CN113943789A - 一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr方法、引物及试剂盒 - Google Patents

一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重pcr方法、引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR‑SBT方法、引物及试剂盒。所述多重PCR‑SBT方法对24个红细胞血型系统基因在同一多重扩增反应体系、反应程序和测序反应下进行分型，具体包括以下步骤：(1)制备人基因组DNA，作为PCR扩增的模板；(2)在同一PCR反应体系中，提供多对扩增引物，用聚合酶链反应多重扩增人基因组DNA中24个红细胞抗原系统的基因序列；(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(4)提供测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序PCR反应；(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。

Description

一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR方法、引物及 试剂盒
技术领域
本申请属于人红细胞血型抗原系统基因分型技术领域，尤其是涉及一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR方法，以及特异性的扩增引物和测序引物以及包含这些引物的试剂盒。
背景技术
红细胞血型是最好的人类遗传标记之一，在临床输血、器官移植以及法医学个体识别和亲子鉴定等方面具有重要的意义。红细胞血型抗原大致可分为蛋白抗原、糖蛋白和糖脂上的抗原两类。个体间不同的血型系统呈现一定的多态性，可通过输血、妊娠或者造血干细胞移植等途径免疫刺激产生同种抗体，造成溶血反应。因此，研究红细胞血型抗原系统，提供有效的检测方法，有助于明确个体红细胞血型抗原系统的基因型，避免产生相应的抗体。
截止2021年2月，国际输血协会(ISBT)明确命名的红细胞血型系统已达到43个，近400种抗原，开展红细胞血型系统分型有助于明确个体红细胞血型抗原表达情况。目前红细胞血型抗原系统基因分型的主要方法是多聚酶链反应-序列特异性引物(PCR-sequencespecific primer，PCR-SSP)、聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸分型(PCR-sequencespecific oligonucleotide，PCR-SSO)、基于PCR测序的直接分型技术(PCR-sequencebased typing，PCR-SBT)和实时荧光定量PCR技术等。
PCR-SSP方法快速简便，但是该方法需要多对引物才能有效区分一个抗原系统，不易自动化，而且不能检测发现一些新的特殊的突变位点。PCR-SSO方法具有特异性强、灵敏度高等优点，但是对于不同探针的杂交条件须严格统一，且易出现误差，难以标准化和自动化，也不能检测一些新的等位基因。实时荧光定量PCR技术在扩增后不需要额外步骤，可直接判读结果，具有耗时短的优点，稳定性好，重复性高，但是所需的荧光探针价格昂贵。
PCR-SBT分型方法能准确对红细胞血型抗原系统进行分型，同时也是发现新等位基因的主要鉴定方法和金标准。但是目前的针对红细胞血型抗原系统的PCR-SBT方法大多是在一个反应体系中只检测一个血型抗原系统，因此想要检测多个血型抗原系统就得扩增多孔，不利于大批量样本的多个红细胞血型抗原系统的检测。因此，建立一种同步检测多个血型抗原系统多个抗原的PCR-SBT方法具有重要价值。
发明内容
本发明首先要解决的问题是提供一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR方法，以提供24个红细胞血型抗原系统等位基因的快速分型方法。
为此，针对本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法，其特征在于：所述方法对24个红细胞血型抗原系统的基因进行分型，具体包括以下步骤：
(1)制备人基因组DNA，作为PCR扩增的模板；
(2)根据不同血型系统预期的扩增片段大小分成6组，每组体系中提供有4或6对扩增引物，对6组分别进行多重PCR反应，扩增人基因组DNA中24个红细胞抗原系统的基因片段；
(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行酶切纯化；
(4)对6组扩增片段分别进行测序PCR反应，共有52个反应体系，每个反应体系中含有一条测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序PCR反应；
(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；
(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。
步骤(2)中所述6个多重PCR反应体系，分别扩增的血型抗原系统为：1组扩增Gill、Kidd、FORS、Knops血型系统；2组扩增Raph、John Milton Hagen、P1PK、Duffy、MNS(Ss等位基因)、Landsteiner-Wiener血型系统；3组扩增I、Vel、Kell、Colton血型系统；4组扩增MNS(MN等位基因)、Lutheran、Diego、Indian血型系统；5组扩增Ok、CD59(3号外显子，CD59-3)、Dombrock、Scianna血型系统；6组扩增CD59(2号外显子，CD59-2)、Cromer、Yt、Augustine血型系统；
