CN116042610A

CN116042610A - 动态突变str位点的检测探针组合及测序分析方法

Info

Publication number: CN116042610A
Application number: CN202310177083.0A
Authority: CN
Inventors: 操振华; 潘世让; 安冬艳; 刘文童; 陶庆; 李净净; 汪德鹏
Original assignee: Wuhan Hope Group Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Wuhan Hope Group Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2023-02-28
Filing date: 2023-02-28
Publication date: 2023-05-02

Abstract

本发明涉及动态突变类疾病诊断领域，具体涉及动态突变STR位点的检测探针组合及测序分析方法。本发明公开了检测致病STR位点及潜在致病STR位点的探针组合及检测方法，本发明利用探针捕获扩增技术与三代长读长测序技术联用，并对STR序列重复次数的计算参数进行了针对性设计，实现了对致病性STR位点的全覆盖式筛查，试验结果表明，筛查结果准确可靠、检测效率高，可同时对多种STR致病位点进行筛查，提升了STR位点的检测效率及大规模筛查的临床可及性，克服传统检测技术目标位点少，成本高，分析不全面的缺陷，为动态突变类疾病STR位点研究提供了便利，具有显著的临床推广应用价值。

Description

动态突变STR位点的检测探针组合及测序分析方法

技术领域

本发明涉及动态突变类疾病诊断领域，具体涉及动态突变STR位点的检测探针组合及测序分析方法。

背景技术

人类基因组包含超过100万个已注释串联重复，目前已经查明超过56个位点的串联重复与扩增与疾病相关。不同STR位点导致的疾病临床表型有很大的相似性，目前尚不能通过临床表现形式直接判断具体的STR致病位点，仍然需要逐个STR位点一一核查，这给此类临床疾病研究带来很大的困扰。

现有的检测技术通量不足限制了串联重复位点的有效检测。常规Southern杂交技术费时费力，一次只能检测一个位点，通量低，且实验材料有放射性对检验员身体健康不利。常用的毛细管电泳技术，也是一次只能检测一个位点，仅仅检测56个已知位点就需要做56次毛细管电泳实验。假如对多个样本进行56个已知位点进行检测就工作量更大，周期更长。此外，有些STR位点扩张致病阈值极高，比如SCA36，只有重复拷贝数达到650以上时才会导致致病发生，如此高的重复拷贝数超出了毛细管电泳技术准确性范围的上限，因此无法使用毛细管电泳技术进行准确性检测。以上缺陷均限制了毛细管电泳技术在临床筛查领域的推广应用。

常规二代NGS测序虽然通量高，但是由于序列短，一旦STR位点扩张长度大于150bp就超出了NGS读长，导致许多STR位点无法准确检测。三代全基因组测序技术可以精确检测STR位点，但是由于数据量极大、分析周期长、测序成本极高，限制了其在临床筛查领域的推广应用。

STR位点可以通过长片段PCR产物三代测序精确检测，但是也面临着PCR自身局限性的问题。多重PCR扩增多个位点时引物相互干扰，降低了分析结果的准确性；单一位点PCR通量低，一次只能检测一个位点，仅仅检测56个已知位点就需要做56次长片段PCR实验。工作量大、周期长，限制了其在临床筛查领域的推广应用。目前临床筛查领域迫切需要一种低成本、高通量、周期短的致病STR位点及潜在致病STR位点全覆盖的筛查技术，从而加快此类疾病临床研究。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供动态突变STR位点的检测探针组合及测序分析方法。

本发明提供了探针组合，其满足如下I)～III)所示要求：

I)、靶向以下动物来源STR位点：SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17、SCA31、SCA36、SCA37、SCA50、CANVAS、DRPLA、FRDA、GDPAG、FAME1、FAME2、FAME3、FAME4、FAME6、FAME7、EPM1A、OPDM1、OPDM2、OPDM3、OPDM4、DM1、DM2、SBMA、FTDALS1、FECD3HD、HDL1、HDL2、DIP2B、FXS、SPD1、CCHS、CBL、HFG、BPES、XLMR、EIF4A3、TBX1、ZIC3、NIPA1、POLG、THAP11、OPML1、HPE5、AFF2、DBQD2、RUNX2、ARX、HMN、DIP2B；

II)、在如I)所示STR位点的上、下游分别延伸3Kb的区域设计；每两个相邻探针所覆盖位点的平均间隔为500bp～2kb；

III)、探针长度为50～130bp，GC含量40％～60％、无发夹结构；

进一步的，

所述STR位点来源为人；

每两个相邻探针所覆盖位点的平均间隔为1000bp；

所述探针长度为120bp。

更进一步的，包括如下所示1483条序列中的至少一种：

chr1:1437017～1437137；chr1:1438571～1438691；chr1:57829425～57829545；chr1:57830517～57830637；chr1:57831425～57831545；chr1:57832425～57832545；chr1:57833629～57833749；chr1:57834466～57834586；chr1:57835480～57835600；chr1:145206532～145206652；chr1:145207288～145207408；chr1:145208311～145208431；chr1:145209962～145210082；chr1:145210288～145210408；chr1:145211300～145211420；chr1:145212288～145212408；chr1:145213274～145213394；chr1:145214286～145214406；chr1:145215290～145215410；chr1:145216288～145216408；chr1:145217288～145217408；chr1:145218909～145219029；chr1:145219293～145219413；chr1:145220689～145220809；chr1:145221288～145221408；chr1:145222318～145222438；chr1:145223625～145223745；chr1:145224470～145224590；chr1:145225356～145225476；chr1:145226285～145226405；chr1:145227211～145227331；chr1:145228288～145228408；chr1:145229159～145229279；chr1:145230409～145230529；chr1:145231373～145231493；chr1:145232288～145232408；chr1:145233325～145233445；chr1:145234335～145234455；chr1:145235288～145235408；chr1:145236288～145236408；chr1:145237288～145237408；chr1:145238344～145238464；chr1:145239591～145239711；chr1:145240288～145240408；chr1:145241317～145241437；chr1:145242272～145242392；chr1:145243288～145243408；chr1:145244250～145244370；chr1:145245889～145246009；chr1:145246316～145246436；chr1:145247260～145247380；chr1:145248519～145248639；chr1:145249596～145249716；chr1:145250288～145250408；chr1:145251391～145251511；chr1:145252319～145252439；chr1:145253288～145253408；chr1:145254301～145254421；chr1:145255810～145255930；chr1:145256210～145256330；chr1:145257372～145257492；chr1:145258288～145258408；chr1:145259291～145259411；chr1:145260288～145260408；chr1:145261344～145261464；chr1:145262288～145262408；chr1:145263288～145263408；chr1:145264228～145264348；chr1:145265288～145265408；chr1:145266356～145266476；chr1:145267349～145267469；chr1:145268264～145268384；chr1:145269425～145269545；chr1:145270604～145270724；chr1:145271482～145271602；chr1:145272507～145272627；chr1:145273288～145273408；chr1:145274288～145274408；chr1:145275187～145275307；chr1:145277244～145277364；chr1:145278529～145278649；chr1:145279233～145279353；chr1:145280229～145280349；chr1:145281288～145281408；chr1:145282265～145282385；chr1:145283304～145283424；chr1:145284349～145284469；chr1:145285944～145286064；chr10:79823547～79823667；chr10:79825547～79825667；chr10:79826550～79826670；chr10:79827547～79827667；chr10:79828547～79828667；chr11:119073928～119074048；chr11:119074888～119075008；chr11:119075687～119075807；chr11:119076506～119076626；chr11:119077687～119077807；chr11:119078592～119078712；chr11:119079637～119079757；chr12:7042630～7042750；chr12:7043579～7043699；chr12:7044579～7044699；chr12:7045579～7045699；chr12:7046579～7046699；chr12:7047579～7047699；chr12:7048510～7048630；chr12:50895378～50895498；chr12:50896429～50896549；chr12:50897539～50897659；chr12:50898467～50898587；chr12:50899467～50899587；chr12:50900441～50900561；chr12:50901689～50901809；chr12:112034117～112034237；chr12:112034810～112034930；chr12:112035459～112035579；chr12:112036459～112036579；chr12:112037496～112037616；chr12:112038304～112038424；

