CN113005125B - 一种乐伐替尼耐药基因nf1、其筛选方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤耐药基因技术领域，特别涉及一种乐伐替尼耐药基因NF1、其筛选方法及应用，NF1的基因的序列为SEQ ID NO：1。其筛选方法包括以下步骤：进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度；进行感染Cas9文库实验，得到稳定株；稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况；筛选乐伐替尼耐药基因；有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。本发明通过CRISPR/Cas9全基因文库筛选得到乐伐替尼的耐药基因，为今后减少乐伐替尼耐药性提供了理论依据，为乐伐替尼的临床应用提供了新的耐药靶点，为临床合理用药提供指导。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤耐药基因技术领域，特别涉及一种乐伐替尼耐药基因NF1、其筛选方法及应用。
背景技术
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国所有肿瘤中位居第三，死亡率高居第二位。2018年9月4日乐伐替尼在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗，乐伐替尼正式取代索拉非尼成为国际上晚期肝癌一线治疗的首选药物，是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，主要作用于是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，乐伐替尼主要作用于是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，同时具有抗肿瘤细胞增殖及抗血管生成作用，靶向药物耐药的主要机制包括肿瘤建立代偿信号通路、靶蛋白改变、肿瘤微环境变化、肿瘤异质性产生和肿瘤对靶向药物的适应等，不同的分子靶向药物可能同时具有多种耐药机制，毫无疑问，分子靶向治疗为肿瘤患者提供了生存和预后获益，但耐药也是分子靶向药物面临的主要问题。目前对于乐伐替尼长期使用后产生的耐药性，尚未见报道，因此，积极探索乐伐替尼的耐药靶基因，对于减少乐伐替尼耐药，指导临床用药有着重要意义。
以往，药物耐药基因常用RNAi文库进行高通量筛选。但RNAi技术造成的表型变化不够稳定、明显，且细胞内源性的RNAi途径导致RNAi筛选存在着广泛的脱靶效应。CRISPR/Cas9 作为一种强大的基因组编辑工具，可以对基因进行完全敲除，为高通量筛选带来了革命性技术。在此基础上构建靶向全基因组范围的CRISPR/Cas9敲除文库，可实现全基因组范围的高通量筛选，能够快速产生功能缺失的突变体并且筛选所期望的表型，进而找出候选基因。与 RNAi技术相比，CRISPR/Cas9敲除文库具有相对较低的脱靶效率和更广泛的作用位点，因而逐渐成为功能性基因筛选的热点方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乐伐替尼耐药基因NF1、其筛选方法及应用。
一种乐伐替尼耐药基因NF1，该基因的序列为SEQ ID NO：1。
乐伐替尼耐药基因NF1的筛选方法为使用HuH7细胞株作为目的细胞，利用CRISPR-Cas9 的高通量功能性筛选技术进行乐伐替尼耐药的差异靶基因筛选，包括以下步骤：
步骤一：进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度；
步骤二：进行感染Cas9文库实验，得到稳定株；
步骤三：稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况；
步骤四：筛选乐伐替尼耐药基因；
步骤五：有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。
进一步地，预实验包括：细胞感染预实验、低MOI感染预实验-荧光、低MOI感染预实验-抗性、乐伐替尼药物浓度预实验。
具体地，细胞感染预实验包括：用包装好的GFP慢病毒感染目的细胞，观察不同MOI值下的感染效率，以确定sgRNA文库的最佳MOI；
低MOI感染预实验-荧光包括：以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3，0.5，1和2稀释带有GFP的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h。感染6h后，将细胞传出到6cm皿中，感染48h后，收细胞进行流式检测；
低MOI感染预实验-抗性包括：以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3，0.5，1和2稀释Cas9sgRNA文库的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h；感染6h后，将细胞传出到6cm皿中；感染48h后，使用Puro筛选细胞48h，计数；
乐伐替尼药物浓度预实验包括：将细胞接种到96孔板种，每孔细胞量为5W，接种细胞后第二天，加入浓度为10mM的乐伐替尼母液，根据细胞数量随药物浓度加入量的变化指标，选择细胞变化量最小的浓度作为下一步实验所使用的乐伐替尼浓度。
