CN115011680A

CN115011680A - 一种探针组合物、检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN115011680A
Application number: CN202110240091.6A
Authority: CN
Inventors: 戴朴; 潘世让; 高搏; 黄莎莎; 袁永一; 王洋; 梁羽; 汪德鹏
Original assignee: Grandomics Biosciences Co ltd; 6th Medical Center of PLA General Hospital
Current assignee: Grandomics Biosciences Co ltd; 6th Medical Center of PLA General Hospital
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2022-09-06

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种探针组合物、检测试剂盒及检测方法。所述探针组合物包括若干条探针；基于GJB2、SLC26A4和12SrRNA基因全长序列进行设计，每间隔500bp～2Kb设计一条探针，所述探针的碱基个数为50～130bp。还公开了一种包括上述探针组合物的耳聋基因检测试剂盒及利用上述探针进行耳聋基因的检测方法。该试剂盒能够一次性检测GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因各种突变信息，具有全面、快速、准确、价格适中等优点。所述三代靶向耳聋基因捕获测序的方法可以检测出常规方法难以检测出的结构变异，具有显著的临床应用价值。

Description

一种探针组合物、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种探针组合物、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

耳聋是常见的致残原因之一，严重影响患者的生活质量。2006年第二次全国残疾人抽样调查显示：中国目前听力障碍人群占残疾人总数的1/3，并以每年3万聋儿的速度在增长。在耳聋人群中40％是由环境因素造成的，60％与遗传因素有关，其中70％的遗传性耳聋患者除耳聋外不伴有其他症状，这类耳聋为非综合征型耳聋(non-syndromic hearingloss，NSHL)，另外30％为伴其他症状的综合征型耳聋。耳聋的基因检测可以帮助患者明确病因，进行有针对性的治疗。

国内大规模耳聋分子流行病学研究表明，GJB2基因、SLC26A4基因、12SrRNA(MT-RNR1)基因为常见的NSHL致病基因。其中，GJB2是第一高发的致聋基因，21.01％的聋人携带GJB2基因突变；大前庭导水管综合征的责任基因SLC26A4是第二高发的致聋基因，其突变检出率达12.7％；4.51％聋人携带线粒体12S rRNA基因突变，他们为药物性耳聋群体的主体。我们可以为中国约40％聋人进行以上基因的诊断。

GJB2基因编码连接蛋白Cx26(Connexin26)，GJB2基因突变后，受Cx26蛋白调控的内淋巴液钾离子(K+)循环紊乱，导致感音神经性聋。常染色体隐性遗传性聋中约有40％-50％与GJB2(gap juntion beta2)基因突变有关。其中，c.235delC是最多见的突变。虽然GJB2基因突变造成的听力损失程度多为重度或极重度，但听觉系统的结构基本正常，常提示人工耳蜗植入效果良好。

SLC26A4基因编码溶脂蛋白(Pendrin)，其转运功能可以在细胞内外实现Cl^-/I^-或C1^-/HCO₃ ^-离子互换，突变的SLC26A4基因编码异常的Pendrin蛋白，使其失去正常的离子转运功能，致使内淋巴液离子环境失衡，进而导致耳聋。通过基因筛查可以在轻-中度耳聋中筛选出听力较好的患儿，对其正确指导，避免跌倒、撞击等外界因素，有望保存残余听力，使患者适应正常教育环境和社会。有残余听力的病人可佩戴助听器，听力损失达到重度或极重度应考虑植入人工耳蜗。

线粒体12SrRNA基因与20％-30％的药物性耳聋相关，中国人最常见的突变位点包括A1555G、C1494T等。由这两种突变形成的U-A或G-C碱基配对使线粒体DNA更加容易与氨基糖甙类药物结合，抑制线粒体的氧化磷酸化过程造成耳毒性，使携带者听力下降或是原有听力下降程度更加严重。通过耳聋基因筛查可以早期发现药物性聋高危人群，终生避免使用氨基糖苷类药物及其他耳毒性药物，可防止耳聋的悲剧发生。

现有耳聋基因诊断的方法可以分为：荧光PCR法、ARMS-PCR法、Sanger测序法及NGS测序法等，总的来说，现有的各种检测方法都不尽理想。荧光PCR法、ARMS-PCR法突出表现为检测位点少。Sanger测序通量低、操作繁琐，一个测序反应仅可以检测600～800bp，为实现耳聋基因全长测序，需要开展很多个测序反应，大大增加了检测周期和患者的负担。NGS测序可以检测点突变、20bp以内的插入缺失及微小重复，但是对于长片段重复、倒位等结构变异检测效果不佳。故此，本领域迫切需要建立一种快速、准确且能够全面检测耳聋基因突变类型的方法，以满足科研需要和临床需求。

发明内容

本发明公开了一种快速、准确且能够全面检测耳聋基因突变类型的方法，解决了现有的检测方法中检测位点不全面、操作繁琐、检测周期长等缺点。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种用于耳聋基因检测的探针组合物。所述探针组合物是基于GJB2、SLC26A4和12SrRNA全长序列设计的若干条探针；所述探针平均间隔500bp至2Kb。优选的，每间隔1Kb设计一条探针。其优势在于，探针间隔与三代测序长读长相匹配，比如Pacbio公司的sequel或Oxford Nanopore公司的PromethION测序长度可达几十Kb，待测样本中的基因组DNA在一种优选方案中被打断成平均长度5Kb的DNA片段，每间隔1Kb设计一条探针，平均每个DNA片段可以结合5个探针，在保证捕获均一性的前提下，实现对目的片段使用最少探针的高效捕获。

