WO2017135396A1 - Ｐｃｒを用いないキャプチャー法によるｈｌａ遺伝子タイピング用プローブセット及びそれを用いたタイピング方法 - Google Patents

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一善 細道
猪子　英俊
敦 田嶋
逸朗 井ノ上
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ジェノダイブファーマ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a novel probe set used in HLA genotyping using a sequence capture method. More specifically, it is possible to comprehensively capture HLA region genes, and at the same time include probes for HLA pseudogenes, enabling specific and efficient capture of HLA genes, and simultaneous typing of multiple samples. It relates to a probe set.
  • HLA Human leukocyte antigen
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA-A, HLA-B, HLA-C Class I molecules expressed in almost all cells and mainly expressed in cells of the immune system
  • Class II molecules HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP.
  • the gene region encoding HLA is located in human chromosome 6 short arm 6p21.3, class I region (HLA-A, HLA-C, HLA-B, etc.) from the telomere side toward the centromere side, Class III region, class II region (HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, etc.) are arranged in this order, and many genes are encoded at very high density. The relationship between transplantation, blood transfusion, drug side effects and various diseases has been reported. There is no HLA gene in the class III region, and genes such as complement components and tumor necrosis factor (TNF) are present.
  • TNF tumor necrosis factor
  • HLA-DRB gene region encoding the ⁇ chain of the HLA-DR antigen.
  • pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome in addition to HLA-DRB1.
  • HLA-DRB5 (DR51) gene and pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome in addition to HLA-DRB1.
  • DR3 DR52
  • HLA-DRB2 HLA-DRB9
  • DR4 DR7 and DR9 types
  • pseudogenes such as HLA-DRB4 (DR53) gene
  • HLA-DRB7, HLA-DRB8 and HLA-DRB9 are located on the same chromosome.
  • DR8 type no HLA-DRB gene other than HLA-DRB1 is located on the same chromosome.
  • Each allele exon has a plurality of polymorphic regions, and the base sequence (amino acid sequence) of a polymorphic region is often common to a plurality of alleles. That is, each HLA allele is defined by a combination of multiple polymorphic regions. In the HLA class I antigen, exon 2 or exon 3 having the same base sequence as well as the polymorphic region in the exon may be common to a plurality of alleles. Recently, it is becoming clear that the 5 'terminal promoter / enhancer region, 5' UT region, 3 'UT region, intron, and the like of the HLA gene have many functional polymorphisms related to transcriptional regulation. There are many pseudo-HLA genes with defects in these gene structures in the HLA region, but whether these pseudo-genes are simply the remnants of genes that have no biological function or have some biological function. Is not clear.
  • HLA has an extremely high number of alleles due to the presence of advanced polymorphisms.
  • DNA typing to determine HLA allele is not only related to the matching of histocompatibility between donor and recipient at the time of transplantation, but also protects and severely affects lifestyle-related diseases, autoimmune diseases, cancer, and viral infections. There are also reports that correlate with chemical side effects and drug side effects.
  • Non-Patent Document 1 discloses that specific HLA alleles involved in disease development or are non-HLA genes in strong linkage disequilibrium with specific HLA alleles involved? Often unknown. This is considered to be caused by the fact that the entire picture of the HLA genomic region is unclear.
  • NGS Next Generation Sequencer
  • This DNA typing method by NGS is based on the positional relationship of multiple polymorphic cis-trans, which is a problem in the conventional PCR-SSO (Sequence Specific Oligonucleotide) -Luminex method and PCR-SBT (Sanga method-based Sequence Based Typing) method. Since it cannot be determined accurately, so-called phase ambiguity does not occur, and polymorphisms in the intron region and promoter region can be detected, so the gene structure is the same as other expressed HLA genes, but the expression is It has the advantage of being able to detect a null allele that is suppressed, and of being able to type many samples at once.
  • the RCR method which is essential in these conventional methods including the NGS method, involves misbase incorporation by DNA polymerase during PCR amplification, and DNA extension is transferred from other chromosomes (for example, from maternally derived chromosomes to paternally derived chromosomes). ) And the production of chimeric molecules by switching to other genes with high homology, and the phenomenon that specific alleles are not amplified due to polymorphisms in the genomic region corresponding to PCR primers (allelic drops) .
