37、CST1、SPNS3、COX6A2；所述仑伐替尼敏感标记物为ACOT6、MT1X、NEDD4L、PCYOX1中任意一种。所述仑伐替尼药敏标记物为RNA或其逆转录的cDNA，或蛋白。
具体筛选过程为：
发明人收集了多例原发性肝癌患者的手术标本，多点取样，通过三维培养的方法，成功建立了涵盖数百个位点的肝癌类器官生物库。团队通过苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，证实类器官保留了患者的病理学特征。通过对类器官和对应的患者标本的免疫荧光、免疫组化染色，发现肝癌类器官与临床上肝癌患者的分子标记物也是一致的。
选取近百个位点，进行组织和对应类器官的外显子、转录组测序，分析了组织与对应类器官的基因组特征。从体细胞突变、拷贝数变异和转录组相似性等多维度验证了类器官生物库高度保留组织样本的分子特征。此外，团队建立的大规模肝癌组织和类器官队列与以往肝癌研究一致，具有肝癌的高发突变。另外，发明人的肝癌数据反映了不同程度的肿瘤间(inter-tumor)和肿瘤内异质性(intra-tumor heterogeneity)，为研究肝癌药敏异质性提供了依据。
本发明选取临床上常用的肝癌药物索拉非尼、仑伐替尼等，对类器官生物库进行大规模药物筛选。发明人将类器官药敏与临床治疗效果相比对，发现其药敏效果是高度一致的。
为了研究肝癌一线靶向药物仑伐替尼的药敏分子分型，对多个类器官位点进行了转录组测序，通过Lasso模型及生信分析，解析出仑伐替尼的敏感标记物为ACOT6、MT1X、NEDD4L、PCYOX1，耐药标记物为JUN、HIST1H1E、WNT6、ZC3H12D、CHAC1、ANKRD37、CST1、SPNS3、COX6A2。其训练集AUC为0.86。之后，我们随后通过同样的方法，收集了多个肝癌标本进行类器官培养、药敏测试和转录组测序，进行分子分型研究，得到仑伐替尼的验证集为0.81。
本发明的第二方面：提供仑伐替尼药敏标记物在非治疗目的的仑伐替尼用药研究中的应用。包括在一些药效方面的基础性研究应用、对仑伐替尼改进研究的药效测定方面的应用。
本发明的第三方面：提供仑伐替尼药敏标记物表达量的定量试剂在制备仑伐替尼药敏检测试剂的应用，所述药敏检测为耐药性检测或药物敏感性检测。
进一步的，检测的样本为肝癌组织样本，所述定量试剂为转录组测序试剂、PCR、基因芯片、组织芯片、NanoString技术、免疫组化试剂中任意一种。
进一步的，提供了一种仑伐替尼药敏评估试剂盒，包含检测所述仑伐替尼药敏标记物表达量的定量试剂，所述药敏评估为耐药性评估或药物敏感性评估。
进一步的，提供了一种原发性肝癌的仑伐替尼药敏分析系统，包括：
靶点表达量检测装置：用于检测样本中所述仑伐替尼药敏标记物的表达量；所述样本为患者肝癌组织；
药敏分析装置：基于仑伐替尼药敏性标记物的表达量，确定肝癌的用药效果；
结果输出装置：用于输出药敏分析装置分析得到的结果，所述药敏分析为耐药性分析或敏感性分析。
本发明的第四方面：提供一种治疗肝癌的药物组合物，仑伐替尼及所述仑伐替尼药敏标记物的抑制剂或促进剂。
进一步的，该药物组合物包含仑伐替尼及所述仑伐替尼药敏标记物的抑制剂，所述仑伐替尼药敏标记物为仑伐替尼耐药标记物。该药物组合物通过抑制仑伐替尼耐药基因的表达来增进仑伐替尼对特定患者的药效。
进一步的，该药物组合物包含仑伐替尼及机所述仑伐替尼药敏标记物的促进剂，所述仑伐替尼药敏标记物为仑伐替尼敏感标记物。该药物组合物通过促进仑伐替尼敏感基因的表达来增进仑伐替尼对特定患者的药效。
本发明的优点和有益效果是：