优选的，所述探针的GC含量值适中，无发夹结构，并进一步与NCBI等数据库进行Blast比对，并确保探针避开基因组上的重复区域，通过这些参数以确保探针的特异性。

更优选地，设计好的探针的碱基个数为120bp。

上述GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因参考序列为人类参考基因组版本Hg19。

优选的，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：91所示。

优选的，采用生物素标记探针组合物。

本发明第二个方面公开了一种耳聋基因检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的探针组合物。

优选的，所述耳聋基因检测试剂盒还包括固相载体。

更优选的，所述固相载体为磁珠。

在一些较佳实施方案中，采用生物素标记探针，采用链霉亲和素标记磁珠，利用链霉亲和素和生物素的高亲和力将捕获了目的基因片段的探针分离出来。

本发明第三个方面公开了一种耳聋基因的检测方法，包括以下步骤：

S1：提取待测样本基因组DNA，构建基因组文库；

S2：预扩增基因组文库；

S3：利用上述的探针组合物对基因组文库预扩增产物进行杂交捕获，得到捕获文库；

S4：预扩增捕获文库；

S5：对捕获文库预扩增产物进行三代测序；

S6：分析测序结果，获得样本GJB2、SLC26A4和12SrRNA的突变情况。

应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3和S4之间、步骤S4和S5之间、步骤S5和S6之间步骤S6之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。

优选的，所述S1包括：

S11：将提取的待测样本基因组DNA打断成平均长度2-10Kb的DNA片段；优选打断成平均长度5Kb的DNA片段；

S12：对DNA片段进行末端修复、加A；连接接头，获得基因组文库。

应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S11之前、步骤S11和S12之间、步骤S12之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。

在一些较佳实施方案中，接头序列由A序列和B序列组合成，其中A序列为：

5'-pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTNNNNNNNNNNACCCACGTCCGCCATACTTG-3'；

B序列为：

5'-CTTGGAGAACACCCCAAAGGAGATNNNNNNNNNNNNNNNNAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/3SpC3/-3'；

上述序列中的p代表磷酸化修饰；N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种，不同的N用于识别不同样本构建的文库；/3SpC3/代表硫代磷酸键修饰。

进一步的，由上述接头A序列与B序列制备成接头溶液的具体操作为：

1)溶解引物粉末；

2)在PCR管中等体积混合接头A和接头B；

3)使用PCR程序：95℃，3分钟；1小时缓慢降温至25℃，0.05℃/s下降温度；即得到接头溶液。

优选的，所述S3包括，在杂交捕获前添加封闭试剂。

在一些较佳实施方案中，所述封闭试剂为Index A Block序列和Index B Block序列。加入封闭试剂的目的在于，分别封闭文库构建中用到的接头A序列和B序列，防止文库上的这两个接头序列和探针杂交。

封闭试剂如下：

Index A Block序列为：

5'-CAAGTATGGCGGACGTGGGTNNNNNNNNNNAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC–3'；

Index B Block序列为：

5'-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTNNNNNNNNNNNNNNNNATCTCCTTTGGGGTGTTCTCCAAG–3'；

上述序列中N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种，其中，Index A Block与接头A序列反向互补；Index B Block与接头B序列反向互补。

本发明第四个方面公开了如下应用：

(a)上述的探针组合物、上述的试剂盒或上述的检测方法在筛查耳聋基因中的应用；

(b)上述的探针组合物、上述的试剂盒或上述的检测方法在预防或辅助诊断耳聋疾病中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

所述用于耳聋基因检测的探针组合物、耳聋基因检测试剂盒、一种耳聋基因的检测方法具有以下优点：1.实现GJB2、SLC26A4、12SrRNA三个基因同时、高均一性、低探针数目的高效捕获；2.全面、准确检出已知突变，对外显子区和内含子区突变均能检出；3.可准确检出现有技术中难以检测的长片段缺失、重复、倒位、异位等结构变异；4.可检出未报道突变位点，为发现新的致病突变提供分子生物学依据；5.样本来源多样，适用于肌肉、血液和羊水等多种组织样本的检测；6.一次性检测GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因各种突变信息，具有全面、快速、准确、价格适中的优点，解决了GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因分子诊断的瓶颈。

因此，本发明还具有显著的临床应用价值。

本发明所述三代测序平台，以Pacific Biosciences和OxfordNanoporeTechnologies为代表，包括但不限于Pacific Biosciences的Sequel、Sequel II平台，Oxford Nanopore Technologies的MinION、PromethION、GridION平台。

本发明对所述探针组合物的生产厂商不做任何限制。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明采取的技术方案是：

一种基于三代靶向捕获测序的GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因检测试剂盒及方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本基因组DNA，构建基因组文库：提取待测样本中的基因组DNA，将其打断成2-10Kb，优选5Kb左右大小的片段；将打断后的双链DNA片段的两端进行末端修复后，再连接上接头序列；即可获得DNA文库；

2)预扩增基因组文库：采用靶向接头序列的引物，将上述DNA文库中带有接头的DNA片段进行第一次PCR扩增，获得预扩增的DNA文库；

3)得到捕获文库：将预扩增的DNA文库中的双链DNA片断变性后，利用检测探针SEQID NO：1～SEQ ID NO：91对靶序列进行杂交捕获得到捕获文库；

4)预扩增捕获文库：将上一步捕获的靶序列进行洗脱，将洗脱下来的靶序列进行第二次PCR扩增；

5)对捕获文库预扩增产物进行三代测序；

6)对三代测序数据进行生物信息学分析，获得与GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因相关的核酸分子序列，并进一步确定待测样本中GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因的具体突变情况。