步骤(2)中所述扩增引物共26对，1组扩增引物由SEQ ID No.9-1、SEQ ID No.9-2、SEQ ID No.14-1、SEQ ID No.14-2、SEQ ID No.21-1、SEQ ID No.21-2、SEQ ID No.25-1、SEQ ID No.25-2组成；2组扩增引物由SEQ ID No.1-1、SEQ ID No.1-2、SEQ ID No.2-1、SEQID No.2-2、SEQ ID No.5-1、SEQ ID No.5-2、SEQ ID No.10-1、SEQ ID No.10-2、SEQ IDNo.15-1、SEQ ID No.15-2、SEQ ID No.26-1、SEQ ID No.26-2组成；3组扩增引物由SEQ IDNo.3-1、SEQ ID No.3-2、SEQ ID No.11-1、SEQ ID No.11-2、SEQ ID No.16-1、SEQ IDNo.16-2、SEQ ID No.19-1、SEQ ID No.19-2组成；4组扩增引物由SEQ ID No.4-1、SEQ IDNo.4-2、SEQ ID No.12-1、SEQ ID No.12-2、SEQ ID No.17-1、SEQ ID No.17-2、SEQ IDNo.22-1、SEQ ID No.22-2组成；5组扩增引物由SEQ ID No.6-1、SEQ ID No.6-2、SEQ IDNo.8-1、SEQ ID No.8-2、SEQ ID No.18-1、SEQ ID No.18-2、SEQ ID No.23-1、SEQ IDNo.23-2组成；6组扩增引物由SEQ ID No.7-1、SEQ ID No.7-2、SEQ ID No.13-1、SEQ IDNo.13-2、SEQ ID No.20-1、SEQ ID No.20-2、SEQ ID No.24-1、SEQ ID No.24-2组成。
作为本发明的优选技术方案：所述多重PCR反应体系包括：2×Multiplex PCRBuffer 10μl；每个引物浓度50μmol/L，引物用量范围为0.04-0.20μl；Multiplex PCRenzyme mix 0.1μl；50-100ng/μl的基因组DNA 2μl；余量以H2O补足至20μl。
作为本发明的优选技术方案：人基因组DNA中多个红细胞抗原系统的基因扩增程序为94℃预变性1min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反应30个循环；72℃10min扩增片段充分延伸。
作为本发明的优选技术方案：所述步骤(3)中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
作为本发明的优选技术方案：26对测序引物与26对扩增引物相同，所述测序引物为各血型抗原系统一对测序引物中的任意一条。
作为本发明的优选技术方案：所述测序PCR反应体系包括：5×缓冲液1.6μl；BigDye mix 0.8μl；测序引物1 1.0μl；DNA 2.0μl；H2O 4.6μl。
作为本发明的优选技术方案：测序程序为预变性96℃3min，96℃变性10s，50℃退火10s，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。
本发明第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供人红细胞血型抗原系统等位基因分型的多重PCR方法用扩增引物组合物。
为此，针对本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：扩增引物分6组，1组扩增引物由SEQ ID No.9-1、SEQ ID No.9-2、SEQ ID No.14-1、SEQ ID No.14-2、SEQ ID No.21-1、SEQ ID No.21-2、SEQ ID No.25-1、SEQ ID No.25-2组成；2组扩增引物由SEQ ID No.1-1、SEQ ID No.1-2、SEQ ID No.2-1、SEQ ID No.2-2、SEQ ID No.5-1、SEQ ID No.5-2、SEQID No.10-1、SEQ ID No.10-2、SEQ ID No.15-1、SEQ ID No.15-2、SEQ ID No.26-1、SEQ IDNo.26-2组成；3组扩增引物由SEQ ID No.3-1、SEQ ID No.3-2、SEQ ID No.11-1、SEQ IDNo.11-2、SEQ ID No.16-1、SEQ ID No.16-2、SEQ ID No.19-1、SEQ ID No.19-2组成；4组扩增引物由SEQ ID No.4-1、SEQ ID No.4-2、SEQ ID No.12-1、SEQ ID No.12-2、SEQ IDNo.17-1、SEQ ID No.17-2、SEQ ID No.22-1、SEQ ID No.22-2组成；5组扩增引物由SEQ IDNo.6-1、SEQ ID No.6-2、SEQ ID No.8-1、SEQ ID No.8-2、SEQ ID No.18-1、SEQ ID No.18-2、SEQ ID No.23-1、SEQ ID No.23-2组成；6组扩增引物由SEQ ID No.7-1、SEQ ID No.7-2、SEQ ID No.13-1、SEQ ID No.13-2、SEQ ID No.20-1、SEQ ID No.20-2、SEQ ID No.24-1、SEQ ID No.24-2组成。
本发明第三个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用测序引物组合物。
为此，针对本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：所述测序引物与扩增引物相同，各测序反应中的测序引物为各血型抗原系统一对测序引物中的任意一条。
本发明还有一个目的在于，提供人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用试剂盒。
为此，针对本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：所述人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用试剂盒，包含所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用扩增引物组合物和所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用测序引物组合物。
作为本发明的优选技术方案：试剂盒还包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
本发明扩增引物的设计参照dbSNP数据库避开了各红细胞血型系统抗原编码序列的多态性位点，避免了任何突变点的漏检。测序引物的设计能保证清晰准确测得所扩增片段的序列，通过对这些序列进行双向测序，从而将样本进行精确的基因定型。