进一步地，感染Cas9文库实验包括：
1)用包装好的lentiCas9-Blast慢病毒感染HuH7细胞，使用杀稻瘟菌素并得到HuH7-Cas9 稳定株；
2)扩增HuH7-Cas9稳定株细胞，再感染sgRNA文库慢病毒；
进一步地，稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况包括：使用乐伐替尼处理上游嘌呤霉素筛选7天后的细胞；将上游细胞等分为两份，一份为0天对照组，另一份为乐伐替尼组；0天对照组收样，冻存在-80℃；乐伐替尼组持续加药筛选，共筛选21天，期间正常换液或传代，21天后，乐伐替尼抗性细胞得到富集，收样提取DNA；使用特异性引物扩增目的产物并回收，检测PCR效果，进行二代测序，对以上每个样本中的每一种sgRNAreads富集数进行统计，统计各样本中不同sgRNA对应的基因上富集到的reads数，对不同样本的比较组合的sgRNA富集的reads进行聚类分析，根据sgRNA 富集的reads支持数差异筛选出候选基因后，富集分析研究候选基因在GeneOntology中的分布状况以阐明实验中样本候选在基因功能上的体现。
进一步地，筛选乐伐替尼耐药基因包括：
1)sgRNA载体构建：首先合成gRNA序列的单链DNAoligo，然后退火配对产生双链DNAoligo，再通过其两端所含酶切位点将其直接连入酶切后的CRISPR/Cas9载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的CRISPR/Cas9载体；
2)慢病毒包装：用构建的慢病毒载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度；
3)稳转株构建：第一天，培养Huh7-Cas9细胞至对数生长期，悬浮细胞直接收样；计算所需sgRNA慢病毒颗粒数，吸取病毒液加入细胞中，将管中混合溶液吸出加入对应的孔板中，补充培养基至半量体系；离心感染后细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养；第二天，感染16h后，观察细胞状态；若状态明显变差，则及时吸出含慢病毒颗粒的培养液，更换为全量新鲜培养基；若状态正常，则补液至全量培养基即可，第三天再更换为全量新鲜培养基；第四天，继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常；第五天，选择合适的真核抗性筛选细胞，药筛两轮，一轮2-3天左右，细胞基本稳定；
将以上细胞株分成NC(-)、乐伐替尼、sgRNA+乐伐替尼三组，对候选基因进行CCK8和克隆形成实验，通过绘制吸光度OD值变化曲线和计算克隆形成率，进行结果分析，确定候选靶基因。
进一步地，有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证包括：
1)建立细胞模型：Huh7、PLC/PRF/5细胞株，并分组处理；
a)对照组(无处理)；
b)有效靶基因过表达组；
c)有效靶基因sgRNA沉默组；
d)乐伐替尼处理组；
e)有效靶基因过表达+乐伐替尼处理组；
f)有效靶基因sgRNA+乐伐替尼处理组；
2)分别将以上分组的细胞进行CCK8、克隆形成实验检测增殖，以及进行Tanswell实验检测迁移和侵袭、通过流式检测细胞周期和凋亡，得到乐伐替尼耐药基因靶点。
一种乐伐替尼耐药基因NF1的用途：将乐伐替尼耐药基因NF1作为抗乐伐替尼耐药药物的设计靶点。
综上，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明通过CRISPR/Cas9全基因文库筛选得到乐伐替尼的耐药基因，为今后减少乐伐替尼耐药性提供了理论依据，对指导临床用药有着重要意义。
本发明，筛选得到乐伐替尼的耐药基因，可为乐伐替尼的临床应用提供了新的耐药靶点，为临床合理用药提供指导。
附图说明
图1是本发明筛选乐伐替尼耐药基因的流程图。
图2是本发明实施例中细胞感染预实验结果图。
图3是本发明实施例中低MOI感染预实验荧光结果图。
图4是本发明实施例中乐伐替尼药物浓度预实验结果图。
图5是本发明实施例中测序细胞处理流程图。
图6是本发明实施例中sgRNA富集的热图。
图7是本发明实施例中差异sgRNA散点富集图。
图8是本发明实施例中差异基因GO富集柱状图。
图9是本发明实施例中差异基因BP富集柱状图。
图10是本发明实施例中差异基因CC富集柱状图。
图11是本发明实施例中差异基因MF富集柱状图。
图12是本发明实施例中靶基因验证的克隆形成实验的结果图。
图13是本发明实施例中靶基因验证的CCK8实验结果图。
图14是本发明实施例中Huh7细胞中NF1功能的初步验证的Western Blot检测Huh7细胞中NF1的表达量.S1:gRNA NC；S2：Cas9-H_NF1 gRNA的结果图。
图15是本发明实施例中Huh7细胞中NF1功能的初步验证的CCK8实验的结果图。
图16是本发明实施例中Huh7细胞中NF1功能的初步验证的细胞生长计数的数据图。
图17是本发明实施例中Huh7细胞中NF1功能的初步验证的克隆形成实验的结果图。
图18是本发明实施例中Huh7细胞中NF1功能的初步验证的Transwell迁移和侵袭实验的结果图。
图19是本发明实施例中Huh7细胞中NF1功能的初步验证的细胞周期实验的结果图。
图20是本发明实施例中Huh7细胞中NF1功能的初步验证的凋亡实验的结果图。