实施例1制备GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因杂交捕获的探针

在保证捕获效率的前提下，为了实现最少探针数量以降低成本，对提取的待测样本基因组DNA片段化大小(2Kb、5Kb、8Kb)、捕获探针平均间隔距离(无间隔，间隔1、4、7、10、13、16、19个探针长度)进行了测试。以0.5×平均覆盖深度的序列所占百分比为指标，评价捕获的均一性，用于考察低覆盖深度带来的局限性。若90％以上的区域呈现超过0.5×的平均覆盖深度，则说明探针捕获的覆盖均一性较好。实验结果显示，在基因组DNA片段化5Kb，探针平均长度为120bp时，探针平均间隔以500bp至2Kb为优选方案，以探针平均间隔1Kb为最优选方案，其0.5×平均覆盖深度的序列占比超过90％。

针对GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因全长序列，每间隔1Kb设计一条探针。设计好的探针的碱基个数在50～130bp之间、GC含量值适中、无发夹结构，并进一步与NCBI等数据库进行Blast比对，并确保探针避开基因组上的重复区域，通过这些参数以确保探针的特异性。GJB2、SLC26A4、12SrRNA基因参考序列为人类参考基因组版本Hg19，设计得到的探针序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：91所示。

实施例2

本实施例公开了耳聋基因的检测方法，包括以下步骤：

1.样本基因组DNA提取及质量评估

1.1提取基因组DNA

取待检测样本外周血0.5～1mL，采用Blood Genomic DNA Mini Kit(北京康为世纪生物科技有限公司)对外周血进行基因组DNA提取。通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性，用Qubit(Life Technologies)对基因组进行浓度测定。选取基因组相对完整且浓度≥25ng/μl的DNA样本进行文库构建。

1.2基因组DNA片段化

使用Covaris E220非接触式超声破碎仪打断基因组DNA，参数设置如下：Duration600secPeak Incident Power 3瓦、Duty Factor 20％、Cycles per Burst1000。

使用0.6倍体积的AMPureXP磁珠进行纯化，制得片段化基因组DNA。

1.3末端修复、加A

使用NEB Next Ultra End Repair/dA-Tailing Module试剂盒。

体系如表1所示：

表1

反应条件如表2所示：

表2

1.4连接接头

使用NEB Next Ultra II Ligation Module试剂盒。

体系如表3所示：

表3

于PCR仪中，20℃反应15min。随后，使用0.6倍体积的AMPure XP磁珠进行纯化，获得文库溶液。

2.预扩增基因组文库

反应体系如表4所示：

表4

其中，Primer即为文库预扩增的引物，具体为：

Primer F：5'-CAAGTATGGCGGACGTGGGT-3'(SEQ ID NO：92)，

Primer-R：5'-CTTGGAGAACACCCCAAAGGA-3'(SEQ ID NO：93)。

反应条件如表5所示：

表5

使用0.6倍体积的AMPure XP磁珠回收PCR产物。

3.杂交捕获

3.1捕获准备

将需要进行捕获的样本等量混合，DNA总量为1μg。加入4μLIndex封闭试剂(IndexA Block和Index B Block)，其目的在于分别封闭文库构建中用到的接头A序列和B序列，防止文库上的这两个接头序列和探针杂交。其中，Index A Block与接头A序列反向互补；Index B Block与接头B序列反向互补。震荡混匀，然后，开盖60℃真空浓缩至蒸干。

3.2捕获

按照试剂盒xGen Lockdown Reagent Kit(IDT，货号：1072281)的使用说明配制杂交缓冲液，具体体系如表6所示：

表6

将上述杂交缓冲液加入蒸干的样本中，震荡混匀，短暂离心，于PCR仪上95℃，10min。

反应结束后，离心，将13μL样本全部转移至含有4μL捕获探针的PCR管中，用移液器吹吸混匀。于PCR仪上在65℃条件下反应16小时。

3.3杂交洗脱

按照试剂盒xGen Lockdown Reagent Kit(IDT，货号：1072281)的使用说明配制洗脱试剂，如表7所示：

表7

捕获磁珠处理：

a)吸取50μl M280磁珠至离心管中，将离心管置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

b)加入200μl 1×Bead Wash Buffer(vial 7)，混匀，离心，置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

c)重复步骤b一次。

d)加入100μl 1×Bead Wash Buffer(vial 7)，混匀，转移至PCR管中，置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

2.5.3磁珠和目标文库的结合：

a)将17μl杂交体系加入到有磁珠的PCR管中，上下缓慢吹吸混匀，于PCR仪上65℃孵育45min。

洗脱：

a)加入100μl 65℃1×Wash Buffer I(vial 1)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

b)加入200μl 65℃1×Stringent Wash Buffer(vial 4)，混匀转移到预热的大离心管中。置于温育仪上，65℃5min。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

c)加入200μl常温1×Wash Buffer I(vial 1)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

d)加入200μl常温1×Wash Buffer II(vial 2)，混匀1。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

e)加入200μl常温1×Wash Buffer III(vial 3)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清.