chr12:112039975～112040095；chr12:124015026～124015146；chr12:124015955～124016075；

chr12:124016955～124017075；chr12:124017955～124018075；chr12:124018964～124019084；

chr12:124020906～124021026；chr13:70710164～70710284；chr13:70711074～70711194；

chr13:70712270～70712390；chr13:70713264～70713384；chr13:70714209～70714329；

chr13:70715019～70715139；chr13:70716828～70716948；chr13:100634917～100635037；

chr13:100635424～100635544；chr13:100636395～100636515；chr13:100637892～100638012；

chr13:100638360～100638480；chr13:100639363～100639483；chr13:100640395～100640515；

chr14:23787878～23787998；chr14:23788567～23788687；chr14:23789366～23789486；

chr14:23790366～23790486；chr14:23791366～23791486；chr14:23792367～23792487；

chr14:23793375～23793495；chr14:92534044～92534164；chr14:92535187～92535307；

chr14:92536138～92536258；chr14:92537151～92537271；chr14:92538046～92538166；

chr14:92539185～92539305；chr14:92540707～92540827；chr15:23083375～23083495；

chr15:23084360～23084480；chr15:23085096～23085216；chr15:23086586～23086706；

chr15:23087428～23087548；chr15:23088540～23088660；chr15:23089134～23089254；

chr15:89873493～89873613；chr15:89874493～89874613；chr15:89875641～89875761；

chr15:89876938～89877058；chr15:89877458～89877578；chr15:89878493～89878613；

chr15:89879496～89879616；chr16:17561442～17561562；chr16:17562442～17562562；

chr16:17563442～17563562；chr16:17564860～17564980；chr16:17565431～17565551；

chr16:17566693～17566813；chr16:17567442～17567562；chr16:24621476～24621596；

chr16:24622522～24622642；chr16:24623476～24623596；chr16:24624507～24624627；

chr16:24625476～24625596；chr16:24626477～24626597；chr16:24627778～24627898；

chr16:66518300～66518420；chr16:66519300～66519420；chr16:66520440～66520560；

chr16:66521300～66521420；chr16:66522197～66522317；chr16:66523300～66523420；

chr16:66524361～66524481；chr16:66525300～66525420；chr16:66526641～66526761；

chr16:66527302～66527422；chr16:87634582～87634702；chr16:87635536～87635656；

chr16:87636641～87636761；chr16:87637637～87637757；chr16:87638401～87638521；

chr16:87639587～87639707；chr16:87640582～87640702；chr17:43972331～43972451；

chr17:43973102～43973222；chr17:43973963～43974083；chr17:78117372～78117492；

chr17:78118501～78118621；chr17:78119501～78119621；chr17:78120564～78120684；

chr17:78121812～78121932；chr17:78123544～78123664；chr18:53250101～53250221；

chr18:53251093～53251213；chr18:53252504～53252624；chr18:53253093～53253213；

chr18:53254173～53254293；chr18:53254977～53255097；chr18:53256077～53256197；

chr19:14603539～14603659；chr19:14605171～14605291；chr19:14605540～14605660；

chr19:14606416～14606536；chr19:14607540～14607660；chr19:14608531～14608651；

chr19:14610091～14610211；chr19:46270432～46270552；chr19:46271036～46271156；

chr19:46272083～46272203；chr19:46273172～46273292；chr19:46273994～46274114；

chr19:46275164～46275284；chr19:46276164～46276284；chr2:96859118～96859238；

chr2:96860436～96860556；chr2:96861118～96861238；chr2:96863669～96863789；

chr2:96864176～96864296；chr2:96865515～96865635；chr2:176954477～176954597；

chr2:176955477～176955597；chr2:176956466～176956586；chr2:176957981～176958101；

chr2:176958477～176958597；chr2:176959477～176959597；chr2:176960343～176960463；

chr2:191742293～191742413；chr2:191743309～191743429；chr2:191744553～191744673；

chr2:191745311～191745431；chr2:191746517～191746637；chr2:191747623～191747743；

chr2:191748438～191748558；chr20:2630212～2630332；chr20:2631057～2631177；

chr20:2632336～2632456；chr20:2632913～2633033；chr20:2634073～2634193；

chr20:2635073～2635193；chr20:2636073～2636193；chr20:4696828～4696948；

chr20:4697550～4697670；chr20:4698550～4698670；chr20:4700083～4700203；

chr20:4700603～4700723；chr20:4701550～4701670；chr21:45193012～45193132；

chr21:45194012～45194132；chr21:45195159～45195279；chr21:45196580～45196700；

chr21:45198104～45198224；chr21:45198831～45198951；chr22:19750934～19751054；

chr22:19752022～19752142；chr22:19752871～19752991；chr22:19754659～19754779；

chr22:19755065～19755185；chr22:19755978～19756098；chr22:19756944～19757064；

chr22:46188154～46188274；chr22:46188895～46189015；chr22:46190055～46190175；

chr22:46190940～46191060；chr22:46193019～46193139；chr22:46193999～46194119；

chr3:63895345～63895465；chr3:63895954～63896074；chr3:63897101～63897221；

chr3:63898160～63898280；chr3:63899047～63899167；chr3:63900072～63900192；

chr3:63901033～63901153；chr3:128888127～128888247；chr3:128889116～128889236；

chr3:128890166～128890286；chr3:128891674～128891794；chr3:128892164～128892284；

chr3:128892977～128893097；chr3:128894625～128894745；chr3:138661554～138661674；

chr3:138662695～138662815；chr3:138663585～138663705；chr3:138665214～138665334；

chr3:138665947～138666067；chr3:138666554～138666674；chr3:138667554～138667674；

chr3:183426978～183427098；chr3:183428103～183428223；chr3:183428637～183428757；

chr3:183429465～183429585；chr3:183430452～183430572；chr3:183432258～183432378；

chr3:183432552～183432672；chr4:3073276～3073396；chr4:3074147～3074267；

chr4:3075208～3075328；chr4:3076348～3076468；chr4:3077306～3077426；

chr4:3078306～3078426；chr4:3079614～3079734；chr4:39346895～39347015；

chr4:39348328～39348448；chr4:39348855～39348975；chr4:39349588～39349708；

chr4:39350975～39351095；chr4:39351744～39351864；chr4:39352928～39353048；

chr4:41744792～41744912；chr4:41745680～41745800；chr4:41746680～41746800；

chr4:41747645～41747765；chr4:41748680～41748800；chr4:41749680～41749800；

chr4:41750680～41750800；chr4:160260394～160260514；chr4:160261891～160262011；

chr4:160262428～160262548；chr4:160263243～160263363；chr4:160264394～160264514；

chr4:160265404～160265524；chr4:160266394～160266514；chr5:10353157～10353277；

chr5:10354326～10354446；chr5:10355199～10355319；chr5:10356106～10356226；

chr5:10357157～10357277；chr5:10358196～10358316；chr5:10359358～10359478；

chr5:146254976～146255096；chr5:146255977～146256097；chr5:146256977～146257097；

chr5:146257981～146258101；chr5:146258977～146259097；chr5:146259981～146260101；

chr5:146260821～146260941；chr6:16324738～16324858；chr6:16325613～16325733；

chr6:16326590～16326710；chr6:16328037～16328157；chr6:16328580～16328700；

chr6:16329580～16329700；chr6:16330486～16330606；chr6:45387183～45387303；

chr6:45388188～45388308；chr6:45389183～45389303；chr6:45390183～45390303；

chr6:45391575～45391695；chr6:45392183～45392303；chr6:45393170～45393290；

chr6:170868101～170868221；chr6:170870383～170870503；chr6:170870720～170870840；

chr6:170872059～170872179；chr6:170872720～170872840；chr6:170873621～170873741；

chr7:27236173～27236293；chr7:27237257～27237377；chr7:27238210～27238330；

chr7:27239609～27239729；chr7:27240235～27240355；chr7:27241235～27241355；

chr7:27242235～27242355；chr8:105597960～105598080；chr8:105598875～105598995；

chr8:105599845～105599965；chr8:105601005～105601125；chr8:105601964～105602084；chr8:105602938～105603058；chr8:105603879～105603999；chr8:119375733～119375853；chr8:119376775～119376895；chr8:119377654～119377774；chr8:119379141～119379261；chr8:119379842～119379962；chr8:119380644～119380764；chr9:27546775～27546895；chr9:27547092～27547212；chr9:27548219～27548339；chr9:27549241～27549361；chr9:27550378～27550498；chr9:27551218～27551338；chr9:27554809～27554929；chr9:27555213～27555333；chr9:27556214～27556334；chr9:27557237～27557357；chr9:27558215～27558335；chr9:27559214～27559334；chr9:27560614～27560734；chr9:27561104～27561224；chr9:27562166～27562286；chr9:27563250～27563370；chr9:27564363～27564483；chr9:27565107～27565227；chr9:27566673～27566793；chr9:27567075～27567195；chr9:27568317～27568437；chr9:27569625～27569745；chr9:27570214～27570334；chr9:27571188～27571308；chr9:27572214～27572334；chr9:27573214～27573334；chr9:27574174～27574294；chr9:27575145～27575265；chr9:71648882～71649002；chr9:71650239～71650359；chr9:71650951～71651071；chr9:71651882～71652002；chr9:71652913～71653033；chr9:71654234～71654354；chr9:71655073～71655193；chrX:25028401～25028521；chrX:25029326～25029446；chrX:25030401～25030521；chrX:25031960～25032080；chrX:25032401～25032521；chrX:25033401～25033521；chrX:25034304～25034424；chrX:66761880～66762000；chrX:66762880～66763000；chrX:66764001～66764121；chrX:66764880～66765000；chrX:66765880～66766000；chrX:66766880～66767000；chrX:66767849～66767969；chrX:136645674～136645794；chrX:136646671～136646791；chrX:136647617～136647737；chrX:136648516～136648636；chrX:136649671～136649791；chrX:136650672～136650792；chrX:136651671～136651791；chrX:139583174～139583294；chrX:139584174～139584294；chrX:139585174～139585294；chrX:139586509～139586629；chrX:139587168～139587288；chrX:139588131～139588251；chrX:139589174～139589294；chrX:146990323～146990443；chrX:146991262～146991382；chrX:146992245～146992365；chrX:146993084～146993204；chrX:146994262～146994382；chrX:146995446～146995566；chrX:146996880～146997000；chrX:147578884～147579004；chrX:147579829～147579949；chrX:147580829～147580949；chrX:147581766～147581886；chrX:147582834～147582954；chrX:147583641～147583761；chrX:147584829～147584949。