图21是本发明实施例中的NF1与AKT、ERK磷酸化水平的结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例的乐伐替尼耐药基因为NF1，该基因的序列为SEQ ID NO：1。
请参阅图1至图21，本发明的乐伐替尼耐药基因NF1的筛选方法包括：
使用HuH7细胞株作为目的细胞，利用CRISPR-Cas9的高通量功能性筛选技术进行乐伐替尼耐药的差异靶基因筛选，步骤如下：
步骤一：请参阅图1至图4，进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度：
进行细胞感染预实验：用包装好的GFP慢病毒感染目的细胞，观察不同MOI值下的感染效率，以确定sgRNA文库的最佳MOI，如图2所示，结果表明MOI＝50，感染效率约为90％，因此选取MOI＝50作为最佳MOI。
进行低MOI感染预实验-荧光：Cas9文库中的sgRNA需要以极低的MOI感染细胞，以保证每个细胞只被1个慢病毒感染。以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3， 0.5，1和2稀释带有GFP的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h。感染6h后，将细胞传出到6cm皿中，感染48h后，收细胞进行流式检测，结果如图3所示。
进行低MOI感染预实验-抗性：Cas9文库中的sgRNA需要以极低的MOI感染细胞，以保证每个细胞只被1个慢病毒感染。以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3， 0.5，1和2稀释Cas9sgRNA文库的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h。感染6h后，将细胞传出到6cm皿中。感染48h后，使用Puro筛选细胞48h，计数。实验结果如表1所示。
表1：低MOI感染预实验-抗性表
| moi | 0(无嘌呤霉素) | 0.3 | 0.5 | 1 | 2 |
| 计数(万/ml) | 415 | 110.5 | 180.75 | 213 | 264 |
| 细胞存活率 | 100.00％ | 26.63％ | 43.55％ | 51.33％ | 63.61％ |
综合低MOI感染预实验-荧光和低MOI感染预实验-抗性的实验结果，sgRNA文库病毒使用0.5的MOI感染Huh7细胞。
进行乐伐替尼药物浓度预实验包括：将细胞接种到96孔板种，每孔细胞量为5W，接种细胞后第二天，加入浓度为10mM的乐伐替尼母液。加样方法如表2所示。
表2：乐伐替尼药物浓度加样方法表
请参阅图4，乐伐替尼药物浓度为1000nM，细胞数量变化最小，故使用1000nM进行正式实验。
通过上述预实验，我们初步确定了sgRNA文库病毒使用0.5的MOI感染Huh7细胞，使用乐伐替尼1000nM进行以下正式实验。
步骤二：请参阅图5，感染Cas9文库实验：
1)用包装好的lentiCas9-Blast慢病毒感染HuH7细胞，使用杀稻瘟菌素并得到HuH7-Cas9 稳定株，使用qPCR验证Cas9感染效果；
2)通过倒置荧光显微镜观察荧光及流式检测估计慢病毒感染目的细胞的效率，抗性实验使用嘌呤霉素筛选细胞48h后计数，最终获得sgRNA文库最佳MOI，按每个sgRNA感染400个细胞，共需要感染5E7的细胞量，正式实验选择1.8E8的细胞量，感染效率在40-50％之间，有效感染数为7.2E7-9E7个细胞；扩增HuH7-Cas9稳定株细胞，再感染sgRNA文库慢病毒；
步骤三：请参阅图5至图11，稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况：
使用1000nM的乐伐替尼处理上游嘌呤霉素筛选7天后的细胞；将上游细胞等分为两份，一份为0天对照组，另一份为乐伐替尼组；0天对照组收样，冻存在-80℃；乐伐替尼组持续加药筛选，共筛选21天，期间正常换液或传代，21天后，乐伐替尼抗性细胞得到富集，收样提取DNA；选取特异性引物，引物序列如下：
Primer-F:5’-AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3’
Primer-R:5’-CTTTAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCC-3’
使用该特异性引物扩增目的产物并回收，检测PCR效果，进行二代测序，对以上每个样本中的每一种sgRNAreads富集数进行统计，统计各样本中不同sgRNA对应的基因上富集到的reads数，对不同样本的比较组合的sgRNA富集的reads进行聚类分析，根据sgRNA富集的reads支持数差异筛选出候选基因后，富集分析研究候选基因在GeneOntology中的分布状况以阐明实验中样本候选在基因功能上的体现。
乐伐替尼抗性细胞富集后收样提DNA。运用Illumina平台进行测序。结果表明，与不加药的对照组相比表达差异超过2倍的有1261个基因，超过6倍的有48个。差异基因GO分析及其中生物过程(BP)表明在基因功能上主要现为genesilencing。
步骤四：请参阅图12至图13，筛选乐伐替尼耐药基因：
选取步骤三中表达差异超过6倍的sgRNA，进行靶基因筛选：
1)sgRNA载体构建：首先合成gRNA序列的单链DNAoligo，然后退火配对产生双链DNAoligo，再通过其两端所含酶切位点将其直接连入酶切后的CRISPR/Cas9载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的CRISPR/Cas9载体；