f)短暂离心，使用10μl吸头移去少量剩余液体。

g)使用25μl Nuclease-free Water悬浮磁珠于-20℃保存。

4.预扩增捕获交文库

上一步得到的M280磁珠探针混悬液，取25μL/文库按照下表在200ml PCR管中进行反应，PCR扩增体系配制如下表8所示：

表8

上表所述引物与上文文库预扩增的引物一致：

Primer F：5'-CAAGTATGGCGGACGTGGGT-3'(SEQ ID NO：92)，

Primer-R：5'-CTTGGAGAACACCCCAAAGGA-3'(SEQ ID NO：93)。

PCR反应程序如表9所示：

表9

反应结束后，使用0.6倍体积的AMPure XP磁珠进行纯化，最后使用TE溶液洗脱磁珠，转移至新的离心管内，进入下一步操作，或者放在-80℃中备用。

文库进行Qbuit检测及Agilent 2100Bioanalyzer检测，检测合格文库进行下一步三代测序文库构建。

5.三代测序文库构建及测序

5.1使用Pacbio sequal测序

将混好的文库进行修复，修复溶液配制如表10所示：

表10

混匀，离心，放入PCR热循环仪中，进行修复反应，具体条件如表11所示：

表11

使用0.45倍样本体积的AMPure XP磁珠进行纯化，最后使用双蒸水洗脱磁珠，-20℃冰箱保存。

使用如表12所示体系进行接头连接：

表12

混匀，离心，于PCR热循环仪中进行连接反应，具体条件如表13所示：

表13

使用0.45倍样本体积的PB磁珠进行纯化，最后使用双蒸水洗脱磁珠，-20℃冰箱保存。

按照Pacbio官方网页给出标准操作方式进行引物退火及Binding(结合)反应。

按照Pacbio sequal仪器标准操作规范进行测序。

5.2使用Oxford Nanopore PromethION测序

接头连接：加入NEB T4 DNA快速连接buffer、NEB T4 DNA快速连接酶和接头，混匀，20℃孵育20min。

进行DNA纯化：

a)将1×AMPureXP磁珠加入DNA中，室温孵育15min，室温磁力架吸附5min，吸弃上清；

b)加入80％乙醇，磁力架吸附，弃上清，重复一次，室温晾干；

c)添加Ultra Pure Water(超纯水)，37℃下吹打洗脱；

d)磁力架上静置5min，吸取上清，即为纯化后的DNA。

按照Oxford Nanopore PromethION官方网页给出标准操作方式进行引物退火及Loading(上样)反应。

按照Oxford Nanopore PromethION仪器标准操作规范进行测序。

6.生物信息学分析

6.1拆分各样本数据

若下机数据为多样本混测，根据各样本的标签序列拆分出每个样本的数据。

6.2数据过滤

根据各平台数据特点，生成高质量数据。ONT平台过滤掉质量值较低的数据。Pacbio平台采用官方软件生成高质量的一致性序列。

6.3数据评估

将高质量的数据比对到人类全基因组参考序列，采取唯一比对(即单条序列只能唯一比对到基因组的一个位置)。

统计目标区域的序列数，评估捕获效率、目标区域覆盖深度、覆盖完整性。

若数据不合格(合格的标准是：靶区域的测序覆盖度，要求30倍覆盖度不低于95％)，根据情况进行补测数据。

6.4变异检测

检测目标区域的单核苷酸位点变异、小片段插入与缺失、染色体结构变异(SNV/InDel、SV)等；并对变异进行各数据库的注释，以筛选致病性高的变异。

6.5变异的验证

将筛选出的高致病性变异进行一代sanger测序验证。

实施例3

共收集16个经临床表型观测，确诊为遗传性耳聋的家系，累计48份样本，16个家系依次编号为A至P，其中“-1”为患者样本，“-2”和“-3”为患者父本和母本样本。根据实施例2的方法进行了耳聋相关基因GJB2、SLC26A4、12SrRNA检测。检测结果如表14所示：

表14

为了保证检测结果的准确性，我们对上述48例样本用本方法检测同时进行NGS测序检测，检测结果显示，共有6例样本显示检测结果不一致。将与二代测序结果不一致的样本进行一代sanger测序验证验证，结果本方法与一代sanger测序结构全部吻合一致。特别的，在家系L中，本方法及二代测序结果均检出了连续外显子的缺失，但是在缺失的长度、缺失的位点出入较大，一代sanger测序验证结果与本方法检出结果一致。

检测结果表明本发明的用于耳聋基因检测的探针组合物、耳聋基因检测试剂盒、一种耳聋基因的检测方法可以同时对耳聋基因GJB2、SLC26A4、12SrRNA突变进行全面、准确、高效的检测。此外，本发明还可以准确检测出NGS测序检测不准确或无法检出的长片段缺失、重复、倒位等结构变异。同时，本发明对基因的全长检测可以不局限于已报道的突变位点，为发现新的致病突变提供分子生物学依据。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京希望组生物科技有限公司

中国人民解放军总医院第六医学中心

<120> 一种探针组合物、检测试剂盒及检测方法

<160> 93

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctattaaaac catattagat tttaaattat tatagagatt atattttaat gttttaaatg 60

tatttgatac attacaaaat tattttagtt acaagcatat cattaaagct attctttatt 120

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcactggtaa ctttgtccac tgttagagat taaaacttcc aaagcaaatg aaagaaccaa 60

tgttcacctt taacgtgggg aaagttggca aaaagaaccc caggaggaca cccaaacctt 120

<210> 3

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggaaaaga cgaatgcaca caacacagga atcactagct aggacagaac agggagactt 60

ctctgagtct gggtaagcaa gcatgcttaa atctcttcct gagcaaacac caactcttac 120

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttcttcttt ttcttaaaag catcctcctc tcctcatttt aggcaagttg catcccgttt 60

