CN116179671A - 一种用于hla基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

一种用于hla基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116179671A
CN116179671A CN202211530754.9A CN202211530754A CN116179671A CN 116179671 A CN116179671 A CN 116179671A CN 202211530754 A CN202211530754 A CN 202211530754A CN 116179671 A CN116179671 A CN 116179671A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hla
primer
seq
nucleotide sequence
gene amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211530754.9A
Other languages
English (en)
Inventor
蒋廷亚
刘海涛
刘枫
王银锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Aogen Diagnostic Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Augen Diagnostic Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Augen Diagnostic Technology Co ltd filed Critical Shanghai Augen Diagnostic Technology Co ltd
Priority to CN202211530754.9A priority Critical patent/CN116179671A/zh
Publication of CN116179671A publication Critical patent/CN116179671A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于HLA基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法，提供的HLA基因扩增引物组，包括如下引物组中至少一组引物组组成的混合物：所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑18所示；上述HLA基因扩增引物组，可以进行单管多重PCR扩增，可以在1个PCR管中对HLA‑A、B、C、DRB1、DPB1、DQB1这6个基因同时进行扩增，通量高，降低了成本，简化了操作，且覆盖区域更广，使得后续的HLA基因分型的精确度更高，可达6位或8位。

Description

一种用于HLA基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于HLA基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法。
背景技术
HLA(human leukocyte antigen)表示人类白细胞抗原，是编码主要组织相容性复合体(MHC)的基因，位于6p21.31的区域，包含了一系列紧密连锁的基因座。与人类的免疫系统功能密切相关。HLA全长约3.6M,含有220多种功能不同的基因，是目前已知的人类染色体中基因密度最高，多态性最为丰富的区域。HLA分型已用于组织配型，器官移植、疾病相关性研究、人类学和法医学等领域。
HLA分型过去主要采用血清学和细胞学方法，随着PCR技术，基因芯片技术等分子生物学技术的发展，已建立了从DNA水平上进行分型的HLA基因分型技术，包括PCR-SSOP(序列特异性寡核苷酸探针)、PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)、PCR-SSP(序列特异性引物)、PCR-SBT(Sanger测序)、基因芯片等。虽然，PCR-SSOP、PCR-RFLP和PCR-SSP具有特异性高、结果简便容易判断等优势，但是需要对每个位点单独设计特异性的引物，实验成本高，检测通量小，相对于HLA这种高度多态性区域，难以用于规模检测。PCR-SBT是直接通过Sanger测序的方法获得待测样本序列与数据库进行比对，进而获得HLA分型，目前是HLA分型的金标准。但是该方法需要对每个外显子区域进行单独PCR扩增测序，以目前常见的分型区域为例(包括HLA-A/B/C的外显子2/3/4和HLA-DRB1/DPB1/DQB1的外显子2/3，共15个外显子区域)，一个待测样本就需要进行15个PCR反应和15个测序反应。基因芯片技术由美国Affymetrix公司首先开发，与现有分型技术比较，具有集成化的优点、操作非常简便、灵敏度高等特点。但是，目前基因芯片还存在着仪器设备昂贵，方法有待标准化以及信号检测低导致结果分辨率低(只能测到2位)等不足。
因此，面对HLA分型遇到的问题，需要亟需得到一个通量高，操作简便，成本较低的方法，而高通量测序技术能够综合这些因素满足现在需求。目前，基于液相杂交技术的HLA基因分型的方法已有报道且已有产品面市，但是目标区域捕获率为70-80％，导致检测准确性低，且在文库构建后，还需要进行液相杂交步骤，增加了成本和所需检测时间。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的HLA基因分型方法存在通量低、操作复杂或成本较高，难以满足检测的规模性和快捷性以及检测准确性和分辨率的缺陷，本发明提供了一种用于HLA基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法，可对HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DQB1、DPB1的6个基因进行单管多重PCR扩增，通量高、操作简单、成本低，进行检测分型，且精确度可达到6位或8位。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种HLA基因扩增引物组，包括如下引物组中至少一组引物组组成的混合物：
HLA-A引物组：正向引物HLA-AF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物HLA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