  • One of the objects of the present invention is to develop an accurate HLA typing that replaces the PCR method, which has various problems that cause such an HLA typing error.
  • the sequence capture method in which DNA from a sample is made into a library, and then the DNA fragments derived from the HLA gene are selectively concentrated and PCR amplified with a small number of cycles, is difficult to solve the conventional PCR method. Is effective as a method for selectively concentrating a plurality of HLA genes.
  • the probes used in the conventional sequence capture method for example, it is difficult to comprehensively type gene loci existing in the HLA region and simultaneously type multiple samples.
  • an object of the present invention is to design a novel probe set specialized in the HLA region that can overcome the HLA typing error in the PCR method as described above and the disadvantages of the conventional sequence capture method.
  • a further object of the present invention is to provide a typing method that can simultaneously process multiple specimens and comprehensively capture genes in the HLA region by using the probe set.
  • Another object of the typing method of the present invention is to enable precise typing that enables specific and efficient capture of each HLA gene by including a probe for an HLA pseudogene in the probe set.
  • the present inventors have conducted intensive research, and as a result, 355 oligonucleotides having a base sequence specific to 37 HLA genes or HLA-like genes in the HLA region, which will be described in detail below. It was found that 37 HLA genes or base sequences of HLA-like genes can be determined simultaneously for multiple specimens by using a probe set consisting of, and the present invention was completed. That is, the present invention provides a probe set for HLA genotyping comprising oligonucleotides each having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 355. Furthermore, the present invention provides a method for typing an HLA gene using the probe set.
  • the probe set of the present invention also includes probes designed for pseudogenes (hereinafter referred to as “pseudoprobes”). By appropriately removing DNA fragments bound to the pseudoprobes, important HLA genes can be efficiently used. Typing.
  • the probe of the present invention comprises 32 genes contained in the HLA region (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA -DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB2, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DRB6, HLA-DRB7, HLA-DRB8, HLA-DRB9, HLA-E , HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-V, HLA-Y,
  • Each HLA gene in the reference sequence HG19 / GRCh37 of the human genome is present in the region described in Table 1 below, and it is common to design a probe that covers that region.
  • each of the above regions includes a region where it is difficult to design an effective probe due to the presence of repeat sequences and GC, and it is necessary to design a probe based on a sequence that is somewhat unique.
  • 333 novel probes effective for specifically capturing each gene were designed based on the regions shown in Table 2 below, based on the regions described in Table 1 above.
  • the probe design start position and probe design end position in Table 2 indicate positions in the reference sequence (HG19 / GRCh37).
  • the base sequences shown in Tables 3 to 8 are synthetic sequences prepared by selecting a majority base from the allele base sequences of HLA genes registered so far and making them all intermediate. By adding probes designed based on these sequences, it is possible to prevent a decrease in capture efficiency in a sample having an HLA genotype having a large difference from the reference sequence, and to obtain a stable sequence yield.
  • each probe of the present invention is basically based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to 355, but one to several (for example, within 10%, preferably within 5%, more preferably within the total length of the probe) 3% or less, more preferably 1% or less) may have a base sequence substituted, deleted, or inserted. However, it is limited to those that exhibit the probe function intended in the present invention.
  • the probe set according to the present invention includes probes consisting of 355 oligonucleotides including 333 probes designed based on the reference sequence and 22 additional probes designed based on the customized sequence.
  • Each probe has a base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 355.
  • the reason for including many pseudo HLA gene probes is to enable typing of the pseudo HLA gene and to capture the expressed HLA gene specifically and efficiently.
  • the present invention provides an HLA gene typing method including sequence capture using the above probe set.
  • An outline of a typing method using the sequence capture method is shown in FIG. Specifically, the method includes the following steps. (1) A step of fragmenting DNA contained in a sample obtained from a subject. (2) A step of mixing and hybridizing the DNA fragment fragmented in the step (1) with the probe set of the present invention. (3) A step of concentrating the DNA fragment hybridized with the probe. (4) A step of detaching the probe from the concentrated DNA fragment and sequencing the obtained DNA fragment.
  • the step of fragmenting DNA contained in a sample obtained from a subject is performed using a conventional method in this field. Both ends of the fragmented DNA are smoothed as necessary, and preferably an adapter containing a unique index for each subject (specimen) is ligated.