tctgatggac tccagaagca ggctcgtagt gaatgtcttt catgacccac agtcgctgcc 120

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctcagca gctgttagtt aggtgagcgc tgttcgggct gccttcctcc tccagtgggg 60

caggatcgag gcactgatgg aaccgtcctg aggacgcggg tctcagccgc acaccacctc 120

<210> 6

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacattgaga tctctctcct ttggaaaagg cagggcaaat gtgaaaaaaa aatcatactt 60

tcctgattta ttgtgactca aaatttccca aacctacttc ttatttttga aaagtagatg 120

<210> 7

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcatgaaat tgttcctgaa gacccccaaa agaaacaatt tcatgccccg aactctgttc 60

agagactttg ctgtgcctgt catgtccagc ttgccatatc ctgttttgta aagtagccac 120

<210> 8

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagacttt cacttttgac ttcgtatact cctgtattat ttaagtgaaa atgtatttat 60

atattctata attacaaaaa tcacattggt tgccttttca ttttgaaatg agcaaaagtg 120

<210> 9

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcattagcca tgtgcagaaa tggaacagcg tctcaccaag ttggggttgc ccctggaccc 60

tgtgaacact ggggcagctg gggtgttcct actgtgcttg ttaccggctt caggaatcaa 120

<210> 10

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccgagggct cggctgggtg ggaggccgct tccacaaggc tttttcttgc tccatacaaa 60

gtgcagactg atgctttgag atatagtcag gattatcatt ttcagagctc aagctctaat 120

<210> 11

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgagtaaca ttttgaaggt ccacttctgg gattcatcca ggagctaaac gggtcatgtc 60

cagccaactc agcattcacc aaggtacgtt tccagaccaa acaccacatt gtccatagac 120

<210> 12

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tctgtactcc gcatagtgcg agaggacttg gcatttatga gcgcttcttt aattttttat 60

tgttagagaa acaggcattc ctccaaggac tgaagatctg ttcgagtcgc ggaggctgcg 120

c 121

<210> 13

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atctggcctc agaatggatt tcccgtgatt gccaccatta ttagcattga cttttccttg 60

aaaaattggc gccccgtggc catgggccga cctaggcagt ttctgcaggg acgagcgtga 120

<210> 14

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaagctgaag cccaatcctg tgttcctcca ccccagccac ccagccccat ggtgaggaca 60

cagggagctt aggatagtac tgctgcgtgc agcatacacc tttgtctcat tgacgtgcag 120

<210> 15

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttattacagg gaacactatt tcactacaat ttctctctgt gtaattgaac cacaccctga 60

cttatgtttt ctgaaaattg ttaaagtcaa atcttttggg gaaaatctgt tgttccattc 120

<210> 16

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgtggtctta gaattcagaa ccgggagaat gtgttagcca ctcatctaag ctattcctta 60

aacgctttca gagccatctc cactgtgggg aaagaagttc tttgtgttct ctgacttagt 120

<210> 17

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcgccctgaa gatgcccaca ccgcccggcc cgggctccac tcccggggag gcctcgaggg 60

ttgcggatgg gactcttaag tggtcacgga tcaggtgggc agggggcagt acagctttct 120

<210> 18

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cctgcgtaga gagaagcgga gcggggcgtc cacgccttgg ggagggaagg gcgtccccag 60

cgggcgagag tggggtgcgg gcggcggagc ccctgggcgc cagctgcttc tcccagaggc 120

<210> 19

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tctttcatct gtaggtcact gaatttaaaa actaccaagt agcaaggtat aaggtataca 60

ttcctcatgc taagattttt gtaaaaacta gctccaggct tgtattgcca aaatatactc 120

<210> 20

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagcttctct attttcattg accacaattc aataagaaat gtgtaaagag tttcaagtca 60

agatttaaaa aaaaaaaaga aatgtgttac atcctgatat atacatatat atctaaagtt 120

<210> 21

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aatgccaagt attctacact gtgctctaag ggctgtgaca tggtgacacc ctgtgactcc 60

tgggggacag gaaccatgcc tcattcatgt ttgttcagca ggtgcctagc acagagacag 120

<210> 22

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ataagcagaa aaaaagagtg taccaggtaa aggtgcaaag gccctgaggc cagaaaactt 60

agcattttcc agggaggaag aggaagaatt gtagtgtgga tgagtgcagt gggggagggt 120

<210> 23

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agataagaga tgaagacaga gtgaagggag aatttgtttt tcttaatatg ggagatacta 60

gaacgtattt gtgaaccgat aggaatgacc tagtagaaag aaagagatct gtggtgcaag 120

<210> 24

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gctcaggtta ctgggaagcc aggaagttgc taaggatgat gggatctttg tgatttttgt 60

tattaaaaca aattcccatc agacagcaaa agatcgatgc aacccttgta gtgctatttt 120

<210> 25

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aatacatata aggaacatga aaaaatacct ccactacaaa ctagaagtct cctctgatcc 60

taccatacag ataacccatt gatatttcag taaatatctt actaggcaca taaatactta 120

<210> 26

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tggaggagtt ggtcaacttc atcagggtag agttgtcttg tctgctgctg agtataatta 60

tcatattttt tctttgggtc taacttttct tccccaccaa aaaaggagaa agggcagtgt 120

a 121

<210> 27

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

accgcaatta cttttgcacc aacctaatat atctgtgtta atgttgtcag ggaaatggga 60

tttcagtgtt ttgcctgctt tttctattca ctgatgttag gtaacttttt taatgaagtg 120

<210> 28

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttttgtctta caaaaagaga aagaaacttc atactccctt tgctgttttt ttaatcctaa 60