HLA-B引物组：正向引物HLA-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物HLA-BR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
HLA-C引物组：正向引物HLA-CF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物HLA-CR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
HLA-DRB1引物组：正向引物HLA-DRB1F1的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，反向引物HLA-DRB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；正向引物HLA-DRB1F2的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，反向引物HLA-DRB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
HLA-DPB1引物组：正向引物HLA-DPB1F1的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，反向引物HLA-DPB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；正向引物HLA-DPB1F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物HLA-DPB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
HLA-DQB1引物组：正向引物HLA-DQB1F1的核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示，反向引物HLA-DQB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；正向引物HLA-DQB1F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，反向引物HLA-DQB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
在上述的引物组中，对于HLA-A、HLA-B、HLA-C基因，分别设计1组引物，对HLA-A、HLA-B、HLA-C基因的第1个外显子到第8个外显子区域进行扩增，如SEQ ID NO.1到SEQ IDNO.6。对于HLA-DRB1、DQB1、DPB1基因，分别对每个基因设计2组引物，其中，在HLA-DRB1扩增引物组中，采用第一组引物(HLA-DRB1F1、HLA-DRB1R1)扩增第1个外显子，采用第二组引物(HLA-DRB1F2、HLA-DRB1R2)扩增第2到第5个外显子区域；在HLA-DPB1扩增引物组中，采用第一组引物(HLA-DPB1F1、HLA-DPB1R1)扩增第1到第2个外显子区域，采用第二组引物(HLA-DPB1F2、HLA-DPB1R2)扩增第3到第5个外显子区域；在HLA-DQB1扩增引物组中，采用第一组引物(HLA-DQB1F1、HLA-DQB1R1)扩增第1到第2个外显子区域，采用第二组引物(HLA-DQB1F2、HLA-DQB1R2)扩增第3到第5个外显子区域，如SEQ ID NO.7到SEQ IDNO.18。
所述引物组混合时，所述正向引物混合摩尔比例HLA-AF：HLA-BF：HLA-CF：HLA-DRB1F1：HLA-DRB1F2：HLA-DPB1F1：HLA-DPB1F2：HLA-DQB1F1：HLA-DQB1F2为(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：0.8～1：0.8～1：(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：0.8～1：0.8～1；
所述反向引物混合摩尔比例HLA-AR：HLA-BR：HLA-CR：HLA-DRB1R1：HLA-DRB1R2：HLA-DPB1R1：HLA-DPB1R2：HLA-DQB1R1：HLA-DQB1R2为(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：0.8～1：0.8～1：(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：0.8～1：0.8～1。
可选的，所述引物组混合时，所述正向引物混合比例HLA-AF：HLA-BF：HLA-CF：HLA-DRB1F1：HLA-DRB1F2：HLA-DPB1F1：HLA-DPB1F2：HLA-DQB1F1：HLA-DQB1F2为0.8：0.8：0.8：1：1：0.8：0.8：1：1；
所述反向引物混合比例HLA-AR：HLA-BR：HLA-CR：HLA-DRB1R1：HLA-DRB1R2：HLA-DPB1R1：HLA-DPB1R2：HLA-DQB1R1：HLA-DQB1R2为0.8：0.8：0.8：1：1：0.8：0.8：1：1。
一种HLA基因扩增的试剂盒，包括所述的HLA基因扩增引物组。
可选的，还包括PCR缓冲液和/或Taq DNA聚合酶。
可选的，包括PCR扩增体系，以25uL为计，如下：
2×PCR buffer，12.5μL；
HLA基因扩增引物组，0.7-1μL；
DNA模板，50-200ng；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.2-0.4μL；
余量用纯水补足至25μL；
所述HLA基因扩增引物组中，HLA-A、HLA-B、HLA-C和/或HLA-DPB1的引物组中每条引物的浓度为2-5μM，HLA-DQB1和/或HLA-DRB1的引物组中每条引物的浓度为2-6μM；
可选的，包括PCR扩增体系，以25uL为计，如下：
2×PCR buffer，12.5μL；
HLA基因扩增引物组，1μL；
DNA模板，50-200ng；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.25μL；
余量用纯水补足至25μL；
所述HLA基因扩增引物组中，HLA-A、HLA-B、HLA-C和/或HLA-DPB1的引物组中每条引物的浓度为4μM，HLA-DQB1和/或HLA-DRB1的引物组中每条引物的浓度为5μM。