本发明所述探针包括如上所述序列的正向序列，也包括如上所示序列的反向互补序列，它们均可作为探针序列用于捕获STR靶序列。

本发明中，所述探针根据人类参考基因组版本Hg19采取合适的间隔设计，在考虑样本DNA建库过程DNA打断片段大小基础上，使探针密度与捕获靶区域的覆盖均一性达到最高；本发明的一些具体的实施例中，所述探针以平均间隔250bp、500bp、1K、2K、3K、4K设计，结果表明，平均间隔1K设计的探针兼具相对较少的探针数目和相对较好的覆盖均一性；平均间隔1K设计的探针覆盖均一性明显优于间隔大于1K设计的探针，平均间隔1K设计的探针与平均间隔小于1K设计的在覆盖均一性方面非常接近，因此，平均间隔1K设计的探针拥有最佳的性价比。

本发明中，所述探针平均间隔为1K，包括了间隔在700～1400bp左右设计的探针；本发明的具体实施例中，针对单一STR位点设计的探针间隔可以在700bp左右，也可以在1400bp左右，所述探针间隔可以为700bp～1400bp之间的任意数值。

本发明中，所述的探针的碱基个数在50～130bp之间、GC含量GC含量40％～60％、无发夹结构；进一步的，所述探针长度优选120bp；并进一步与NCBI等数据库进行Blast比对，去掉非特异性的分子探针，优选高特异性探针，因此，本发明所述的探针组合为经过筛选后获得的性价比最好、覆盖度最高、特异性最好的用于58种STR位点引起的相关疾病检测筛查的最佳探针组合。

本发明所述探组合中的每个探针连接有标记物，所述标记物选自生物素、亲和素、抗生物素蛋白、抗体或化学偶联剂中的至少一种；所述标记物便于探针与DNA片段特异性结合后的信号放大和发光检测。

本发明提供了STR位点的测序方法，其包括以下步骤：

步骤1、待测样品中的基因组DNA经打断、末端修复、加接头、扩增后获得DNA文库；

步骤2、本发明所述的探针组合经封闭后与所述DNA文库杂交获得预杂交文库，预杂交文库经扩增，获得杂交文库；

步骤3、对杂交文库进行三代测序后分析数据，获得STR位点序列信息。

进一步的，

所述的检测方法的步骤1中，

打断后的基因片段大小为4.5～5.5kb；

接头包括接头A和接头B，接头A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，接头B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

扩增的引物包括Primer-F和Primer-R，Primer-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，Primer-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

所述的检测方法的步骤2中，

所述封闭使用封闭引物，所述封闭引物包括Index A Block和Index B Block，Index ABlock的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，Index B Block的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示；

扩增的引物包括Primer-F和Primer-R，Primer-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，Primer-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

扩增体系包括：0M～5M Betaine、0.1μM～1.0μM Primer F、0.1μM～0.5μM PrimerR、0.5mM～4.0mM Mg²⁺、8vol％dNTP Mixture、聚合酶、聚合酶缓冲液、预杂交文库；所述dNTPMixture中各dNTP的浓度分别为0.5mM～5mM；所述聚合酶选自EX Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶和/或PrimeSTAR GXL聚合酶中的至少一种；

扩增程序包括：98℃1min；98℃15sec，58℃～64℃15sec，68℃6min，18cycle；68℃5min。

优选的，

扩增体系为：1M Betaine、0.5μM Primer F、0.5μM Primer R、2mM Mg²⁺、8vol％dNTP Mixture、2vol％PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、20vol％5×PrimeSTAR GXLBuffer、50vol％预杂交文库；dNTP Mixture中各dNTP的浓度分别为2.5mM；

扩增程序包括：98℃1min；98℃15sec，62℃15sec，68℃6min，18cycle；68℃5min。

本发明对杂交文库构建种扩增体系相关参数进行了调整；本发明的一些实施例中，引物浓度为0.1μM～1.0μM；Betaine浓度为0M～5M；DNA聚合酶选自EX Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、PrimeSTAR GXL聚合酶；镁离子浓度为0.5mM～4.0mM；退火温度为58℃～64℃；实验结果表明，引物浓度为0.5μM，Betaine浓度为1M，DNA聚合酶为PrimeSTAR GXL聚合酶，镁离子浓度为2mM，退火温度为62℃时，杂交文库的扩增效果最好。

所述的检测方法的步骤3中，

所述分析数据的方法为：提取STR区域序列数据后选择参数n_component为1或2时计算得出的AIC值较小的高斯混合模型，判断STR重复次数。

判断STR重复次数的标准为：

选择的模型的n_component为1，则直接返回模型的峰值平均值做为样本的重复次数；

选择的模型的n_component为2，则选择模型的峰值平均值附近且read数目大于等于最小read数目阈值2的重复次数，作为该STR在样本中的重复次数。

本发明中，所述分析数据的软件为GrandSTR；STR位点串联重复拷贝数检测发现，本发明生信软件结果与repeat理论数值100％一致，Straglr、repeatHMM、tandem-genotypes和PACMONSTR软件结果均有多例样本与repeat理论数值不符。表明本发明生信软件结果优于Straglr、repeatHMM、tandem-genotypes和PACMONSTR软件结果。

本发明中，所述三代测序采用平台包括PacBio Sequel、PromethION、MinION、GridION平台进行中的至少一种；

进一步的，本发明利用采用PacBio Sequel平台和PromethION均可进行。

本发明中，所述的待测样品包括但不限于血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液、羊水或它们的混合物中的至少一种。

本发明提供了如下所示中的至少一项在制备STR位点相关疾病筛查试剂盒中的应用：

I)、本发明所述的探针组合；

II)、本发明所述的检测方法。

本发明中，所述STR位点包括但不限于SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA10、SCA12、SCA17、SCA31、SCA3、SCA37、SCA50、CANVAS、DRPLA、FRDA、GDPAG、FAME1、FAME2、FAME3、FAME4、FAME6、FAME7、EPM1A、OPDM1、OPDM2、OPDM3、OPDM4、DM1、DM2、SBMA、FTDALS1、FECD3HD、HDL1、HDL2、DIP2B、FXS、SPD1、CCHS、CBL HFG、BPES、XLMR、EIF4A3、TBX1、ZIC3、NIPA1、POLG、THAP11、OPML1、HPE5、AFF2、DBQD2、RUNX2、ARX、HMN和/或DIP2B中的至少一种。

所述STR位点突变引起的疾病包括但不限于脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型、脊髓小脑共济失调8型、脊髓小脑共济失调10型、脊髓小脑共济失调12型、脊髓小脑共济失调17型、脊髓小脑共济失调31型、脊髓小脑共济失调36型、脊髓小脑共济失调37型、多聚谷氨酰胺神经疾病、小脑共济失调-神经病和前庭反射障碍综合征、齿状核红核苍白球路易氏体萎缩、Friedreich共济失调1型、全面发育迟缓-进行性共济失调和谷氨酰胺升高、家族性成人肌阵挛性癫痫1型、家族性成人肌阵挛性癫痫2型、家族性成人肌阵挛性癫痫3型、FAME4家族性肌阵挛癫痫4型、家族性成人肌阵挛性癫痫6型、家族性成人肌阵挛性癫痫7型、癫痫-进行性肌阵挛1A、眼咽远端肌病、神经元核内包涵体疾病、强直性营养不良2型、强直性营养不良1型、眼咽肌营养不良、脊髓延髓肌萎缩症、额颞叶智障、肌萎缩性侧索硬化症1型、Fuchs角膜内皮营养不良3型、OPML1伴有脑白质病变的眼咽病1型、亨廷顿舞蹈病、亨廷顿舞蹈病样2型、智力障碍,FRA12A型、X-连锁智力障碍109型/脆性X综合征、Desbuquois发育不良2型、并指1型、先天性中枢性通气不足综合征1型、雅各布森综合征、BCCD短指和颅骨锁骨发育不全、HFGS手足生殖器综合征、BPES先天小睑裂综合征、HPE5前脑无裂畸形5型、EIEE1早期婴儿型癫痫性脑病1型、MRGH单一性生长激素缺乏症伴精神发育迟滞、HDL1、HMN、RCPS、TOF、VACTERLX、ALS–susceptibility和/或POLG中的至少一种。