  • each probe included in the probe set needs to be attached with a label capable of binding to a label carried on a separation carrier such as beads in a subsequent concentration step.
  • Biotin is preferably used as the substance for labeling the probe.
  • the DNA fragment hybridized with the probe is concentrated by binding to a separation carrier.
  • a separation carrier when the probe is labeled with biotin, magnetic beads having streptavidin immobilized on the surface are preferably used.
  • the DNA fragment hybridized with the probe is immobilized on the surface of the carrier for separation (magnetic beads) by interaction with biotin and streptavidin, and the target DNA fragments are concentrated by adsorbing the magnetic beads to a magnet.
  • DNA fragments that have not hybridized with the probe are removed by washing.
  • the concentrated DNA fragment and the probe are desorbed using a conventional method.
  • the desorbed DNA fragment is subjected to PCR amplification as necessary, and the base sequence is determined using a sequence analyzer or the like. Thereafter, data analysis or mapping based on the base sequence information is performed as necessary.
  • 355 probes SEQ ID NOs: 1 to 355 were designed and synthesized.
  • the target DNA was concentrated by the sequence capture method, the probes were desorbed, and then sequenced using NGS.
  • Tables 10 to 29 below. Although all HLA loci were capable of typing up to the 4th section (8 digits) level, the information on the reference sequence for many alleles was poor, and the 3rd section (6 digits) level or the 2nd section Since only names up to (4 digits) level are shown, Tables 10 to 29 all indicate alleles at the third zone (6 digits) level or the second zone (4 digits) level.
  • a DNA library for HLA gene sequencing was prepared using a commercially available kit. That is, 100 ng of DNA was cleaved into fragments centered at 300 bp using a Covaris S2 acoustic solver (Covaris), and used as a library in the steps of DNA fragment end repair, adenine addition, and adapter ligation. At this time, the adapter was adjusted so as to have a maximum of 96 types of index arrays that differ from sample to sample.
  • Covaris Covaris
  • Ligated DNA library was measured for fragment length by Bioanalyzer (Agilent) and DNA concentration by Qubit2.0 (Thermo Fisher Scientific). Based on the measurement information, adjusted DNA library of up to 96 samples was measured. Mixed at molarity.
  • the mixed DNA library was used for sequence capture for region enrichment targeted by the probe of the present invention.
  • SeqCap EZ choice (Roche Diagnostics) synthesized by the above custom design was used, and the mixed DNA library and SeqCap EZ choice custom oligo probe were hybridized at 47 ° C. for 64 hours. All hybridization and subsequent washing steps were performed according to the SeqCap EZ protocol.
  • the DNA fragment of the target region hybridized with the custom oligo probe was PCR-amplified with an adapter sequence and specific primers to obtain a library for sequencing.
  • MiSeq was used as the sequence of a mixed library of up to 96 samples, and nucleotide sequence data was obtained at 300 bp paired ends.
  • HLA-DQA2, HLA-DQB2, HLA-DQB3, HLA-DPA2, HLA-DPB2, and HLA-DQB2, which do not have an allyl name, are used.
  • HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, HLA-DOB by adding HLA-Y gene to 31 genes excluding 6 genes of HLA-DPA3 , HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB2, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DRB6, HLA-DRB7, HLA -DRB8, HLA-DRB9, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-V, HLA-Y, determination of allyl MICA and MICB) was possible.
  • HLA-DQA2, HLA-DQB2, HLA-DQB3, HLA-DPA2, HLA-DPB2, and HLA-DPA3 have been determined, but all of them are reference sequences in the IMGT / HLA database. Since no allyl name is named, the allyl name cannot be determined and is not included in Tables 10 to 29.
  • HLA-Y is a pseudogene.
  • DRB1 * 14: 01 and DRB1 * 14: 54: 01 differ only in the single nucleotide polymorphism (SNP) of exon 3.