2)慢病毒包装：用构建的慢病毒载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度；
3)稳转株构建：第一天，培养Huh7-Cas9细胞至对数生长期，悬浮细胞直接收样。计算所需sgRNA慢病毒颗粒数，吸取病毒液加入细胞中，将管中混合溶液吸出加入对应的孔板中，补充培养基至半量体系。离心感染后细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养。第二天，感染16h后，观察细胞状态；若状态明显变差，则及时吸出含慢病毒颗粒的培养液，更换为全量新鲜培养基；若状态正常，则补液至全量培养基即可，第三天再更换为全量新鲜培养基；第四天，继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常；第五天，选择合适的真核抗性筛选细胞，药筛两轮，一轮2-3天左右，细胞基本稳定。
将以上细胞株分成NC(-)、乐伐替尼、sgRNA+乐伐替尼三组，对候选基因进行CCK8和克隆形成实验，通过绘制吸光度OD值变化曲线和计算克隆形成率，进行结果分析。
在表达差异的基因中，有48个基因表达差异超过6倍，我们通过以上功能分析和文献阅读，挑选了其中的18个潜在基因进行了靶基因验证，如表3所示。通过克隆形成和CCK8实验发现，感染NF1sgRNA后，细胞生长状况与对照组相比，在两个实验中均有明显差别。据此确定NF1为候选靶基因。
表3：选择验证的基因列表(部分sgRNA靶向两个基因)
| NO. | TargetSeq |
| NC | ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA |
| H_ARHGAP28 | AATGTTCAGAAAACCAGATT |
| H_BBS7 | TTGTGTAGCTCTGTGTCTTG |
| H_BBS7 | AAGACACAGAGCTACACAAA |
| H_C20orf195 | CAACTCATACTGCTCCGATG |
| H_CHMP4C | AAACAGCTCACTCAGATTGA |
| H_CRYAB | TTTCTAGATGCGCCTGGAGA |
| H_CRYAB | GTGGTGGATGGCGATGTCCA |
| H_DUSP9 | TCTCAACGATGCCTATGACC |
| H_DUSP9 | GTGTGGCACCCTCCGAATCC |
| H_MAMLD1 | ATCTTCTTCCTCCATCCACG |
| H_NF1 | GTTGTGCTCAGTACTGACTT |
| H_NF1 | AGTCAGTACTGAGCACAACA |
| H_OR51V1 | CTTCTCCTCAATCTATGCCA |
| H_OR51V1 | TAGTTACTATGCCCTGATGC |
| H_ORC3 | TTTCTGCAAAAATCACATTC |
| H_PLAT | CTCCTCTTCTGAATCGGGCA |
| H_RTDR1 | CAACCAGAACATCCGCAGCA |
| H_SSH1 | ATTTAAGCCTGTGTCTGTCC |
| H_USP26 | TCATGCATCATGAACGCCAC |
步骤五：请参阅图14至图20，有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证：
1)建立细胞模型：Huh7、PLC/PRF/5细胞株，并分组处理；
a)对照组(无处理)；
b)NF1过表达组；
c)NF1 sgRNA沉默组；
d)乐伐替尼处理组；
e)NF1过表达+乐伐替尼处理组；
f)NF1sgRNA+乐伐替尼处理组；
2)分别将以上分组的细胞进行CCK8、克隆形成实验检测增殖，以及进行Tanswell实验检测迁移和侵袭、通过流式检测细胞周期和凋亡，结果表明，NF1sgRNA可将NF1敲除；NF1 敲除后的细胞能逆转乐伐替尼对癌细胞的抑制作用，但对细胞凋亡没有影响。
一种乐伐替尼耐药基因NF1作为抗乐伐替尼耐药药物设计靶点的用途：
特异生物标志物和治疗靶点，具有重要科学意义和潜在临床应用价值。
乐伐替尼可抑制癌症进展相关的RTKs，阻断促进细胞分裂的PI3K/AKT/mTOR和RAS/Raf/MAPK信号通路发挥抑癌作用，AKT、ERK是RAS/Raf/MAPK信号通路关键标志物，检测敲低NF1后AKT、ERK的磷酸化水平，请参阅图21，结果表明，乐伐替尼可抑制AKT、 ERK磷酸化，而NF1敲低可以使AKT、ERK磷酸化重新激活。
据上，课题组前期工作表明，NF1敲除通过激活AKT磷酸化逆转乐伐替尼对癌细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用，导致乐伐替尼耐药，由此，NF1能够作为抗乐伐替尼耐药药物设计靶点使用。
本发明通过CRISPR/Cas9全基因文库筛选得到乐伐替尼的耐药基因，为今后减少乐伐替尼耐药性提供了理论依据，对指导临床用药有着重要意义。
本发明，筛选得到乐伐替尼的耐药基因，可为乐伐替尼的临床应用提供了新的耐药靶点，为临床合理用药提供指导。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
序列表
<110> 柳州市柳铁中心医院
<120> 一种乐伐替尼耐药基因NF1、其筛选方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12372