本发明提供了STR位点检测的产品，其包括本发明所述的探针组合、固相载体、接头序列、接头封闭序列、用于与所述接头序列结合并扩增核酸片段的引物、DNA提取体系、PCR反应缓冲液、无核酸酶的水、DNA聚合酶、分子量marker、靶序列洗脱液、末端修复酶、末端修复缓冲液、DNA连接酶中的一种或多种。

本发明的一些具体实施例中，所述接头序列包括接头A和接头B，接头A的序列如SEQ ID NO:1所示；接头B的序列如SEQ ID NO:2所示；所述接头封闭序列包括Index ABlock和Index B Block，所述Index A Block的序列如SEQ ID NO:5所示，所述Index ABlock的序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明的一些具体实施例中，所述的引物包括Primer-F和Primer-R，Primer-F的序列如SEQ ID NO:3所示，Primer-R的序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明所述固相载体为富集颗粒，所述富集颗粒包被有生物素或亲和素；

进一步的，所述富集颗粒为磁珠，所述捕获发生在固相载体上。

本发明公开了检测致病STR位点及潜在致病STR位点的探针组合及检测方法，本发明利用探针捕获扩增技术与三代长读长测序技术联用，并对STR序列重复次数的计算参数进行了针对性设计，实现了对致病性STR位点的全覆盖式筛查，试验结果表明，筛查结果准确可靠、检测效率高，可同时对多种STR致病位点进行筛查，提升了STR位点的检测效率及大规模筛查的临床可及性，克服传统检测技术目标位点少，成本高，分析不全面的缺陷，为动态突变类疾病STR位点研究提供了便利，具有显著的临床推广应用价值。

附图说明

图1示探针密度与捕获靶区域的覆盖均一性；

图2示数据计算流程。

具体实施方式

本发明提供了动态突变STR位点的检测探针组合及测序分析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

动态突变又称为不稳定寡核苷酸重复序列，简称STR，常见的是三核苷酸重复序列GCA、GCT和GCC等，个别位点是TTTTA五核苷酸重复序列，或其它形式的寡核苷酸重复序列。串联重复拷贝数随着世代的传递而不断扩增，因而称之为动态突变。串联重复拷贝数达到一定阈值时可引发疾病，一般具有遗传早现现象，即后代发病年龄提前，症状加重。动态突变是导致人类遗传病的一种新的基因突变类型。

本发明通过精心设计STR位点的长片段捕获扩增技术与三代长读长测序技术联用，实现了低成本、高通量、短周期的致病STR位点及潜在致病STR位点全覆盖式筛查。可以一次性检测56个已知致病STR位点，及潜在致病STR位点。可以添加barcode对多个人同时进行56个已知位点进行检测，快速高效，适合大规模临床样本筛查。56个已知致病STR位点和两个潜在致病STR位点为HMN、DIP2B，如表1所示。

表1.58个致病STR位点

SCA1

SCA2

SCA3

SCA6

SCA7

SCA8

SCA10

SCA12

SCA17

SCA31

SCA36

SCA37

SCA50

CANVAS

DRPLA

FRDA

GDPAG

FAME1

FAME2

FAME3

FAME4

FAME6

FAME7

EPM1A

OPDM1

OPDM2

OPDM3

OPDM4

DM1

DM2

SBMA

FTDALS1

FECD3

HD

HDL1

HDL2

DIP2B

FXS

SPD1

CCHS

CBL

HFG

BPES

XLMR

EIF4A3

TBX1

ZIC3

NIPA1

POLG

THAP11

OPML1

HPE5

AFF2

DBQD2

RUNX2

ARX

HMN

DIP2B

与表1所述的已知致病STR位点的位置及引起的疾病如表2所示：

表2.58个已知致病STR位点信息

本方法通过设计捕获探针，覆盖56个已知位点，及2个潜在致病的STR位点，并进一步借助三代长读长测序技术，实现STR位点快速检测。具体操作如下

一种基于三代靶向捕获测序的STR位点检测试剂盒及方法，包括以下步骤：

1)基因组DNA文库的构建：提取待测样品中的基因组DNA，将其打断成2～10k，优选5k左右大小的片段；将打断后的双链DNA片段的两端进行末端修复后，再连接上接头序列；即可获得DNA文库；

2)DNA文库的预扩增：采用靶向接头序列的引物，将上述DNA文库中带有接头的DNA片段进行第一次PCR扩增，获得预扩增的DNA文库；

3)杂交捕获靶序列：将预扩增的DNA文库中的双链DNA片断变性后，利用检测探针对靶序列进行杂交捕获；

4)靶序列洗脱和第二次PCR扩增：将上一步捕获的靶序列进行洗脱，将洗脱下来的靶序列进行第二次PCR扩增；

5)将上述第二次PCR扩增的产物进行三代测序文库的构建；

6)将三代文库进行三代测序仪测序；

7)对三代测序数据进行生物信息学分析，获得与STR位点相关的核酸分子序列，并进一步确定待测样品中STR位点的具体重复拷贝数情况。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1三代靶向捕获测序的STR位点检测

1、制备STR位点杂交捕获的探针

1.1STR位点杂交捕获的探针设计

针对STR位点上、下游分别延伸3Kb，每间隔500bp～2K设计一条探针，优选的每间隔1K设计一条探针。(三代测序仪测序读长长，比如，Pacbio公司的sequel或OxfordNanopore公司的PromethION测序长度可达几十K，待测样品中的基因组DNA被打断成5K左右的大小片段，每间隔1K设计一条探针，平均每个DNA片段可以结合5个探针，足以对目的片段开展有效的捕获)。设计好的探针的碱基个数在50～130bp之间、GC含量值适中、无发夹结构，并进一步与NCBI等数据库进行Blast比对，确保探针的特异性。优选地，设计好的探针的碱基个数为120bp。STR位点参考序列为人类参考基因组版本Hg19，设计得到的探针序列为“STR位点探针”信息中所示；