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Abstract

本不明は、ＰＣＲ法におけるＨＬＡタイピングのエラー並びに従来のシークエンスキャプチャー法の欠点を克服した、ＨＬＡ領域に特化された新規なプローブセットをデザインした。当該プローブセットを用いることによって、多検体を同時に処理できるとともに、ＨＬＡ領域の遺伝子を網羅的に捕捉できる。当該プローブセットにＨＬＡ偽遺伝子に対するプローブも含めることにより、各ＨＬＡ遺伝子の捕捉をそれぞれ特異的、かつ効率よく行える精密なタイピングが可能になる。本発明は、配列番号：１～３５５に示す塩基配列を各々有するオリゴヌクレオチドからなる、偽遺伝子を含むＨＬＡ遺伝子タイピング用プローブセット及び当該プローブセットを用いた、偽遺伝子を含むＨＬＡ遺伝子タイピング方法に関する。

Description

ＰＣＲを用いないキャプチャー法によるＨＬＡ遺伝子タイピング用プローブセット及びそれを用いたタイピング方法
　本発明は、シークエンスキャプチャー法を用いたＨＬＡ遺伝子タイピングにおいて使用する新規なプローブセットに関する。より詳細には、ＨＬＡ領域の遺伝子を網羅的に捕捉できると同時に、ＨＬＡ偽遺伝子に対するプローブも含めることにより、ＨＬＡ遺伝子の捕捉を特異的、かつ効率よく行え、なおかつ多検体の同時タイピングを可能にするプローブセットに関する。
　ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっている。主なものとして６種類の抗原が知られており、ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ分子（ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰ）が含まれる。
　ＨＬＡをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｂ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、移植、輸血、薬剤副作用及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスＩＩＩ領域にはＨＬＡ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。
　ＨＬＡ－ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子領域には５種類の構造多型が確認されている。ＤＲ１型やＤＲ１０型では、同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ１の他にＨＬＡ－ＤＲＢ６やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ２型では、同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ１の他にＨＬＡ－ＤＲＢ５（ＤＲ５１）遺伝子やＨＬＡ－ＤＲＢ６やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲ６型では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ３（ＤＲ５２）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ２やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ４、ＤＲ７およびＤＲ９型では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ４（ＤＲ５３）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ７、ＨＬＡ-ＤＲＢ８やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、ＤＲ８型では、同一染色体上にＨＬＡ－ＤＲＢ１以外のＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子は位置しない。
　各アリルのエクソンには多型性を示す複数の領域が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のアリルに共通であることも多い。すなわち各ＨＬＡアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＨＬＡクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が、複数のアリルに共通であることもある。最近では、ＨＬＡ遺伝子の５‘末端のプロモーター・エンハンサー領域、５’ＵＴ領域、３‘ＵＴ領域、イントロンなどにも多くの転写調節に関わる機能的な多型を有することも明らかになりつつある。ＨＬＡ領域には、これらの遺伝子構造に欠陥をもつ偽ＨＬＡ遺伝子も数多く存在するが、これらの偽遺伝子が生物学的機能を持たない単なる遺伝子の残骸か、何らかの生物学的機能を持っているかは、明らかでない。