一种HLA基因扩增方法，包括利用所述的HLA基因扩增引物组和/或所述的HLA基因扩增试剂盒进行PCR扩增。
可选的，所述PCR扩增的反应程序为：94℃保持1min；98℃保持10sec，68℃保持4min，20个循环；72℃保持10min；4℃保存。
一种HLA基因测序文库构建的方法，包括如下步骤：
利用所述的HLA基因扩增引物组和/或权利要求4-6任一项所述的HLA基因扩增试剂盒进行PCR扩增得到PCR扩增产物；
对PCR扩增产物进行文库构建。
可选的，在文库构建前，还包括对PCR扩增产物进行质检的步骤；
可选的，在对PCR扩增产物质检合格后，还包括对PCR扩增产物进行片段化打断，片段化范围为150-250bp。
可选的，所述片段化打断方法包括机械打断和酶切打断。
可选的，所述NGS文库构建，包括DNA片段化、末端修复、A尾添加、接头连接、文库富集等，所用试剂可以为目前市场上存在的NGS建库试剂盒，包括NEBNext
Figure BDA0003975772050000062
UltraTM II FSDNA Library Prep Kit，诺唯赞VAHTS Universal DNA Library Prep Kit，翌圣生物HieffNGS/>
Figure BDA0003975772050000061
Ultima Pro DNA Library Prep Kit等。
一种HLA基因测序方法，包括采用所述的HLA基因测序文库构建的方法构建HLA基因测序文库，然后进行测序。
可选的，采用Illumina测序平台进行测序。
一种HLA基因分型方法，包括采用所述的HLA基因测序文库构建方法获得的文库进行测序后，对得到的测序数据进行生物信息学流程比对分析，得到单倍型序列，进行分型；
可选的，所述生物信息学流程比对分析，包括HLA-LA(Dilthey AT,etal.HLA*LA-HLA typing from linearly projected graph alignments.Bioinformatics.2019Nov 1；35(21):4394-4396)、xHLA(参考文献Xie,C.et al.(2017)Fast and accurate HLA typingfrom short-read next-generation sequence data withxHLA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,114,8059–8064)Kourami(参考文献Lee,H.,and Kourami,K.C.(2018)Graph-guided assembly for novel human leukocyte antigen allelediscovery.Genome Biol.,19,16)等。
可选的，所述生物信息学流程为HLA-LA
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的HLA基因扩增引物组，包括如下引物组中至少一组引物组组成的混合物：所述HLA-A引物组：正向引物HLA-AF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物HLA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；HLA-B引物组：正向引物HLA-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物HLA-BR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；HLA-C引物组：正向引物HLA-CF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物HLA-CR的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；HLA-DRB1引物组：正向引物HLA-DRB1F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物HLA-DRB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；正向引物HLA-DRB1F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物HLA-DRB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；HLA-DPB1引物组：正向引物HLA-DPB1F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物HLA-DPB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；正向引物HLA-DPB1F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物HLA-DPB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；HLA-DQB1引物组：正向引物HLA-DQB1F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，反向引物HLA-DQB1R1的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示；正向引物HLA-DQB1F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，反向引物HLA-DQB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；上述HLA基因扩增引物组，可以进行单管多重PCR扩增，可以在1个PCR管中对HLA-A、B、C、DRB1、DPB1、DQB1这6个基因同时进行扩增，通量高，降低了成本，简化了操作，且覆盖区域更广，使得后续的HLA基因分型的精确度更高，可达6位或8位。
2.本发明提供的HLA基因扩增引物组，相对已报道的采用三代测序如Pac-BioSMRT(参考文献Mayor NP,et al.HLA Typing for the Next Generation.PLoSOne.2015May 27；10(5):e0127153)、Oxford Nanopore(参考文献Liu C,et al.AccurateTyping of Human Leukocyte Antigen Class IGenes by Oxford NanoporeSequencing.J Mol Diagn.2018Jul；20(4):428-435.)的方法，本发明将扩增区域控制在2000-4000bp左右，降低了对DNA模板完整性的要求，避免了由待测样本DNA降解而导致扩增效率降低。同时，也减少了PCR扩增中引物延伸的时间，检测更快捷。