确定了JUN及与JUN相关的一组基因(HIST1H1E、WNT6、ZC3H12D、CHAC1、ANKRD37、CST1、SPNS3、COX6A2)与仑伐替尼耐药相关；确定了ACOT6、MT1X、NEDD4L、PCYOX1基因与仑伐替尼敏感相关。这些标记物可用于预测仑伐替尼的药效。通过对肝癌患者的组织测序，或通过RT-qPCR、免疫组化的方法检测相关分子的表达，可为仑伐替尼的用药与肝癌的精准治疗提供线索。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者的类器官保留患者的病理特征和组织标记物。其中，图1A.HCC患者不同位点的HE及免疫组化染色；图1B.HCC患者类器官的显微镜下状态和HE染色；图1C.类器官的免疫荧光染色；图1D.类器官的免疫组化染色。
图2为类器官保留患者的外显子、转录组特征。其中，图2A.外显子测序揭示类器官保留了患者的突变特征。图2B.转录组测序显示类器官保留了患者的转录组特征。
图3为类器官药敏测试。图3A仑伐替尼的药敏曲线，图3B，对376例类器官的7种肝癌靶向药物测试。图3C，类器官的体外药敏测试，与临床患者的药物反应具有一致性。
图4为仑伐替尼药敏分子分型。图4A.仑伐替尼的药敏分子分型。图4B.仑伐替尼训练集和验证集的AUC。图4C，仑伐替尼的耐药靶点互作图。
图5为仑伐替尼分子分型在100例肝癌组织中的验证。
图6为靶向JUN增强仑伐替尼的药敏效果。图示为6位肝癌患者的药敏曲线，圆形点标记的曲线表示原始的肝癌类器官的药敏曲线，方形点标记的曲线表示敲低JUN(A)或过表达JUN(B)的药敏曲线。横坐标显示了不同的仑伐替尼药物浓度，纵坐标显示了该浓度下类器官的存活比例。图6A，在仑伐替尼耐药的位点中，敲低JUN可以显著增强仑伐替尼的药物敏感度。图6B，在仑伐替尼敏感的位点中，过表达JUN也可以使得仑伐替尼敏感度降低。
具体实施方式
下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
仑伐替尼药敏标记物的筛选：
本实施例通过3D培养的方法，成功建立了涵盖376个位点的肝癌类器官生物库。以肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者的手术标本为例，发明人通过HE染色的方法，证实类器官保留了患者的病理学特征(图1A、1B)。通过对类器官和对应的患者标本进行免疫荧光、免疫组化染色，发现肝细胞癌患者及其类器官高中HCC诊断标记物AFP、hepatocyte阳性(图1C、1D)，而胆管癌标记物EPCAM阴性，与临床上肝癌患者的分子标记物也是一致的。说明本实施例建立的类器官体系很好的保留了患者的病理特征。
本实施例选取99个位点，进行组织和对应类器官的外显子、转录组测序，分析了组织与对应类器官的基因组特征。从体细胞突变、拷贝数变异和转录组相似性等多维度验证了类器官生物库高度保留组织样本的分子特征。团队建立的大规模肝癌组织和类器官队列与以往肝癌研究一致，具有肝癌的高发突变(图2A)。在转录组层面，类器官和对应患者的组织也具有高度的相关性(图2B)。
本实施例对376个类器官进行肝癌一线药物索拉非尼、仑伐替尼，常用的二/三线药物瑞戈非尼、阿帕替尼、贝伐单抗，以及针对胆管癌FGFR2融合的药物Pemigatinib、胆管癌IDH1突变的药物Ivosidenib的药敏测试。本实施例绘制了一线药物仑伐替尼的药敏曲线(图3A)和所有靶向药物的热图(图3B)。且患者类器官的药敏反应，与患者临床的实际用药效果总体是一致的(图3C)。
为了研究肝癌一线靶向药物仑伐替尼的药敏分子分型，本实施例对106个类器官位点进行了转录组测序，通过Lasso模型及生信分析，仑伐替尼的敏感标记物为ACOT6、MT1X、NEDD4L、PCYOX1，耐药标记物为JUN、HIST1H1E、WNT6、ZC3H12D、CHAC1、ANKRD37、CST1、SPNS3、COX6A2(图4A)。其训练集AUC为0.86(图4B)。之后，随后通过同样的方法，收集了106个肝癌标本进行类器官培养、药敏测试和转录组测序，进行分子分型研究，得到仑伐替尼的验证集为0.81(图4B)。本实施例对仑伐替尼的耐药基因绘制了互作网络，揭示了这些耐药分子之间的联系(图4C)。