　ＨＬＡには高度な多型が存在するため対立遺伝子（アリル）の種類が極めて多いことも知られている。一方、ＨＬＡアリルを判定するＤＮＡタイピングは、移植の際のドナーとレシピエントとの組織適合性の一致に関連するのみならず、生活習慣病や自己免疫疾患、癌、ウイルス感染症における防御と重症化、薬剤副作用等と相関するとの報告もある。
　しかしながら、従来のＤＮＡタイピング法で解明される情報の範囲では、特定のＨＬＡアリルが疾患発症にかかわっているのか、あるいは特定のＨＬＡアリルと強い連鎖不平衡にある非ＨＬＡ遺伝子が関与しているのか不明な場合が多い。これは、ＨＬＡゲノム領域の全体像が未解明であることが原因であると考えられる（非特許文献１）。
　近年、いわゆる「次世代シークエンサー（Next Generation Sequencer：ＮＧＳ）」の出現により、高スループットでのＤＮＡタイピングが可能となっているが、次世代シークエンサーで採用されているＤＮＡタイピング法の主流は、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）よって産生されるＰＣＲ産物をＮＧＳにより塩基配列決定する方式である。
　このＮＧＳによるＤＮＡタイピング法は、従来のＰＣＲ―ＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）－Ｌｕｍｉｎｅｘ法やＰＣＲ－ＳＢＴ（サンガ法によりＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ｔｙｐｉｎｇ）法で問題となる複数の多型のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができない、いわゆるフェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ　ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じないこと、イントロン領域やプロモーター領域における多型をも検出できるため、遺伝子構造は他の発現ＨＬＡ遺伝子と変わらないが発現が抑制されるヌル（ｎｕｌｌ）アリルの検出が可能であること、さらには多数の検体を一度にタイピングできること、という長所をもつ。
　ＮＧＳ法を含めてこれらの従来法で必須とされているＲＣＲ法は、ＰＣＲ増幅時のＤＮＡポリメラーゼによる誤塩基取り込み、ＤＮＡ伸長が他の染色体（例えば、母方由来染色体から、父方由来染色体への乗り換え）や相同性の高い他の遺伝子への乗り換えによるキメラ分子の産生、ＰＣＲプライマーに相当するゲノム領域の多型による特定のアリルが増幅されない現象（アリルドロップ）といった解決困難な問題を有している。本発明の目的の一つは、このようなＨＬＡタイピングのエラーの原因となる諸問題をかかえるＰＣＲ法に代わる、正確なＨＬＡタイピングを開発することである。
　一方、検体からのＤＮＡをライブラリ化した後、ＨＬＡ遺伝子由来のＤＮＡ断片を選択的に濃縮し、これを少ないサイクル数でＰＣＲ増幅をするシークエンスキャプチャー法は、従来法におけるＰＣＲ法の解決困難な問題を解消でき、複数のＨＬＡ遺伝子を選択的に濃縮する方法として有効である。しかしながら、従来のシークエンスキャプチャー法で用いられていたプローブでは、例えばＨＬＡ領域に存在する遺伝子座を網羅的に、かつ多検体を同時にタイピングすることが困難であった。
ＷＯ２０１３／０１１７３４号パンフレット
「次世代シークエンサーによるＨＬＡ領域のターゲットリシークエンス」、細道一善、他、医学のあゆみ、Vol.233、No.13（2010年）1187～1191頁
　よって本発明は、上記のようなＰＣＲ法におけるＨＬＡタイピングエラー並びに従来のシークエンスキャプチャー法の欠点を克服できるＨＬＡ領域に特化された新規なプローブセットをデザインすることを目的とする。さらに本発明は、前記プローブセットを用いることによって、多検体を同時に処理できるとともに、ＨＬＡ領域の遺伝子を網羅的に捕捉できるタイピング方法を提供することを目的とする。本発明のタイピング方法では、当該プローブセットにＨＬＡ偽遺伝子に対するプローブも含めることにより、各ＨＬＡ遺伝子の捕捉をそれぞれ特異的、かつ効率よく行える精密なタイピングを可能にすることも目的としている。