3.本发明提供的HLA基因分型方法，相比于目前市场上的液相杂交对HLA分型区域进行靶向捕获的高通量测序HLA分型方法，本发明直接采用多重PCR的方法对目标区域进行捕获，省去了杂交捕获这一步骤，节约了时间，降低了成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中HLA-A、B、C、DRB1、DPB1、DQB1基因的引物组扩增区域示意图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中：
2×PCR buffer购自TAKARA。
引物序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
NGS文库构建试剂盒购自翌圣生物科技(上海)有限公司。
DNA纯化磁珠(DNA cleaning Beads)购自翌圣生物科技(上海)有限公司。
2X Super Cannce II High-Fidelity Mix购自翌圣生物科技(上海)有限公司。
PCR Primer Mix购自翌圣生物科技(上海)有限公司。
实施例1一种HLA基因扩增的引物组、试剂盒
本实施例提供了一种HLA基因扩增的引物组，包括由如下引物组组成的混合物，下述的HLA-A、B、C、DRB1、DPB1、DQB1基因的引物组扩增区域示意如图1所示：
HLA-A引物组：正向引物HLA-AF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物HLA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
HLA-B引物组：正向引物HLA-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物HLA-BR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
HLA-C引物组：正向引物HLA-CF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物HLA-CR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
HLA-DRB1引物组：正向引物HLA-DRB1F1的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，反向引物HLA-DRB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；正向引物HLA-DRB1F2的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，反向引物HLA-DRB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
HLA-DPB1引物组：正向引物HLA-DPB1F1的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，反向引物HLA-DPB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；正向引物HLA-DPB1F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，反向引物HLA-DPB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；和
HLA-DQB1引物组：正向引物HLA-DQB1F1的核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示，反向引物HLA-DQB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；正向引物HLA-DQB1F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，反向引物HLA-DQB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
上述引物组混合物中，所述正向引物混合比例HLA-AF：HLA-BF：HLA-CF：HLA-DRB1F1：HLA-DRB1F2：HLA-DPB1F1：HLA-DPB1F2：HLA-DQB1F1：HLA-DQB1F2为0.8：0.8：0.8：1：1：0.8：0.8：1：1；
所述反向引物混合比例HLA-AR：HLA-BR：HLA-CR：HLA-DRB1R1：HLA-DRB1R2：HLA-DPB1R1：HLA-DPB1R2：HLA-DQB1R1：HLA-DQB1R2为0.8：0.8：0.8：1：1：0.8：0.8：1：1。
进一步的，本实施例提供了一种HLA基因扩增的试剂盒，所述试剂盒包括PCR扩增体系，以25μL为计，如下：
2×PCR buffer，12.5μL；
上述的HLA基因扩增引物组，1μL；
DNA模板，50-200ng；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.25μL；
余量用纯水补足至25μL；
所述HLA基因扩增引物组中，HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DPB1的引物组中每条引物的浓度为4μM，HLA-DQB1和HLA-DRB1的引物组中每条引物的浓度为5μM。
实施例2一种HLA基因扩增的引物组、试剂盒
本实施例与实施例1的区别在于：上述引物组混合物中，所述正向引物混合比例HLA-AF：HLA-BF：HLA-CF：HLA-DRB1F1：HLA-DRB1F2：HLA-DPB1F1：HLA-DPB1F2：HLA-DQB1F1：HLA-DQB1F2为0.7：0.7：0.7：0.8：0.8：0.7：0.7：0.8：0.8；
所述反向引物混合比例HLA-AR：HLA-BR：HLA-CR：HLA-DRB1R1：HLA-DRB1R2：HLA-DPB1R1：HLA-DPB1R2：HLA-DQB1R1：HLA-DQB1R2为0.7：0.7：0.7：0.8：0.8：0.7：0.7：0.8：0.8。
所述试剂盒包括PCR扩增体系，以25uL为计，如下：
2×PCR buffer，12.5μL；
上述的HLA基因扩增引物组，0.7μL；