本实施例在100例肝癌患者的组织中验证了此药敏分子分型的有效性。在肝癌组织中，仑伐替尼的药敏分子分型AUC为0.78(图5)。
为了进一步揭示药敏分子分型对肝癌用药的指导，本实施例以仑伐替尼为例，根据耐药基因的互作图，选择了JUN这一居于核心区的基因，作为耐药的关键靶点。在仑伐替尼耐药的位点中，敲低JUN可以显著增强仑伐替尼的药物敏感度(图6A)，在仑伐替尼敏感的位点中，过表达JUN也可以使得仑伐替尼敏感度降低(图6B)(注：JUN基因编码c-JUN蛋白)。
实施例2
仑伐替尼标记物在非治疗目的的仑伐替尼用药研究中的应用。本实施例中为对仑伐替尼活性的研究：选取特定肝癌组织，将不同批次的仑伐替尼与之作用，测定实施例1中筛选的仑伐替尼药敏分子中的一种或几种的定量表达，由此判断各个批次仑伐替尼的生物活性。
实施例3
本实施例提供一种RT-qPCR仑伐替尼药敏评估试剂盒，包含检测实施例1中所筛选出的仑伐替尼耐药标记物JUN(不同试剂盒可以为HIST1H1E、WNT6、ZC3H12D、CHAC1、ANKRD37、CST1、SPNS3、COX6A2、ACOT6、MT1X、NEDD4L、PCYOX1中任意一种，本实施例中选择检测JUN)表达量的定量试剂。该试剂盒包含JUN的RNA的上下游引物。利用本发明的试剂盒结合常用的RNA提取试剂以及反转录试剂，可以特异性地检测样本中JUN的表达量，有助于提前判断肝癌患者对仑伐替尼的耐药性。可以在肝癌病人进行手术或者病理穿刺取得肝癌组织后即刻测定，在使用仑伐替尼前即可评估药物疗效，为患者提供个性化精准的治疗方案。
实施例4
本实施例提供一种RT-qPCR仑伐替尼药敏评估试剂盒，包含检测实施例1中所筛选出的仑伐替尼敏感标记物MSRA等表达量的定量试剂。该试剂盒包含MSRA的RNA的上下游引物。利用本发明的试剂盒结合常用的RNA提取试剂以及反转录试剂，可以特异性地检测样本中MSRA的表达量，有助于提前判断肝癌患者对仑伐替尼的敏感性。可以在肝癌病人进行手术或者病理穿刺取得肝癌组织后即刻测定，在使用仑伐替尼前即可评估药物疗效，为患者提供个性化精准的治疗方案。
实施例5
本实施例提供一种原发性肝癌的仑伐替耐药分析系统，包括：
RT-qPCR靶点表达量检测装置：用于检测样本中仑伐替尼耐药标记物JUN等的表达量；所述样本为患者肝癌组织；所述靶点表达量检测装置采用的试剂为RT-qPCR定量试剂，包括该基因上下游引物；
耐药分析装置：基于仑伐替尼耐药标记物JUN的表达量，确定肝癌的用药效果；
结果输出装置：用于输出耐药分析装置分析得到的结果。
在患者使用仑伐替尼前即可评估药物疗效，为患者提供个性化精准的治疗方案。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种联用仑伐替尼药敏标记物，其特征在于：所述联用仑伐替尼药敏标记物为仑伐替尼耐药标记物和仑伐替尼敏感标记物；所述仑伐替尼耐药标记物为JUN、HIST1H1E、WNT6、ZC3H12D、CHAC1、ANKRD37、CST1、SPNS3和COX6A2；所述仑伐替尼敏感标记物为ACOT6、MT1X、NEDD4L和PCYOX1。
2.根据权利要求1所述的仑伐替尼药敏标记物，其特征在于：所述药敏标记物为RNA或其逆转录的cDNA，或蛋白。
3.检测权利要求1中所述仑伐替尼药敏标记物表达量的定量试剂在制备仑伐替尼药敏检测试剂的应用，所述药敏检测为耐药性检测或药物敏感性检测。
4.根据权利要求3所述的应用，检测的样本为肝癌组织样本，所述定量试剂为转录组测序试剂、PCR、基因芯片、组织芯片、NanoString技术、免疫组化试剂中任意一种。
5.一种仑伐替尼药敏评估试剂盒，其特征在于：包含检测权利要求1中所述仑伐替尼药敏标记物表达量的定量试剂，所述药敏评估为耐药性评估或药物敏感性评估。
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