　前記の課題を解決するために本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、下記に詳述する、ＨＬＡ領域の３７個のＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ様遺伝子に特有の塩基配列を持つ３５５個のオリゴヌクレオチドからなるプローブセットを用いることにより、多検体について同時に３７個のＨＬＡ遺伝子、またはＨＬＡ様遺伝子の塩基配列の決定が可能であり、タイピングできることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、配列番号１～３５５に示す塩基配列を各々有するオリゴヌクレオチドからなるＨＬＡ遺伝子タイピング用プローブセットを提供する。さらに本発明は、前記プローブセットを用いたＨＬＡ遺伝子のタイピング方法を提供する。
　本発明のプローブセットは偽遺伝子に対してデザインされたプローブ（以下、「偽プローブ」と称する）も含んでおり、偽プローブに結合したＤＮＡ断片を適宜除去することにより、重要なＨＬＡ遺伝子を効率的にタイピングできる。本発明のプローブはＨＬＡ領域に含まれる３２遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＨＬＡ－ＤＲＢ６、ＨＬＡ－ＤＲＢ７、ＨＬＡ－ＤＲＢ８、ＨＬＡ－ＤＲＢ９、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｋ、ＨＬＡ－Ｌ、ＨＬＡ－Ｖ、ＨＬＡ－Ｙ、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）を網羅的にタイピングできるようにデザインされているため、多検体（現時点で最大９６検体）のこれら３２遺伝子座を同時にアリル（ＩＭＧＴ／ＨＬＡのデータベースで命名されているアリル名）を決定することが可能になる。また、特定のＨＬＡ遺伝子のみを増幅するＰＣＲの行程を含まないので、ＨＬＡタイピングの日常検査に欠かせない全自動化が可能になる。さらには、ＰＣＲを用いた従来法（ＮＧＳを用いた方法も含む）に比較して操作が簡易であり費用も安価にすることができる。
シーケンスキャプチャー法を用いた遺伝子タイピング方法の概略を示す図である（日本組織適合性学会誌、第22巻、第2号、2015年、第89頁から引用）。
　ヒトゲノムのリファレンス配列ＨＧ１９／ＧＲＣｈ３７における各ＨＬＡ遺伝子は、およそ下記の表１に記載の領域に存在しており、その領域をカバーするようなプローブを設計するのが一般的である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　しかしながら、上記各領域には、リピート配列やＧＣが存在するために有効なプローブ設計が困難な領域が含まれ、或る程度ユニークな配列を基礎としてプローブ設計をすることが必要である。また、各ＨＬＡ遺伝子間の配列に類似する部分が存在するため、各遺伝子を特異的に捕捉するプローブの設計には困難が伴う。
　本発明では、上記表１に記載の領域を基礎としながら、下記の表２に示した領域に基づいて各遺伝子を特異的に捕捉するのに有効な３３３個の新規なプローブを設計した。
　なお、表２におけるプローブ設計開始位置及びプローブ設計終端位置は、リファレンス配列（ＨＧ１９／ＧＲＣｈ３７）における位置を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　さらに本発明では、表１において「*」を付した遺伝子について、独自にカスタマイズした以下の表３～表８に示す塩基配列を用いて追加的なプローブを設計した。
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　前記表３～表８に示す塩基配列に基づいて、以下の表９に示す領域で２２個の追加的プローブを設計した。前記表３～８に示した塩基配列は、これまでに登録されているＨＬＡ遺伝子のアリル塩基配列から多数派となる塩基を選び、全アリルで中間的となるように作成した合成配列である。これらの配列に基づいて設計したプローブを追加することにより、リファレンス配列との違いが大きいＨＬＡ遺伝子型をもつサンプルにおけるキャプチャー効率の低下を防ぎ、安定したシーケンス収量を得ることができる。
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 　本明細書に記載したプローブ設計開始（又は終端）位置の表記は、ＵＣＳＣのＢＥＤフォーマットに従って記載されている。また、表２及び表９における「Ｎｏ．」の数字は配列表における配列番号に対応している。
　本発明の各プローブは、配列番号：１～３５５に示す塩基配列を持つことを基本とするが、１個から数個（例えば、プローブ全長の１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは３％以内、さらに好ましくは１％以内）の塩基が置換、欠失、又は挿入された塩基配列を有するものであってもよい。ただし、本発明で意図するプローブ機能を発揮するものに限られる。