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
acttccggtg gggtgtcatg gcggcgtctc ggactgtgat ggctgtgggg agacggcgct 60
agtggggaga gcgaccaaga ggccccctcc cctccccggg tccccttccc ctatccccct 120
ccccccagcc tccttgccaa cgcccccttt ccctctcccc ctcccgctcg gcgctgaccc 180
cccatcccca cccccgtggg aacactggga gcctgcactc cacagaccct ctccttgcct 240
cttccctcac ctcagcctcc gctccccgcc ctcttcccgg cccagggcgc cggcccaccc 300
ttccctccgc cgccccccgg ccgcggggag gacatggccg cgcacaggcc ggtggaatgg 360
gtccaggccg tggtcagccg cttcgacgag cagcttccaa taaaaacagg acagcagaac 420
acacatacca aagtcagtac tgagcacaac aaggaatgtc taatcaatat ttccaaatac 480
aagttttctt tggttataag cggcctcact actattttaa agaatgttaa caatatgaga 540
atatttggag aagctgctga aaaaaattta tatctctctc agttgattat attggataca 600
ctggaaaaat gtcttgctgg gcaaccaaag gacacaatga gattagatga aacgatgctg 660
gtcaaacagt tgctgccaga aatctgccat tttcttcaca cctgtcgtga aggaaaccag 720
catgcagctg aacttcggaa ttctgcctct ggggttttat tttctctcag ctgcaacaac 780
ttcaatgcag tctttagtcg catttctacc aggttacagg aattaactgt ttgttcagaa 840
gacaatgttg atgttcatga tatagaattg ttacagtata tcaatgtgga ttgtgcaaaa 900
ttaaaacgac tcctgaagga aacagcattt aaatttaaag ccctaaagaa ggttgcgcag 960
ttagcagtta taaatagcct ggaaaaggca ttttggaact gggtagaaaa ttatccagat 1020
gaatttacaa aactgtacca gatcccacag actgatatgg ctgaatgtgc agaaaagcta 1080
tttgacttgg tggatggttt tgctgaaagc accaaacgta aagcagcagt ttggccacta 1140
caaatcattc tccttatctt gtgtccagaa ataatccagg atatatccaa agacgtggtt 1200
gatgaaaaca acatgaataa gaagttattt ctggacagtc tacgaaaagc tcttgctggc 1260
catggaggaa gtaggcagct gacagaaagt gctgcaattg cctgtgtcaa actgtgtaaa 1320
gcaagtactt acatcaattg ggaagataac tctgtcattt tcctacttgt tcagtccatg 1380
gtggttgatc ttaagaacct gctttttaat ccaagtaagc cattctcaag aggcagtcag 1440
cctgcagatg tggatctaat gattgactgc cttgtttctt gctttcgtat aagccctcac 1500
aacaaccaac actttaagat ctgcctggct cagaattcac cttctacatt tcactatgtg 1560
ctggtaaatt cactccatcg aatcatcacc aattccgcat tggattggtg gcctaagatt 1620
gatgctgtgt attgtcactc ggttgaactt cgaaatatgt ttggtgaaac acttcataaa 1680
gcagtgcaag gttgtggagc acacccagca atacgaatgg caccgagtct tacatttaaa 1740
gaaaaagtaa caagccttaa atttaaagaa aaacctacag acctggagac aagaagctat 1800
aagtatcttc tcttgtccat ggtgaaacta attcatgcag atccaaagct cttgctttgt 1860
aatccaagaa aacaggggcc cgaaacccaa ggcagtacag cagaattaat tacagggctc 1920
gtccaactgg tccctcagtc acacatgcca gagattgctc aggaagcaat ggaggctctg 1980