DNA模板，50-200ng；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.4μL；
余量用纯水补足至25μL；
所述HLA基因扩增引物组中，HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DPB1的引物组中每条引物的浓度为2.1μM，HLA-DQB1和HLA-DRB1的引物组中每条引物的浓度为2.4μM。
实施例3一种HLA基因扩增的引物组、试剂盒
本实施例与实施例1的区别在于：上述引物组混合物中，所述正向引物混合比例HLA-AF：HLA-BF：HLA-CF：HLA-DRB1F1：HLA-DRB1F2：HLA-DPB1F1：HLA-DPB1F2：HLA-DQB1F1：HLA-DQB1F2为1：1：1：1：1：1：1：1：1；
所述反向引物混合比例HLA-AR：HLA-BR：HLA-CR：HLA-DRB1R1：HLA-DRB1R2：HLA-DPB1R1：HLA-DPB1R2：HLA-DQB1R1：HLA-DQB1R2为1：1：1：1：1：1：1：1：1。
所述试剂盒包括PCR扩增体系，以25uL为计，如下：
2×PCR buffer，12.5μL；
上述的HLA基因扩增引物组，1μL；
DNA模板，50-200ng；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.2μL；
余量用纯水补足至25μL；
所述HLA基因扩增引物组中，HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DPB1的引物组中每条引物的浓度为5μM，HLA-DQB1和HLA-DRB1的引物组中每条引物的浓度为5μM。
实施例4一种HLA基因扩增方法、测序文库构建方法、测序方法，基因分型方法
1、HLA基因扩增
使用QIAGEN血液基因组DNA提取试剂盒(货号69504)对已知HLA基因型别(通过HLA-SBT法分型，采用的试剂盒购自北京曼泰里生物技术有限公司)的血液样本(3例)提取DNA。采用Qubit 3.0(dsDNA HS Assay Kit)对提取的DNA样品进行浓度测定，将50-200ng的DNA样品作为DNA模板，然后利用实施例1中HLA基因扩增的引物组或试剂盒配制如下PCR扩增体系进行PCR扩增，所述PCR扩增体系如下：
2×PCR buffer，12.5μL；
HLA基因扩增引物组，1μL；
DNA模板，50-200ng；
TaKaRa LA的Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.25μL；
余量用纯水补足至25μL；
所述HLA基因扩增引物组中，HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DPB1的引物组中每条引物的浓度为4μM，HLA-DQB1和HLA-DRB1的引物组中每条引物的浓度为5μM；
所述PCR扩增的反应程序如下：
94℃保持1min；
20个循环(98℃保持10sec；68℃保持4min)；
72℃保持10min；
4℃保存。
2、PCR扩增产物质检
将上述获得的PCR扩增产物通过1％的琼脂糖凝胶进行电泳，观察有单一明亮的条带(由于每对引物获得的目的产物片段大小相差小，通过凝胶电泳观察，会集中在一起，因此形成的条带单一)出现，再用20uL的AMPureXP磁珠进行纯化，Qubit 3.0进行定量。
3、NGS文库构建
(1)酶切打断及末端修复
取50ng上述PCR产物，采用酶切的方法进行片段化。反应体系如下:
上述质检合格的DNA50ng；
Figure BDA0003975772050000141
Smearase(翌圣生物)5μL；
H2O补足到30μL；
反应程序如下：4℃保持1min；30℃保持20min；72℃保持20min。
(2)连接接头(Adapter)
反应体系如下:
上述步骤(1)中的产物，30μL；
快速连接缓冲液(Rapid Ligation buffer)，15μL；
快速连接酶(Rapid DNALigase)，2.5μL；
接头(Adapter)，2.5μL；
反应条件如下：20℃保持20min。
(3)磁珠筛选和纯化
S1.将40μL重悬浮DNA纯化磁珠(DNA cleaning Beads)加至连接产物管(步骤(2)中获得)开始纯化，最终使用100μL纯水回溶后进行下一步纯化。
S2.将60μL重悬浮DNA纯化磁珠加至S1步骤中纯水回溶后的样品管，吹打混匀，盖上盖子，短暂离心2s，静置5min。
S3.将PCR管重新离心后放在磁架，待所有磁珠被吸附在磁力架侧壁上时，使用300μL移液器小心转移上清至同样标记的PCR管中，不要扰动磁珠。
S4.加入40μL重悬浮DNA纯化磁珠至每个PCR管(S3步骤中最后上清转移至同样标记的PCR管)中进行纯化，最终加入10μL纯水回溶，静置5min；
S5.按下列比例配制PCR MIX(单个反应)：
2X Super Cannce II High-Fidelity Mix，12.5μL；
PCR Primer Mix，2.5μL
S6.将配制好的PCR MIX按15μL/管分装至对应流水号的PCR管中；
S7.将S4中静置5min后的反应管，放置磁力架上，将上清转至S6步骤中提前分装好的PCR MIX的对应流水号的PCR管中进行下一步实验。
(4)文库扩增
将上述的纯化产物进行PCR扩增，反应体系如下:
2X Super Cannce II High-Fidelity Mix，12.5μL；
PCR Primer Mix，2.5μL；
上述纯化产物，10μL；
反应条件如下：98℃保持1min；10个循环(98℃保持10s；60℃保持30s；72℃保持30s)；72℃保持5min。
(5)扩增产物纯化
将20μL重悬浮的DNA纯化磁珠加至文库扩增管开始纯化，最终使用30μL纯水回溶。
4、Illumina测序
采用Illumina测序平台对上述步骤获得的文库进行测序，PE150测序模式，每个样本1M数据量。
5、基因分型
通过对获得的测序数据进行生物信息学流程比对分析，采用HLA-LA分析流程，得到待测样本的HLA基因分型结果。结果如下表所示。
表1、HLA基因分型结果
Figure BDA0003975772050000161
/>
Figure BDA0003975772050000171
由上表1可知，与HLA-SBT法进行比对，结果显示，本发明的分型结果与HLA-SBT法全部一致，且精准度更高，可达到6位或8位。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于，在对测序数据进行分析的过程中，采用xHLA和Kourami两种分析流程对待测样本数据进行比较分析。结果见下表。