　即ち、本発明に係るプローブセットは、リファレンス配列に基づいて設計した３３３個のプローブと、カスタマイズされた配列に基づいて設計した２２個の追加的プローブを含む３５５個のオリゴヌクレオチドからなるプローブを含み、各々のプローブは配列番号１～３５５に示す塩基配列を有する。多くの偽ＨＬＡ遺伝子のプローブを含めた理由は、偽ＨＬＡ遺伝子のタイピングを可能にするとともに、発現ＨＬＡ遺伝子の捕捉をそれぞれ、特異的、かつ効率よく行うためである。
　さらに本発明は、上記のプローブセットを用いたシーケンスキャプチャーを含むＨＬＡ遺伝子のタイピング方法を提供する。
シーケンスキャプチャー法を用いたタイピング方法の概略を図１に示す。当該方法は、具体的には、以下の工程を含む。
（１）被験者から得たサンプル中に含まれるＤＮＡを断片化する工程。
（２）行程（１）で断片化したＤＮＡ断片を上記本発明のプローブセットと混合してハイブリダイズさせる工程。
（３）プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を濃縮する工程。
（４）濃縮したＤＮＡ断片からプローブを脱離させ、得られたＤＮＡ断片の配列決定をする工程。
　（１）被験者から得たサンプル中に含まれるＤＮＡを断片化する工程は、当該分野のおける常法を用いて実施される。断片化されたＤＮＡの両末端は必要に応じて平滑化し、好ましくは、被験者（検体）毎に特有のインデックスを含むアダプターをライゲーションする。
　（２）（１）で得られたＤＮＡ断片を、本発明のプローブセットと混合してハイブリダイズさせる。ハイブリダイズさせる条件は以下の通りである。
　ハイブリダイゼーションの温度：４７℃
　反応時間：２４時間以内
　その他の条件は従来通りである。
　なお、ハイブリダイズさせる前に、プローブセットに含まれる各プローブには後の濃縮工程においてビーズ等の分離用担体に担持された標識と結合可能な標識を付加しておくことが必要である。プローブを標識する物質としては、ビオチンを用いるのが好ましい。
　（３）次いで、プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を分離用担体に結合させることにより濃縮する。分離用担体としては、プローブがビオチン標識されている場合には、表面にストレプトアビジンを固定化した磁気ビーズが好ましく用いられる。
　プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片は、ビオチンとストレプトアビジンと相互作用により分離用担体（磁気ビーズ）表面に固定化され、当該磁気ビーズを磁石に吸着させることにより目的とするＤＮＡ断片が濃縮される。一方、プローブとハイブリダイズしなかった（ＨＬＡ遺伝子関連以外の）ＤＮＡ断片は洗浄により除去される。
　（４）次に、濃縮したＤＮＡ断片とプローブとを、常法を用いて脱離させる。脱離したＤＮＡ断片は、必要に応じてＰＣＲ増幅した後、シークエンス解析装置等を用いて塩基配列が決定される。その後、必要に応じて塩基配列情報に基づくデータ分析又はマッピングなどを実施する。
　表２及び表９に記載した領域に基づいて、３５５個のプローブ（配列番号：１～３５５）を設計して合成した。
　４０検体のＤＮＡサンプルについて、得られた３５５個のプローブを用いて、シーケンスキャプチャー法により目的とするＤＮＡを濃縮し、プローブを脱離させた後に、ＮＧＳを用いて配列決定した。その結果を以下の表１０～表２９に示す。なお、いずれのＨＬＡ遺伝子座についても第４区域（８桁）レベルまでのタイピングが可能であったが、多くのアリルについてリファレンス配列の情報が乏しく、第３区域（６桁）レベルあるいは第２区域（４桁）レベルまでしか命名されていないので、表１０～表２９ではすべて第３区域（６桁）レベルあるいは第２区域（４桁）レベルでのアリルを表記した。
　具体的な工程は以下の通りである。
　ＨＬＡ遺伝子のシーケンスのためのＤＮＡライブラリーを市販のキットを用いて調整した。すなわち、ＤＮＡ１００ｎｇを、Ｃｏｖａｒｉｓ　Ｓ２アコースティックソルビライザー（Ｃｏｖａｒｉｓ）にて３００ｂｐを中心とした断片に切断し、ＤＮＡ断片の末端修復、アデニン付加、アダプターライゲーションの工程にてライブラリーとした。このときアダプターはサンプルごとに異なる最大９６種類のインデックス配列を持つように調整した。
　ライゲーションしたＤＮＡライブラリーはバイオアナライザー（アジレント）により断片長を、Ｑｕｂｉｔ２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック）によりＤＮＡ濃度を測定し、測定情報にもとづいて、最大９６サンプルの調整済みＤＮＡライブラリーを等モル濃度にて混合した。
　混合したＤＮＡライブラリーを本発明プローブが対象とする領域濃縮のためのシーケンスキャプチャーに用いた。シーケンスキャプチャーには上述のカスタムデザインにより合成したＳｅｑＣａｐＥＺ　ｃｈｏｉｃｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、混合ＤＮＡライブラリーとＳｅｑＣａｐＥＺ　ｃｈｏｉｃｅのカスタムオリゴプローブを４７℃で６４時間ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションならびにその後の洗浄の工程は全てＳｅｑＣａｐＥＺのプロトコールに従って行った。