chr1:1437017～1437137；chr1:1438571～1438691；chr1:57829425～57829545；

chr1:57830517～57830637；chr1:57831425～57831545；chr1:57832425～57832545；

chr1:57833629～57833749；chr1:57834466～57834586；chr1:57835480～57835600；

chr1:145206532～145206652；chr1:145207288～145207408；chr1:145208311～145208431；

chr1:145209962～145210082；chr1:145210288～145210408；chr1:145211300～145211420；

chr1:145212288～145212408；chr1:145213274～145213394；chr1:145214286～145214406；

chr1:145215290～145215410；chr1:145216288～145216408；chr1:145217288～145217408；

chr1:145218909～145219029；chr1:145219293～145219413；chr1:145220689～145220809；

chr1:145221288～145221408；chr1:145222318～145222438；chr1:145223625～145223745；

chr1:145224470～145224590；chr1:145225356～145225476；chr1:145226285～145226405；

chr1:145227211～145227331；chr1:145228288～145228408；chr1:145229159～145229279；

chr1:145230409～145230529；chr1:145231373～145231493；chr1:145232288～145232408；

chr1:145233325～145233445；chr1:145234335～145234455；chr1:145235288～145235408；

chr1:145236288～145236408；chr1:145237288～145237408；chr1:145238344～145238464；

chr1:145239591～145239711；chr1:145240288～145240408；chr1:145241317～145241437；

chr1:145242272～145242392；chr1:145243288～145243408；chr1:145244250～145244370；

chr1:145245889～145246009；chr1:145246316～145246436；chr1:145247260～145247380；

chr1:145248519～145248639；chr1:145249596～145249716；chr1:145250288～145250408；

chr1:145251391～145251511；chr1:145252319～145252439；chr1:145253288～145253408；

chr1:145254301～145254421；chr1:145255810～145255930；chr1:145256210～145256330；

chr1:145257372～145257492；chr1:145258288～145258408；chr1:145259291～145259411；

chr1:145260288～145260408；chr1:145261344～145261464；chr1:145262288～145262408；

chr1:145263288～145263408；chr1:145264228～145264348；chr1:145265288～145265408；

chr1:145266356～145266476；chr1:145267349～145267469；chr1:145268264～145268384；

chr1:145269425～145269545；chr1:145270604～145270724；chr1:145271482～145271602；

chr1:145272507～145272627；chr1:145273288～145273408；chr1:145274288～145274408；

chr1:145275187～145275307；chr1:145277244～145277364；chr1:145278529～145278649；

chr1:145279233～145279353；chr1:145280229～145280349；chr1:145281288～145281408；

chr1:145282265～145282385；chr1:145283304～145283424；chr1:145284349～145284469；

chr1:145285944～145286064；chr10:79823547～79823667；chr10:79825547～79825667；

chr10:79826550～79826670；chr10:79827547～79827667；chr10:79828547～79828667；

chr11:119073928～119074048；chr11:119074888～119075008；chr11:119075687～119075807；

chr11:119076506～119076626；chr11:119077687～119077807；chr11:119078592～119078712；

chr11:119079637～119079757；chr12:7042630～7042750；chr12:7043579～7043699；

chr12:7044579～7044699；chr12:7045579～7045699；chr12:7046579～7046699；

chr12:7047579～7047699；chr12:7048510～7048630；chr12:50895378～50895498；

chr12:50896429～50896549；chr12:50897539～50897659；chr12:50898467～50898587；

chr12:50899467～50899587；chr12:50900441～50900561；chr12:50901689～50901809；

chr12:112034117～112034237；chr12:112034810～112034930；chr12:112035459～112035579；

chr12:112036459～112036579；chr12:112037496～112037616；chr12:112038304～112038424；

chr20:2632336～2632456；chr20:2632913～2633033；chr20:2634073～2634193；

chr20:2635073～2635193；chr20:2636073～2636193；chr20:4696828～4696948；

chr20:4697550～4697670；chr20:4698550～4698670；chr20:4700083～4700203；

chr3:183432552～183432672；chr4:3073276～3073396；chr4:3074147～3074267；

chr4:3075208～3075328；chr4:3076348～3076468；chr4:3077306～3077426；

chr4:3078306～3078426；chr4:3079614～3079734；chr4:39346895～39347015；

chr8:105599845～105599965；chr8:105601005～105601125；chr8:105601964～105602084；

chr8:105602938～105603058；chr8:105603879～105603999；chr8:119375733～119375853；

chr8:119376775～119376895；chr8:119377654～119377774；chr8:119379141～119379261；

chr8:119379842～119379962；chr8:119380644～119380764；chr9:27546775～27546895；

chr9:27547092～27547212；chr9:27548219～27548339；chr9:27549241～27549361；

chr9:27550378～27550498；chr9:27551218～27551338；chr9:27554809～27554929；chr9:27555213～27555333；chr9:27556214～27556334；chr9:27557237～27557357；chr9:27558215～27558335；chr9:27559214～27559334；chr9:27560614～27560734；chr9:27561104～27561224；chr9:27562166～27562286；chr9:27563250～27563370；chr9:27564363～27564483；chr9:27565107～27565227；chr9:27566673～27566793；chr9:27567075～27567195；chr9:27568317～27568437；chr9:27569625～27569745；chr9:27570214～27570334；chr9:27571188～27571308；chr9:27572214～27572334；chr9:27573214～27573334；chr9:27574174～27574294；chr9:27575145～27575265；chr9:71648882～71649002；chr9:71650239～71650359；chr9:71650951～71651071；chr9:71651882～71652002；chr9:71652913～71653033；chr9:71654234～71654354；chr9:71655073～71655193；chrX:25028401～25028521；chrX:25029326～25029446；chrX:25030401～25030521；chrX:25031960～25032080；chrX:25032401～25032521；chrX:25033401～25033521；chrX:25034304～25034424；chrX:66761880～66762000；chrX:66762880～66763000；chrX:66764001～66764121；chrX:66764880～66765000；chrX:66765880～66766000；chrX:66766880～66767000；chrX:66767849～66767969；chrX:136645674～136645794；chrX:136646671～136646791；chrX:136647617～136647737；chrX:136648516～136648636；chrX:136649671～136649791；chrX:136650672～136650792；chrX:136651671～136651791；chrX:139583174～139583294；chrX:139584174～139584294；chrX:139585174～139585294；chrX:139586509～139586629；chrX:139587168～139587288；chrX:139588131～139588251；chrX:139589174～139589294；chrX:146990323～146990443；chrX:146991262～146991382；chrX:146992245～146992365；chrX:146993084～146993204；chrX:146994262～146994382；chrX:146995446～146995566；chrX:146996880～146997000；chrX:147578884～147579004；chrX:147579829～147579949；chrX:147580829～147580949；chrX:147581766～147581886；chrX:147582834～147582954；chrX:147583641～147583761；chrX:147584829～147584949；

1.2探针密度与捕获靶区域的覆盖均一性测试

0.5×平均覆盖深度的序列所占百分比，是一种比较常见评估panel覆盖均一性的参数，用于考察低覆盖深度带来的局限性。如果90％以上的靶区域呈现超过0.5×的平均覆盖深度，则Panel的覆盖均一性较好。为此，评估了平均间隔250bp、500bp、1K、2K、3K、4K设计的探针对靶区域覆盖均一性，如图1所示，平均间隔1K设计的探针覆盖均一性明显优于间隔大于1K设计的，平均间隔1K设计的探针与平均间隔小于1K设计的在覆盖均一性方面非常接近，平均间隔1K设计的探针兼具相对较少的探针数目和相对较好的覆盖均一性。因此，平均间隔1K设计的探针拥有最佳的性价比。

2.接头序列

接头由A序列与B序列组合成，

A序列为：

5'～pGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTNNNNNNNNNNACCCACGTCCGCCATA CTTG～3'(SEQID:Adaptor part A；SEQ ID NO:1)；

B序列为：

5'～CTTGGAGAACACCCCAAAGGAGATNNNNNNNNNNNNNNNNAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT/3SpC3/-3'(SEQ ID:Adaptor part B；SEQ ID NO:2)；

上述序列中的p代表磷酸化修饰；N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种；/3SpC3/代表硫代磷酸键修饰；A序列NNNNNNNNNN及B序列NNNNNNNNNNNNNNNN用于识别不同样品构建的文库。

进一步的，由上述接头A序列与B序列制备成工作接头的具体操作为：

1)溶解引物粉末；

2)在PCR管中等体积混合接头A和接头B；

3)使用PCR程序：95℃，3分钟；1小时缓慢降温至25℃，0.05℃/s下降温度；

即得到工作接头。

3、样品基因组DNA提取及质量评估

取待检测样品外周血0.5～1mL，采用Blood Genomic DNAMini Kit(北京康为世纪生物科技有限公司，外周血)进行基因组DNA提取。通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性，用Qubit(Life Technologies，美国)对基因组进行浓度测定。选取基因组相对完整且浓度≥25ng/μl的DNA样品进行文库构建。

4.捕获文库的构建

4.1基因组DNA打断

使用Covaris E220非接触式超声破碎仪打断基因组DNA，参数设置如下：Duration600sec、Peak Incident Power 3瓦、Duty Factor 20％、Cycles per Burst 1000。使用0.6倍体积的AMPure PB磁珠进行纯化，制得片段化基因组DNA。

4.2样本末端修复、加接头

4.2.1末端修复，加“A尾”

使用NEB Next Ultra End Repair/dA～Tailing Module试剂盒。

表2.加A尾体系

试剂组分	体积(μl)
		NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix	3
NEBNext Ultra II End Prep Reaction buffer	7
		片段化基因组DNA	50
总体积	60

表3.加A尾体系反应条件

4.2.2接头连接

使用NEB Next Ultra II Ligation Module试剂盒。

表4.接头连接体系

试剂组分	体积(μl)
		NEBNext Ultra II Ligtion Master Mix	30
NEBNext Ligation Enhancer	1
		Adaptor(工作接头)	2.5
末端修复产物	60
		总体积	93.5

于PCR仪中，20℃反应15min。随后，使用0.6倍体积的AMPure XP磁珠进行纯化，获得文库溶液。

4.3文库的预扩增

表5.文库的预扩增体系

其中，Primer-F和Primer-R即为文库预扩增的引物，具体为：

Primer-F：5'-CAAGTATGGCGGACGTGGGT-3'，SEQ ID NO:3；

Primer-R：5'-CTTGGAGAACACCCCAAAGGA-3'，SEQ ID NO:4。

表6.文库的预扩增反应条件

步骤	温度	循环数	时间
				基因组变性	98℃	1	1min
变性	98℃		15sec
				延伸	68℃	7	10min
延伸	68℃	1	10min
				保存	10℃	1	......