表2、HLA基因分型结果
Figure BDA0003975772050000172
Figure BDA0003975772050000181
上述结果显示，xHLA和Kourami流程的HLA分型结果中，均有与HLA-SBT法不一致的地方，且Kourami流程在DPB1的分型中，并无结果被输出，无法给出分型结果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种HLA基因扩增引物组，其特征在于，包括如下引物组中至少一组引物组组成的混合物：
HLA-A引物组：正向引物HLA-AF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物HLA-AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
HLA-B引物组：正向引物HLA-BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物HLA-BR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
HLA-C引物组：正向引物HLA-CF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物HLA-CR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
HLA-DRB1引物组：正向引物HLA-DRB1F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物HLA-DRB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；正向引物HLA-DRB1F2的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，反向引物HLA-DRB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
HLA-DPB1引物组：正向引物HLA-DPB1F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物HLA-DPB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；正向引物HLA-DPB1F2的核苷酸序列如SEQID NO.13所示，反向引物HLA-DPB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
HLA-DQB1引物组：正向引物HLA-DQB1F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，反向引物HLA-DQB1R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；正向引物HLA-DQB1F2的核苷酸序列如SEQID NO.17所示，反向引物HLA-DQB1R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
2.根据权利要求1所述的HLA基因扩增引物组，其特征在于，所述引物组混合时，所述正向引物混合摩尔比例HLA-AF：HLA-BF：HLA-CF：HLA-DRB1F1：HLA-DRB1F2：HLA-DPB1F1：HLA-DPB1F2：HLA-DQB1F1：HLA-DQB1F2为(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：(0.8～1)：(0.8～1)：(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：(0.8～1)：(0.8～1)；
所述反向引物混合摩尔比例HLA-AR：HLA-BR：HLA-CR：HLA-DRB1R1：HLA-DRB1R2：HLA-DPB1R1：HLA-DPB1R2：HLA-DQB1R1：HLA-DQB1R2为(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：(0.8～1)：(0.8～1)：(0.7-0.9)：(0.7-0.9)：(0.8～1)：(0.8～1)。
3.根据权利要求1或2所述的HLA基因扩增引物组，其特征在于，所述引物组混合时，所述正向引物混合比例HLA-AF：HLA-BF：HLA-CF：HLA-DRB1F1：HLA-DRB1F2：HLA-DPB1F1：HLA-DPB1F2：HLA-DQB1F1：HLA-DQB1F2为0.8：0.8：0.8：1：1：0.8：0.8：1：1；
所述反向引物混合比例HLA-AR：HLA-BR：HLA-CR：HLA-DRB1R1：HLA-DRB1R2：HLA-DPB1R1：HLA-DPB1R2：HLA-DQB1R1：HLA-DQB1R2为0.8：0.8：0.8：1：1：0.8：0.8：1：1。
4.一种HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的HLA基因扩增引物组。
5.根据权利要求4所述的HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液和/或Taq DNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述的HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增体系，以25uL为计，如下：
2×PCR buffer，12.5μL；
HLA基因扩增引物组，0.7-1μL；
DNA模板，50-200ng；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.2-0.4μL；
余量用纯水补足至25μL；
所述HLA基因扩增引物组中，HLA-A、HLA-B、HLA-C和/或HLA-DPB1的引物组中每条引物的浓度为2-5μM，HLA-DQB1和/或HLA-DRB1的引物组中每条引物的浓度为2-6μM；
可选的，包括PCR扩增体系，以25uL为计，如下：
2×PCR buffer，12.5μL；
HLA基因扩增引物组，1μL；
DNA模板，50-200ng；
Taq DNA聚合酶，5U/μL，0.25μL；
余量用纯水补足至25μL；
所述HLA基因扩增引物组中，HLA-A、HLA-B、HLA-C和/或HLA-DPB1的引物组中每条引物的浓度为4μM，HLA-DQB1和/或HLA-DRB1的引物组中每条引物的浓度为5μM。