本发明通过对红细胞血型抗原系统分别进行序列测序，获得红细胞血型抗原基因分型的寡核苷酸序列，精确地对其基因进行定型。随着基因测序技术的普及，PCR-SBT技术已广泛应用于检测。而本发明采用了多重扩增的PCR-SBT技术，建立了在同一反应体系(相同的PCR扩增缓冲体系和扩增反应参数)中加入多对引物、分组同步扩增和测序多个基因序列的方法，它具有检测多个红细胞血型基因序列的特点，结果准确并具有节约试剂耗材的特性。
本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了24个红细胞血型抗原系统定型的问题，发挥PCR-SBT对红细胞血型系统抗原基因定型操作高通量、结果准确的特点，可应用于临床输血医学研究和遗传学等领域，对于医学研究单位和试剂开发单位具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明的检测标本的24个红细胞血型抗原系统基因PCR扩增电泳图谱。1孔为第1组扩增片段Gill、Kidd、FORS、Knops血型系统；2孔为第2组扩增片段Raph、JohnMilton Hagen、P1PK、Duffy、MNS(Ss等位基因)、Landsteiner-Wiener血型系统；3孔为第3组扩增片段I、Vel、Kell、Colton血型系统；4孔为第4组扩增片段MNS(MN等位基因)、Lutheran、Diego、Indian血型系统；5孔为第5组扩增片段Ok、CD59(3号外显子，CD59-3)、Dombrock、Scianna血型系统；第6孔为第6组扩增片段CD59(2号外显子，CD59-2)、Cromer、Yt、Augustine血型系统。M为DNA marker，分子量分别为2000，1000，750，500，250，100bp。
图2为Gill血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.710+1多态性位点，标本基因型为GIL*01/GIL*01。
图3为Kidd血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.838多态性位点，标本基因型为JK*A/JK*B。
图4为FORS血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.887多态性位点，标本基因型为GBGT1*01N.01/GBGT1*01N.01。
图5为Knops血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.4681多态性位点，标本基因型为KN*01/KN*01。
图6为Raph血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.511和c.533多态性位点，标本基因型为RAPH*01/RAPH*01。
图7为John Milton Hagen血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.619和c.620多态性位点，标本基因型为JMH*01/JMH*01。
图8为P1PK血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为rs5751348多态性位点，标本基因型为A4GALT*P1.01/A4GALT*P1.01。
图9为Duffy血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.125多态性位点，标本基因型为FY*A/FY*A。
图10为MNS血型系统Ss抗原的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.143多态性位点，标本基因型为GYPB*s/GYPB*s。
图11为Landsteiner-Wiener的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.299多态性位点，标本基因型为LW*A/LW*A。
图12为I血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.816多态性位点，标本基因型为GCNT2*01/GCNT2*01。
图13为Vel血型系统的部分测序电泳图谱，横线及箭头所指为c.64_80delAGCCTAGGGGCTGTGTC多态性位点，标本基因型为VEL*01/VEL*01。
图14为Kell血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.578多态性位点，标本基因型为KEL*02/KEL*02。
图15为Colton血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.134多态性位点，标本基因型为CO*01/CO*01。
图16为MNS血型系统MN抗原的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.59、c.71和c.72多态性位点，标本基因型为GYPA*M/GYPA*M。
图17为Lutheran血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.230多态性位点，标本基因型为LU*02/LU*02。
图18为Diego血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.2561多态性位点，标本基因型为DI*B/DI*B。
图19为Indian血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.137多态性位点，标本基因型为IN*B/IN*B。
图20为Ok血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.274多态性位点，标本基因型为OK*01.01/OK*01.01。
图21为CD59血型系统CD59-3抗原的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.266多态性位点，标本基因型为CD59*01/CD59*01。
图22为Dombrock血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.793多态性位点，标本基因型为DO*A/DO*B。
图23为Scianna血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.169多态性位点，标本基因型为SC*01/SC*01。