使用0.6倍体积的AMPure XP磁珠回收PCR产物。

4.4杂交捕获靶序列

4.4.1捕获准备

将需要进行捕获的样品等量混合，DNA总量为1μg。

加入4μL Index封闭试剂(Index ABlock、Index B Block)，其目的在于分别封闭文库构建中用到的接头A序列和B序列，防止文库上的这两个接头序列和探针杂交。

Index ABlock序列为：5'-CAAGTATGGCGGACGTGGGTNNNNNNNNNNAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3'，SEQ ID NO:5；

Index B Block序列为：5'-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTNNNNNNNNNNNNNNNNATCTCCTTTGGGGTGTTCTCCAAG-3'，SEQ ID NO:6；

上述序列中N代表A/G/C/T四种碱基的任意一种，其中，Index ABlock与接头A序列反向互补；Index B Block与接头B序列反向互补。

震荡混匀，然后，开盖60℃真空浓缩至蒸干；

4.4.2捕获

按照试剂盒xGen Lockdown Reagent Kit(IDT，货号：1072281)的配制杂交buffer，

表7.杂交buffer体系

试剂组分	体积(μl)
		2x Hybridization Buffer	8.5
Hybridization Buffer Enhancer	2.7
		Nuclease～free Water	1.8
总体积	13

将表7杂交buffer加入蒸干的样品中，震荡混匀，短暂离心，于PCR仪上95℃，10min。

反应结束后，离心，将13μL样品全部转移至含有4μL捕获探针的PCR管中，用移液器吹吸混匀。于PCR仪上65℃，16小时。

4.5杂交洗脱

4.5.1按照试剂盒xGen Lockdown Reagent Kit(IDT,货号：1072281)的配制洗脱试剂：

表8.洗脱试剂

4.5.2捕获磁珠处理：

a)吸取50μl M280磁珠至离心管中，将离心管置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

b)加入200μl 1×Bead Wash Buffer(vial 7)，混匀，离心，置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

c)重复步骤b一次。

d)加入100μl 1×Bead Wash Buffer(vial 7)，混匀，转移至PCR管中，置于磁力架上待上清完全澄清，弃上清。

4.5.3M280磁珠和目标文库的结合：

a)将17μl杂交体系加入到有磁珠的PCR管中，上下缓慢吹吸混匀，于PCR仪上65℃孵育45min。

4.5.4洗脱：

a)加入100μl 65℃1×Wash Buffer I(vial 1)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

b)加入200μl 65℃1×Stringent Wash Buffer(vial 4)，混匀转移到预热的大离心管中。置于温育仪上，65℃5min。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

c)加入200μl常温1×Wash Buffer I(vial 1)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

d)加入200μl常温1×Wash Buffer II(vial 2)，混匀1。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清。

e)加入200μl常温1×Wash Buffer III(vial 3)，混匀。置于磁力架上，待上清完全澄清，弃上清.

f)短暂离心，使用10μl吸头移去少量剩余液体。

g)使用25μl Nuclease-free Water悬浮磁珠，获得M280磁珠探针混悬液，于-20℃保存。

4.6杂交文库扩增反应体系与反应条件的优化

4.6.1反应体系与反应条件优化的基础体系与条件如下：

上一步得到的M280磁珠探针混悬液，取25μL/文库按照下表在200ml PCR管中进行

表9.杂交文库扩增反应体系

试剂组分	体积(μl)
		Nuclease～free Water	3
5×PrimeSTAR GXL Buffer	10
		dNTP Mixture	4
Betaine	5
		Primer	2
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	1
		M280磁珠探针混悬液	25
总体积	50

上表所述Primer与上文文库预扩增的引物一致：

Primer F：5'～CAAGTATGGCGGACGTGGGT～3'(SEQ ID NO:3)，

Primer～R：5'～CTTGGAGAACACCCCAAAGGA～3'(SEQ ID NO:4)。

表10.杂交文库扩增反应程序

(1)引物浓度的优化：在反应体系其它条件相同的情况下，调整引物Primer-F和Primer-R的浓度，引物在反应体系中的浓度分别为0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.8μM和1.0μM。反应条件同上基础反应条件。结果显示，引物浓度为0.5μM时的反应体系的扩增效果最好，确定反应体系中最佳引物浓度是0.5μM。

(2)Betaine浓度的优化：在反应体系其他条件相同的情况下，调整Betaine的浓度，Betaine在反应体系中的浓度分别为0M、0.1M、0.3M、1M、3M和5M。反应条件同上基础反应条件。结果显示，Betaine浓度为1M时的反应体系的扩增效果最好，确定反应体系中Betaine最佳浓度是1M。

(3)酶的优化：在反应体系其他条件相同的情况下，使用不同的DNA聚合酶，所用的DNA聚合酶分别为EX Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、PrimeSTAR GXL聚合酶，每个反应体系一种DNA聚合酶，各DNA聚合酶在反应体系中的浓度均相同。反应条件同上基础反应条件。结果显示，PrimeSTAR GXL聚合酶的反应体系的扩增效果最好，确定最佳DNA聚合酶为PrimeSTAR GXL聚合酶。

(4)镁离子浓度的优化：在反应体系其它条件相同的情况下，调整镁离子在反应体系中的浓度，镁离子在反应体系中的浓度分别为0.5mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM和4.0mM。反应条件同上基础反应条件。结果显示，镁离子浓度是2mM时的反应体系的扩增效果最好，确定反应体系中最佳镁离子浓度是2mM。

(5)退火温度的优化：反应体系为基础反应体系，在反应的其他条件相同的情况下，调整退火温度进行梯度PCR(退火温度分别为58℃、60℃、62℃和64℃)。结果显示，退火温度是62℃时的反应体系的扩增效果最好，确定最佳退火温度是62℃。

由此得到上述基础反应体系即为最佳反应体系，基础反应条件即为最佳反应条件。

反应结束后，使用0.6倍体积的AMPure XP磁珠进行纯化，最后使用TE溶液洗脱磁珠，转移至新的离心管内，进入下一步操作，或者放在～80℃中备用。

4.7文库质检

文库进行Qbuit检测及Agilent 2100Bioanalyzer检测，检测合格文库(主峰2K以上，判定合格)进行下一步三代测序文库构建。

5.三代测序文库构建及测序

5.1使用Pacbio sequal测序

5.1.1使用建库试剂盒进行建库

5.1.1.1将混好的文库进行修复

表11.修复溶液配制

修复溶液配置好后混匀，离心，放入PCR热循环仪中，进行修复反应，具体条件如下：

表12.修复反应程序

反应步骤	反应温度	反应时间
			修复反应	37℃	30min
保存	4℃	......

5.1.1.2纯化

使用0.45倍样品体积的PB磁珠进行纯化，最后使用双蒸水洗脱磁珠，-20℃冰箱保存。

5.1.1.3接头连接

表13.连接溶液体系

试剂组分	体积(μl)
		经修复反应后的DNA溶液	50
接头链接缓冲液	30
		DNA连接酶	10
接头溶液(20μM)	5
		去离子水	5
总体积	100

混匀，离心，于PCR热循环仪中进行连接反应，具体条件如下：

表14.连接反应程序

反应步骤	反应温度	反应时间
			接头连接	25℃	15h
保存	4℃	......

5.1.1.4纯化

5.1.2引物退火及Binding反应

按照Pacbio sequal仪器测序标准操作方式进行。

5.1.3三代测序

按照Pacbio sequal仪器标准操作规范进行测序。

5.2使用Oxford Nanopore PromethION测序

5.2.1样本末端修复

取DNA，置于冰上，加入NEB末端修复/加A尾连接试剂，混匀。20℃孵育40分钟，65℃孵育20分钟。

5.2.2DNA纯化

将1×AMPure beads加入DNA中，室温孵育15min，室温磁力架吸附5min，吸弃上清。

加入80％乙醇，磁力架吸附，弃上清，重复一次。室温晾干。

添加Ultra Pure Water，37℃下吹打洗脱。

磁力架上静置5min，吸取上清，即为纯化后的DNA。

5.2.3接头连接

加入NEB T4 DNA快速连接buffer、NEB T4 DNA快速连接酶和接头，混匀，20℃孵育20min。

5.2.4DNA纯化

将0.8×AMPure beads加入PCR产物中，室温孵育5min，室温磁力架吸附2min，吸弃上清。加入200μl SFB吹打混匀，磁力架吸附，弃上清，重复一次。添加EB 15μl，吹打洗脱。磁力架上静置5min，吸取上清，即为纯化后的DNA。