　カスタムオリゴプローブにハイブリダイズした目的領域のＤＮＡ断片はアダプター配列と特異的プライマーによりＰＣＲ増幅してシーケンスのためのライブラリーとした。最大９６サンプルの混合ライブラリーのシーケンスはＭｉＳｅｑを用い、３００ｂｐのペアエンドにて塩基配列のデータを得た。
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　表１０～２９に示されるように、表１に示したプローブに用いた３７遺伝子のなかで、アリル名を持たないＨＬＡ－ＤＱＡ２，ＨＬＡ－ＤＱＢ２，ＨＬＡ－ＤＱＢ３，ＨＬＡ－ＤＰＡ２，ＨＬＡ－ＤＰＢ２，及びＨＬＡ－ＤＰＡ３の６遺伝子を除く３１遺伝子に、ＨＬＡ－Ｙ遺伝子を加えた３２遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＨＬＡ－ＤＲＢ６、ＨＬＡ－ＤＲＢ７、ＨＬＡ－ＤＲＢ８、ＨＬＡ－ＤＲＢ９、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｈ、ＨＬＡ－Ｊ、ＨＬＡ－Ｋ、ＨＬＡ－Ｌ、ＨＬＡ－Ｖ、ＨＬＡ－Ｙ、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）のアリルの決定が可能であった。
　ＨＬＡ－ＤＱＡ２，ＨＬＡ―ＤＱＢ２，ＨＬＡ－ＤＱＢ３，ＨＬＡ－ＤＰＡ２，ＨＬＡ－ＤＰＢ２，及びＨＬＡ－ＤＰＡ３の６遺伝子は、それぞれ塩基配列は決定されたが、いずれもＩＭＧＴ／ＨＬＡデータべースにリファレンス配列がなく、アリル名も命名されていないので、アリル名を決定できず、表１０～２９には含まれていない。
　プローブに含まれていないＨＬＡ－Ｙ遺伝子のアリルが決定できたのは、他のクラスＩ遺伝子プローブとの相同性の高さにより、ＨＬＡ－Ｙ遺伝子も捕捉されたものと思われる。なお、このＨＬＡ－Ｙは全てのヒトに存在するわけではなく、ＨＬＡ－Ａ３１や－Ａ３３ハプロタイプにのみに特異的に存在していた。なお、ＨＬＡ－Ｙは偽遺伝子である。
　次に、ＰＣＲを用いる従来法であるＬｕｍｉｎｅｘ法を用いて同一の検体の配列タイピングを行った。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１における結果を対比して以下の表３０～３４に示す。
　表３０～３４に示した結果から明らかなように、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子については、本発明の方法で得られたタイピング結果とＬｕｍｉｎｅｘ法で得られた結果とが完全に一致した。
　一方、Ｔ３２０およびＴ３３４検体のＨＬＡ－Ｃについては、本発明の方法においては、従来法では検出できなかった頻度が稀なアリル（HLA-C*08:22およびHLA-C*04:82）を正確にタイピングすることができたため、Ｌｕｍｉｎｅｘのタイピング結果とは相違している。
　また、エクソン３の多型を検出していないＬｕｍｉｎｅｘ法では「DRB1*14:01」とタイピングされたアリルについて、本発明では「DRB1*14:54:01」と正しくタイピングされた。なお、DRB1*14:01と DRB1*14:54:01はエクソン３の一塩基多型（ＳＮＰ）のみに違いがある。
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Claims (5)

  1. 配列番号：１～３５５に示す塩基配列を各々有するオリゴヌクレオチドからなる、偽遺伝子を含むＨＬＡ遺伝子タイピング用プローブセット。
  2. ビオチン付加されている、請求項１に記載のプローブセット。
  3. 被験者から得たサンプル中に含まれるＤＮＡを断片化する工程、
    前記行程で断片化したＤＮＡ断片を請求項１に記載のプローブセットと混合してハイブリダイズさせる工程、
    プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を濃縮する工程、
    濃縮したＤＮＡ断片からプローブを脱離させ、得られたＤＮＡ断片の配列決定をする工程、
    を含む、ＨＬＡ遺伝子のタイピング方法。
  4. 前記プローブセットに含まれる各オリゴヌクレオチドがビオチン標識され、前記濃縮する工程が、ストレプトアビジン固定化ビーズを添加することにより実施される、請求項３に記載のタイピング方法。
  5. ＤＮＡ断片の配列決定をする前に、ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する工程を更に含む、請求項３又は４に記載のタイピング方法。
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