图24为CD59血型系统CD59-2抗原的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.146多态性位点，标本基因型为CD59*01/CD59*01。
图25为Cromer血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.679多态性位点，标本基因型为CROM*01/CROM*01。
图26为Yt血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.1057多态性位点，标本基因型为YT*A/YT*A。
图27为Augustine血型系统的部分测序电泳图谱，箭头所指为c.1159和c.1171多态性位点，标本基因型为AUG*01/AUG*01。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的内容作进一步详细说明。
本实施具体以献血者的血液为检测样本进行人红细胞血型系统抗原等位基因的分型为例，对本发明内容做详细说明。
本发明的24个红细胞血型抗原系统为：Raph、John Milton Hagen、I、MNS、Ok、CD59、Gill、P1PK、Vel、Lutheran、Cromer、Kidd、Duffy、Kell、Diego、Dombrock、Colton、Yt、FORS、Indian、Scianna、Augustine、Knops、Landsteiner-Wiener。所述红细胞血型抗原系统基因为：CD151、SEMA7A、GCNT2、GYPA/GYPB、BSG、CD59、AQP3、A4GALT、SMIM1、BCAM、CD55、SLC14A1、ACKR1、KEL、SLC4A1、ART4、AQP1、ACHE、GBGT1、CD44、ERMAP、SLC29A1、CR1、ICAM4。
本发明的基因分型的多重PCR-SBT方法包括以下步骤：
1、制备人基因组DNA，作为PCR扩增的模板。
取待检全血200μl，按照MagDNA Pure LC DNA Isolation Kit试剂盒说明书提取基因组DNA，并利用分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度。
2、PCR扩增体系及扩增反应。
合成26对扩增引物，序列表如下：
Figure BDA0003275995680000091
Figure BDA0003275995680000101
本发明扩增引物的设计参照dbSNP数据库避开了各红细胞血型系统抗原编码序列的多态性位点，避免了任何突变点的漏检。本发明所设计的寡核苷酸引物是根据GenBank中人类的红细胞血型抗原基因序列包括其遗传多态性位点在内的连续寡核苷酸序列进行设计获得的。Raph血型系统抗原的CD151基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007478.1(9452-9470；9761-9778)的序列进行设计；John Milton Hagen血型系统抗原的SEMA7A基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_011733.1(21350-21369；21682-21701)的序列进行设计；I血型系统抗原的GCNT2基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007469.2(139139-139158；139473-139492)的序列进行设计；MNS血型系统抗原的GYPA和GYPB基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007470.3(25079-25098；25416-25435)和NG_007483.2(24502-24519；24982-25001)的序列进行设计；Ok血型系统抗原的BSG基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007468.1(13841-13860；14180-14199)的序列进行设计；CD59血型系统抗原的CD59基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_008057.1(23883-23902；24225-24244；31008-31027；31388-31407)的序列进行设计；Gill血型系统抗原的AQP3基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007476.1(10016-10035；10358-10378)的序列进行设计；P1PK血型系统抗原的A4GALT基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007495.1(7959-7978；8306-8325)的序列进行设计；Vel血型系统抗原的SMIM1基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_033869.1(7493-7512；7845-7863)的序列进行设计；Lutheran血型系统抗原的BCAM基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007480.1(7864-7883；8232-8250)的序列进行设计；Cromer血型系统抗原的CD55基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007465.1(14495-14516；14878-14897)的序列进行设计；Kidd血型系统抗原的SLC14A1基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_011775.4(57387-57406；57774-57793)的序列进行设计；Duffy血型系统抗原的ACKR1基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_011626.2(5580-5599；5970-5989)的序列进行设计；Kell血型系统抗原的KEL基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007492.1(9275-9294；9666