5.2.5Priming及Loading操作

按照Oxford Nanopore PromethION测序标准操作方式进行。

5.2.6三代测序

按照Oxford Nanopore PromethION仪器标准操作规范进行测序。

6.生物信息学分析

6.1拆分各样品数据

若下机数据为多样品混测，根据各样品的标签序列拆分出每个样品的数据。

6.2数据过滤

根据各平台数据特点，生成高质量数据。

ONT平台过滤掉质量值较低的数据。Pacbio平台采用官方软件生成高质量的一致性序列。

6.3数据评估

将高质量的数据比对到人类全基因组参考序列，采取唯一比对(即单条序列只能唯一比对到基因组的一个位置)。

统计目标区域的序列数，评估捕获效率、目标区域覆盖深度、覆盖完整性。

若数据不合格(合格的标准是：靶区域的测序覆盖度，要求30倍覆盖度不低于95％)，根据情况进行补测数据。

6.4STR位点串联重复拷贝数检测

检测目标区域的STR位点串联重复拷贝数，并筛选出重复拷贝数达到致病阈值的STR位点，数据计算过程使用的生物信息学分析软件为自主研发的GrandSTR，该软件数据计算流程如图2。

6.4.1提取read中的STR区域序列：根据bam格式比对文件，从参考序列STR区域坐标往两侧延伸30bp提取对应read中的STR区域序列。如果根据bam格式比对文件未提取出STR区域序列，则重比对参考序列与read序列，并提取read中的STR区域序列。

6.4.2计算read中STR序列的重复次数：如果考虑motif发生改变的情况，对于提取的read中的STR序列，从头计算其中的重复单元，看是否都与预期的重复单元一致。如果重复单元一致，则认为motif没有发生改变。将STR序列与STR重复单元多次拷贝的模板序列比对，调整边界，去除比对结果两端比对较差的序列或者往两端延伸比对较好的序列，计算相似性和重复次数。

6.4.3高斯混合模型计算重复次数峰值：根据多条reads中的STR序列重复次数，使用高斯混合模型设置n_component参数为1或2拟合重复次数的分布，并计算AIC(Akaikeinformation criterion)，选择AIC较小的模型。如果选择的模型的n_component为1，直接返回模型的峰值平均值做为样本的重复次数。如果选择的模型的n_component为2，则选择模型的峰值平均值附近且read数目大于等于最小read数目阈值(为2)的重复次数，作为该STR在样本中的重复次数。

6.5变异的验证。

将筛选出的存在STR扩张的位点进行其它手段验证。

本实施例对20个经临床表型观测确诊为动态突变疾病的家系，累计60份样本；进行了STR位点检测，并将本发明检测结果与二代测序结果进行了对比，不一致的结果进行了一代验证。检测过程中，实验人员、数据分析人员均不知道样本的基因型及表现型，以确保结果的可信性。检测结果如下表15：

表15.检测结果

备注：N/A表示未检测。Southern杂交验证由于其自身分辨率的限制，误差为±50bp,故Southern杂交验证检测值在扣除误差因素后，落入本方法检测结果数值范围内则本视为与本方法检测结果一致。

同时进行了STR位点串联重复拷贝数检测软件比较，将本测试数据用已有的STR分析工具包括Straglr、repeatHMM、tandem-genotypes、PACMONSTR与自主研发的GrandSTR进行了对比。repeat理论数值在1～100范围内的检测值与理论值偏差±2视为一致；repeat理论数值在101～300范围内的检测值与理论值偏差±5视为一致；repeat理论数值在300以上的检测值与理论值偏差±15视为一致。比对结果如下：

表16.STR位点串联重复拷贝数检测软件比较

以上比对结果表明本发明生信软件GrandSTR结果与repeat理论数值100％一致，Straglr、repeatHMM、tandem-genotypes和PACMONSTR软件结果均有多例样本与repeat理论数值不符。这表明本发明生信软件GrandSTR结果优于Straglr、repeatHMM、tandem-genotypes和PACMONSTR软件结果。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.探针组合，其满足如下I)～III)所示要求：

III)、探针长度为50～130bp，GC含量40％～60％、无发夹结构。

2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，

所述STR位点来源为人；

每两个相邻探针所覆盖位点的平均间隔为1000bp；

所述探针长度为120bp。

3.根据权利要求1或2所述的探针组合，其特征在于，包括如下所示1483条序列中的至少一种：

chr1:1437017～1437137；chr1:1438571～1438691；chr1:57829425～57829545；chr1:57830517～57830637；chr1:57831425～57831545；chr1:57832425～57832545；chr1:57833629～57833749；chr1:57834466～57834586；chr1:57835480～57835600；chr1:145206532～145206652；chr1:145207288～145207408；chr1:145208311～145208431；chr1:145209962～145210082；chr1:145210288～145210408；chr1:145211300～145211420；chr1:145212288～145212408；chr1:145213274～145213394；chr1:145214286～145214406；chr1:145215290～145215410；chr1:145216288～145216408；chr1:145217288～145217408；chr1:145218909～145219029；chr1:145219293～145219413；chr1:145220689～145220809；chr1:145221288～145221408；chr1:145222318～145222438；chr1:145223625～145223745；chr1:145224470～145224590；chr1:145225356～145225476；chr1:145226285～145226405；chr1:145227211～145227331；chr1:145228288～145228408；chr1:145229159～145229279；chr1:145230409～145230529；chr1:145231373～145231493；chr1:145232288～145232408；chr1:145233325～145233445；chr1:145234335～145234455；chr1:145235288～145235408；chr1:145236288～145236408；chr1:145237288～145237408；chr1:145238344～145238464；chr1:145239591～145239711；chr1:145240288～145240408；chr1:145241317～145241437；chr1:145242272～145242392；chr1:145243288～145243408；chr1:145244250～145244370；chr1:145245889～145246009；chr1:145246316～145246436；chr1:145247260～145247380；chr1:145248519～145248639；chr1:145249596～145249716；chr1:145250288～145250408；chr1:145251391～145251511；chr1:145252319～145252439；chr1:145253288～145253408；chr1:145254301～145254421；chr1:145255810～145255930；chr1:145256210～145256330；chr1:145257372～145257492；chr1:145258288～145258408；chr1:145259291～145259411；chr1:145260288～145260408；chr1:145261344～145261464；chr1:145262288～145262408；chr1:145263288～145263408；chr1:145264228～145264348；chr1:145265288～145265408；chr1:145266356～145266476；chr1:145267349～145267469；chr1:145268264～145268384；chr1:145269425～145269545；chr1:145270604～145270724；chr1:145271482～145271602；chr1:145272507～145272627；chr1:145273288～145273408；chr1:145274288～145274408；chr1:145275187～145275307；chr1:145277244～145277364；chr1:145278529～145278649；chr1:145279233～145279353；chr1:145280229～145280349；chr1:145281288～145281408；chr1:145282265～145282385；chr1:145283304～145283424；chr1:145284349～145284469；chr1:145285944～145286064；chr10:79823547～79823667；chr10:79825547～79825667；chr10:79826550～79826670；chr10:79827547～79827667；chr10:79828547～79828667；chr11:119073928～119074048；chr11:119074888～119075008；chr11:119075687～119075807；chr11:119076506～119076626；chr11:119077687～119077807；chr11:119078592～119078712；chr11:119079637～119079757；chr12:7042630～7042750；chr12:7043579～7043699；chr12:7044579～7044699；chr12:7045579～7045699；chr12:7046579～7046699；chr12:7047579～7047699；chr12:7048510～7048630；chr12:50895378～50895498；chr12:50896429～50896549；chr12:50897539～50897659；chr12:50898467～50898587；chr12:50899467～50899587；chr12:50900441～50900561；chr12:50901689～50901809；chr12:112034117～112034237；chr12:112034810～112034930；chr12:112035459～112035579；chr12:112036459～112036579；chr12:112037496～112037616；chr12:112038304～112038424；chr12:112039975～112040095；chr12:124015026～124015146；chr12:124015955～124016075；chr12:124016955～124017075；chr12:124017955～124018075；chr12:124018964～124019084；chr12:124020906～124021026；chr13:70710164～70710284；chr13:70711074～70711194；chr13:70712270～70712390；chr13:70713264～70713384；chr13:70714209～70714329；chr13:70715019～70715139；chr13:70716828～70716948；chr13:100634917～100635037；chr13:100635424～100635544；chr13:100636395～100636515；chr13:100637892～100638012；chr13:100638360～100638480；chr13:100639363～100639483；chr13:100640395～100640515；chr14:23787878～23787998；chr14:23788567～23788687；chr14:23789366～23789486；chr14:23790366～23790486；chr14:23791366～23791486；chr14:23792367～23792487；chr14:23793375～23793495；chr14:92534044～92534164；chr14:92535187～92535307；chr14:92536138～92536258；chr14:92537151～92537271；chr14:92538046～92538166；chr14:92539185～92539305；chr14:92540707～92540827；chr15:23083375～23083495；chr15:23084360～23084480；chr15:23085096～23085216；chr15:23086586～23086706；chr15:23087428～23087548；chr15:23088540～23088660；chr15:23089134～23089254；chr15:89873493～89873613；chr15:89874493～89874613；chr15:89875641～89875761；chr15:89876938～89877058；chr15:89877458～89877578；chr15:89878493～89878613；chr15:89879496～89879616；chr16:17561442～17561562；chr16:17562442～17562562；chr16:17563442～17563562；chr16:17564860～17564980；chr16:17565431～17565551；chr16:17566693～17566813；chr16:17567442～17567562；chr16:24621476～24621596；chr16:24622522～24622642；chr16:24623476～24623596；chr16:24624507～24624627；chr16:24625476～24625596；chr16:24626477～24626597；chr16:24627778～24627898；chr16:66518300～66518420；chr16:66519300～66519420；chr16:66520440～66520560；chr16:66521300～66521420；chr16:66522197～66522317；chr16:66523300～66523420；chr16:66524361～66524481；chr16:66525300～66525420；chr16:66526641～66526761；chr16:66527302～66527422；chr16:87634582～87634702；chr16:87635536～87635656；chr16:87636641～87636761；chr16:87637637～87637757；chr16:87638401～87638521；chr16:87639587～87639707；chr16:87640582～87640702；chr17:43972331～43972451；chr17:43973102～43973222；chr17:43973963～43974083；chr17:78117372～78117492；chr17:78118501～78118621；chr17:78119501～78119621；chr17:78120564～78120684；chr17:78121812～78121932；chr17:78123544～78123664；chr18:53250101～53250221；chr18:53251093～53251213；chr18:53252504～53252624；chr18:53253093～53253213；