cttcgaccct gtgatattga tcaaggtact cagatccaca gagatcagga cattggacac 120

<210> 29

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atcatcaaag tcagagacag aaaaaagcac agaagaacat gtgtgattca attgaggatg 60

agagaaggga aatatacggg aatccataaa ggagaaaaag tgttctggtg agcggagaca 120

<210> 30

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

taatgaagta aaggctgctc tggaatgtaa cagacttgat ttctagcctc agctttgtct 60

ctaacaggta agtgaccctg gatacatcat gtagggtgct aattgaaagc tcagttttag 120

<210> 31

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cacaggtgga tcacttgatc ccatgagttc aagatcagct tgggcaacat gacaaaacct 60

tgtccctact aataatacaa aaataattag acatgcattg tggcacgcac ctgtagtccc 120

<210> 32

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccaccatgtc cagcccatat tttaaaatta aaattaaaat tttaagattt tattttggta 60

gagacagggg ttttgcaatg tcgcccaggc tggtcttgaa cccctggcct caagcagtca 120

<210> 33

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

taaatgcaga gtagtagagg attctcccag aaaagactgt aagattgttg taaaatactt 60

tacctggagt gttaacttat ctttgttcta aggttgcact ttggtttgtc ctgccctctc 120

<210> 34

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tataatctta tattattata taatcttata ttattatatt atataatctt atattatata 60

atcttatctt atataatctt atattatatg ctcttatata atataatctt attatataat 120

<210> 35

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttatttttgt aaggtaaaaa tgtttgtgtg attgggataa tgattccaaa tgttttgttt 60

ttcaagtttt aatttttgca tcttgagttg aaaagtacac ctttaatgaa tagacaattc 120

<210> 36

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tttacaaaac aaaactagtt tttcttgaat tgattcatct gtctacttaa agattttttt 60

tggccagttg tggtagctca tgcctgtaac cccaacactt tgagaggttg ggcaggagga 120

<210> 37

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ccagtttttc ctttccaagt aaacaatcat aaaaaacttg gtgtatatat atattgcagc 60

aattgtatgt atgtaatggt ctctgtatca accaacacat ttttatcatt ttactgaaac 120

<210> 38

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

acgtctggcc taaattctct atcatttagt ttaatcaatt ttggataata attatatcct 60

cgtacccata agtaaaatgc attatcttca agggaagttt tagaaacatt tggtagtttg 120

<210> 39

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cttcctagga tgtatcaagt tataggtggt ccacagagca ggccctgtcc catccatccg 60

tgttccatta gttggtttag ggaactcatt tcttctgccc taaattatcc ctccaggtcc 120

<210> 40

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

caggcttctc ttttacctct tctgttatag tggtgtgtgt gtgtctgtgt gtatgtgtgt 60

gtgtgtgctc acgcacgtgt atgtgtaaac ccataacaag attgacagct ctgtcctcta 120

<210> 41

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

agtgttcaga cccagtctga agtactctgg tattctgttt ggtattctgt ttatgacgct 60

ggcctgtcgt ttgtggaatt ttgggccctt cagggttcac ttctcccggt cttcatcttt 120

<210> 42

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

taacctcact ggtagggaga gtaaggctac aagggcagag aaccagacag atcttgttag 60

gtaggaaatc gtctaatatc taacatttag acctggaccc actaactgac atcaagcaaa 120

<210> 43

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tcaagtactt tcatgtctaa tatgtgactg agcagatata gcatttgatg agatggggaa 60

aaaggatggt ggtcaaatct tcacagcatt tttcacttaa aaactcacta ggtttttgcc 120

<210> 44

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

taaaaattat cgagagcaat gagacctctc tcagatggta tggcgtccaa actcctgatg 60

tcgtacaagg accccaagta cctatcacgg taaaaattaa attggaccac cacgcagagt 120

<210> 45

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ctctggataa tccctccttc agtgttcaga aagctcagga gccatactca aaggccactc 60

tttccagcag gacacagtcg aagagaccac accaagcaga tgggcacaag agacagactc 120

<210> 46

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tgggctggct gtcccagtaa gtatgcccat gtaaagtgac ctccttggca cagggtttgg 60

gggataatgg tgctctggta agctaatacc ccctgccaca tactggcatg tattatattt 120

<210> 47

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

acagagctcc ccatccacag tgagatgcaa gtggctcggt aaatactggt tgagtaattg 60

catgcaagga aggaagggag ggataaggga aggaaagaaa gaagaaaatg gaaggaagga 120

<210> 48

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ctatgtgcca tgagaattta tttcccaaga atacgacaat gatctctgtt gttgggaaag 60

gggggattgg tccatgtttc ctgccatggt aaataactag aagcttggcc tgaatggacg 120

<210> 49

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

catatgaggc tcattcatac acctttggcc ttctaaacac aaaaagcaaa aaaatgttta 60

aacaccctag tttagaagga caaacaacat acaaaacaat gcaaaaacaa aatacaaaat 120

<210> 50

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gttactgtat attgagtgct tctatgcatt aagcagacag tgttttacag acatacttaa 60