-9685)的序列进行设计；Diego血型系统抗原的SLC4A1基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007498.1(21608-21627；22029-22048)的序列进行设计；Dombrock血型系统抗原的ART4基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007477.1(7667-7686；8101-8120)的序列进行设计；Colton血型系统抗原的AQP1基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007475.1(5002-5021；5485-5504)的序列进行设计；Yt血型系统抗原的ACHE基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007474.2(7751-7768；8201-8220)的序列进行设计；FORS血型系统抗原的GBGT1基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_033868.1(14975-14994；15426-15445)的序列进行设计；Indian血型系统抗原的CD44基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_008937.1(42465-42484；42950-42969)的序列进行设计；Scianna血型系统抗原的ERMAP基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_008749.1(18602-18621；19120-19139)的序列进行设计；Augustine血型系统抗原的SLC29A1基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_042893.1(18157-18176；18681-18700)的序列进行设计；Knops血型系统抗原的CR1基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007481.1(118051-118076；118583-118602)的序列进行设计；Landsteiner-Wiener血型系统抗原的ICAM4基因序列的扩增引物和测序引物根据GenBank中编号为NG_007728.1(4969-4988；5572-5591)的序列进行设计，可保证24个抗原系统基因的有效扩增。
将引物用纯水稀释至50μmol/L，准备Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(Mg2+，dNTPplus，TaKaRa)、dH2O，与步骤1所制备的PCR扩增模板，按方法优化的下表1配制多重PCR反应体系。
扩增人基因组DNA中如前文所述的24个红细胞抗原系统的基因片段，根据不同血型系统扩增片段大小进行分组，以便于在同一组间能有效区分不同血型系统，各组间预期扩增片段分子量类似的，原则上分组可以重新组合。优选分组实施例如下，每组体系中提供有4或6对扩增引物，将26对扩增引物分成6组，扩增引物组合具体如表1中所示。
表1：多重PCR反应体系
Figure BDA0003275995680000121
上表中，引物对1-6分别代表不同的红细胞血型抗原系统或等位基因扩增引物，1组扩增Gill、Kidd、FORS、Knops血型系统；2组扩增Raph、John Milton Hagen、P1PK、Duffy、MNS(Ss等位基因)、Landsteiner-Wiener血型系统；3组扩增I、Vel、Kell、Colton、血型系统；4组扩增MNS(MN等位基因)、Lutheran、Diego、Indian血型系统；5组扩增Ok、CD59(3号外显子，CD59-3)、Dombrock、Scianna血型系统；6组扩增CD59(2号外显子，CD59-2)、Cromer、Yt、Augustine血型系统。
上述PCR反应体系混匀后，在美国ABI公司的PCR仪(ABI9700)上按以下程序进行扩增：94℃预变性1min，DNA双链充分解开；94℃变性30s，60℃退火30s，扩增引物结合到模板上，72℃延伸30s，延长所需扩增片段，反应30个循环；72℃，10min，扩增片段充分延伸。然后冷却至12℃。
3、扩增产物的双酶切纯化。
将检测样本所扩增片段，各取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的特异性。在剩余的PCR产物中分别加入5μlExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent(Applied Biosystems，内含虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ)，利用虾碱性磷酸酶(SAP)的核苷酸5′端去磷酸化功能以及核酸外切酶Ⅰ(Exo-Ⅰ)的单链特异性3′→5′核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。37℃，进行40min酶切反应，80℃下15min酶失活。
4、测序PCR体系及反应。
合成26对测序引物，所述测序引物与扩增引物相同，除MNS、CD59有两对引物外，其他血型系统为一对引物。测序引物的设计能保证清晰准确测得所扩增片段的序列，通过对这些序列进行双向测序，从而将样本进行精确的基因定型。
将步骤3中纯化之后的PCR产物中加入25μl纯水稀释，混匀，将测序引物用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDye terminator v3.1 sequencing kit(美国ABI公司)试剂按照表2配制反应体系：
表2：PCR扩增产物的PCR测序体系
PCR测序体系 体积(μl)
5×缓冲液 1.6
BigDye mix 0.8
测序引物1 1.0
DNA 2.0
H<sub>2</sub>O 4.6
总体积 10.0
表2中测序引物1为各血型抗原系统两条测序引物中的任意一条。所测样本以扩增纯化的片段1:1稀释后作为模板，分别进行52个测序反应。用PCR进行如下测序反应：预变性96℃3min，DNA双链充分解开；96℃变性10s，50℃退火10s，测序引物结合到DNA模板上，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。然后冷却至12℃。