chr20:2632336～2632456；chr20:2632913～2633033；chr20:2634073～2634193；

chr20:2635073～2635193；chr20:2636073～2636193；chr20:4696828～4696948；

chr20:4697550～4697670；chr20:4698550～4698670；chr20:4700083～4700203；

chr3:183432552～183432672；chr4:3073276～3073396；chr4:3074147～3074267；

chr4:3075208～3075328；chr4:3076348～3076468；chr4:3077306～3077426；

chr4:3078306～3078426；chr4:3079614～3079734；chr4:39346895～39347015；

chr5:10357157～10357277；chr5:10358196～10358316；chr5:10359358～10359478；chr5:146254976～146255096；chr5:146255977～146256097；chr5:146256977～146257097；chr5:146257981～146258101；chr5:146258977～146259097；chr5:146259981～146260101；chr5:146260821～146260941；chr6:16324738～16324858；chr6:16325613～16325733；chr6:16326590～16326710；chr6:16328037～16328157；chr6:16328580～16328700；chr6:16329580～16329700；chr6:16330486～16330606；chr6:45387183～45387303；chr6:45388188～45388308；chr6:45389183～45389303；chr6:45390183～45390303；chr6:45391575～45391695；chr6:45392183～45392303；chr6:45393170～45393290；chr6:170868101～170868221；chr6:170870383～170870503；chr6:170870720～170870840；chr6:170872059～170872179；chr6:170872720～170872840；chr6:170873621～170873741；chr7:27236173～27236293；chr7:27237257～27237377；chr7:27238210～27238330；chr7:27239609～27239729；chr7:27240235～27240355；chr7:27241235～27241355；chr7:27242235～27242355；chr8:105597960～105598080；chr8:105598875～105598995；chr8:105599845～105599965；chr8:105601005～105601125；chr8:105601964～105602084；chr8:105602938～105603058；chr8:105603879～105603999；chr8:119375733～119375853；chr8:119376775～119376895；chr8:119377654～119377774；chr8:119379141～119379261；chr8:119379842～119379962；chr8:119380644～119380764；chr9:27546775～27546895；chr9:27547092～27547212；chr9:27548219～27548339；chr9:27549241～27549361；chr9:27550378～27550498；chr9:27551218～27551338；chr9:27554809～27554929；chr9:27555213～27555333；chr9:27556214～27556334；chr9:27557237～27557357；chr9:27558215～27558335；chr9:27559214～27559334；chr9:27560614～27560734；chr9:27561104～27561224；chr9:27562166～27562286；chr9:27563250～27563370；chr9:27564363～27564483；chr9:27565107～27565227；chr9:27566673～27566793；chr9:27567075～27567195；chr9:27568317～27568437；chr9:27569625～27569745；chr9:27570214～27570334；chr9:27571188～27571308；chr9:27572214～27572334；chr9:27573214～27573334；chr9:27574174～27574294；chr9:27575145～27575265；chr9:71648882～71649002；chr9:71650239～71650359；chr9:71650951～71651071；chr9:71651882～71652002；chr9:71652913～71653033；chr9:71654234～71654354；chr9:71655073～71655193；chrX:25028401～25028521；chrX:25029326～25029446；chrX:25030401～25030521；chrX:25031960～25032080；chrX:25032401～25032521；chrX:25033401～25033521；chrX:25034304～25034424；chrX:66761880～66762000；chrX:66762880～66763000；chrX:66764001～66764121；chrX:66764880～66765000；chrX:66765880～66766000；chrX:66766880～66767000；chrX:66767849～66767969；chrX:136645674～136645794；chrX:136646671～136646791；chrX:136647617～136647737；chrX:136648516～136648636；chrX:136649671～136649791；chrX:136650672～136650792；chrX:136651671～136651791；chrX:139583174～139583294；chrX:139584174～139584294；chrX:139585174～139585294；chrX:139586509～139586629；chrX:139587168～139587288；chrX:139588131～139588251；chrX:139589174～139589294；chrX:146990323～146990443；chrX:146991262～146991382；chrX:146992245～146992365；chrX:146993084～146993204；chrX:146994262～146994382；chrX:146995446～146995566；chrX:146996880～146997000；chrX:147578884～147579004；chrX:147579829～147579949；chrX:147580829～147580949；chrX:147581766～147581886；chrX:147582834～147582954；chrX:147583641～147583761；chrX:147584829～147584949。

4.根据权利要求1～3任一项所述的探针组合，其特征在于，所述探组合中的每个探针都连接有标记物，所述标记物选自生物素、亲和素、抗生物素蛋白、抗体或化学偶联剂中的至少一种。

5.STR位点的测序方法，其包括以下步骤：

步骤2、权利要求1～4任一项所述的探针组合经封闭后与所述DNA文库杂交获得预杂交文库，预杂交文库经扩增，获得杂交文库；

6.根据权利要求5所述的测序方法，其特征在于，步骤1中，

打断后的基因片段大小为4.5～5.5kb；

7.根据权利要求5或6所述的测序方法，其特征在于，步骤2中，

所述封闭使用封闭引物，所述封闭引物包括Index A Block和Index B Block，Index ABlock的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，Index B Block的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

扩增体系包括：0M～5M Betaine、0.1μM～1.0μM Primer F、0.1μM～0.5μM Primer R、0.5mM～4.0mM Mg²⁺、8vol％dNTP Mixture、聚合酶、聚合酶缓冲液、预杂交文库；所述dNTPMixture中各dNTP的浓度为0.5mM～5mM；所述聚合酶选自EX Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶和/或PrimeSTAR GXL聚合酶中的至少一种；

8.根据权利要求7所述的测序方法，其特征在于，所述步骤2中，

扩增体系为：1M Betaine、0.5μM Primer F、0.5μM Primer R、2mM Mg²⁺、8vol％dNTPMixture、2vol％PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、20vol％5×PrimeSTAR GXL Buffer、50vol％预杂交文库；dNTP Mixture中各dNTP的浓度为2.5mM；

9.根据权利要求5～8任一项所述的测序方法，其特征在于，步骤3中，所述分析数据的方法为：提取STR区域序列数据后选择参数n_component为1或2时计算得出的AIC值较小的高斯混合模型，判断STR重复次数。

10.根据权利要求9所述的测序方法，其特征在于，判断STR重复次数的标准为：

11.如下所示中的至少一项在制备STR位点相关疾病筛查试剂盒中的应用：

I)、权利要求1～4任一项所述的探针组合；

II)、权利要求5～10任一项所述的测序方法。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述STR位点包括：DRPLA、FRDA、GDPAG、FAME1、FAME2、FAME3、FAME4、FAME6、FAME7、EPM1A、OPDM1、OPDM2、OPDM3、OPDM4、DM1、DM2、SBMA、FTDALS1、FECD3 HD、HDL1、HDL2、DIP2B、FXS、SPD1、CCHS、CBL HFG、BPES、XLMR、EIF4A3、TBX1、ZIC3、NIPA1、POLG、THAP11、OPML1、HPE5、AFF2、DBQD2、RUNX2、ARX、HMN和/或DIP2B中的至少一种。

13.STR位点检测的产品，其包括权利要求1～4任意一项所述的探针组合、固相载体、接头序列、接头封闭序列、用于与所述接头序列结合并扩增核酸片段的引物、DNA提取体系、PCR反应缓冲液、无核酸酶的水、DNA聚合酶、分子量marker、靶序列洗脱液、末端修复酶、末端修复缓冲液、DNA连接酶中的一种或多种。