7.一种HLA基因扩增方法，其特征在于，包括利用权利要求1-3任一项所述的HLA基因扩增引物组和/或权利要求4-6任一项所述的HLA基因扩增试剂盒进行PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的HLA基因扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃保持1min；98℃保持10sec，68℃保持4min，20个循环；72℃保持10min；4℃保存。
9.一种HLA基因测序文库构建的方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用权利要求1-3任一项所述的HLA基因扩增引物组、权利要求4-6任一项所述的HLA基因扩增试剂盒和/或权利要求7-8任一项所述的HLA基因扩增方法进行PCR扩增得到PCR扩增产物；
对PCR扩增产物进行文库构建。
10.一种HLA基因分型方法，其特征在于，包括采用权利要求9所述的HLA基因测序文库构建方法获得的文库进行测序后，对得到的测序数据进行生物信息学流程比对分析，得到单倍型序列，进行分型；
所述生物信息学流程比对分析包括HLA-LA、xHLA或Kourami。
CN202211530754.9A 2022-12-01 2022-12-01 一种用于hla基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法 Pending CN116179671A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211530754.9A CN116179671A (zh) 2022-12-01 2022-12-01 一种用于hla基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211530754.9A CN116179671A (zh) 2022-12-01 2022-12-01 一种用于hla基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116179671A true CN116179671A (zh) 2023-05-30

Family

ID=86439157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211530754.9A Pending CN116179671A (zh) 2022-12-01 2022-12-01 一种用于hla基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116179671A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5968879B2 (ja) Ｄｎａ分子タグ技術及びｄｎａ不完全断片化技術に基づいたｐｃｒシークエンシング法及びそれを用いたｈｌａ遺伝子タイピング法
WO2012000150A1 (zh) Hla-a，b基因分型用pcr引物及其使用方法
WO2012000153A1 (zh) 基于illuminaga测序技术的hla基因高分辨率分型方法
WO2018147438A1 (ja) Ｈｌａ遺伝子のｐｃｒプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法
Yin et al. Challenges in the application of NGS in the clinical laboratory
US20220228212A1 (en) Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphisms
WO2017135396A1 (ja) Ｐｃｒを用いないキャプチャー法によるｈｌａ遺伝子タイピング用プローブセット及びそれを用いたタイピング方法
WO2017185758A1 (zh) 用于微嵌合检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法
Kulski et al. In phase HLA genotyping by next generation sequencing-a comparison between two massively parallel sequencing bench-top systems, the Roche GS Junior and ion torrent PGM
TW201300528A (zh) Ｈｌａ－ｄｑｂ１基因分型的方法及其相關引子
CN112442530A (zh) 检测cah相关真假基因的方法
CN115125295A (zh) 一种用于多位点可持续使用的基因分型标准品
KR102475292B1 (ko) Hla 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도
CN112592972B (zh) 弥漫性毒性甲状腺肿易感基因的早筛方法及试剂盒
CN116179671A (zh) 一种用于hla基因分型的扩增引物组、试剂盒及方法
CN113943789A (zh) 一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr方法、引物及试剂盒
CN112210597A (zh) 基于长DNA片段目标捕获及MinION长读数对HLA探针文库进行测序的方法
CN117143997B (zh) 一种用于pkd1基因突变检测的引物组、试剂盒及检测方法
CN115354072A (zh) 一种用于hla-dqa1基因分型的引物组和分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20240102

Address after: Room 203f, a7 / F, bio nano Park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, 215000, Jiangsu Province

Applicant after: Suzhou aogen Diagnostic Technology Co.,Ltd.

Address before: 201114 Room 401, building 1, No. 760, Xinjun Ring Road, Minhang District, Shanghai

Applicant before: Shanghai Augen Diagnostic Technology Co.,Ltd.