5、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。
将步骤4中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR产物中加入40μl PPT和100％无水乙醇混合液(1:20)，混匀，3000g离心30min；去除上清，加入100μl 80％乙醇，3000g离心5min，去除上清，酒精挥发后加入13μl甲酰胺溶解，95℃变性2min，迅速在冰上冷却。
6、毛细管高通量电泳测序，确定其血型抗原的基因型。
将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测序结果利用SeqScape V2.5软件进行序列比对，确定相应红细胞血型系统的基因型，结果显示了检测样本的部分序列。图2-27分别为本发明的血液检测样本进行红细胞血型系统基因分型的部分测序电泳图谱，图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省血液中心
<120> 一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR方法、引物及试剂盒
<141> 2021-09-23
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacctctgca ggagcctct 19
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccccacctcc tggtagat 18
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccctggttc tgtttgaagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacatcagga tcccatctgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaccctttt gaaagcaagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgtggtcct gaaacggtta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagaggcaag aattcctcca 20
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcatgggact ggcatctc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcatttgaaa caagcaatgg 20
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<212> DNA
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agggggtctg ttggttctct 20
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<212> DNA
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ctcaggccaa caacttctcc 20
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<212> DNA
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atttgtgcgg gagtggaagt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccaatacac acctgacgct 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgggatgag catcttgcct 20
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaagcggac tacgcaggaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaggaggggt cagagaaagg 20
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggggacaga cactcatagt c 21
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<211> 20
<212> DNA
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cgagaagcca ggttctttgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcctcccac ctcctcagtc 20
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<212> DNA
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ctcagagggg gtcttgactg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtttgctgag ctgctggac 19
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggatgggacc ggaatgagat 20
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cacgtagtct cgctcgtcg 19
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcatctcttg ttggtaatgc tg 22
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tgaatgtctg caacccacat 20
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<212> DNA