ctggttcttc atcagttaga tagcattgat ttgtggaatc ctgatgctcc tgtagaaaca 2040
ttttgggaga ttagctcaca aatgcttttt tacatctgca agaaattaac tagtcatcaa 2100
atgcttagta gcacagaaat tctcaagtgg ttgcgggaaa tattgatctg caggaataaa 2160
tttcttctta aaaataagca ggcagataga agttcctgtc actttctcct tttttacggg 2220
gtaggatgtg atattccttc tagtggaaat accagtcaaa tgtccatgga tcatgaagaa 2280
ttactacgta ctcctggagc ctctctccgg aagggaaaag ggaactcctc tatggatagt 2340
gcagcaggat gcagcggaac ccccccgatt tgccgacaag cccagaccaa actagaagtg 2400
gccctgtaca tgtttctgtg gaaccctgac actgaagctg ttctggttgc catgtcctgt 2460
ttccgccacc tctgtgagga agcagatatc cggtgtgggg tggatgaagt gtcagtgcat 2520
aacctcttgc ccaactataa cacattcatg gagtttgcct ctgtcagcaa tatgatgtca 2580
acaggaagag cagcacttca gaaaagagtg atggcactgc tgaggcgcat tgagcatccc 2640
actgcaggaa acactgaggc ttgggaagat acacatgcaa aatgggaaca agcaacaaag 2700
ctaatcctta actatccaaa agccaaaatg gaagatggcc aggctgctga aagccttcac 2760
aagaccattg ttaagaggcg aatgtcccat gtgagtggag gaggatccat agatttgtct 2820
gacacagact ccctacagga atggatcaac atgactggct tcctttgtgc ccttggggga 2880
gtgtgcctcc agcagagaag caattctggc ctggcaacct atagcccacc catgggtcca 2940
gtcagtgaac gtaagggttc tatgatttca gtgatgtctt cagagggaaa cgcagataca 3000
cctgtcagca aatttatgga tcggctgttg tccttaatgg tgtgtaacca tgagaaagtg 3060
ggacttcaaa tacggaccaa tgttaaggat ctggtgggtc tagaattgag tcctgctctg 3120
tatccaatgc tatttaacaa attgaagaat accatcagca agttttttga ctcccaagga 3180
caggttttat tgactgatac caatactcaa tttgtagaac aaaccatagc tataatgaag 3240
aacttgctag ataatcatac tgaaggcagc tctgaacatc tagggcaagc tagcattgaa 3300
acaatgatgt taaatctggt caggtatgtt cgtgtgcttg ggaatatggt ccatgcaatt 3360
caaataaaaa cgaaactgtg tcaattagtt gaagtaatga tggcaaggag agatgacctc 3420
tcattttgcc aagagatgaa atttaggaat aagatggtag aatacctgac agactgggtt 3480
atgggaacat caaaccaagc agcagatgat gatgtaaaat gtcttacaag agatttggac 3540
caggcaagca tggaagcagt agtttcactt ctagctggtc tccctctgca gcctgaagaa 3600
ggagatggtg tggaattgat ggaagccaaa tcacagttat ttcttaaata cttcacatta 3660
tttatgaacc ttttgaatga ctgcagtgaa gttgaagatg aaagtgcgca aacaggtggc 3720
aggaaacgtg gcatgtctcg gaggctggca tcactgaggc actgtacggt ccttgcaatg 3780
tcaaacttac tcaatgccaa cgtagacagt ggtctcatgc actccatagg cttaggttac 3840
cacaaggatc tccagacaag agctacattt atggaagttc tgacaaaaat ccttcaacaa 3900
ggcacagaat ttgacacact tgcagaaaca gtattggctg atcggtttga gagattggtg 3960