tcttcaaaaa tagcctatga atagttttga ttagtctcat tctacaggtg agaaaagaga 120

<210> 51

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

tctcaatttg cttctaggac acgtctcaga aacgctcctt agaagatgct gtctctcatg 60

ctgtatatgc ctcagtgtct attttttctt gtgtggatgt ggttggaaaa gaagggtttt 120

<210> 52

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gaagcatccc tagcacagat atctacaaaa gtaccaagaa ttacaaaaac gtaagtacct 60

ttgtgagaca tttgctggac ttgggtttac tagcctgaag tttcagcagc tccattttac 120

<210> 53

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

ttctaagcct cagtttcttt tctggaaatc agagggttga ataaattgct ttctaaggcc 60

ctttctaact ttgaccttct atgagactgt agaggtccaa gagtttttgt aacctgttgt 120

<210> 54

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tgcctctaaa tcagtgtttt tctaagtgag ttccagggca aactgattca gaggaatgtt 60

cacagatttt gcaataacaa aagggctctg tgataccaag ggaatttgga aaacccagac 120

<210> 55

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

acaacatcaa agtttgggct gaggtgaaac ccatccttaa aaattcatct ccttgatgtc 60

ttgcttacca aggaacagtg tgtaggtctt ttggataatt tgatatgaat ggttgaaaga 120

<210> 56

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gacacagttt ctacctacgt gggacttagc agtctggagg agaaggcaaa cattaagtca 60