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cctagggacc aatgggagtt 20
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gggacgtcac ttgtcctgtt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctgctttgt ccttttccac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagcggaaga gaggtctgaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcaggacct tgggagaagg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ctctcttccc aacctgcaac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttcctctac atgggggtca 20
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cctgccctag ttctgagacg 20
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acctcacctc agcaatccag 20
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cccaaaaacc cactgagaaa 20
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gctctcagag ggaattgagc 20
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atggaaccag tgcctttcag 20
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caccttgtgg gctgtcct 18
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cagttacaga cccggaacca 20
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ctgagacctt gggagacctg 20
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ctggtctgca cgctagtgaa 20
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gcccggccta atttttgtat 20
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atccattcag ctgtgggaaa 20
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atcccttccc aagctttctc 20
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gccatcctgg caagtaaaaa 20
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ccatgcccct ttcaagagta 20
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aggctccaaa atcacgctgt 20

Claims (10)

1.一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法，其特征在于：所述方法对24个红细胞血型抗原系统的基因进行分型，具体包括以下步骤：
(1)制备人基因组DNA，作为PCR扩增的模板；
(2)根据不同血型系统预期的扩增片段大小分成6组，每组体系中提供有4或6对扩增引物，对6组分别进行多重PCR反应，扩增人基因组DNA中24个红细胞抗原系统的基因片段；
(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行酶切纯化；
(4)对6组扩增片段分别进行测序PCR反应，共有52个反应体系，每个反应体系中含有一条测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序PCR反应；
(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；
(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；
步骤(2)中所述6组多重PCR反应体系，分别扩增的血型抗原系统为：1组扩增Gill、Kidd、FORS、Knops血型系统；2组扩增Raph、John Milton Hagen、P1PK、Duffy、MNS(Ss等位基因)、Landsteiner-Wiener血型系统；3组扩增I、Vel、Kell、Colton血型系统；4组扩增MNS(MN等位基因)、Lutheran、Diego、Indian血型系统；5组扩增Ok、CD59(3号外显子，CD59-3)、Dombrock、Scianna血型系统；6组扩增CD59(2号外显子，CD59-2)、Cromer、Yt、Augustine血型系统；