gaactggtca caatgatggg tgatcaagga gaactcccta tagcgatggc tctggccaat 4020
gtggttcctt gttctcagtg ggatgaacta gctcgagttc tggttactct gtttgattct 4080
cggcatttac tctaccaact gctctggaac atgttttcta aagaagtaga attggcagac 4140
tccatgcaga ctctcttccg aggcaacagc ttggccagta aaataatgac attctgtttc 4200
aaggtatatg gtgctaccta tctacaaaaa ctcctggatc ctttattacg aattgtgatc 4260
acatcctctg attggcaaca tgttagcttt gaagtggatc ctaccaggtt agaaccatca 4320
gagagccttg aggaaaacca gcggaacctc cttcagatga ctgaaaagtt cttccatgcc 4380
atcatcagtt cctcctcaga attcccccct caacttcgaa gtgtgtgcca ctgtttatac 4440
caggcaactt gccactccct actgaataaa gctacagtaa aagaaaaaaa ggaaaacaaa 4500
aaatcagtgg ttagccagcg tttccctcag aacagcatcg gtgcagtagg aagtgccatg 4560
ttcctcagat ttatcaatcc tgccattgtc tcaccgtatg aagcagggat tttagataaa 4620
aagccaccac ctagaatcga aaggggcttg aagttaatgt caaagatact tcagagtatt 4680
gccaatcatg ttctcttcac aaaagaagaa catatgcggc ctttcaatga ttttgtgaaa 4740
agcaactttg atgcagcacg caggtttttc cttgatatag catctgattg tcctacaagt 4800
gatgcagtaa atcatagtct ttccttcata agtgacggca atgtgcttgc tttacatcgt 4860
ctactctgga acaatcagga gaaaattggg cagtatcttt ccagcaacag ggatcataaa 4920
gctgttggaa gacgaccttt tgataagatg gcaacacttc ttgcatacct gggtcctcca 4980
gagcacaaac ctgtggcaga tacacactgg tccagcctta accttaccag ttcaaagttt 5040
gaggaattta tgactaggca tcaggtacat gaaaaagaag aattcaaggc tttgaaaacg 5100
ttaagtattt tctaccaagc tgggacttcc aaagctggga atcctatttt ttattatgtt 5160
gcacggaggt tcaaaactgg tcaaatcaat ggtgatttgc tgatatacca tgtcttactg 5220
actttaaagc catattatgc aaagccatat gaaattgtag tggaccttac ccataccggg 5280
cctagcaatc gctttaaaac agactttctc tctaagtggt ttgttgtttt tcctggcttt 5340
gcttacgaca acgtctccgc agtctatatc tataactgta actcctgggt cagggagtac 5400
accaagtatc atgagcggct gctgactggc ctcaaaggta gcaaaaggct tgttttcata 5460
gactgtcctg ggaaactggc tgagcacata gagcatgaac aacagaaact acctgctgcc 5520
accttggctt tagaagagga cctgaaggta ttccacaatg ctctcaagct agctcacaaa 5580
gacaccaaag tttctattaa agttggttct actgctgtcc aagtaacttc agcagagcga 5640
acaaaagtcc tagggcaatc agtctttcta aatgacattt attatgcttc ggaaattgaa 5700
gaaatctgcc tagtagatga gaaccagttc accttaacca ttgcaaacca gggcacgccg 5760
ctcaccttca tgcaccagga gtgtgaagcc attgtccagt ctatcattca tatccggacc 5820
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Claims (1)
1.一种乐伐替尼耐药基因NF1的用途，其特征在于：将乐伐替尼耐药基因NF1作为抗乐伐替尼耐药药物的设计靶点，该基因NF1的序列为SEQ ID NO：1。
Priority Applications (1)
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