tcttataaat aacaattgta gtaagtgctc caaagaagat gaataggaca tcacctgaag 120

<210> 57

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

tcttctttcc acaaatgctt atttagcacc tccacgctat caagtgctgt gctattgagc 60

gctggatgtt gccatctctt gagatataat cctaattata ccattactgt agtttgaaaa 120

<210> 58

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

aggatgggca cagctgcttg gcccctgagc caccgaaggc tgctctactc cttcgttctg 60

gctactaaaa gctgcaaagc tctgggaggg caaagctcaa gaagactaaa acaatggcct 120

<210> 59

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

tagttcttgg tcttcattgg agtgttgtag ccagatatta gtgaaagcta aaagaattaa 60

gaatccagct cagtctacag gtagataata aaaactcata aatattgaac agggctacag 120

<210> 60

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

agatagcttt aaagaaaaat tttctttaga tctggaaaac aaatattaaa agaaccagca 60

atgtttcaaa taaaaaagcc ataaaacctg taattcttct ccatcagttc attcagtctc 120

<210> 61

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

cagtgtactt taatattaat gctcaatttt tagaaaaact tataaataat tcccttctac 60

ttttagccaa ctcaatcaca taaaattttt catgatattt atcttctaca aaccttctac 120

<210> 62

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

gaaagtctcc agagaagggc acagctgtga aacattggca gcctggccca cagcagcagg 60

aggatggata cactggcttg gccaaaggga cgtgatcgtc cacaaggttg actacgacca 120

<210> 63

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

ttccacttaa attctcagca atctggaaaa ccttgaatta taaatgtctt taaacaggat 60

ccaccaggcc ataagtgatc tttgaaaaag aaatttaaaa atcaagccac aaagaagccc 120

<210> 64

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

ggaccttaaa caaatagact aagcataacg gaatgcttgt attacatact tactggtcca 60

ctaaaagtgg gttggacatt cctggtggcc tgtgagatca agaggcttat atttctgtgt 120

<210> 65

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

aagcttcaaa tcattttcag tggagcatca ggtgggttga tgctattcta tttctaccct 60

gtgttctctt tttcaagatc actctcattc aggattgtaa agataccctt gaattaatag 120

<210> 66

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

cctagtgaac tgagatctgc cttccttagc aacacagacc ttcccactga acagcccttc 60

aaatatttga gaatagttct catgtctcca gcagactctc ttccagttga gactcttcta 120

<210> 67

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

gcagtgcctt gtacatagta agtgctcaat aaatagtaat cattgctctt aaataaatcc 60

aattaaagtg tgatgaatac aggccaggct cagtgactca agcctgtaat cccagcactt 120

<210> 68

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

gaaccaggcc aatatatttt gaaatattga tgcagacaaa tgaaataata aagagatttt 60

catggtttat aaaaatcttt tttgatatga taataatcat gatcacaact gagatcaaaa 120

<210> 69

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

ctagagtttg taaattctgg gttcatttgt gatgacataa gtcagcaaac tgcgggaata 60

ctgtctcttc tatgtatttt gtgaatagta agcataattt tagttttgta ttatcaatga 120

<210> 70

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

caacatgttt gcattctttt gcaattcttc tgatttgaga acattttaaa ttgtaaaaaa 60

aaaaaaaaaa agaaaaaatt tataccacaa tattcgctct cagacaaaaa taatgtagca 120

<210> 71

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

tatacagagt gagtatattc agattctact ttaaaacaaa tactttcctc tgttgtagtg 60

gagttgagct atacatccaa caataatgaa aaaatacacg catatataca tatatggaga 120

<210> 72

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

tgaggcatcc ttgcacattc cagaaatatt tggtggggtg gggttcctct atctggggct 60

tagatctgtg aggtgagaat caatgaaatt agggttattt tccatttgca tcaggttagg 120

<210> 73

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

tcttctgatt ttacttgctt gtaataaaga aacttttggt ccctaaaaca aagcaaggag 60

tgattgctca atatttctgt ttaaacccgt tattaaatgt ttacaacaaa atacaagctg 120

<210> 74

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

cttactgtga cagctcacct gcttgcctgt ctgccttacc tattggtctc cagaaaatgg 60

cctgggaatt cacttgtatg ttagcagagc ttcagggaat taaaggccct ttaatgtcta 120

<210> 75

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

ctctaaatca ccacgatcaa aagggacaag catcaagcac gcagcaatgc agctcaaaac 60

gcttagccta gccacacccc cacgggaaac agcagtgatt aacctttagc aataaacgaa 120

<210> 76

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

agctaaacct agccccaaac ccactccacc ttactaccag acaaccttag ccaaaccatt 60

tacccaaata aagtataggc gatagaaatt gaaacctggc gcaatagata tagtaccgca 120

<210> 77

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

aacaaaccca caggtcctaa actaccaaac ctgcattaaa aatttcggtt ggggcgacct 60

cggagcagaa cccaacctcc gagcagtaca tgctaagact tcaccagtca aagcgaacta 120

<210> 78

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

tcttctacta tgaacccccc tccccatacc caaccccctg gtcaacctca acctaggcct 60

cctatttatt ctagccacct ctagcctagc cgtttactca atcctctgat cagggtgagc 120

<210> 79

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

aagctatcgg gcccataccc cgaaaatgtt ggttataccc ttcccgtact aattaatccc 60

ctggcccaac ccgtcatcta ctctaccatc tttgcaggca cactcatcac agcgctaagc 120

<210> 80

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

ctaatctact ccacctcaat cacactactc cccatatcta acaacgtaaa aataaaatga 60

cagtttgaac atacaaaacc caccccattc ctccccacac tcatcgccct taccacgcta 120

<210> 81

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

cctcccttag cagggaacta ctcccaccct ggagcctccg tagacctaac catcttctcc 60

ttacacctag caggtgtctc ctctatctta ggggccatca atttcatcac aacaattatc 120

<210> 82

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

gactaccccg atgcatacac cacatgaaac atcctatcat ctgtaggctc attcatttct 60

ctaacagcag taatattaat aattttcatg atttgagaag ccttcgcttc gaagcgaaaa 120

<210> 83

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

tagggcccgt atttacccta tagcaccccc tctaccccct ctagagccca ctgtaaagct 60

aacttagcat taacctttta agttaaagat taagagaacc aacacctctt tacagtgaaa 120

<210> 84

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

aacacataat gacccaccaa tcacatgcct atcatatagt aaaacccagc ccatgacccc 60

taacaggggc cctctcagcc ctcctaatga cctccggcct agccatgtga tttcacttcc 120

<210> 85

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

agaaaaatcc accccttacg agtgcggctt cgaccctata tcccccgccc gcgtcccttt 60

ctccataaaa ttcttcttag tagctattac cttcttatta tttgatctag aaattgccct 120

<210> 86

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

taatcatatt ttatatcttc ttcgaaacca cacttatccc caccttggct atcatcaccc 60

gatgaggcaa ccagccagaa cgcctgaacg caggcacata cttcctattc tacaccctag 120

<210> 87

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

agaaaacacc ctcatgttca tacacctatc ccccattctc ctcctatccc tcaaccccga 60

catcattacc gggttttcct cttgtaaata tagtttaacc aaaacatcag attgtgaatc 120

<210> 88

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

cagcccaatt aggtctccac ccctgactcc cctcagccat agaaggcccc accccagtct 60

cagccctact ccactcaagc actatagttg tagcaggaat cttcttactc atccgcttcc 120

<210> 89

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

ccttcttacg agccaaaacc tgcccctact cctcctagac ctaacctgac tagaaaagct 60

attacctaaa acaatttcac agcaccaaat ctccacctcc atcatcacct caacccaaaa 120

<210> 90

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

ctcaccagac gcctcaaccg ccttttcatc aatcgcccac atcactcgag acgtaaatta 60

tggctgaatc atccgctacc ttcacgccaa tggcgcctca atattcttta tctgcctctt 120

<210> 91

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

gaaaacaaaa tactcaaatg ggcctgtcct tgtagtataa actaatacac cagtcttgta 60

aaccggagac gaaaaccttt ttccaaggac aaatcagaga aaaagtcttt aactccacca 120

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

caagtatggc ggacgtgggt 20

<210> 93

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

cttggagaac accccaaagg a 21

Claims

1.一种用于耳聋基因检测的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物是基于GJB2、SLC26A4和12SrRNA全长序列设计的若干条探针；所述探针平均间隔500bp至2Kb，优选为1Kb。

2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：91所示。

3.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，采用生物素标记探针组合物。

4.一种耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的探针组合物。

5.根据权利要求4所述的耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，所述耳聋基因检测试剂盒还包括固相载体。

6.根据权利要求5所述的耳聋基因检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为磁珠。

7.一种耳聋基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：提取待测样本基因组DNA，构建基因组文库；

S2：预扩增基因组文库；

S3：利用权利要求1-3任一项所述的探针组合物对基因组文库预扩增产物进行杂交捕获，得到捕获文库；

S4：预扩增捕获文库；

S5：对捕获文库预扩增产物进行三代测序；

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述S1包括：

S11：将提取的待测样本基因组DNA打断成平均长度2-10K的DNA片段；优选打断成平均长度5k的DNA片段；

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述S3还包括，在杂交捕获前添加封闭试剂。

10.如下应用：

(a)根据权利要求1-3任一项所述的探针组合物、权利要求4-6任一项所述的试剂盒或权利要求7-9任一项所述的检测方法在筛查耳聋基因中的应用；

(b)根据权利要求1-3任一项所述的探针组合物、权利要求4-6任一项所述的试剂盒或权利要求7-9任一项所述的检测方法在预防或辅助诊断耳聋疾病中的应用。