相应地，步骤(2)中所述扩增引物共26对，1组扩增引物由SEQ ID No.9-1、SEQ IDNo.9-2、SEQ ID No.14-1、SEQ ID No.14-2、SEQ ID No.21-1、SEQ ID No.21-2、SEQ IDNo.25-1、SEQ ID No.25-2组成；2组扩增引物由SEQ ID No.1-1、SEQ ID No.1-2、SEQ IDNo.2-1、SEQ ID No.2-2、SEQ ID No.5-1、SEQ ID No.5-2、SEQ ID No.10-1、SEQ ID No.10-2、SEQ ID No.15-1、SEQ ID No.15-2、SEQ ID No.26-1、SEQ ID No.26-2组成；3组扩增引物由SEQ ID No.3-1、SEQ ID No.3-2、SEQ ID No.11-1、SEQ ID No.11-2、SEQ ID No.16-1、SEQ ID No.16-2、SEQ ID No.19-1、SEQ ID No.19-2组成；4组扩增引物由SEQ ID No.4-1、SEQ ID No.4-2、SEQ ID No.12-1、SEQ ID No.12-2、SEQ ID No.17-1、SEQ ID No.17-2、SEQID No.22-1、SEQ ID No.22-2组成；5组扩增引物由SEQ ID No.6-1、SEQ ID No.6-2、SEQ IDNo.8-1、SEQ ID No.8-2、SEQ ID No.18-1、SEQ ID No.18-2、SEQ ID No.23-1、SEQ IDNo.23-2组成；6组扩增引物由SEQ ID No.7-1、SEQ ID No.7-2、SEQ ID No.13-1、SEQ IDNo.13-2、SEQ ID No.20-1、SEQ ID No.20-2、SEQ ID No.24-1、SEQ ID No.24-2组成。
2.如权利要求1所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法，其特征在于：所述多重PCR反应体系包括：2×Multiplex PCR Buffer 10μl；每个引物浓度50μmol/L，引物用量范围为0.04-0.20μl；Multiplex PCR enzyme mix 0.1μl；50-100ng/μl的基因组DNA 2μl；余量以H2O补足至20μl；
扩增程序为：94℃预变性1min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反应30个循环，72℃10min扩增片段充分延伸。
3.如权利要求1所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法，其特征在于：所述步骤(3)中酶切纯化所需的酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
4.如权利要求1所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法，其特征在于：26对测序引物与26对扩增引物相同，测序反应中的测序引物为各血型抗原系统一对测序引物中的任意一条。
5.如权利要求1所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法，其特征在于：所述测序PCR反应体系包括：5×缓冲液1.6μl；BigDye mix 0.8μl；测序引物1 1.0μl；DNA 2.0μl；H2O 4.6μl；
测序反应程序为：预变性96℃3min，96℃变性10s，50℃退火10s，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。
6.一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用引物组合物，其特征在于：扩增引物分6组，所述1组扩增引物由SEQ ID No.9-1、SEQ ID No.9-2、SEQ ID No.14-1、SEQ ID No.14-2、SEQ ID No.21-1、SEQ ID No.21-2、SEQ ID No.25-1、SEQ ID No.25-2组成；2组扩增引物由SEQ ID No.1-1、SEQ ID No.1-2、SEQ ID No.2-1、SEQ ID No.2-2、SEQID No.5-1、SEQ ID No.5-2、SEQ ID No.10-1、SEQ ID No.10-2、SEQ ID No.15-1、SEQ IDNo.15-2、SEQ ID No.26-1、SEQ ID No.26-2组成；3组扩增引物由SEQ ID No.3-1、SEQ IDNo.3-2、SEQ ID No.11-1、SEQ ID No.11-2、SEQ ID No.16-1、SEQ ID No.16-2、SEQ IDNo.19-1、SEQ ID No.19-2组成；4组扩增引物由SEQ ID No.4-1、SEQ ID No.4-2、SEQ IDNo.12-1、SEQ ID No.12-2、SEQ ID No.17-1、SEQ ID No.17-2、SEQ ID No.22-1、SEQ IDNo.22-2组成；5组扩增引物由SEQ ID No.6-1、SEQ ID No.6-2、SEQ ID No.8-1、SEQ IDNo.8-2、SEQ ID No.18-1、SEQ ID No.18-2、SEQ ID No.23-1、SEQ ID No.23-2组成；6组扩增引物由SEQ ID No.7-1、SEQ ID No.7-2、SEQ ID No.13-1、SEQ ID No.13-2、SEQ IDNo.20-1、SEQ ID No.20-2、SEQ ID No.24-1、SEQ ID No.24-2组成。
7.如权利要求6所述的一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用引物组合物，其特征在于：测序引物与所述扩增引物相同，各测序反应中的测序引物为各血型抗原系统一对测序引物中的任意一条。
8.一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用试剂盒，其特征在于：所述人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用试剂盒包括权利要求6所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用扩增引物组合物。
9.如权利要求8所述的一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用试剂盒其特征在于：还包括权利要求7所述的人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用测序引物组合物。
10.如权利要求8所述的一种人红细胞血型抗原系统基因分型的多重PCR-SBT方法用试剂盒，其特征在于：还包括酶切用的虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。
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